CN111574348A - 一种维生素k1的纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种维生素K1的纯化工艺，其方法包括以下步骤：步骤1，使用C18反相硅胶柱作为填料的DAC600制备色谱柱，甲醇和乙酸乙酯混合溶液为流动相，对合成得到的VK1粗品进行层析纯化；步骤2，步骤1收获的经过反相硅胶柱层析纯化的VK1进一步用正相层析硅胶作为填料，正己烷为流动相，对VK1进行层析纯化。

Description

一种维生素K1的纯化工艺

技术领域：

本发明涉及一种原料药的纯化方法，特别涉及一种维生素K1的纯化工艺。

背景技术：

维生素k1，英文名Vitamin K1，别名：植物甲萘醌；2-甲基-3-(3,7,11,15-四甲基十六-2-烯基)-1,4-萘醌，分子式C31H46O2，分子量450.71，结构式：

维生素k1为维生素类及矿物质缺乏症用药。

维生素K1注射液是2009版国家基本药物目录品种，主要用于各种维生素K缺乏引起的出血性疾病的治疗。在临床上应用于凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症的防治以及梗阻性黄疸、胆瘘、慢性腹泻等所致出血，香豆素类、水杨酸钠等所致的低凝血酶原血症。维生素还具有镇痛、缓解支气管痉挛的作用，对内脏平滑肌绞痛、胆管痉挛、肠痉挛引起的绞痛有明显的效果。维生素K1还可以用于多维食品和禽畜饲料的添加剂。

维生素k1原料药为黄色至橙黄色透明粘稠的液体。无臭或几乎无臭；遇光易分解。在氯仿、乙醚或植物油中易溶，在乙醇中略溶，在水中不溶，折光率为1.525～1.528。

2011年，国家食品药品监督管理局发布了第43期药品不良反应信息通报，表示维生素K1注射液存在严重过敏反应，提醒医务人员和患者要关注过敏反应的风险。数据分析显示，维生素K1注射液的安全风险除其本身外，还包括原料药中的杂质成分。

维生素K1的制备方法包括：

使用氧化银将未酯化的二氢维生素K1转化为维生素K1。

使用六硝酸联铵为催化剂对二氢维生素K1二甲醚的氧化去甲基化可制备维生素K1。

通过氧化二氢维生素K1碱金属盐制备维生素K1的方法。

使用碱金属氢氧化物皂化二氢维生素K1单乙酸酯或单苯甲酸酯，然后使用空气氧化。

日本专利公开(公开)212 142/1982公开了使用二乙酯代替单酯为原料。使用空气氧化制备维生素K1方法。

日本专利公开(公开)76854/1973公开了使用氧化银、氧化铅、二氧化锰、过氧化镍和二甲亚砜将二氢维生素K1氧化为维生素K1的方法现有方法所得到的产物，可能产生的杂质包括：维生素K1顺式异构体杂质(杂质3)，溶剂残留，以及相关的过氧化产物或中间体，如"β,γ-Dihydro Vitamin K1"(杂质2)，"Vitamin K1 2,3-Epoxide"(杂质1)等。

对维生素K1的纯化问题是制备维生素K1原料药的难题，特别是如何去除上述杂质，现有技术报道极少。本发明人经过研究发现采用层析法有利于安全性的提高，但如何将其应用于工业化生产，仍需要探索。

层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。层析系统由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同，在两相中的分配(含量比)不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。常用的层析方法包括，凝胶层析，离子交换层析，高效液相层析(HPLC)，亲和层析等。

《沈阳药科大学学报》2013年第04期“维生素K1微乳剂在大鼠体内的药物动力学”孙婷；唐丽英；徐静瑶；赵云丽；于治国等公开了大鼠血浆中维生素K1的高效液相色谱测定法，并应用于经灌胃给予维生素K1微乳剂后的维生素K1药动学研究。方法为采用无水乙醇一乙醚(体积比为1：3)提取的方法处理血浆样品。采用反相高效液相色谱法测定维生素K1的血药浓度，色谱柱为ThermoC18柱(150mm×4.6mm，5p.m)，流动相为无水乙醇一水(体积比为90：10)，流速为1.1mL·min-1，检测波长为270nm，柱温为35℃。

2005版中国药典公开了维生素K1的检测方法：照高效液相色谱法(附录Ⅴd)测定。避光操作。色谱条件与系统适用性试验用硅胶为填充剂；以石油醚(60-90℃)-正戊醇(2000:2.5)为流动相；检测波长为254nm。测定法取本品约20mg，精密称定.置50ml量瓶中.用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液5ml与内标溶液1ml，置10ml量瓶中，以流动相稀释至刻度.摇匀.取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取维生素k1对照品适量，精密称定，同法测定。按内标法以顺、反式异构体峰面积的和计算，即得。

本发明人对现有技术进行了研究后，找到一种适合维生素k1的层析方法。

发明内容：

本发明提供一种维生素k1原料药的纯化方法，所述方法，包括以下步骤：

步骤1，使用C18反相硅胶柱作为填料的DAC600制备色谱柱，甲醇和乙酸乙酯混合溶液为流动相，对合成得到的VK1粗品进行层析纯化。

步骤2，步骤1收获的经过反相硅胶柱层析纯化的VK1进一步用正相层析硅胶作为填料，正己烷为流动相，对VK1进行层析纯化。

其中，步骤1的层析条件如下：

流动相为：甲醇和乙酸乙酯，两者比例为200：85，检测波长：270nm，300nm，流速：10L/min，上样量：5％，样品浓度：400mg/ml

步骤1的操作过程如下：

1)流动相配制

将甲醇1781kg和乙酸乙酯676kg加入反应釜并混合搅拌均匀。

2)样品配制

称取VK1粗品9.00kg，加入乙酸乙酯8.00kg搅拌溶清，将Vk1粗品的乙酸乙酯溶液过预柱过滤以除去机械杂质和活性炭，用剩余的2.22Kg乙酸乙酯冲洗，冲洗液合并到滤液中，搅拌下称量加入甲醇8.88kg，搅拌并保证溶液为澄清状态；一般甲醇用量会比乙酸乙酯少(7.20Kg左右)，否则会发生浑浊；若溶液发生浑浊，则向其中加入少量乙酸乙酯即可溶清(0.20Kg左右)；将配制好的样品溶液平均分成4份待用。

3)进针，冲柱，进针，洗脱；

4)洗脱液浓缩

将所收集的洗脱液减压浓缩，蒸出溶剂，加热从30℃逐渐升温至70℃，减压真空≥0.095MPa，抽蒸5～10小时，检测折光率1.520～1.528之间，出料，得到VK1精制品，供正相层析精制。

其中，步骤2的层析条件如下：

溶剂和洗脱液：正己烷填料：正相层析硅胶+活性炭

步骤2操作过程如下：

1)备柱

取硅胶，加入正己烷浸泡装入层析柱中；再在硅胶上层铺垫一层活性炭；

2)装料

VK1精制品加入正己烷溶解，打开层析柱底部料液出口，使料液进入柱中；

3)洗脱

加入正己烷洗脱液，进行洗脱。流速大约在2～3Kg/min；前洗脱无色溶液返回流动相釜继续使用，待洗脱出黄色料液，开始收集，收集时间约2～3小时；

4)浓缩将所收集的层析液减压浓缩，得VK1纯品。

经过检测，本发明VK1纯品，各种指标如下：

采用现有方法制备得到的VK1，有关杂质含量如下：

	收率	总杂含量	杂质1含量	杂质2含量	杂质3含量
						样品	50％	0.25	0.06％	0.12％	0.07％

其中，现有方法为采用正相硅胶柱，流动相为3％乙酸乙酯的石油醚溶液，不加压自然过滤洗脱，重复2次过柱分离，单次过柱耗时约10天，单次溶剂消耗每公斤原料药约1200升。

注：其中所述含量为重量百分含量

本发明的优点：

1、反相柱采用DAC600型工业自动化制备柱，单次分离时间约30～40分钟；正相柱采用传统的正相硅胶柱，正己烷为流动相，加压快速过滤分离，单次分离时间约2～3小时，节省时间和人工成本；

2、反相柱流动相消耗每公斤原料药约300升，正相柱流动相消耗每公斤原料药120升，较传统硅胶柱分离纯化大大节省了溶剂消耗。

3、反相柱和正相柱全部采用目标物段全接收方法，单次过柱收率80％以上，总收率65％左右，操作简单，适合工业化生产。

本发明的核心技术在于步骤1，其中的层析条件是经过筛选获得的，筛选过程如下：

流动相的筛选

1、反相柱流动相可用甲醇和乙酸乙酯、乙醇和乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷、乙醇和二氯甲烷等体系，其中乙醇和乙酸乙酯从分离效果和溶剂安全方面为最佳选择；

2、正相柱流动相可用石油醚、正己烷、异辛烷等烷烃类溶剂，其中正己烷效果最佳。

色谱柱的筛选

1、反相柱为DAC600工业制备柱，填料选用C18硅胶，C18硅胶对于化物的保留能力强于C8硅胶，适合VK1这种弱极性化合物的分离；

2、正相柱采用100到200目硅胶做为填料。

附图说明：

图1本发明实施例1所得VK1高效液相色谱图，检测方法参照药典。其中1为杂质1，2为杂质2，3为VK1，被测样品为第一批样品1。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

VK1柱层析工艺(单批粗品9kg批量)

一、工序一：DAC600柱层析(C18反相硅胶柱)

1、物料和设备信息

1-1物料配比

物料名称	配比(W/W)	投料量(kg)
			VK1粗品	1	9.00
甲醇	200	2000
			乙酸乙酯	94.44	850

1-2设备信息

2、实验条件

检测波长：270nm，300nm

流速：10L/min

流动相：甲醇：乙酸乙酯

上样量：5％

样品浓度：400mg/ml

3、操作过程

1)流动相配制

将甲醇1781kg和乙酸乙酯676kg加入反应釜并混合搅拌均匀。

2)样品配制

称取VK1粗品9.00kg，加入乙酸乙酯8.00kg搅拌溶清，将Vk1粗品的乙酸乙酯溶液过预柱过滤以除去机械杂质和活性炭，用剩余的2.22Kg乙酸乙酯冲洗，冲洗液合并到滤液中，搅拌下称量加入甲醇8.88kg，搅拌并保证溶液为澄清状态；一般甲醇用量会比乙酸乙酯少(7.20Kg左右)，否则会发生浑浊；若溶液发生浑浊，则向其中加入少量乙酸乙酯即可溶清(0.20Kg左右)；将配制好的样品溶液平均分成4份待用。

3)平衡仪器

用配制好的甲醇与乙酸乙酯混合溶液冲洗柱子至检测基线平衡，流速10L/min。

3)进第一针

(1)将一份样品溶液用流动相泵抽入色谱柱，流速5L/min；用甲醇和乙酸乙酯配制的流动相清洗样品瓶，清洗液一并抽入色谱柱以清洗进样管路，清洗标准为泵头前段透明管路中无明显颜色即可；

(2)样品进入柱后，按照设定好的方法进行洗脱，当VK1峰升起即可开始接收，将VK1主峰部分全部接收入减压蒸馏釜备用；

4)进第二针

(1)将一份样品溶液用流动相泵抽入色谱柱，流速5L/min；用甲醇和乙酸乙酯配制的流动相清洗样品瓶，清洗液一并抽入色谱柱以清洗进样管路，清洗标准为泵头前段透明管路中无明显颜色即可；

(2)样品进入柱后，按照设定好的方法进行洗脱，当VK1峰升起即可开始接收，将VK1主峰部分全部接收入减压蒸馏釜备用；

5)冲柱

用乙酸乙酯冲洗柱子至检测基线平衡，流速10L/min，冲洗约10min；再用甲醇和乙酸乙酯配制的流动相冲洗柱子，流速10L/min，时间约20min。

6)进第三针

(1)将一份样品溶液用流动相泵抽入色谱柱，流速5L/min；用甲醇和乙酸乙酯配制的流动相清洗样品瓶，清洗液一并抽入色谱柱以清洗进样管路，清洗标准为泵头前段透明管路中无明显颜色即可；

(2)样品进入柱后，按照设定好的方法进行洗脱，当VK1峰升起即可开始接收，将VK1主峰部分全部接收入减压蒸馏釜备用；

7)进第四针

(1)将一份样品溶液用流动相泵抽入色谱柱，流速5L/min；用甲醇和乙酸乙酯配制的流动相清洗样品瓶，清洗液一并抽入色谱柱以清洗进样管路，清洗标准为泵头前段透明管路中无明显颜色即可；

(2)样品进入柱后，按照设定好的方法进行洗脱，当VK1峰升起即可开始接收，将VK1主峰部分全部接收入减压蒸馏釜备用；

8)冲柱与封柱

用乙酸乙酯冲洗柱子至检测基线平衡，流速10L/min，冲洗约10min；再用甲醇冲洗柱子，流速10L/min，时间约20min。

9)减压蒸除溶剂

将所收集的洗脱液减压浓缩，蒸出溶剂，加热从30℃逐渐升温至70℃，减压真空≥0.095MPa，抽蒸5～10小时，检测折光率1.520～1.528之间，出料，得到VK1半成品，供正相层析精制。

二、工序二：正相柱层析

1、物料和设备信息

1-1、物料配比

1-2设备信息

设备名称	规格
		搪玻璃浓缩釜	2000L
搪玻璃浓缩釜	3000L
		层析柱	20cm*200cm
匀浆罐	300L

2、操作过程

1)称取洗脱液

称取223.30Kg正己烷加入到流动相釜中备用；

2)装柱

称取计量的硅胶，用正己烷淹没，浸泡(加以搅拌)60分钟。然后将浸泡过的硅胶用洗脱液按湿法装柱操作，装入层析柱中；再在硅胶上层铺垫一层活性炭0.39kg(活性炭用正己烷浸泡后上柱，防止粉尘飞扬，浸泡所用正己烷从流动相釜中放出)，保持硅胶及活性炭被洗脱液淹没、备用(后续操作避日光及白炽灯光)。

2)装料

将称取的VK1半成品加入19.80倍质量的正己烷(VK1半成品3.76kg，正己烷74.46kg)，室温搅拌30分钟，稀释溶解均匀。

柱层析采用下行法层析：对已装填完毕的硅胶层析柱，打开底部料液出口，将柱中洗脱液放出至柱顶部液体和硅胶平，然后从柱上端泵入已稀释溶解的粗品料液，并将柱中洗脱液从下部放出，使料液逐渐进入柱中，适当加压，使上料时间大约在1小时左右。

3)洗脱

待料液全部进入硅胶柱中后(料液液面与活性炭层基本持平)，再从柱上部加入正己烷，从柱下部放出洗脱液，进行洗脱。整个洗脱过程，层析柱上部加入的洗脱液不能中断、不能使活性炭层露出液面，控制压力(约0.03MPa)，使流出速度大约在2～3Kg/min。

前洗脱无色溶液返回流动相釜继续使用，待洗脱出黄色料液，开始收集，收集时间约2～3小时；

将所收集的层析所得产品料液减压浓缩，真空控制在0.090～0.095MPa，控温50℃，蒸干洗脱液溶剂，至基本无冷凝液滴出。再采用高真空，控0.0980～0.1000MPa，控温70℃，抽拉4～6小试。至料液检测折光1.525～1.528，得VK1合格产品，放入铝罐待QC收件后入库。

Claims (6)

1.一种维生素K1的纯化工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：

步骤1，使用C18反相硅胶柱作为填料的DAC600制备色谱柱，甲醇和乙酸乙酯混合溶液为流动相，对合成得到的VK1粗品进行层析纯化；

步骤2，步骤1收获的经过反相硅胶柱层析纯化的VK1进一步用正相层析硅胶作为填料，正己烷为流动相，对VK1进行层析纯化。

2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，

其中，步骤1的层析条件如下：

流动相为：甲醇和乙酸乙酯，两者比例为200：85，检测波长：270nm，300nm，

流速：10L/min，上样量：5％，样品浓度：400mg/ml。

3.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，

步骤1的操作过程如下：

1)流动相配制

将甲醇1781kg和乙酸乙酯676kg加入反应釜并混合搅拌均匀。

2)样品配制

称取VK1粗品9.00kg，加入乙酸乙酯8.00kg搅拌溶清，将Vk1粗品的乙酸乙酯溶液过预柱过滤以除去机械杂质和活性炭，用剩余的2.22Kg乙酸乙酯冲洗，冲洗液合并到滤液中，搅拌下称量加入甲醇8.88kg，搅拌并保证溶液为澄清状态；一般甲醇用量会比乙酸乙酯少(7.20Kg左右)，否则会发生浑浊；若溶液发生浑浊，则向其中加入少量乙酸乙酯即可溶清(0.20Kg左右)；将配制好的样品溶液平均分成4份待用。

3)进针，冲柱，进针，洗脱；

4)洗脱液浓缩

将所收集的洗脱液减压浓缩，蒸出溶剂，加热从30℃逐渐升温至70℃，减压真空≥0.095MPa，抽蒸5～10小时，检测折光率1.520～1.528之间，出料，得到VK1精制品，供正相层析精制。

4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，

其中，步骤2的层析条件如下：

溶剂和洗脱液：正己烷

填料：正相层析硅胶+活性炭。

5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，

步骤2操作过程如下：

1)备柱

取硅胶，加入正己烷浸泡装入层析柱中；再在硅胶上层铺垫一层活性炭；

2)装料

VK1精制品加入正己烷溶解，打开层析柱底部料液出口，使料液进入柱中；

3)洗脱

加入正己烷洗脱液，进行洗脱。流速大约在2～3Kg/min；前洗脱无色溶液返回流动相釜继续使用，待洗脱出黄色料液，开始收集，收集时间约2～3小时；

4)浓缩

将所收集的层析液减压浓缩，得VK1纯品。

6.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：

步骤1，使用C18反相硅胶柱作为填料的DAC600制备色谱柱，甲醇和乙酸乙酯混合溶液为流动相，对合成得到的VK1粗品进行层析纯化；

步骤2，步骤1收获的经过反相硅胶柱层析纯化的VK1进一步用正相层析硅胶作为填料，正己烷为流动相，对VK1进行层析纯化；

其中，步骤1的层析条件如下：

流动相为：甲醇和乙酸乙酯，两者比例为200：85，检测波长：270nm，300nm，流速：10L/min，上样量：5％，样品浓度：400mg/ml；

步骤1的操作过程如下：

1)流动相配制

将甲醇1781kg和乙酸乙酯676kg加入反应釜并混合搅拌均匀；

2)样品配制

称取VK1粗品9.00kg，加入乙酸乙酯8.00kg搅拌溶清，将Vk1粗品的乙酸乙酯溶液过预柱过滤以除去机械杂质和活性炭，用剩余的2.22Kg乙酸乙酯冲洗，冲洗液合并到滤液中，搅拌下称量加入甲醇8.88kg，搅拌并保证溶液为澄清状态；一般甲醇7.20Kg，将配制好的样品溶液平均分成4份待用；

3)进针，冲柱，进针，洗脱；

4)洗脱液浓缩

将所收集的洗脱液减压浓缩，蒸出溶剂，加热从30℃逐渐升温至70℃，减压真空≥0.095MPa，抽蒸5～10小时，检测折光率1.520～1.528之间，出料，得到VK1精制品，供正相层析精制；

其中，步骤2的层析条件如下：

溶剂和洗脱液：正己烷

填料：正相层析硅胶+活性炭

步骤2操作过程如下：

1)备柱

取硅胶，加入正己烷浸泡装入层析柱中；再在硅胶上层铺垫一层活性炭；

2)装料

VK1精制品加入正己烷溶解，打开层析柱底部料液出口，使料液进入柱中；

3)洗脱

加入正己烷洗脱液，进行洗脱。流速大约在2～3Kg/min；前洗脱无色溶液返回流动相釜继续使用，待洗脱出黄色料液，开始收集，收集时间约2～3小时；

4)浓缩

将所收集的层析液减压浓缩，得VK1纯品。

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