CN108558864B - 一种瑞喹莫德的酰化衍生物及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种瑞喹莫德的酰化衍生物及其制备方法与应用，所述瑞喹莫德的酰化衍生物结构通式如下，其中，R₁选自苯甲酰基、乙酰基、甲酰基、苯乙酰基或氢中的一个；R₂选自苯甲酰基、甲酰基、氢或乙酰基中的一个。本发明提供的瑞喹莫德酰化衍生物对口腔癌细胞、黑色素瘤细胞的具有良好的活性应用，具有良好的临床应用价值。在应用于治疗口腔癌、黑色素瘤中具有显著效果。

Description

一种瑞喹莫德的酰化衍生物及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及化学物及化学合成领域，具体涉及一种用于抗口腔癌的瑞喹莫德的酰化衍生物及其制备方法。

背景技术

口腔癌是一种严重的、发病率不断增长的全球性恶性肿瘤疾病。由于口腔癌高患病率和发病率成为重大公共卫生问题，口腔癌为世界第六大常见肿瘤，每年口腔癌的新发病例为26.3万例，死亡人数近13万。西方国家为口腔癌发病高发区域，而且口腔癌疾病感染率正逐渐上升和备受关注。中国为人口大国，人数较多，针对口腔癌防治和治疗工作及有效的药物开发至关重要。目前,临床上针对口腔癌的治疗方法主要有手术治疗、放射疗法、化疗疗法化及不同方法的联合治疗。尽管近年来口腔癌的临床诊断及治疗都有了很大的进步,但患者的五年生存率依旧比较低。黑色素瘤是一种高度恶性的肿瘤，皮肤多见，早期极易发生转移，死亡率高，预后差，治疗效果不佳。1/3病例术后出现复发或远处转移，转移性黑素瘤进展快，对放、化疗不敏感，预后差，对人类健康构成极大威胁。关于黑素瘤的治疗,除了手术治巧、化学药物治疗、放射治疗外，生物免疫治疗已成为目前研究热点。

Resiquimod，又名瑞喹莫德，是与Imiquimod(咪喹莫特)结构相关的咪唑并喹啉家族的一员，是一种免疫反应调节剂，起Toll样受体7和8激动剂的作用。Imiquimod被FDA批准用于治疗许多皮肤病，然而，由于该药物仅通过Toll样受体7(TLR7)信号传导，与Resiquimod明显不同。与Imiquimod相比，Resiquimod是更有效的IFN-α，TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8和IL-12的诱导剂。虽然Resiquimod在T细胞活化方面已经显示比咪喹莫特强10-100倍，但尚未被FDA批准临床使用。

已有研究显示，Resiquimod促进外源性抗原的交叉呈递，可在动物模型中有效诱导CD8+T细胞特异性抗原应答。通过踢体内实验证明，Resiquimod具有激活树突细胞的能力，包括诱导免疫细胞的局部活化，刺激促炎细胞因子的产生，并增强树突细胞的抗原呈递，从而有效的激活细胞应答。在淋巴癌模型中，Resiquimod经全身扩散性给药具有持久的抗肿瘤免疫反应。目前，Resiquimod已用于临床试验，治疗光化性角化病，皮肤T细胞淋巴瘤和单状疱疹病毒，结果好坏参半。Resiquimod的已有技术，可作为疫苗佐剂来治疗各种疾病，包括治疗结果不确定的转移性黑素瘤。Resiquimod已被用作治疗黑素瘤的NY-10ESO-1蛋白疫苗的疫苗佐剂，而抗口腔癌的作用尚未报道。

发明内容

基于上述背景技术，本发明提供一种用于抗口腔癌的瑞喹莫德(Resiquimod)的酰化衍生物，其特征在于，结构通式如下：

其中，R₁选自苯甲酰基、乙酰基、甲酰基、苯乙酰基或氢中的一种；R₂选自苯甲酰基、甲酰基、氢或乙酰基中的一种。

本发明进一步提出的，所述瑞喹莫德的酰化衍生物中R₁为苯甲酰基，R₂为苯甲酰基。

结构式为：

上述瑞喹莫德的酰化衍生物优选采用如下制备方法制得：

所述制备方法，包括以下步骤：

1)在-3～2℃的温度下，将瑞喹莫德溶于有机溶剂中，向其分别加入三乙胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)后，再缓慢滴加苯甲酰氯溶液，获得混合液；

2)将所述混合液在20～30℃的温度下，搅拌至TLC检测中TLC点板出现新点，淬灭反应，即得；优选地，所述有机溶剂为氯仿或四氢呋喃，优选为氯仿。

优选地，所述瑞喹莫德与苯甲酰氯的摩尔比为0.1～0.5:1，优选为0.3:1；

优选地，每1mL所述有机溶剂中溶于0.3～0.7mmol的所述苯甲酰氯溶液中苯甲酰氯；更优选地，每1mL所述有机溶剂中溶于0.5mmol的所述苯甲酰氯溶液中苯甲酰氯。

本发明进一步提出的，上述任一制备方法中，瑞喹莫德与所述三乙胺的质量比为0.1～0.5:1，优选为0.3:1；

所述三乙胺为催化剂。

本发明进一步提出的，上述任一制备方法还包括纯化，所述纯化具体为：淬灭反应后，采用乙酸乙酯萃取反应液2～4次，取有机相，进行干燥处理后，旋蒸去除有机相；再采用硅胶柱层析进行洗脱，浓缩干燥，即得；

优选地，所述洗脱采用乙酸乙酯：石油醚＝1:4～2:1的梯度进行。

本发明提供的瑞喹莫德(Resiquimod)酰化衍生物对口腔癌细胞、黑色素瘤细胞具有良好的活性，且选择性强，具有良好的临床应用价值。在应用于治疗口腔癌、黑色素瘤的药物中具有显著效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

如下实施例中TLC检测中展开剂具体为：乙酸乙酯：石油醚＝2:1；其中，碘缸显色。

实施例1

本实施例提供一种Resiquimod的酰化衍生物(A)，结构如下：

所述Resiquimod的酰化衍生物采用如下方法制得，所述方法包括如下步骤：

1)冰浴条件下，将47.2mg(0.15mMol，mw＝314)瑞喹莫德溶于10ml氯仿中，向其分别加入51mg三乙胺和2mg 4-二甲氨基吡啶后，再缓慢滴加乙酰氯的氯仿溶液，获得混合液；

其中，所述乙酰氯的氯仿溶液中70mg苯甲酰氯溶于1ml氯仿中；

2)将所述混合液在25℃的温度下，搅拌至TLC检测中TLC点板出现新点，加入冰水淬灭反应；

3)向淬灭反应的反应液中，分别采用10ml乙酸乙酯萃取反应液3次，分液后，取有机相；再采用无水硫酸钠进行干燥处理后，旋蒸去除有机相；再采用硅胶柱层析进行洗脱，浓缩干燥，即得；

其中，所述洗脱采用乙酸乙酯：石油醚＝1:4～2:1的梯度进行。

本实施例制得到50mg Resiquimod酰化衍生物(mw＝522.59)，收率为63.8％。

实施例2

分别将口腔鳞癌细胞SCC-15和人舌癌细胞CAL-27在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下,含10％胎牛血清、100万单位青霉素、80万单位链霉素的RPMI 1640完全培养液中培养、传代(必要时冻存)。取对数生长期口腔鳞癌细胞SCC-15和人舌鳞状细胞CAL-27两株，胰蛋白酶消化后，收悬液，离心(1000r，4min)，弃上清，加培养基细胞计数后，稀释成浓度为5×104个/ml，加入96孔板，每孔100ul。

隔夜培养后，去原培养液，实验组加入Resiquimod、Resiquimod酰化衍生物A(实施例1制得的Resiquimod酰化衍生物)终浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml的培养液，阴性对照组加完全培养液。分别作用24h、48h后去原培养液，加10ul MTT试剂，37℃孵箱4h后取出去除上清液，加入100ul DMSO在微孔震荡仪上震荡15min后，用酶联反应标记仪在波长为570nm测吸光度(OD值)，记录结果求平均值，并计算增殖抑制率。试验重复3次以上,结果基本一致。

参照上述方法，在同1块96孔板上将Resiquimod、Resiquimod酰化衍生物A作用于口腔鳞癌细胞SCC-15。两个化合物对细胞生长具有不同程度的抑制作用(参见表1所示)，其中以衍生物效果最佳，两种化合物半数抑制浓度IC50分别为169.55μg/ml、19.04μg/ml。

参照上述方法，在同1块96孔板上将Resiquimod、Resiquimod酰化衍生物A作用于人舌癌细胞CAL-27。两个化合物对细胞生长具有不同程度的抑制作用(参见表2所示)，其中以衍生物效果最佳，两种化合物半数抑制浓度IC50分别为0.92mg/ml、51.50μg/ml。

表1MTT法测定2种活性物质对SCC-15细胞的作用

表2MTT法测定2种活性物质对CAL-27细胞的作用

实施例3

分别将人黑色素瘤细胞A875和恶性黑色素瘤细胞WM 451Lu在37℃、5％CO2及饱和湿度环境下,含10％胎牛血清、100万单位青霉素、80万单位链霉素的RPMI 1640完全培养液中培养、传代(必要时冻存)。取对数生长期人黑色素瘤细胞A875和恶性黑色素瘤细胞WM451Lu两株，胰蛋白酶消化后，收悬液，离心(1000r，4min)，弃上清，加培养基细胞计数后，稀释成浓度为5×104个/ml，加入96孔板，每孔100ul。

隔夜培养后，去原培养液，实验组分别加入Resiquimod、Resiquimod酰化衍生物A终浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、10ug/ml的培养液，阴性对照组加完全培养液。分别作用48h后去原培养液，加10ul MTT试剂，37℃孵箱4h后取出去除上清液，加入100ul DMSO在微孔震荡仪上震荡15min后，用酶联反应标记仪在波长为570nm测吸光度(OD值)，记录结果求平均值，并计算增殖抑制率。试验重复3次以上,结果基本一致。

参照上述方法，在同1块96孔板上将Resiquimod、Resiquimod酰化衍生物A作用于人黑色素瘤细胞A875。两个化合物对细胞生长具有不同程度的抑制作用(参见表1所示)，其中衍生物较Resiquimod而言效果显著，两种化合物半数抑制浓度IC50分别为219.44μg/ml、16.88μg/ml。

参照上述方法，在同1块96孔板上将Resiquimod、Resiquimod酰化衍生物A作用于恶性黑色素瘤细胞WM 451Lu。两个化合物对细胞生长具有不同程度的抑制作用(参见表3所示)，其中衍生物较Resiquimod而言效果显著，两种化合物半数抑制浓度IC50分别为194.56μg/ml、42.25μg/ml。

表3 MTT法测定2种活性物质对2种黑色素瘤细胞的作用

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (12)

1.一种瑞喹莫德的酰化衍生物，其特征在于，结构式如下：

其中，R₁为苯甲酰基，R₂为苯甲酰基。

2.权利要求1所述瑞喹莫德的酰化衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在-3～2℃的温度下，将瑞喹莫德溶于有机溶剂中，向其分别加入三乙胺和4-二甲氨基吡啶后，再缓慢滴加苯甲酰氯溶液，获得混合液；

2)将所述混合液在20～30℃的温度下，搅拌至TLC检测中TLC点板出现新点，淬灭反应，即得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿或四氢呋喃。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述瑞喹莫德与苯甲酰氯的质量比为0.1～0.5:1。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述瑞喹莫德与苯甲酰氯的质量比为0.3:1。

6.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，每1mL所述有机溶剂中溶于0.3～0.7mmol的所述苯甲酰氯溶液中苯甲酰氯。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，每1mL所述有机溶剂中溶于0.5mmol的所述苯甲酰氯溶液中苯甲酰氯。

8.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述瑞喹莫德与所述三乙胺的质量比为0.1～0.5:1。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述瑞喹莫德与所述三乙胺的质量比为0.3:1。

10.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括纯化，具体为：淬灭反应后，采用乙酸乙酯萃取反应液2～4次，取有机相，进行干燥处理后，旋蒸去除有机相；再采用硅胶柱层析进行洗脱，浓缩干燥，即得。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱采用乙酸乙酯：石油醚＝1:4～2:1的梯度进行。

12.权利要求1所述的瑞喹莫德的酰化衍生物或权利要求2～11任一项所述的制备方法制得的瑞喹莫德的酰化衍生物在制备治疗口腔癌细胞、黑色素瘤细胞的药物中的应用。