CN113861261A - 山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用 - Google Patents

山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113861261A
CN113861261A CN202111289830.7A CN202111289830A CN113861261A CN 113861261 A CN113861261 A CN 113861261A CN 202111289830 A CN202111289830 A CN 202111289830A CN 113861261 A CN113861261 A CN 113861261A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extract
chromatographic column
ilicin
macroporous resin
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111289830.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113861261B (zh
Inventor
孙云
刘畅
祁明明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Haiyao Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Haiyao Medicine Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Haiyao Medicine Technology Co ltd filed Critical Jiangsu Haiyao Medicine Technology Co ltd
Priority to CN202111289830.7A priority Critical patent/CN113861261B/zh
Publication of CN113861261A publication Critical patent/CN113861261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113861261B publication Critical patent/CN113861261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
    • C07J63/008—Expansion of ring D by one atom, e.g. D homo steroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明的目的在于揭示一种山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用，提取主要成分明确的提取物并开发其具体制剂及应用，提取物包含冬青素A、海南冬青素E及式Ⅰ化学结构式所示的化合物A，与现有技术相比，本发明的有益效果是：提取物主要成为冬青素A、海南冬青素E和化合物A，主要成分含量在总提取物中占比超过80％，杂质含量低，提取物成分稳定，为提取物的批量生产就应用做好了准备；经研究，提取物可制备成多种形态的制剂并可以在治疗溃疡类疾病方面产生疗效。

Description

山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用
技术领域
本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用。
背景技术
山绿茶源于冬青科植物海南冬青(llex hain-anensis Merr.)的干燥叶，全年均可采收，主要分布于广西一带。作为广西少数民族民间中草药，山绿茶历史悠久，收载于《广西中药材标准》(1990年版)，由山绿茶制成的单方制剂山绿茶降压片被2010年《中华人民共和国药典》收录。山绿茶具有清热解毒、消肿止痛、活血通脉的功效。作为降压、降脂的常用中成药，具有疗效确切、毒副作用小等优点。我们前期研究表明：山绿茶除具有降压降脂的作用，还可用于癌症、肿瘤的预防及治疗。目前，山绿茶已开发为多种制剂，如山绿茶降压片、复方山绿茶胶囊、双山冲剂等。
口腔溃疡(又称口腔溃烂、口疮)可由多种因素诱发，包括遗传因素、饮食因素、生活因素、精神因素、免疫因素等。口腔溃疡发病率为5％～66％，各年龄段均可发生，且部分患者易反复发作。此外，口腔溃疡经常反复性发作会严重影响患者的日常生活和工作。
迄今，尚未见对山绿茶具有改善口腔溃疡的药理学活性报道。
国内外学者对山绿茶进行了研究，证实其化学成分具有很好的药理活性，从植物中分离和检测出的物质有三萜及其苷类、黄酮类、咖啡酰奎宁酸、半萜苷(酯)类等，如冬青皂苷A1、冬青素A、乌索酸、芦丁、圣草酚、槲皮素、绿原酸、3'，5'-O-二咖啡酰基奎宁酸等成分，其中以三萜类成分为主。2020年版《中华人民共和国药典》中山绿茶降压片仍以芦丁与绿原酸为指标性成分，另有研究检测山绿茶中芦丁、绿原酸、冬青素A等成分的含量；其中，芦丁与绿原酸在其它药材中也广泛存在，与之相比冬青素A为冬青属中几种近缘植物的特征性成分，也可能是主要有效成分之一。
山绿茶已开发出的制剂如山绿茶降压片，其制法系将山绿茶粉碎成粗粉、过筛，取适量细粉备用；剩余粗粉用70％乙醇为溶剂，浸渍后渗漉，收集渗漉液回收乙醇并浓缩至稠膏状，加入上述细粉及适量的淀粉、混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包糖衣或薄膜衣，即得。此制法可有效将山绿茶中大部分成分转移至制剂中，与原药材具有较高的一致性，但化学成分组成较为复杂，作用机制难以有效说明，应用范围难以扩大。再比如双山颗粒，是由山绿茶与山楂二味药材的水煎液，经醇沉工艺精制后，清膏加蔗糖粉，混匀，制成颗粒，干燥，所得。其化学成分主要为一些水溶性成分，如绿原酸等，可较好的还原山绿茶作为“茶”时被人体所摄入的化学成分，但同时会造成山绿茶中含量较高的三萜苷元类成分如冬青素A的损失。
综上所述，山绿茶仍存在应用范围较窄，开发程度较低的问题。现有制剂仍存在成分复杂、有效成分不明确、质量标准不合理等情况。
发明内容
本发明的目的在于揭示一种山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用，提取主要成分明确的提取物并开发其具体制剂及应用。
本发明的第一个目的在于开发一种山绿茶三萜皂苷元类提取物。
本发明的第二个目的在于开发一种山绿茶三萜皂苷元类提取工艺。
本发明的第三个目的在于开发一种提取物制剂。
本发明的第四个目的在于开发一种提取物应用。
为实现上述发明第一个目的，本发明提供了一种山绿茶三萜皂苷元类提取物，提取物包含如式Ⅰ化学结构式所示的化合物A：
Figure BDA0003334291770000031
为实现上述发明第一个目的，本发明还提供了一种山绿茶三萜皂苷元类提取物，提取物包含冬青素A、海南冬青素E及式Ⅰ化学结构式所示的化合物A，
Figure BDA0003334291770000032
优选地，在所述提取物中，冬青素A含量＞海南冬青素E含量＞化合物A含量；其中，冬青素A和海南冬青素E的含量之和在提取物中占比不小于70％；冬青素A、海南冬青素E和化合物A的含量之和在提取物中占比不小于80％。
为实现上述发明第二个目的，本发明提供了一种绿茶三萜皂苷元类提取工艺，所述提取工艺采用Ca(OH)2溶液或包含Ca(OH)2的混合碱液进行提取。
优选地，包括以下步骤：
取山绿茶干燥叶100重量份，第一次回流提取时，提取液为800-1200重量份的水、2-10重量份的碱，回流温度100℃，回流时间为0.5h-2h，过滤得第一滤液；
第二次回流提取时，提取液为600-1000重量份的水，回流温度100℃，回流时间为0.5h-1h，过滤的第二滤液；
混合第一滤液和第二滤液，静置2h-12h，冷却至60℃以下，上清液过滤得第三滤液。
优选地，还包括以下步骤：
第三滤液流经大孔树脂层析柱，树脂用量为50重量份-200重量份，流速为1倍～5倍树脂体积/h，待第三滤液完全流过大孔树脂层析柱后，第三滤液中的提取物被大孔树脂层析柱吸附，用去离子水洗脱大孔树脂层析柱，洗脱水体积为树脂体积1-5倍；
以质量分数为0.1％-1％的NaOH溶液洗脱大孔树脂层析柱以去除杂质，NaOH洗脱溶液体积为大孔树脂层析柱的1倍～5倍，NaOH溶液流速为0.5倍～3倍树脂体积/h，再以3倍～8倍树脂体积的去离子洗脱大孔树脂层析柱以除去残留NaOH溶液；
以含有质量分数为0.05％的NaOH和质量分数为20％的乙醇的水溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为大孔·树脂层析柱的4倍～8倍，流速为0.5倍～3倍树脂体积/h；
用质量分数为50％-60％乙醇溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为大孔树脂层析柱的4倍～8倍，流速为0.5倍～3倍树脂体积/h，得洗脱液；
洗脱液经截留相对分子量为400的纳滤膜截留并浓缩至原体积1/4，维持跨膜压力为1.0MPa，截留液浓缩后得流浸膏，流浸膏于70-105℃下烘2h～12h，即得三萜皂苷元类成分的提取物；
所述大孔树脂层析柱为AB-8、HPD-400、D101中的一种。
优选地，所述碱为Ca(OH)2或混合碱，所述混合碱中Ca(OH)2和NaOH的重量比为3:1。
为实现上述发明第三个目的，本发明提供了一种提取物制剂，采用第一发明创造所述的山绿茶三萜皂苷元类提取物以及药学上可接受的载体，制备成漱口水、牙膏、片剂、胶囊剂、口服液体制剂、软膏剂或透皮贴剂。
为实现上述发明第四个目的，本发明提供了一种提取物应用，第一发明创造所述的山绿茶三萜皂苷元类提取物用于治疗溃疡。
优选地，所述溃疡包括口腔溃疡、胃溃疡及结肠溃疡。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)山绿茶药材经混合碱液提取，一方面，避开了乙醇提取脂溶性杂质较多且难以分离的问题，另一方面，在用乙醇提取时，含一个或两个羧基的三萜皂苷元类成分均能够高效溶解，两类成分难以分离，采用混合碱提取，仅提取含两个羧基的三萜皂苷元类提取物，直接克服了此技术难题。
(2)Ca2+可高效除去提取物中大部分色素、鞣质、粘液质杂质及黄酮、绿原酸等酚性物质，可有效解决普通碱水提取杂质较多的问题，促进苷类成分水解，富集目标成分得到两个羧基三萜苷元的总提取物。
(3)采用膜分离技术，超滤与纳滤结合，可绿色高效地除去大分子及小分子杂质，进一步提高产物纯度。
(4)采用含钙碱液提取、大孔树脂吸附、膜分离的技术组合，得到的提取物主要为含有两个羧基的三萜皂苷元类成分，成分结构类别单一，三个成分含量高于80％，成分组成稳定，同时，此提取工艺操作简单、成本低、便于生产，提取物的成分结构明确，纯度较高，疗效稳定。
(5)经化合物结构鉴定，提取物主要成为冬青素A、海南冬青素E和化合物A，主要成分含量在总提取物中占比超过80％，杂质含量低，提取物成分稳定，为提取物的批量生产就应用做好了准备。
(6)经研究，提取物可制备成多种形态的制剂并可以在治疗溃疡类疾病方面产生疗效。
附图说明
图1山绿茶提取物液相色谱图。
图2冬青素A氢谱图。
图3冬青素A碳谱图。
图4海南冬青素E氢谱图。
图5海南冬青素E碳谱图。
图6化合物A氢谱图。
图7化合物A碳谱图。
图8化合物A COSY图。
图9化合物A HMBC图。
图10化合物A NOESY图。
图11化合物A-(R)-MTPA-酯氟谱图。
图12化合物A-(S)-MTPA-酯氟谱图。
图13冬青素A-(R)-MTPA-酯氟谱图。
图14冬青素A-(S)-MTPA-酯氟谱图。
图15化合物A-(R)-MTPA-酯碳谱图。
图16化合物A-(S)-MTPA-酯碳谱图。
图17冬青素A-(R)-MTPA-酯碳谱图。
图18冬青素A-(S)-MTPA-酯碳谱图。
图19(R)-MTPA酯及(S)-MTPA-酯构型关系模示图。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
以下通过多个实施例对本发明的具体实现过程予以阐述。
实施例1
实施例1揭示一种山绿茶三萜皂苷元类提取物工艺及提取物，具体提取步骤如下：
取山绿茶干燥叶4kg，第一次回流提取时，提取液为48kg的水、氢氧化钙240g、NaOH80g，回流温度100℃，回流时间为1h，过滤得第一滤液；
第二次回流提取时，提取液为40kg的水，回流温度100℃，回流时间为1h，过滤的第二滤液；
混合第一滤液和第二滤液，静置6h，冷却至50℃，上清液过滤得第三滤液；
AB-8大孔树脂通过水洗去除气泡后装入层析柱，第三滤液流经大孔树脂层析柱，树脂用量为5kg，流速为9L/h，待第三滤液完全流过大孔树脂层析柱后，第三滤液中的提取物被大孔树脂层析柱吸附，用去离子水洗脱大孔树脂层析柱，洗脱水体积为10L，洗去大部分残留药液及无机物；
以质量分数为0.5％的NaOH溶液洗脱大孔树脂层析柱以去除杂质，NaOH洗脱溶液体积为10L，NaOH溶液流速为5L/h，再以20L去离子洗脱大孔树脂层析柱以除去残留NaOH溶液；
以含有质量分数为0.05％的NaOH和质量分数为20％的乙醇的水溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为20L，流速为5L/h；
用质量分数为50％乙醇溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为20L，流速为10L/h，得洗脱液；
洗脱液经截留相对分子量为400的纳滤膜截留并浓缩至原体积1/4，维持跨膜压力为1.0MPa，截留液浓缩后得流浸膏，流浸膏于105℃下烘5h，即得三萜皂苷元类成分的提取物。
上述工艺得到的提取物总量为90g，用浓度为95％的乙醇溶解部分提取物，完成供试品溶液的制备，提取物中主要成分的含量测定，采用“高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)”。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相柱的尺寸为250mm*10mm；以甲醇和0.5％的甲酸(20:80)为流动相；流速4ml/min，检测波长210nm。
通过高效液相色谱法分离出冬青素A(峰3)、海南冬青素E(峰2)及化合物A(峰1)，具体参见图1，经冷动干燥后称重，分别得到冬青素A30mg、海南冬青素E15mg及化合物A10mg，三个化合物在提取物中质量占比为82％，化合物A在提取物中质量占比为9％。
实施例2
实施例2揭示一种山绿茶三萜皂苷元类提取物工艺及提取物，具体提取步骤如下：
取山绿茶干燥叶4kg，第一次回流提取时，提取液为48kg的水、氢氧化钙320g，回流温度100℃，回流时间为1.5h，过滤得第一滤液；
第二次回流提取时，提取液为44kg的水，回流温度100℃，回流时间为1h，过滤的第二滤液；
混合第一滤液和第二滤液，静置10h，冷却至40℃，上清液过滤得第三滤液；
AB-8大孔树脂通过水洗去除气泡后装入层析柱，第三滤液流经大孔树脂层析柱，树脂用量为5kg，流速为12L/h，待第三滤液完全流过大孔树脂层析柱后，第三滤液中的提取物被大孔树脂层析柱吸附，用去离子水洗脱大孔树脂层析柱，洗脱水体积为12L，洗去大部分残留药液及无机物；
以质量分数为0.5％的NaOH溶液洗脱大孔树脂层析柱以去除杂质，NaOH洗脱溶液体积为4L，NaOH溶液流速为5L/h，再以10L去离子洗脱大孔树脂层析柱以除去残留NaOH溶液；
以含有质量分数为0.05％的NaOH和质量分数为20％的乙醇的水溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为15L，流速为5L/h；
用质量分数为60％乙醇溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为25L，流速为10L/h，得洗脱液；
洗脱液经截留相对分子量为400的纳滤膜截留并浓缩至原体积1/4，维持跨膜压力为1.0MPa，截留液浓缩后得流浸膏，流浸膏于80℃下烘8h，即得三萜皂苷元类成分的提取物。
上述工艺得到的提取物总量为65g，用浓度为95％的乙醇溶解部分提取物，完成供试品溶液的制备，提取物中主要成分的含量测定，采用“高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)”。
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，固定相柱的尺寸为250mm*10mm；以甲醇和0.5％的甲酸(20:80)为流动相；流速4ml/min，检测波长210nm。
通过高效液相色谱法分离出冬青素A(峰3)、海南冬青素E(峰2)及化合物A(峰1)，具体参见图1，经冷动干燥后称重，分别得到冬青素A30mg、海南冬青素E15mg及化合物A10mg，三个化合物在提取物中质量占比为88％化合物A在提取物中质量占比为8％。
实施例3
实施例3揭示一种山绿茶三萜皂苷元类提取物主要成分的鉴定过程及结论。
(1)冬青素A的鉴定
实施例1或2中得到白色无定型粉末，经高分辨质谱检测，给出本化合物的准分子离子峰[M-H]-为m/z 501.2731，确定其分子式为C30H46O6。
核磁共振氢谱具体如下，1H NMR(C5D5N)：1.13，1.16，1.45，1.71，1.75(each 3H，s)，1.11(3H，d，J＝6.6Hz)，3.05(1H，s)，3.12(1H，td，J＝5Hz，10Hz)，3.35(1H，dd)，5.61(1H，s)。
碳13的核磁共振谱具体如下，13C NMR(C5D5N)C1→30：39.45，28.59，78.11，49.04，56.71，20.75，33.71，40.02，46.96，37.67，24.30，127.88，139.71，42.02，29.09，26.22，48.12，54.49，72.44，42.16，26.71，38.24，23.99，180.61，13.65，16.92，24.49，180.41，26.91，16.56。
其1H-NMR、13C-NMR谱与文献报道基本一致，具体参见图2和图3，即可判断此化合物为冬青素A。
(2)海南冬青素E的鉴定
实施例1或2中得到白色无定型粉末，经高分辨质谱检测，给出本化合物的准分子离子峰[M-H]-为m/z 501.2599，确定其分子式为C30H46O6。
核磁共振氢谱具体如下，1H NMR(C5D5N)：1.10(3H，s)，1.10(3H，s)，1.12(3H，s)，1.18(3H，s)，1.67(3H，s)，1.71(3H，s)，2.83(1H，td，J＝5Hz，10Hz)，3.35(1H，dd)，3.62(1H，s)，5.57(1H，s)。
碳13的核磁共振谱具体如下，13C NMR(C5D5N)：C1→30：39.15，28.88，78.07，49.06，56.72，20.74，33.39，39.64，47.59，37.83，24.07，122.83，144.59，42.02，28.2，28.99，45.87，44.65，80.99，35.51，28.94，33.39，24.53，180.73，13.46，17.10，24.61，180.66，28.61，24.45。
其1H-NMR、13C-NMR谱与文献报道基本一致，具体参见图4和图5，即可判断此化合物为海南冬青素E。
(3)化合物A的鉴定
实施例1或2中得到的白色无定型粉末，经高分辨质谱检测，给出本化合物的准分子离子峰[M-H]-为m/z 499.2319，确定其分子式为C30H44O6。
核磁共振氢谱具体如下，1H NMR(C5D5N)：1.05(1H，m)，1.72(1H，m)，1.94(1H，m)、2.45(1H，m)，3.35(1H，dd，J＝10，5Hz)，1.09(1H，m)，2.69(1H，m)、2.22(1H，m)，1.63(1H，m)、1.12(1H，m)，1.90(1H，m)，2.07(2H，m)，5.62(1H，br.s)，1.35(1H，br.d)、2.33(1H，m)，2.20(1H，m)、3.24(1H，m)，3.23(1H，s)，2.23(1H，m)、3.14(1H，td，J＝5Hz，10Hz)，2.14(1H，m)、2.35(1H，m)，1.70(3H，s)，1.12(3H，s)，1.13(3H，s)，1.79(3H，s)，1.66(3H，s)，4.79，4.99(each1H，s)
碳13的核磁共振谱具体如下，13C NMR(C5D5N)：39.50，28.95，78.08，49.05，56.73，20.74，33.89，39.83，46.95，37.68，23.99，128.11，139.36，42.11，28.99，26.62，48.15，55.17，72.73，156.35，28.68，39.22，24.54，180.87，13.74，17.05，23.71，179.92，27.36，105.10。
参见图6和图7，在确定了化合物A的1H-NMR、13C-NMR谱图的基础上，进一步通过核磁共振图谱检测，化合物A的H-H COSY、NOESY和HMBC谱图分别参见图8、图9和图10，具体信息如表1。
表1H-H COSY、HMBC和NOESY图谱的相关信息
Figure BDA0003334291770000111
Figure BDA0003334291770000121
化合物A与柿酸A的结构区别为3-OH的手性差异，二者A环碳谱数据差异较为明显，具体参见化合物A与柿酸A的碳谱数据对比表表2。
表2化合物A与柿酸A的碳谱数据对比表
Figure BDA0003334291770000122
化合物A的绝对构型的确定：
Mosher法是确定手性醇类化合物绝对构型的常用方法之一，包括利用分子中手性中心的1H-NMR与13C-NMR的化学位移值及CF3的19F-NMR谱来确定其构型。
具体测定方法如下：
①MTPA-酯制备
将化合物A(约10mg)溶于1mLCH2Cl2中，加入0.1ml吡啶、4-二甲氨基吡啶(约10mg)和三乙胺(约20ul)，振摇，搅拌，得无色透明液体，再加入(R)-MTPA-Cl(约25ul)，溶液呈淡黄色。HPLC监测，硅胶柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(体积比2:1)洗脱。旋转蒸发溶剂，得到白色固体。将所得的(R)-MTPA酯溶于C5D5N中，进行19F-NMR、13C-NMR测试。同法制备(S)-MTPA酯样品。
按以上操作，同法制备冬青素A的(R)-MTPA酯及(S)-MTPA酯样品，进行19F-NMR、13C-NMR测试。
②NMR测试结果
该化合物A(R)-MTPA酯及(S)-MTPA酯19F-NMR谱中19F的化学位移分别为-72.05、-71.31，其ΔδSR＝0.74＞0；冬青素A的(R)-MTPA酯及(S)-MTPA酯19F-NMR谱中19F的化学位移分别为-72.04、-71.30，其ΔδSR＝0.74＞0，二者位移一致，说明二者的C3羟基手性一致(参见图11～图14)。
(R)-MTPA酯及(S)-MTPA-酯构型关系模示图见附图19，在(R)-MTPA酯中，苯环与羧基、甲基处于同侧，在(S)-MTPA酯中，苯环与羧基、甲基处于异侧，因此，受到空间或电子云的相互作用的影响，(S)-MTPA酯中的三氟甲基与羰基更接近于共平面位置，因此其三氟甲基受到的其屏蔽作用要强于(R)-MTPA酯中的三氟甲基，所以(S)-MTPA酯中CF3的19F-NMR信号处于相对低场，即ΔδSR＞0(ΔδSR＝δS-δR)，由此即可推断出该化合物的3位绝对构型为S-构型，则3-OH为β取代。
该化合物A(R)-MTPA酯及(S)-MTPA酯13C-NMR谱中C-3的化学位移分别为83.06、83.39，其ΔδSR＝0.33；冬青素A的(R)-MTPA酯及(S)-MTPA酯13C-NMR谱中C-3的化学位移分别为83.07、83.41，其ΔδSR＝0.34(参见图15～图18)，二者位移基本一致，验证此化合物A与冬青素A的C3绝对构型一致，3位绝对构型为S-构型，即3-OH为β取代。
综上，可得出化合物A的结构式为式Ⅰ所示，命名为3-epi-diospyric acid A，化学物A学名为{3β,19α-二羟基乌索-12,20(30)-二烯-24,28-二羧酸，3β,19α-Dihydroxyursa-12,20(30)-diene-24,28-dioic acid}。
Figure BDA0003334291770000141
实施例4
实施例4揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成复方片剂，具体配比见表3，具体配比工艺为：将山绿茶提取物和环糊精放入研钵中混合均匀，依次加入羧甲基淀粉钠，可压性淀粉混合均匀，用5％PVP的无水乙醇溶液做黏合剂制粒，40℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁混匀，压片即可。
表3山绿茶提取物复方片剂配方
山绿茶提取物 0.5g
可压性淀粉 120.0g
环糊精 10.0g
羧甲基淀粉钠 10.0g
硬脂酸镁 0.6g
5％PVP的无水乙醇溶液 适量
实施例5
实施例5揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成复方片剂，具体配比见表4，具体配比工艺为：将山绿茶提取物和环糊精放入研钵中混合均匀，依次加入羧甲基淀粉钠、微晶纤维素、微粉硅胶混合均匀，粉末压片即可。
表4山绿茶提取物复方片剂配方
山绿茶提取物 50g
微晶纤维素 150g
环糊精 10g
羧甲基淀粉钠 15g
微粉硅胶 1g
实施例6
实施例6揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成胶囊剂，具体配比见表5，具体配比工艺为：将山绿茶提取物和环糊精放入研钵中混合均匀，依次加入微晶纤维素、微粉硅胶混合均匀，装填胶囊壳即可。
表5山绿茶提取物胶囊剂配方
山绿茶提取物 250g
微晶纤维素 150g
环糊精 10g
微粉硅胶 1g
实施例7
实施例7揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成缓释片剂，具体配比见表6，具体配比工艺为：称取处方量的山绿茶提取物、卡波姆、羟丙基纤维素、环糊精混合均匀，另取适量8％淀粉浆，加入混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，晒出干粉中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，最后再与干颗粒混合均匀，压片即可。
表6山绿茶提取物缓释片剂配方
山绿茶提取物 600g
环糊精 10g
卡波姆 180g
羟丙基纤维素 15g
硬脂酸镁 1.5g
8％淀粉浆 适量
实施例8
实施例8揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成颗粒剂，具体配比见表7，具体配比工艺为：先将山绿茶提取物与环糊精混合均匀，后加入交联羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠，过16目筛混合，然后与甜橙香精、阿斯巴甜混合均匀。混合物用5％聚维酮乙醇液制粒、干燥、整粒、分装即得。
表7山绿茶提取物颗粒剂配方
山绿茶提取物 180g
交联羧甲基纤维素钠 10g
甲基纤维素 10g
环糊精 15g
微晶纤维素 200g
阿斯巴甜 1.5g
十二烷基硫酸钠 50g
5％聚维酮乙醇液 适量
甜橙香精 5g
实施例9
实施例9揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成牙膏，具体配比见表8，具体配比工艺为：取甘油，依次加入山绿茶提取物、去离子水、甲基纤维素、焦磷酸四钠。后高速搅拌成胶体溶液。随后加入配置山梨醇水溶液及余下甘油，继续搅拌均匀直至成透明胶体溶液。后加入碳酸钙、尼泊金混合脂、K12、色素、香精后至真空条件下高速搅拌，直至膏体无颗粒存在，且均匀细腻。
表8山绿茶提取物牙膏配方
山绿茶提取物 1％－10％
碳酸钙 20％－30％
甘油 6％－8％
山梨醇 3％－5.5％
甲基纤维素 0.1％－0.3％
黄原胶 0.1％－0.3％
尼泊金混合脂 0.2％－0.6％
焦磷酸四钠 0.05％－0.15％
K12 0.6％－1.0％
色素 适量
香精 适量
无水乙醇 适量
去离子水 适量
实施例10
实施例10揭示一种提取物制剂，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物制作成漱口水，具体配比见表9，具体配比工艺为：将木糖醇、香精加入水中溶解，后加入山梨醇搅拌均匀；加入山绿茶提取物及氟化钾继续搅拌，混合均匀后过滤膜即得。
表9山绿茶提取物漱口水配方
山绿茶提取物 0.5％－3％
木糖醇 0.1％－0.3％
香精 0.15％－0.3％
氟化钾 0.6％－0.8％
山梨醇 3％－5％
去离子水 余量
实施例11
实施例11揭示一种提取物应用，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物，取豚鼠40只，雌雄各半，随机分为对照组、欧柏宁组(欧柏宁凝胶剂是一种医用高分子口腔溃疡保护膜，主要用于治疗口腔溃疡)、山绿茶高剂量(4g/kg)组，及山绿茶低剂量组(1g/kg)组，每组10只。豚鼠乙醚麻醉后，用棉签蘸取90％苯酚溶液灼烧豚鼠面颊60秒，24小时后观察豚鼠口腔黏膜出现直径5mm的溃疡，表明造模成功。采用棉签将相应药物涂抹至豚鼠口腔溃疡处，每隔24小时观察溃疡改善情况，连续给药5天后评价各组溃疡改善效果。
效果评价采用以下标准。溃疡等级Ⅰ：溃疡存在，溃疡处无明显假膜；溃疡等级Ⅱ:溃疡处表面有一层黄白色薄的假膜；溃疡等级Ⅲ:溃疡表面有较厚的假膜，溃疡周围有炎性水肿情况；溃疡等级Ⅳ度:溃疡表面假膜厚，溃疡周围炎性水肿严重。
结果显示，给药五天后，对照组口腔溃疡等级II、Ⅲ的豚鼠数量分别为4只及6只；山绿茶低剂量给药五天后，口腔溃疡等级II、Ⅲ的豚鼠数量分别为8只及2只；山绿茶高剂量给药五天后，口腔溃疡等级I、II、III豚鼠数量分别为2只，7只，和1只，效果具体参见表10。
所获得的结果表明山绿茶提取物含片对改善豚鼠口腔溃疡具有意想不到的的作用。
表10提取物在治疗豚鼠口腔溃疡的应用效果(n＝10)
Figure BDA0003334291770000191
实施例12
实施例12揭示一种提取物应用，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物，提取物直接压制成含片，每片山绿茶提取物含片质量为80mg。患者招募：招募口腔黏膜及舌头表面浅表性溃疡患者102例，招募标准为：口腔黏膜、舌面或舌头两侧面等位置出现破损溃烂，大小约为米粒至黄豆大小(面积约为5-8mm)患者，年龄在18～65周岁，性别不限。
入组患者观察后给予连续山绿茶提取物含片含服，每日3次，每次间隔8小时，含服1～2日溃疡即愈合。给药后分别于12、24、48小时后评估溃疡改善/恢复情况。结果显示，102例患者在服用绿茶提取物含片1至2日后溃疡均消失，其中含服1天后口腔溃疡愈合人数为90例；含服2天后愈合人数为101例。有效率分别达88％与99％，效果具体参见表11。
现有数据表明山绿茶提取物含片对口腔溃疡患者具有意想不到的效果。
表11提取物在治疗患者口腔溃疡的应用效果
Figure BDA0003334291770000192
Figure BDA0003334291770000201
实施例13
实施例13揭示一种提取物应用，具体地，采用实施例1或2工艺所提取的提取物，提取物直接压片，每片山绿茶提取物含片质量为80mg。
患者给药：消化道肿瘤患者12例，于2020年12月30日至2021年3月15日招募。患者在使用山绿茶提取物含片前评估口腔溃疡等级，按以下标准分级：等级一：口腔出现多处小溃疡或白斑，范围<25％；等级二：口腔出现融合性大溃疡或白斑，范围界于25％～50％；等级三：出血性溃疡范围＞50％。患者连续服用山绿茶提取物含片9日，每日3次，每次间隔8小时。给药后的第3，5，7，9日评估溃疡等级，于第9日计算有效率(即在给药第9日溃疡等级较给药第3日有所改善)。
具体效果参见表12，山绿茶提取物含片给药九日后，显著改善11例消化道癌症患者口腔溃疡等级，其有效率为91.6％。
所获得的结果表明山绿茶提取物含片具有意想不到的改善口腔溃疡的作用。
表12提取物在治疗消化道癌患者口腔溃疡的临床应用效果
Figure BDA0003334291770000202
Figure BDA0003334291770000211

Claims (10)

1.山绿茶三萜皂苷元类提取物，其特征在于，提取物包含如式Ⅰ化学结构式所示的化合物A：
Figure FDA0003334291760000011
2.山绿茶三萜皂苷元类提取物，其特征在于，提取物包含冬青素A、海南冬青素E及式Ⅰ化学结构式所示的化合物A，
Figure FDA0003334291760000012
3.如权利要求2所述的绿茶三萜皂苷元类提取物，其特征在于，在所述提取物中，冬青素A含量＞海南冬青素E含量＞化合物A含量；其中，冬青素A和海南冬青素E的含量之和在提取物中占比不小于70％；冬青素A、海南冬青素E和化合物A的含量之和在提取物中占比不小于80％。
4.绿茶三萜皂苷元类提取工艺，其特征在于，所述提取工艺采用Ca(OH)2溶液或包含Ca(OH)2的混合碱液进行提取。
5.如权利要求4所述的绿茶三萜皂苷元类提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
取山绿茶干燥叶100重量份，第一次回流提取时，提取液为800-1200重量份的水、2-10重量份的碱，回流温度100℃，回流时间为0.5h-2h，过滤得第一滤液；
第二次回流提取时，提取液为600-1000重量份的水，回流温度100℃，回流时间为0.5h-1h，过滤的第二滤液；
混合第一滤液和第二滤液，静置2h-12h，冷却至60℃以下，上清液过滤得第三滤液。
6.如权利要求5所述的绿茶三萜皂苷元类提取工艺，其特征在于，还包括以下步骤：
第三滤液流经大孔树脂层析柱，树脂用量为50重量份-200重量份，流速为1倍～5倍树脂体积/h，待第三滤液完全流过大孔树脂层析柱后，第三滤液中的提取物被大孔树脂层析柱吸附，用去离子水洗脱大孔树脂层析柱，洗脱水体积为树脂体积1-5倍；
以质量分数为0.1％-1％的NaOH溶液洗脱大孔树脂层析柱以去除杂质，NaOH洗脱溶液体积为大孔树脂层析柱的1倍～5倍，NaOH溶液流速为0.5倍～3倍树脂体积/h，再以3倍～8倍树脂体积的去离子洗脱大孔树脂层析柱以除去残留NaOH溶液；
以含有质量分数为0.05％的NaOH和质量分数为20％的乙醇的水溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为大孔树脂层析柱的4倍～8倍，流速为0.5倍～3倍树脂体积/h；
用质量分数为50％-60％乙醇溶液洗脱大孔树脂层析柱，洗脱液体积为大孔树脂层析柱的4倍～8倍，流速为0.5倍～3倍树脂体积/h，得洗脱液；
洗脱液经截留相对分子量为400的纳滤膜截留并浓缩至原体积1/4，维持跨膜压力为1.0MPa，截留液浓缩后得流浸膏，流浸膏于70-105℃下烘2h～12h，即得三萜皂苷元类成分的提取物；
所述大孔树脂层析柱为AB-8、HPD-400、D101中的一种。
7.如权利要求5所述的绿茶三萜皂苷元类提取工艺，其特征在于，所述碱为Ca(OH)2或混合碱，所述混合碱中Ca(OH)2和NaOH的重量比为3:1。
8.提取物制剂，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述的山绿茶三萜皂苷元类提取物以及药学上可接受的载体，制备成漱口水、牙膏、片剂、胶囊剂、口服液体制剂、软膏剂或透皮贴剂。
9.提取物应用，其特征在于，权利要求1-3任一所述的山绿茶三萜皂苷元类提取物用于治疗溃疡。
10.如权利要求9所述的提取物应用，其特征在于，所述溃疡包括口腔溃疡、胃溃疡及结肠溃疡。
CN202111289830.7A 2021-11-02 2021-11-02 山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用 Active CN113861261B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111289830.7A CN113861261B (zh) 2021-11-02 2021-11-02 山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111289830.7A CN113861261B (zh) 2021-11-02 2021-11-02 山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113861261A true CN113861261A (zh) 2021-12-31
CN113861261B CN113861261B (zh) 2022-08-26

Family

ID=78986626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111289830.7A Active CN113861261B (zh) 2021-11-02 2021-11-02 山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113861261B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101181318A (zh) * 2007-11-20 2008-05-21 广西万寿堂药业有限公司 一种降血压、降血脂的山绿茶提取物及其制备方法
CN103110673A (zh) * 2013-01-25 2013-05-22 江苏省中国科学院植物研究所 一种抗菌毛冬青三萜总皂苷及其应用
CN103494846A (zh) * 2013-09-23 2014-01-08 扬州大学 海南冬青总三萜提取物及其制备方法与用途
CN109053851A (zh) * 2018-08-28 2018-12-21 江苏海钥医药科技有限公司 一种含冬青素a的提取物及其提取方法
CN109400665A (zh) * 2018-11-19 2019-03-01 广州中医药大学(广州中医药研究院) 从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101181318A (zh) * 2007-11-20 2008-05-21 广西万寿堂药业有限公司 一种降血压、降血脂的山绿茶提取物及其制备方法
CN103110673A (zh) * 2013-01-25 2013-05-22 江苏省中国科学院植物研究所 一种抗菌毛冬青三萜总皂苷及其应用
CN103494846A (zh) * 2013-09-23 2014-01-08 扬州大学 海南冬青总三萜提取物及其制备方法与用途
CN109053851A (zh) * 2018-08-28 2018-12-21 江苏海钥医药科技有限公司 一种含冬青素a的提取物及其提取方法
CN109400665A (zh) * 2018-11-19 2019-03-01 广州中医药大学(广州中医药研究院) 从毛冬青中制备四种三萜类化合物对照品的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI-PING LIN ET AL.: "Biomarkers for Ilex pubescens under anti-platelet activityoriented isolation", 《BIOCHEMICAL SYSTEMATICS AND ECOLOGY》 *
周思祥: "山绿茶的化学成分和生物活性研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》 *
周渊等: "毛冬青叶的化学成分研究", 《中草药》 *
程齐来等: "山绿茶化学成分的研究", 《光谱实验室》 *
魏香兰等: "HPLC法测定山绿茶药材及其制剂中冬青素A 的含量", 《西北药学杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113861261B (zh) 2022-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2520305B1 (en) Pharmaceutical composition including sunflower extract, preparative method and use thereof
WO2015081703A1 (zh) 一种含有广金钱草总黄酮的固体分散体及其制备方法和用途
CN101766694A (zh) 肉苁蓉总苷提取工艺及其制剂
WO2017133465A1 (zh) 一种黄芩苷镁化合物及其制备方法与它的用途
CN106963853A (zh) 一种川射干总黄酮苷元提取物及其制备方法和用途
CN102134268B (zh) 竹节参皂苷Ⅳa制备方法以及在制备保肝降酶药物中的应用
WO2008145064A1 (fr) Procédé d&#39;obtention d&#39;un extrait contenant du séquoyitol à partir d&#39;une espèce du genre trifolium, de soja et de ginkgo biloba, et utilisation de celui-ci
CN101585825A (zh) 一种穗花杉双黄酮的制备方法
CN101574410B (zh) 一种牡丹叶有效组分及其制备方法和用途
CN102875615B (zh) 大麻药苷a和大麻药总皂苷的提取方法及其应用
CN113861261B (zh) 山绿茶三萜皂苷元类提取物、提取工艺、制剂及应用
WO2004039759A1 (fr) Compose naturel servant dans le traitement de diabetes, sa preparation et son utilisation
CN100429196C (zh) 大黄素、芦荟大黄素提取方法及其应用
CN101849950A (zh) 救必应酸在制备调血脂的药物中的应用
CN101564405A (zh) 续断总苷元及单一成分常春藤皂苷元在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用
CN108314620B (zh) 异序乌桕素i和j及其药物组合物和其应用
CN112294883B (zh) 一种正胃片药物制剂及其制备方法
CN112807337B (zh) 一种坎巴嘎布提取物及其制备方法和应用
CN101744881B (zh) 包衣材料和致孔剂的混合物在制备中药组合物方面的应用
CN101269123A (zh) 消渴降糖胶囊二次开发的新工艺
CN100546602C (zh) 抗肿瘤复方虎杖根、藤梨根、水杨梅根制剂及其制备方法和应用
CN101214256A (zh) 丁香苦苷片剂及其制备工艺
CN112500444B (zh) 一种化合物及其制备方法和应用
CN107245088A (zh) 新的抗炎松香烷型二萜糖苷tripterycosideA
CN102688291B (zh) 一种半枝莲总黄酮组合物及由其制备的口服制剂和制法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant