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一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测β‑半乳糖苷酶的荧光探针：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。本发明的探针实现了β‑半乳糖苷酶分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强，是一种简单，快速，灵敏的β‑半乳糖苷酶特异性检测试剂。该探针的合成只需要几步就可以完成，且后处理过程相对简单。本发明的探针在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶(β-gal)是一种能够将β-半乳糖苷水解成半乳糖和糖苷的酶。随着科学技术的快速发展，β-半乳糖苷酶在环境、生物、医学、化学、等领域的应用越来越多。在食品工业领域，利用β-半乳糖苷酶能够水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。在生物领域，β-半乳糖苷酶是一种被广泛应用的基因标记酶，可用来研究基因的转录调控和基因表达等。β-半乳糖苷酶基因是基因工程中最常用的报告基因，利用其表达产物β-半乳糖苷酶来研究目的基因的表达调控。最近报道的文献发现β-半乳糖苷酶与动物细胞的衰老有密切的关系。因此，在医学研究、基因诊断、生物免疫等方面，检测β-半乳糖苷酶活性显得十分重要。
发明内容
针对目前β-半乳糖苷酶荧光探针检测所面临的问题的现状，本发明以HBT的衍生物生色团作为荧基团，通过β-半乳糖苷酶选择性脱去半乳糖基团来实现对β-半乳糖苷酶的荧光检测，响应速度快、抗干扰能力强。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中、细胞内或生物内β-半乳糖苷酶的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，简称ESIPT-GAL，其化学结构式如式（I）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式（I）。
上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将化合物1、Na2SO4和Cs2CO3溶于乙腈中，将化合物2缓慢加入上述溶液中，室温反应，反应液分离纯化得到化合物3：
Figure 236645DEST_PATH_IMAGE002
；
（2）将化合物3和Na2S2O5溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入2-氨基苯硫酚，室温反应，加水析出沉淀，抽滤得化合物4：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
；
（3）化合物4溶于甲醇中，加入溶于甲醇的甲醇钠，室温反应，抽滤，甲醇洗涤，得荧光探针：
Figure 357048DEST_PATH_IMAGE004
。
所述化合物1和化合物2的摩尔比为1:1-1.5。
所述Na2SO4和Cs2CO3的摩尔比为1:2。
所述化合物3和2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:2-2.5。
所述化合物4和甲醇钠的摩尔比为1:3。
步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：将反应液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:2。
上述荧光探针可应用于检测溶液、细胞或生物体中β-半乳糖苷酶。
本发明的检测原理如下：
当体系中不存在β-半乳糖苷酶时，荧光探针分子受激发后，发生在激发态分子内部邻近的质子给体与质子受体之间的质子转移由于β-半乳糖而受阻，发射蓝色荧光。当体系中不存在β-半乳糖苷酶时，特异性降解荧光探针，使半乳糖游离；此时受激发后，质子在激发态分子内部邻近的质子给体与质子受体之间转移，呈ESIPT-on状态，共轭体系扩大，光谱红移，呈绿色荧光。
本发明具有以下优点：
本发明的探针实现了β-半乳糖苷酶分子探针的选择性快速检测，并且选择性好，抗其他分子干扰能力强，是一种简单，快速，灵敏的β-半乳糖苷酶特异性检测试剂。该探针的合成只需要几步就可以完成，且后处理过程相对简单。本发明的探针在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是荧光探针的检测原理图；
图2是荧光探针的1H NMR图谱；
图3是探针随β-半乳糖苷酶的加入荧光谱图的变化情况；
图4是探针对不同离子和分子的选择性荧光谱图；
图5是探针对不同离子和分子的选择性柱状图数据；
图6是探针在β-半乳糖苷酶加入后随时间变化的光谱图；
图7是探针在β-半乳糖苷酶加入后的光稳定性图；
图8是探针对内源性β-半乳糖苷酶的细胞成像图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE005
（1）化合物1（1 eq），Na2SO4（2.5 eq），Cs2CO3（5 eq）溶于乙腈中，将化合物2（1.5eq）缓慢加入上述溶液中，室温反应24小时，反应液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:2，分离得到化合物3，产率为80%；
（2）化合物3（1 eq），Na2S2O5（2.2 eq）溶于DMF中，然后加入2-氨基苯硫酚（2.2eq），室温反应过夜，加水析出沉淀，抽滤得化合物4，产率为85%；
（3）化合物4（1 eq）溶于甲醇中，加入溶于甲醇的甲醇钠（3 eq），室温反应4小时，抽滤，甲醇洗涤，得化合物5，即荧光探针ESIPT-GAL，产率为40%。其1H NMR图谱如图2。
实施例2 荧光探针对β-半乳糖苷酶的响应
取实施例1制备的荧光探针ESIPT-GAL溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1 mmol/L的储备液。从储备液中取出20 μL加入到5 mL的离心管当中，加入不同量80 U/mL的β-半乳糖苷酶标准溶液，用PBS缓冲溶液（0.1 mol/L，pH = 7.4）溶液稀释至2 mL，使β-半乳糖苷酶终浓度为0-13 U，测量其荧光性质（激发波长355nm）。荧光光谱如图3所示：由图3可见，随着β-半乳糖苷酶加入量的增加，体系中552 nm的荧光逐渐增强，406 nm的荧光减弱。
实施例3 荧光探针对不同分子或离子的选择性
从实施例2中荧光探针储备液中取出20 μL加入到5 mL的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的β-半乳糖苷酶溶液，10 min后检测溶液的荧光发射光谱变化（激发波长355nm），由图4和图5可以发现，其他离子对ESIPT-GAL的荧光几乎没有影响，仍然在406 nm处；而β-半乳糖苷酶溶液的加入使ESIPT-GAL的在552nm处的荧光显著增强。
实施例4 荧光探针对β-半乳糖苷酶的响应动力学
从实施例2中荧光探针储备液中取出20 μL加入到5 mL的离心管当中，加入13 U的β-半乳糖苷酶溶液，检测溶液的荧光发射光谱（激发波长355nm，检测波长552nm）随时间的变化，由图6可以发现，探针的荧光强度在0-5分钟内显著增强，在10分钟后趋于平缓。
实施例5 荧光探针的光稳定性
从实施例2中荧光探针储备液中取出20 μL加入到5 mL的离心管当中，加入13 U的β-半乳糖苷酶溶液，连续检测溶液的荧光发射光谱变化140 min，由图7可以发现，其荧光强度基本保持不变，光稳定性很好。
实施例6 荧光探针在活细胞中的成像应用
将本发明探针应用于HeLa细胞以及OVCAR-3细胞对内源性的β-半乳糖苷酶进行荧光成像应用具体操作步骤如下：将10 μM探针DMSO溶液分别加入到育有HeLa细胞或OVCAR-3细胞的培养液中，在二氧化碳培养箱中培养50 min后用共聚焦显微镜进行成像，结果如图8所示：
首先，进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；
然后，用蓝光进行激发观察在两种细胞中的荧光成像情况，可以观察到HeLa细胞在蓝色通道中显示出强的荧光，绿色通道的光则非常弱（图a-d）；OVCAR-3细胞在绿色通道中观察到强荧光，而蓝色通道的光则非常弱（图e-h）；
为了确定荧光的产生仅是由于探针与细胞中的β-gal反应，进行了对OVCAR-3细胞的抑制性实验，在OVCAR-3细胞中加入D-半乳糖作为酶抑制剂，孵育30min后再次用蓝光进行激发观察荧光成像情况，可以观察到细胞在蓝色通道中显示出强的荧光，绿色通道的光则非常弱（图i-l）。

Claims (5)

1.一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：
Figure 380612DEST_PATH_IMAGE002
式（I）。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将化合物1、Na2SO4和Cs2CO3溶于乙腈中，将化合物2缓慢加入上述溶液中，室温反应，反应液分离纯化得到化合物3：
Figure DEST_PATH_IMAGE004AA
；
（2）将化合物3和Na2S2O5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入2-氨基苯硫酚，室温反应，加水析出沉淀，抽滤得化合物4：
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
；
（3）化合物4溶于甲醇中，加入溶于甲醇的甲醇钠，室温反应，抽滤，甲醇洗涤，得荧光探针：
Figure 438697DEST_PATH_IMAGE008
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物1和化合物2的摩尔比为1:1-1.5；所述Na2SO4和Cs2CO3的摩尔比为1:2；所述化合物3和2-氨基苯硫酚的摩尔比为1:2-2.5；所述化合物4和甲醇钠的摩尔比为1:3。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：将反应液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为乙酸乙酯/石油醚=1:2。
5.根据权利要求1所述的荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中β-半乳糖苷酶活性试剂中的应用。
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