CN101495128A - 胡桃分离提取物及其获取方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胡桃分离提取物,在其用于制备治疗病毒、真菌和细菌疾病的药物的时间内具有高效性和高稳定性,特征在于所述提取物通过包括下述步骤方法获得:i)采集未成熟胡桃果实作为原料;ii)制备用于提取的原料;iii)冷冻前一步骤中制备的原料;iv)干燥;v)用少于10分钟的时间进行提取;vi)过滤;和vii)最终包装。本发明还涉及用所述提取物用于制备治疗细菌、真菌和病毒疾病的药物的应用,以及涉及含有所述提取物的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及胡桃分离提取物,在其用于制备治疗病毒、真菌和细菌疾病的药物的时间内具有高效性和高稳定性。
本发明还涉及获取所述胡桃分离提取物的方法。
背景技术
胡桃提取物和泥罨剂被用于流行的食疗药物已经有很多年。
胡桃树的树皮、叶子或果实中含有没食子单宁、儿茶(catequic)单宁、胡桃醌、胡桃定(juglandine)、胡萝卜素、肌醇、焦倍酚、维生素C和其他物质。
已证明胡桃树皮(中国东北)主要含有5-羟基-1,4-萘醌(胡桃醌)、1,4,5-三羟基萘(氢化胡桃醌)、氢化胡桃醌的糖苷、羟基-α-四氢萘酮的糖苷,以及这些糖苷的没食子酸衍生物。还已知胡桃壳富含维生素C,且叶子中含有β-胡萝卜素、维生素B1、B2和B6。
胡桃醌被认为是一种具有抗微生物、抗肿瘤和抗寄生虫作用的天然产物,并具有抗真菌和杀菌特性。因此,其可在多种市场产品中被找到,包括染发组合物和缎胡桃木油中。从胡桃壳中制备的胡桃醌是一种在饮食补充剂中有活性的活性组分。
有证据表明胡桃醌是一种强力的化学治疗或化学预防试剂。美国国家癌症研究所(NCI)的治疗研发小组在其对HIV-1的研究中评估了胡桃醌。
2001年10月的US 6,296,838涉及一种用于治疗和预防人类指甲的真菌感染的局部用抗真菌组合物。具体地,US 6,296,838描述了这种具有协同效应的提取物含有10-15%提取自胡桃壳的胡桃醌和20-30%匙叶甘松(Nardostachys jatamansi)、香根草(Vetiveria zizanioides)或长春花(Catharanthus roseus)的碾碎的根的混合物,因为即使进行长期治疗,仅含胡桃醌的提取物在长期治疗过程中的效力和对真菌的毒性作用非常低。
为了获得所述提取物,需将胡桃壳分离、水洗和风干。然后将其磨碎,并用选自丙酮、乙醇和丁醇的溶剂提取胡桃醌。从提取物中除去溶剂,再将其冷却以除去蜡类,从而使得胡桃醌得以被部分分馏。
现有技术中所述的胡桃分离提取物是基于从胡桃树富含活性成分的部分中提取可抗真菌、抗细菌或抗病毒的确定活性成分。
目前有含有提取自胡桃壳的胡桃醌的抗真菌组合物或含高浓度维生素C的组合物,其中维生素C来自某些广为人知的富含维生素C的组织之一--胡桃树叶组织。
含有胡桃分离提取物的组合物存在的缺点是必须在制备后马上给药,因为所述组合物效力会随着时间流逝而降低导致其寿命较短。
因此,由于所述胡桃分离提取物的低稳定性,含有该提取物的组合物必须在几天之内生产和给药,以在治疗中达到合适的效力。
所以,由于所述提取物中胡桃醌的低稳定性,所述基于胡桃分离提取物的组合物的应用具有时间上的限制,而且它们只能专用于抗真菌、抗细菌或抗病毒。
因此,还没有任何能够较长时间稳定并且不依赖生产时间(moment ofpreparation)的仅来源自胡桃的提取物。此外,也还没有任何能够同时具有抗真菌、抗细菌和抗病毒性质并且长时间保持稳定的含所述提取物的组合物。
发明内容
因此,本发明的第一方面是提供不依赖于生产时间的并且长时间稳定的基于胡桃的分离提取物。
本发明的第二方面是提供能够同时有效地用于抗真菌、抗细菌和抗病毒治疗的基于胡桃的分离提取物。
本发明的第三方面是提供可获得根据本发明前两方面的胡桃分离提取物的方法。
本发明的第四方面是根据本发明第一方面的胡桃分离提取物用于制备治疗病毒、真菌和细菌疾病的药物的用途。
本发明的第五方面是提供一种含有根据本发明第一方面的胡桃分离提取物的组合物,用于制备治疗病毒、真菌和细菌疾病的药物。
定义
本发明中的“未成熟的胡桃果实”是指所述胡桃处于乳状蜡(Lactic-Waxy)成熟状态。所述成熟状态一般发生于6月10号和9月15号之间,更接近7月10号和8月10号之间,但是所述日期可根据果实成熟地点的天气而有所变化。
附图说明
图1示出了一个本发明方法的流程图,其中用少于10分钟的提取时间获得胡桃提取物。
图2是不同提取时间的胡桃提取物中胡桃醌百分比含量相对于从制备时起的时间的变化的图示。从所述图2中可以看出只有当提取时间少于10分钟时(-■-),胡桃醌的含量是随时间保持稳定的。
具体实施方式
本发明的发明人已经发现获取胡桃提取物时所用的提取时间是所获提取物的最终性质的决定性条件。
有利地,根据本发明第一方面的胡桃分离提取物是随时间稳定的,并具有可同时用于抗真菌、抗细菌和抗病毒的性质。
根据本发明前三方面,本发明提供了胡桃分离提取物,其特征在于所述提取物是通过包括如下步骤的方法获取的:
i)采集不成熟胡桃果实作为原料;
ii)制备用于提取的原料;
iii)冷冻上一步制备的原料;
iv)干燥;
v)在少于10分钟的时间内完成提取;
vi)过滤;和
vii)最终包装。
具体地,所述制备用于提取的原料的步骤(ii)优选地包括机械清洗、自来水清洗、蒸馏水清洗和风干。
优选地,所述冷冻步骤(iii)包括将胡桃果实置于温度为-18到-20℃的冷冻室中70-170小时,甚至更优选地为120±5小时。
具体地,所述干燥步骤(iv)包括,首先,剥取冷冻的胡桃的外壳为2-3mm的薄层,然后,将它们置于托盘中干燥(优选地置于太阳下),再置于温度为38℃±2℃的干燥室中,直至湿度低于10%。
所述提取步骤(v)包括将在所述干燥步骤中获得的干燥物切成小片,加入1/2到1/5重量/体积比、优选为1/3的重量/体积比的乙醇(96%),然后在10分钟之内、优选5分钟之内、甚至更优选2分钟之内进行提取。
所述提取物的过滤步骤优选为在一个初级净化过滤器中进行,然后在0.25±0.005MPa的压力下在一个细孔除菌过滤器中进行。
只要不背离本发明的发明构思,本领域的技术人员对步骤i)到iv),vi)和vii)进行的修改也包括在本发明的范围内。图1是本发明上述方法的一个非限制性的图解。
本发明的发明人已经发现提取时间对所述胡桃分离提取物的最终性质非常关键。本发明人相信当提取时间增加时,可能影响所获提取物随时间的稳定性和效力的其他组分也会被从胡桃中提取出来。
令人惊讶地,本发明的发明人已经发现根据本发明第一方面获得的胡桃分离提取物保持了同时抗真菌、抗细菌和抗病毒的性质,并且是随时间稳定的。
因此,本发明还提供一种用于获得根据本发明第一方面定义的胡桃分离提取物的方法。
本发明的发明人将胡桃醌的稳定性评估为所述提取步骤v)中所用时间的函数。
从下表1可看出,步骤v)中所用的提取时间越长,活性成分胡桃醌随时间的稳定性越低。
表1
从表1显示的结果可看出,当步骤v)中的提取时间增加时,最终提取物中的胡桃醌的含量会下降,且所述胡桃醌提取物在制备后随时间的稳定性也会下降。
令人惊讶地,用少于10分钟的提取时间获得的胡桃醌提取物在其制备后的最长至24个月的时间内保持稳定,因此其效力不依赖于其制备后的时间,而是依赖于提取所用的时间,参见图2和试验编号1。
有利地,根据本发明的第一方面获得的胡桃醌分离提取物具有两年以上的稳定性,大大超过现有技术中公开的胡桃提取物的若干天的稳定性。
所述本发明的胡桃分离提取物可用于治疗疱疹、水痘、皮肤或指甲上的真菌,通常用于治疗皮肤疾病。
本发明的提取物的给药可通过局部、腹膜内或口服的形式进行,例如以液体、霜剂或片剂的形式,但是本发明的提取物的其他应用形式也包括在本发明范围内。
本发明的发明人还研究了试验1到5(表1)中的根据本发明第一方面的分离提取物对于细菌、真菌和病毒的效力。参见下表2。
表2
脚注:
(+)抑制生长;
(-)不抑制生长;
(+*)在DR(骨肉瘤)细胞培养物中和人类肌皮成纤维细胞的培养物中抑制HSV-1病毒的复制;
(-*)在DR(骨肉瘤)细胞培养物中和人类肌皮成纤维细胞的培养物中不抑制HSV-1病毒的复制;
从前表显示的数据可看出当提取时间增加时,提取物随制备后的时间而效力降低。
所示结果表明,根据本发明第一方面的胡桃分离提取物在其制备后的最长至24个月的时间内保持了对细菌、真菌和病毒的效力,且所述效力依赖于提取步骤中所用的时间(试验1)。
因此,根据本发明的第四方面,本发明还提供了可用于制备治疗病毒、真菌和细菌疾病的药物的胡桃分离提取物。
本发明还涉及一种含有根据本发明第一方面的提取物的组合物,及其用于制备治疗病毒、真菌和细菌疾病的药物的用途。
下文的一些细胞毒性研究表明根据本发明第一方面的提取物适用于人类。
一般毒性研究
在大鼠和小鼠体内对根据本发明第一方面的胡桃分离提取物(以下简称为提取物)进行了毒理学评估,其中对大鼠和小鼠用不同浓度的提取物进行胃内给药。使用胃内给药是为了对急性感染和病毒载体中的疱疹病毒都能产生全身性效力。因此,该提取物可被认为是一种天然抗病毒的化学治疗药物。然而,因为所述提取物的给药是通过全身性吸收的方式,可以预料其会表现一定的毒性,这也在对大鼠和小鼠的亚急性研究中得到证实。然而必须指出,即使当以最大剂量进行胃内给药时,致死结果的频率也非常低,从而无法确定平均致死剂量(LD50等)。所述提取物既没有物质累积性质,也没有对骨髓细胞的诱变作用。
关于一般毒性,有必要指出对CNS的作用和对幼年动物的体重增长的抑制作用。涉及薄壁组织器官的毒性特别地包括肝脏薄壁组织细胞的衰退和肾脏排泄功能的改变。脾脏和肾上腺质量的减少似乎反映了30天的长期处理所导致的应激状态(参见表1.1,5%乙醇)。
同样,已确定了导致大鼠中正常指标的最小偏差的提取物剂量,这在传统上被当作最大耐受剂量,即给药0.5ml浓度为0.5%的溶液持续30天。对于人类,这相当于250-500ml所述浓度的溶液。实际上,如人们所熟知的,在临床条件下试验了1/100-1/10的所述最小毒性剂量或“无活性”剂量,即每天2.5-5.0ml浓度为0.5%的溶液。
因此,对经皮肤施用数次的不同浓度的提取物溶液的毒理学评估的结果表明,剂量为0.2ml浓度为0.5%的溶液的制剂不会导致明显的中毒作用。然而,在组织学上表现出表皮上角质化过程的某种程度的加强,但是表皮细胞层没有增加且对皮肤自身(真皮)没有炎症作用。
50%的提取物溶液导致皮肤出现明显的角化过度、干燥和硬化。在组织学上,伴随角质化过程的加强,还导致表皮中细胞层的增加,但是在这种情况下仍然没有观察到炎症反应。在这个剂量下,没有观察到(通过吸收的)全身性毒性迹象。
在使用小鼠进行的两周长的实验中,小鼠接受了约4倍体积的同浓度的溶液(5%和50%的溶液)。使用5%提取物溶液时,已经可以见到经组织学确认的皮肤反应(以脱落和增厚的方式),没有炎症反应。还可在观察到粒细胞生成反应,表现为啮齿类特有的由造血“淋巴细胞”类型转变为“粒细胞”类型。浓度为5%的制剂没有导致直肠末端黏膜发生任何破坏性或炎性变化。在这个剂量下,未观察到一般的全身性毒性作用的症状。将特别高浓度(50%)的提取物用于皮肤会伴随全身性毒性作用。还观察到该制剂的特征性质,尤其是在不对皮肤和粘膜产生炎性作用的情况下刺激角质化和粒细胞生成(粒细胞增多)。
当使用经皮下途径的给药模拟对所述制剂的强烈经皮吸收时,全身性作用最特征性标志是导致发生CNS抑制现象的神经毒性。
以所确定的小鼠中平均毒性剂量和其他指标为基础(动物体内TD50-0.4ml浓度为17±3.8%的溶液,TD16-0.4ml浓度为10%的溶液,TD84-0.4ml浓度为35%的溶液),使用剂量为1.0-1.5ml/Kg的浓度为5%的溶液作为大鼠局部皮肤给药时的近似非毒性剂量。
浓度为5-50%的提取物溶液用于皮肤时,既没有局部刺激性,也没有致过敏(变应原性)作用。
抗病毒活性研究
本研究的目标是检验用于制造制剂的根据本发明第一方面的胡桃分离提取物(以下简称为提取物),以证明其在细胞培养物中存在抗病毒活性(抗疱疹)。下列细胞被作为实验模型使用:骨肉瘤的连续细胞系DR(获自佐治亚特危感染国家中心病毒学实验室)和人类肌皮来源的成纤维细胞的原代培养物(流产材料,获自佐治亚卫生部产科学、妇科学和围产医学研究所)。病毒材料:I型单纯疱疹病毒,获自俄罗斯联邦卫生部病毒制剂研究所病毒学实验室保藏室(莫斯科)。
为了进行本实验,使用了交叉评估方法,包括对不同浓度的提取物(1∶5至1∶80)和不同稀释度的病毒的(1∶10至1∶10,000,000,传统上表示为-1.0lg到-7.0lg)同时分析。此方法能够显示所述制剂和剂量之间相互作用的更细微差别,也能够显示最大程度保护细胞免于所述病毒感染的最优化变量(Zdrodovski P.F.,Sokolov M.I.-Rukovodstvo polaboratornoy diagnostike virusnikh i rikketsioznikh bolezney[Manual of analytical diagnostic of viral and rickettsian diseases]M.,″Meditsina″,1965,c396)。
对所获结果的分析使得可以无疑义地断定用于制造所述制剂的该植物提取物能够抑制DR细胞培养物(骨肉瘤)和人类肌皮成纤维细胞中疱疹单纯病毒的复制。当以1∶5的稀释度使用该提取物时,这种作用更加强烈(考虑到可能对细胞有细胞毒性作用,没有特意对纯提取物进行试验)。对细胞培养物中所述提取物和病毒进行交叉评估的方法能够证明该提取物的保护性抗疱疹作用,并发现细胞内感染过程的某些规律。
抗疱疹活性研究
在体外研究中,根据第一方面的胡桃分离提取物(以下简称为提取物)显示出在人类成纤维细胞和DR骨肉瘤的细胞培养物中有抗单纯疱疹病毒(HSV)的保护性作用,从而使得有必要在小白鼠体内研究该提取物的抗病毒作用。
为此目的,应用小白鼠疱疹感染模型来研究动物死亡率和病毒复制指数。就抗体保护、吞噬作用和干扰素活性对所述生物体的免疫系统状态进行了评估。也对怀孕雌鼠体内疱疹病毒的胚胎毒性和诱变作用以及抗氧化保护的状态进行了分析。在用该提取物处理的被感染小鼠中对所有这些参数进行了研究。
研究的结果有力地证明,该提取物可被成功地用于选择性地中和疱疹病毒的免疫抑制作用。我们可以为该提取物所表现出的性质提出多种不同的机制,但是最可接受的是如下机制:在疱疹病毒存在的情况下,在所述生物体内发生了激素失衡,并且发生全身性缺氧和细胞缺氧,然后这些破坏性过程导致中毒。所有这些现象要么是源于已经存在的免疫病理作用,要么是由它们本身导致的。换句话说,在疱疹病毒存在的情况下,至少产生了全部所述四种因素:激素失衡、组织缺氧、中毒和免疫病理现象,它们彼此具有相互恶化的作用。
所述提取物的保护作用的机制之一是其抗氧化性质,这有利于细胞内水平(包括免疫细胞)的呼吸的重建。相信该提取物通过其含有的活性生理物质(抗生素、胡桃醌和类黄酮;微量元素;维生素C、E、PP的复合物)产生这些作用,这有利于加强所述免疫活性细胞的功能活性。
因此,该提取物可以被毫无疑问地归类于可有效用于预防和治疗病毒和细菌感染、化脓性和炎性疾病、以及需要加强代谢和适应过程的其他病理状态的活性天然药物。
Claims (15)
1.胡桃分离提取物,特征在于所述提取物由包括下述步骤的方法获得:
i)采集未成熟胡桃果实作为原料;
ii)制备用于提取的原料;
iii)冷冻前一步骤中制备的原料;
iv)干燥;
v)在不到10分钟的时间内进行提取;
vi)过滤;和
vii)最终包装。
2.根据权利要求1的分离提取物,其中所述制备用于提取的原料的步骤(ii)包括机械清洗、水洗和风干。
3.根据权利要求1的分离提取物,其中所述冷冻步骤(iii)包括将胡桃果实置于温度为-18到-20℃的冷冻室中70-170小时。
4.根据权利要求1的分离提取物,其中所述干燥步骤(iv)包括:首先剥取冷冻的胡桃的外壳为2-3mm的薄层,然后将它们干燥至湿度低于10%。
5.根据权利要求1的分离提取物,其中所述提取步骤(v)包括将在干燥步骤中获得的干燥物分成小片,并加入1/2到1/5重量/体积比的醇,然后进行时间少于10分钟的提取;
6.根据权利要求5的分离提取物,其中所述醇是乙醇(96%)。
7.根据权利要求5的分离提取物,其中所述醇为1/3的重量/体积比。
8.根据权利要求5的分离提取物,其中所述提取时间少于5分钟。
9.根据权利要求5的分离提取物,其中所述提取时间少于2分钟。
10.根据权利要求1的分离提取物,其中所述提取物过滤步骤在一个初级净化过滤器中进行,然后在一个细孔除菌过滤器中进行。
11.获得权利要求1-10任一项的胡桃分离提取物的方法。
12.含有权利要求1-10任一项的胡桃分离提取物的组合物,用作药物。
13.根据权利要求12的组合物,其特征在于以液体、片剂或霜剂的形式给药。
14.根据权利要求1-10任一项的提取物用于制备治疗细菌、真菌和病毒疾病的药物的用途。
15.根据权利要求14的提取物的用途,所述用途为用于制备治疗疱疹、水痘,以及皮肤和指甲上的真菌的药物。
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