CN115785187A - 一种雷公藤红素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化合物提取技术领域，具体涉及一种雷公藤红素的提取方法。本发明提供的提取方法：将南蛇藤粉体装入正相硅胶色谱柱，采用第一洗脱溶剂进行第一柱层析分离，将得到的第一洗脱产物装入反相硅胶色谱柱，采用第二洗脱溶剂进行第二柱层析分离，将得到的第二洗脱产物装入凝胶色谱柱，采用第三洗脱溶剂进行第三柱层析分离，将得到的雷公藤红素粗品重结晶得到雷公藤红素纯品。本发明采用“免提取粉末直接色谱法”能够实现以极高的效率获得高纯度的雷公藤红素，以面积归一化计算纯度>98％。本发明提供的方法相比较传统色谱法，节省了提取过程消耗的大量溶剂和人力物力成本，同时可以大幅度地提高产品的回收率，大大缩短了分离的过程和时间。
Description
技术领域
本发明属于化合物提取技术领域，具体涉及一种雷公藤红素的提取方法。
背景技术
南蛇藤，又名蔓性落霜红、南蛇风、大南蛇、香龙草和果山藤等，卫矛科南蛇藤属植物。在我国分布较多，多应用于祛风除湿、活血解毒及消肿抗炎。现代药理研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、昆虫拒食、抗微生物、抗氧化以及抗纤维化和抗生育等药理作用。雷公藤红素(Celastrol)作为南蛇藤根皮中主要三萜类成分，研究表明其有抗炎、免疫抑制、抗肥胖、抗肿瘤等作用，已被用于类风湿性关节炎、肥胖、肿瘤的治疗。雷公藤红素是一种醌甲基五环三萜类化合物，分子式为C29H38O4，红色针状晶体，难溶于水，熔点185～200℃，紫外在425nm处有强吸收，其结构式如式1所示。
近年来的研究表明雷公藤红素是最具潜力的减肥药物，雷公藤红素单体已成为行业关注的焦点。2015年，哈佛医学院Umut Ozcan团队在Cell发表题为“TreatmentofObesity with Celastrol”的研究论文，该研究发现雷公藤红素(Celastrol)是一种瘦素增敏剂，是一种有前途的治疗肥胖症的药物。2019，哈佛医学院Umut Ozcan团队在NatureMedicine发表题为“IL1R1 is required for celastrol’s leptin-sensitization andantiobesity effects”的研究论文，该研究发现IL1R1是雷公藤红素代谢作用的“看门人”。2021，郑州大学，德克萨斯大学西南医学中心，复旦大学等多单位合作在JCI Insight在线发表题为“PERK inPOMC neurons connects celastrol withmetabolism”的研究论文，该研究表明在POMC神经元中具有PERK缺陷的小鼠中，雷公藤红素诱导的瘦素敏感性和能量平衡的改善减弱。可以预见雷公藤红素未来会成为医药中间体或原料的重要品种。
现有的雷公藤红素提取工艺主要是色谱法，第一步骤基本都是用硅胶柱色谱分离，传统的正相硅胶柱层析一般是先溶剂提取药材粗品，然后再拌样，最后再洗脱，工艺流程相对复杂。这种常规的提取纯化方法获得的雷公藤红素的收率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种雷公藤红素的提取方法，本发明提供的提取方法能够显著提高雷公藤红素的收率，且生产效率高。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种雷公藤红素的提取方法，包括以下步骤：
将南蛇藤粉体装入正相硅胶色谱柱，采用第一洗脱溶剂进行第一柱层析分离，得到第一洗脱产物，所述第一洗脱溶剂包括体积百分含量为50～100％的含石油醚溶剂；
将所述第一洗脱产物装入反相硅胶色谱柱，采用第二洗脱溶剂进行第二柱层析分离，得到第二洗脱产物，所述第二洗脱溶剂包括体积百分含量为80～100％的含甲醇溶剂；
将所述第二洗脱产物装入凝胶色谱柱，采用第三洗脱溶剂进行第三柱层析分离，得到雷公藤红素粗品，所述第三洗脱溶剂包括体积百分含量为90～100％的含甲醇溶剂；
将所述雷公藤红素粗品重结晶，得到雷公藤红素纯品。
优选的，所述第一柱层析分离包括：采用第一洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚的体积百分含量为66.67％的石油醚-乙酸乙酯；所述第三阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚的体积百分含量为50％的石油醚-乙酸乙酯；
将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到所述第一洗脱产物。
优选的，所述第二柱层析分离包括：采用第二洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为80％的甲醇-水；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为90％的甲醇-水；所述第三阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇；
将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到所述第二洗脱产物。
优选的，所述凝胶色谱柱为葡萄糖凝胶色谱柱。
优选的，所述第三柱层析分离的洗脱程序为等度洗脱，所述第三柱层析分离的洗脱溶剂为甲醇和水的混合溶剂，所述甲醇的体积百分含量为90％。
优选的，所述南蛇藤粉体的直径≤0.425mm。
优选的，所述南蛇藤粉体和所述正相硅胶色谱柱中的硅胶颗粒的质量比≥1:3。
优选的，所述重结晶包括以下步骤：将所述雷公藤红素粗品溶解于重结晶溶剂中，得到雷公藤红素粗品溶液；将所述雷公藤红素粗品溶液静置结晶，得到所述雷公藤红素纯品；所述重结晶溶剂为乙醇和水的混合溶剂，所述重结晶溶剂中乙醇的体积百分含量为90～95％。
优选的，所述反相硅胶色谱柱为RP-C18色谱柱。
优选的，所述南蛇藤粉体含水率≤5％。
本发明提供了一种雷公藤红素的提取方法，包括以下步骤：将南蛇藤粉体装入正相硅胶色谱柱，采用第一洗脱溶剂进行第一柱层析分离，得到第一洗脱产物，所述第一洗脱溶剂包括体积百分含量为50～100％的含石油醚溶剂；将所述第一洗脱产物装入反相硅胶色谱柱，采用第二洗脱溶剂进行第二柱层析分离，得到第二洗脱产物，所述第二洗脱溶剂包括体积百分含量为80～100％的含甲醇溶剂；将所述第二洗脱产物装入凝胶色谱柱，采用第三洗脱溶剂进行第三柱层析分离，得到雷公藤红素粗品，所述第三洗脱溶剂包括体积百分含量为90～100％的含甲醇溶剂；将所述雷公藤红素粗品重结晶，得到雷公藤红素纯品。本发明采用“免提取粉末直接色谱法”以南蛇藤粉体为原料直接进行柱层析分离，通过依次进行正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和凝胶柱层析以及重结晶，能够实现以极高的效率获得高纯度的雷公藤红素，以面积归一化计算，本发明制备的雷公藤红素纯品的纯度>98％，可以用于对照品使用，且获得的雷公藤红素粗品和纯品的收率高。
本发明提供的方法“免提取粗粉直接色谱法”相比较传统色谱法，节省了提取过程消耗的大量溶剂和人力物力成本，同时可以大幅度地提高产品的回收率，大大缩短了分离的过程和时间。
附图说明
图1为本发明实施例1南蛇藤样品颗粒的液相色谱图；
图2为本发明实施例1制备的雷公藤红素纯品的液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种雷公藤红素的提取方法，包括以下步骤：
将南蛇藤粉体装入正相硅胶色谱柱，采用第一洗脱溶剂进行第一柱层析分离，得到第一洗脱产物，所述第一洗脱溶剂包括体积百分含量为50～100％的含石油醚溶剂；
将所述第一洗脱产物装入反相硅胶色谱柱，采用第二洗脱溶剂进行第二柱层析分离，得到第二洗脱产物，所述第二洗脱溶剂包括体积百分含量为80～100％的含甲醇溶剂；
将所述第二洗脱产物装入凝胶色谱柱，采用第三洗脱溶剂进行第三柱层析分离，得到雷公藤红素粗品，所述第三洗脱溶剂包括体积百分含量为90～100％的含甲醇溶剂；
将所述雷公藤红素粗品重结晶，得到雷公藤红素纯品。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明将南蛇藤粉体装入正相硅胶色谱柱，采用第一洗脱溶剂进行第一柱层析分离，得到第一洗脱产物，所述第一洗脱溶剂包括体积百分含量为50～100％的含石油醚溶剂。
在本发明中，所述南蛇藤粉体优选为南蛇藤茎皮粉体。
在本发明中，所述南蛇藤粉体的制备方法优选包括以下步骤：将所述南蛇藤茎皮依次进行干燥、粉碎和筛分，得到所述南蛇藤粉体。所述干燥的温度优选为≤50℃，更优选为50℃。本发明对所述粉碎的具体实施过程没有特殊要求，在本发明中，所述筛分使用的分离筛孔径优选为40目、60目或80目。
在本发明中，所述南蛇藤粉体的直径优选≤0.425mm，更优选为≤0.25mm，进一步优选为≤0.178mm。
在本发明中，进行所述第一柱层析分离之前，本发明优选还包括将所述南蛇藤粉体进行干燥，所述干燥的温度优选为≤50℃，更优选为50℃。本发明对所述干燥的时间没有特殊要求。
在本发明中，所述南蛇藤粉体含水率优选≤5％。更优选为≤1％。
在本发明中，所述南蛇藤粉体和所述正相硅胶色谱柱中的硅胶颗粒的质量比优选≥1:3，更优选为1:3。
本发明优选将所述南蛇藤粉体直接从正相硅胶色谱柱的顶部装入所述正相硅胶色谱柱中进行所述第一柱层析分离。
在本发明中，所述第一柱层析分离优选包括：采用第一洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚的体积百分含量为66.67％的石油醚-乙酸乙酯；所述第三阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚的体积百分含量为50％的石油醚-乙酸乙酯。
或所述第一柱层析分离优选包括：采用第一洗脱溶剂进行连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱时，所述第一洗脱溶剂优选为石油醚和乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积变化为1:0→1:1。
在本发明中，所述第一柱层析分离时，本发明优选每10mL一个洗脱馏分收集所述第一柱层析分离得到的洗脱产物。本发明优选对所述第一柱层析分离得到的洗脱产物(每一个洗脱馏分)采用薄层色谱检识，将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到所述第一洗脱产物。或本发明优选对所述第一柱层析分离得到的洗脱产物(每一个洗脱馏分)采用肉眼检识，将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物(颜色为红色)合并，得到所述第一洗脱产物。
本发明所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物(或连续梯度洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物馏分)合并，得到第一洗脱液，本发明优选对所述第一洗脱液进行除溶剂，得到所述第一洗脱产物。在本发明中，所述除溶剂优选为减压蒸馏，本发明对所述减压蒸馏的具体实施过程没有特殊要求。
得到第一洗脱产物后，本发明将所述第一洗脱产物装入反相硅胶色谱柱，采用第二洗脱溶剂进行第二柱层析分离，得到第二洗脱产物，所述第二洗脱溶剂包括体积百分含量为80～100％的含甲醇溶剂。
在本发明中，所述反相硅胶色谱柱优选为RP-C18色谱柱。
在本发明中，所述第二柱层析分离优选包括：采用第二洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为80％的甲醇-水；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为90％的甲醇-水；所述第三阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇。
或在本发明中，所述第二柱层析分离优选包括：采用第二洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱和第二阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为90％的甲醇-水；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇。
或所述第二柱层析分离优选包括：采用第二洗脱溶剂进行连续梯度洗脱，所述连续梯度洗脱时，所述第二洗脱溶剂优选为甲醇和水，所述甲醇和水的体积变化为8:2→1:0。
在本发明中，所述第二柱层析分离时，本发明优选每10mL一个洗脱馏分收集所述第二柱层析分离得到的洗脱产物。本发明优选对所述第二柱层析分离得到的洗脱产物(每一个洗脱馏分)采用薄层色谱检识，将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物(或连续梯度洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物馏分)合并，得到所述第二洗脱产物。或本发明优选对所述第二柱层析分离得到的洗脱产物(每一个洗脱馏分)采用肉眼检识，将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物(颜色为红色)合并，得到所述第二洗脱产物。
本发明所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到第二洗产物。
得到第二洗脱产物后，本发明将所述第二洗脱产物装入凝胶色谱柱，采用第三洗脱溶剂进行第三柱层析分离，得到雷公藤红素粗品，所述第三洗脱溶剂包括体积百分含量为90～100％的含甲醇溶剂。
在本发明中，所述凝胶色谱柱为葡萄糖凝胶色谱柱。
在本发明中，所述第三柱层析分离的洗脱程序优选为等度洗脱，所述第三柱层析分离的洗脱溶剂优选为甲醇和水的混合溶剂，所述甲醇的体积百分含量优选为90％。
在本发明中，所述第三柱层析分离时，本发明优选手动收集洗脱馏分。
在本发明中，所述第二柱层析分离时，本发明优选每10mL一个洗脱馏分手动收集所述第三柱层析分离得到的洗脱产物。本发明优选对所述第三柱层析分离得到的洗脱产物(每一个洗脱馏分)采用薄层色谱检识，将所述第三柱层析洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到所述雷公藤红素粗品。或本发明优选对所述第三柱层析分离得到的洗脱产物(每一个洗脱馏分)采用肉眼检识，将颜色为红色的洗脱馏分合并，得到所述雷公藤红素粗品。
在本发明中，所述第三柱层析分离检识后得到的含有雷公藤红素的洗脱馏分合并，得到第三洗脱液，本发明优选对所述第三洗脱液进行除溶剂，得到所述雷公藤红素粗品。在本发明中，所述除溶剂优选为减压蒸馏，本发明对所述减压蒸馏的具体实施过程没有特殊要求。
本发明仅仅只需要将药材粉碎，不需要通过提取，将粗粉颗粒装入硅胶柱上方进行反相柱层析，再结合反相硅胶柱层析和葡聚糖凝胶色谱即可得到良好的硅胶柱层析的效果，得到雷公藤红素粗品，可以极高的效率获得雷公藤红素粗品。
得到雷公藤红素粗品后，本发明将所述雷公藤红素粗品重结晶，得到雷公藤红色纯品。
在本发明中，所述重结晶包括以下步骤：将所述雷公藤红素粗品溶解于重结晶溶剂中，得到雷公藤红素粗品溶液；将所述雷公藤红素粗品溶液静置结晶，得到所述雷公藤红素纯品；所述重结晶溶剂为乙醇和水的混合溶剂，所述重结晶溶剂中乙醇的体积百分含量为90～95％，优选为95％。
在本发明中，所述溶解优选为加热溶解，更优选在加热回流的条件下进行所述溶解。本发明优选将所述溶解得到的溶液进行固液分离，得到雷公藤红素粗品溶液。在本发明中，所述固液分离的具体实施方式优选为过滤。在本发明中，所述静置结晶优选在阴凉干燥的环境中进行。在本发明中，所述静置结晶后，本发明优选对得到的结晶溶液进行固液分离，得到所述雷公藤红素纯品。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将10kg南蛇藤茎皮干燥粉碎过筛得到80目的南蛇藤茎皮粉体(粒径≤0.178mm)；将南蛇藤茎皮粉体在50℃的鼓风干燥箱中干燥恒重；
将干燥后的南蛇藤茎皮粉体加到装填好的正相硅胶色谱柱上面进行层析分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(体积比为2:1)和石油醚-乙酸乙酯(体积比1:1)进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到洗脱液；减压蒸干，得到第一洗脱产物；将第一洗脱物作为为雷公藤红色初始粗品，采用HPLC测定方法雷公藤红色初始粗品的纯度和收率，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色初始粗品的纯度为28.7％，收率为88％。
第一洗脱产物采用RP-C18色谱柱进行柱层析分离，依次采用甲醇-水(甲醇体积含量为80％)、甲醇-水(甲醇体积含量为90％)和甲醇进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第二洗脱产物；
第二洗脱产物以葡聚糖凝胶柱色谱纯化，采用体积含量为90％甲醇-水作为洗脱溶剂洗脱，手动收集各个组分洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第三洗脱液，减压蒸干，得到雷公藤红素粗品；
将收集的雷公藤红素粗品用热的95％乙醇溶解，过滤后的澄清溶液放置在阴凉干燥处重结晶析出晶体，得到雷公藤红色纯品，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色纯品的纯度为98.7％，收率为73％。其中图1为本实施例1中南蛇藤茎皮粉体的液相色谱图，图2为本实施例制备的雷公藤红色纯品的液相色谱图。
实施例2
将10kg南蛇藤茎皮干燥粉碎过筛得到60目的南蛇藤茎皮粉体(粒径≤0.25mm)；将南蛇藤茎皮粉体在50℃的鼓风干燥箱中干燥恒重；
将干燥后的南蛇藤茎皮粉体加到装填好的正相硅胶色谱柱上面进行层析分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(体积比为2:1)和石油醚-乙酸乙酯(体积比1:1)进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到洗脱液；减压蒸干，得到第一洗脱产物；为雷公藤红色初始粗品，采用HPLC测定方法雷公藤红色初始粗品的纯度和收率，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色初始粗品的纯度为28.9％，收率为93％。
第一洗脱产物采用RP-C18色谱柱进行柱层析分离，依次采用甲醇-水(甲醇体积含量为80％)、甲醇-水(甲醇体积含量为90％)和甲醇进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第二洗脱产物；
第二洗脱产物以葡聚糖凝胶柱色谱纯化，采用体积含量为90％甲醇-水作为洗脱溶剂洗脱，手动收集各个组分洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第三洗脱液，减压蒸干，得到雷公藤红素粗品；
将收集的雷公藤红素粗品用热的95％乙醇溶解，过滤后的澄清溶液放置在阴凉干燥处重结晶析出晶体，得到雷公藤红色纯品，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色纯品的纯度为98.6％，收率为72.1％。
实施例3
将10kg南蛇藤茎皮干燥粉碎过筛得到40目的南蛇藤茎皮粉体(粒径≤0.425mm)；将南蛇藤茎皮粉体在50℃鼓风干燥箱中干燥恒重；
将干燥后的南蛇藤茎皮粉体加到装填好的正相硅胶色谱柱上面进行层析分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(体积比为2:1)和石油醚-乙酸乙酯(体积比1:1)进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到洗脱液；减压蒸干，得到第一洗脱产物；为雷公藤红色初始粗品，采用HPLC测定方法雷公藤红色初始粗品的纯度和收率，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色初始粗品的纯度为30.9％，收率为95％。
第一洗脱产物采用RP-C18色谱柱进行柱层析分离，依次采用甲醇-水(甲醇体积含量为80％)、甲醇-水(甲醇体积含量为90％)和甲醇进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第二洗脱产物；
第二洗脱产物以葡聚糖凝胶柱色谱纯化，采用体积含量为90％甲醇-水作为洗脱溶剂洗脱，手动收集各个组分洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第三洗脱液，减压蒸干，得到雷公藤红素粗品；
将收集的雷公藤红素粗品用热的95％乙醇溶解，过滤后的澄清溶液放置在阴凉干燥处重结晶析出晶体，得到雷公藤红色纯品，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色纯品的纯度为98.6％，收率为76％。
实施例4
将5kg南蛇藤茎皮干燥粉碎过筛得到80目南蛇藤茎皮粉体(粒径≤0.178mm)；将南蛇藤茎皮粉体在50℃的鼓风干燥箱中干燥恒重；
将干燥后的南蛇藤茎皮粉体加到装填好的正相硅胶色谱柱上面进行层析分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(体积比为2:1)和石油醚-乙酸乙酯(体积比1:1)进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到洗脱液；减压蒸干，得到第一洗脱产物；为雷公藤红色初始粗品，采用HPLC测定方法雷公藤红色初始粗品的纯度和收率，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色初始粗品的纯度为28.9％，收率为86.2％。
第一洗脱产物采用RP-C18色谱柱进行柱层析分离，依次采用甲醇-水(甲醇体积含量为80％)、甲醇-水(甲醇体积含量为90％)和甲醇进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第二洗脱产物；
第二洗脱产物以葡聚糖凝胶柱色谱纯化，采用体积含量为90％甲醇-水作为洗脱溶剂洗脱，手动收集各个组分洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到第三洗脱液，减压蒸干，得到雷公藤红素粗品；
将收集的雷公藤红素粗品用热的95％乙醇溶解，过滤后的澄清溶液放置在阴凉干燥处重结晶析出晶体，得到雷公藤红色纯品，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本实施例制备的雷公藤红色纯品的纯度为98.8％，收率为74.4％。
对比例1
将10kg南蛇藤茎皮干燥粉碎过筛得到80目的南蛇藤茎皮粉体(粒径≤0.178mm)；将南蛇藤茎皮粉体在50℃的鼓风干燥箱中干燥恒重；
将干燥后的南蛇藤茎皮粉体加入石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂中进行提取，其中石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:1，在30℃条件下超声提取2次，每次30min，每次提取溶剂的质量为粉体质量的10倍，过滤合并浓缩，得到提取浓缩液；
将提取浓缩液硅胶拌样后，加到装填好的正相硅胶色谱柱上面进行层析分离，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯(体积比为2:1)和石油醚-乙酸乙酯(体积比1:1)进行阶段梯度洗脱；阶段梯度洗脱时，每10mL收集1个洗脱馏分，肉眼收集红色或经过薄层色谱检识后合并含有雷公藤红素的洗脱馏分，得到洗脱液；减压蒸干，得到得到雷公藤红色纯品，色谱条件：色谱柱：Extend-C18色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：乙腈(90v/v％)-0.1％磷酸水溶液(10v/v％)；流速：0.8mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。本对比例制备的雷公藤红色纯品的纯度为28.4％，收率为32.5％。
实施例1～3和对比例1的结果表明本发明实施例1～4粉碎后不经溶剂提取拌样南蛇藤中分离得到的雷公藤红素的纯度和收率均显著高于对比例1传统提取后拌样分离的产物，本发明提供的方法显著提高雷公藤红素的回收率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种雷公藤红素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
将南蛇藤粉体装入正相硅胶色谱柱，采用第一洗脱溶剂进行第一柱层析分离，得到第一洗脱产物，所述第一洗脱溶剂包括体积百分含量为50～100％的含石油醚溶剂；
将所述第一洗脱产物装入反相硅胶色谱柱，采用第二洗脱溶剂进行第二柱层析分离，得到第二洗脱产物，所述第二洗脱溶剂包括体积百分含量为80～100％的含甲醇溶剂；
将所述第二洗脱产物装入凝胶色谱柱，采用第三洗脱溶剂进行第三柱层析分离，得到雷公藤红素粗品，所述第三洗脱溶剂包括体积百分含量为90～100％的含甲醇溶剂；
将所述雷公藤红素粗品重结晶，得到雷公藤红素纯品。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一柱层析分离包括：采用第一洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚的体积百分含量为66.67％的石油醚-乙酸乙酯；所述第三阶段洗脱的洗脱溶剂为石油醚的体积百分含量为50％的石油醚-乙酸乙酯；
将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到所述第一洗脱产物。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第二柱层析分离包括：采用第二洗脱溶剂进行阶段梯度洗脱，所述阶段梯度洗脱包括第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱；所述第一阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为80％的甲醇-水；所述第二阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇的体积百分含量为90％的甲醇-水；所述第三阶段洗脱的洗脱溶剂为甲醇；
将所述第一阶段洗脱、第二阶段洗脱和第三阶段洗脱得到的含有雷公藤红素的洗脱产物合并，得到所述第二洗脱产物。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为葡萄糖凝胶色谱柱。
5.根据权利要求1或4所述的提取方法，其特征在于，所述第三柱层析分离的洗脱程序为等度洗脱，所述第三柱层析分离的洗脱溶剂为甲醇和水的混合溶剂，所述甲醇的体积百分含量为90％。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述南蛇藤粉体的直径≤0.425mm。
7.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述南蛇藤粉体和所述正相硅胶色谱柱中的硅胶颗粒的质量比≥1:3。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述重结晶包括以下步骤：将所述雷公藤红素粗品溶解于重结晶溶剂中，得到雷公藤红素粗品溶液；将所述雷公藤红素粗品溶液静置结晶，得到所述雷公藤红素纯品；所述重结晶溶剂为乙醇和水的混合溶剂，所述重结晶溶剂中乙醇的体积百分含量为90～95％。
9.根据权利要求1或3所述的提取方法，其特征在于，所述反相硅胶色谱柱为RP-C18色谱柱。
10.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述南蛇藤粉体含水率≤5％。
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