CN111171091B - 一种一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法 - Google Patents

一种一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一锅法制备用于检测β‑D‑葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法，具体为以式（I）结构化合物和乙酰溴‑α‑D‑葡萄糖醛酸甲酯为原料，在极性溶剂、偶联试剂存在的条件下反应8‑24h后加入碱性试剂，室温反应4‑8h后加入酸性试剂调节pH至2‑3，经后处理制所述用于检测β‑D‑葡萄糖醛酸苷酶的底物。本发明以苯酚结构上取代或未取代的酚酞以及乙酰溴‑α‑D‑葡萄糖醛酸甲酯为反应物，制备了用于检测β‑D‑葡萄糖醛酸苷酶的底物，反应步骤和操作非常简便，降低了工艺复杂性，易于扩大化生产。

Description

一种一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及药物合成，具体涉及一种一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法。
背景技术
β葡萄糖醛酸苷酶是细胞溶酶体中的水解酶，广泛分布于自然界多种生物体系中，负责催化葡萄糖醛酸结合物的水解反应，在肝细胞中含量较高。人体内β-葡萄糖醛酸苷酶的表达与一些炎症及癌症的发生发展过程密切相关，因此也被认为是一种重要的肿瘤标志物。测定β葡萄糖醛酸苷酶，有助于病情观察和预后评价，它的生物技术潜力正越来越受到人们的关注。但由于其制备方法较为繁杂、现有的制备方法多存在收率低、需更换溶剂等问题，因此尚未实现大规模制备。申请号为CN201810068438.1的专利申请中公开了检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物及其制备方法和试剂盒，并具体公开了将百里酚酞与乙酰溴-α-D-葡萄糖酮酸甲基酯反应制得百里酚酞-α-乙酰基-D-葡糖醛酸甲酯，脱除乙酰基得到百里酚酞-α-D-葡糖醛酸甲酯，然后经水解反应得到百里酚酞-α-D-葡糖醛酸的方法。但上述方法在百里酚酞与乙酰溴-α-D-葡萄糖酮酸甲基酯反应的步骤使用二氯甲烷作为溶剂、在脱乙酰基的步骤中使用甲醇作为溶剂以及反应过程中需要加热，也即存在需要更换溶剂而导致引入杂质、产生污染的问题，此外，上述方法为多步法反应且两步合并收率较低，并且导致生产工艺复杂，一方面在生产共过程产生大量废弃物，另一方面复杂的生产工艺对于工业化大规模制备目标物在成本和安全等方面带来非常不利的影响。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法，具体为：以式（I）结构化合物和乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯为原料，在极性溶剂、偶联试剂存在的条件下反应一定时间后加入碱性试剂，室温反应一定时间后加入酸性试剂调节pH至酸性，经后处理制得式（II）结构化合物、即用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的底物。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、卤素、CN、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6烯基、卤代C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基；
进一步地，具体步骤如下：
S1：将式（I）结构化合物和乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯加入反应瓶内，加入极性溶剂、偶联试剂，反应8-24h；
S2：搅拌条件下加入碱性试剂，控制反应温度为室温，反应4-8h后加入酸性试剂，调pH至2-3，后旋蒸掉极性溶剂并经反相纯化得到式（II）结构化合物即产物β-葡萄糖醛酸。
进一步地，式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、卤素、CN、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基；再进一步地，R1、R2分别独立地选自H、C1-C6烷基。
进一步地，式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基；再进一步地，R1、R2分别独立地选自H、甲基、异丙基；再进一步地，R1、R2同时为H，或者R1为甲基、R2为异丙基。
进一步地，所述极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的任一种或几种的混合物。
进一步地，所述偶联试剂为银盐；再进一步地，偶联试剂为氧化银或碳酸银；
进一步地，在极性溶剂、偶联试剂存在的条件下的反应温度为25-40℃。
进一步地，式（I）结构化合物与乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯的摩尔比为1:1-1:1.5；式（I）结构化合物与偶联试剂的摩尔比为1:1-1:1.5。
进一步地，式（I）结构化合物与碱性试剂的摩尔比为1:1-1:1.5。
进一步地，所述碱性试剂为NaOH或KOH；所述酸性试剂为10%盐酸或10%硫酸。
本发明的有益效果体现在： 1）本发明采用了一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物，以苯酚结构上取代或未取代的酚酞以及乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯为反应物，制备得到了用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物，反应步骤和操作非常简便，降低了工艺复杂性，易于扩大化生产。2）采用本发明制备的产品纯度极高，纯度≥98%，收率≥24%，由于采用了一锅法因此无需中途更换溶剂、避免更换溶剂造成的杂质引入，保证了产品质量。3）本发明采用的制备方法避免使用二氯甲烷等挥发性的有毒有害卤代烷溶剂，同时避免了溶剂更换频率高、产品含量低需多次提纯等问题，最大程度地减少了环境污染。
附图说明
图1为本发明的一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的反应路线。
图2为本发明的酚酞β-D-葡萄糖醛酸的1H NMR谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
实施例1：
将乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯5.0 g和酚酞4.0 g加入圆底烧瓶中，加入25.0 mL甲醇后加入1.46 g氧化银，室温下反应8h；反应完成后边搅拌边加入2.0 g NaOH，室温条件下反应4 h，反应完成后加入17 mL 10%盐酸水溶液，将pH调至2-3，旋蒸除去极性溶剂后经反相柱纯化得到、即R1、R2均为H的式II结构化合物，即酚酞β-D-葡萄糖醛酸，为类白色粉末。产量：2.18 g；收率：34 %；HPLC含量：99.6%。
核磁共振测定结果如下：1H NMR（D2O，400 MHz）：δ 7.83 (m, 1H),7.66 ( m, 1H),7.50 (m, 1H), 7.48 (m, 1H ), 7.06 (m, 2H), 6.95 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz,2H), 4.94 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.60 (m, 3H) ，谱图参见附图2。
实施例2：
将乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯5.0 g和酚酞4.0g加入圆底烧瓶中，加入25.0mLDMF后加入1.46 g氧化银，室温下反应8h；反应完成后边搅拌边加入2.0 gNaOH，室温条件下反应4h，反应完成后加入17 mL10%盐酸水溶液，将pH调至2-3，旋蒸除去极性溶剂后经反相柱纯化得到产物酚酞β-D-葡萄糖醛酸、即R1、R2均为H的式II结构化合物，为类白色粉末。产量：2.0 g；收率：31%；HPLC含量：97.8%。
核磁共振测定结果如下：1H NMR（D2O，400MHz）：δ 7.83 (m, 1H),7.66 ( m, 1H),7.50 (m, 1H), 7.48 (m, 1H ), 7.06 (m, 2H), 6.95 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz,2H), 4.94 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.60 (m, 3H)。
实施例3：
将乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯5.0 g和百里酚酞4.2 g加入圆底烧瓶中，加入25mL甲醇后加入1.46 g氧化银，室温下反应8 h；反应完成后边搅拌边加入2.0 gNaOH，室温条件下反应4h，反应完成后加入17 mL10%盐酸水溶液，将pH调至2-3，旋蒸除去极性溶剂后经反相柱纯化得到产物百里酚酞-β-D-葡萄糖醛酸、即R1为甲基、R2为异丙基的式II结构化合物，为类白色粉末。产量：2.3g；收率：35%；HPLC含量：97%。
核磁共振测定结果如下：1H NMR（D2O，400MHz）：7.93 (m, 1H),7.76 ( m, 1H),7.60 (m, 1H), 7.58 (m, 1H ), 7.15 (m, 2H), 6.95 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz,2H), 4.94 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.60 (m, 3H), 2.99 (m, 2H ), 1.33 (m, 12H)。
实施例4：
将乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯5.0 g和百里酚酞4.2 g加入圆底烧瓶中，加入25mL DMF后加入1.46 g碳酸银，室温下反应8h；反应完成后边搅拌边加入2.0 gNaOH，室温条件下反应4 h，反应完成后加入17 mL10%盐酸水溶液，将pH调至2-3，旋蒸除去极性溶剂后经反相柱纯化得到产物, 百里酚酞-β-D-葡萄糖醛酸、即R1为甲基、R2为异丙基的式II结构化合物，为类白色粉末。产量：2.15g；收率：33 %；HPLC含量：95%。
核磁共振测定结果如下：1H NMR（D2O-d 6 ，400MHz）7.93 (m, 1H),7.76 ( m, 1H),7.60 (m, 1H), 7.58 (m, 1H ), 7.15 (m, 2H), 6.95 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz,2H), 4.94 (m, 1H), 3.83 (m, 1H), 3.60 (m, 3H), 2.29 (m, 2H), 1.33 (m, 12H)。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种一锅法制备用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物的方法，其特征在于，以式（I）结构化合物和乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯为原料，在极性溶剂、偶联试剂存在的条件下反应一段时间后加入碱性试剂，继续反应一定时间后加入酸性试剂调节pH至酸性，经后处理制得式（II）结构化合物，即所述用于检测β-D-葡萄糖醛酸苷酶的底物；
Figure 434109DEST_PATH_IMAGE001
；
式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、卤素、CN、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6烯基、卤代C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、卤代C1-C6烷氧基、C3-C6环烷基；
所述极性溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的任一种；
所述偶联试剂为氧化银或碳酸银；
在极性溶剂、偶联试剂存在的条件下的反应温度为25-40℃；
所述碱性试剂为NaOH或KOH；所述酸性试剂为盐酸或硫酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1：将式（I）结构化合物和乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯加入反应瓶内，加入极性溶剂、偶联试剂，反应8-24h；
S2：搅拌条件下加入碱性试剂，控制反应温度为室温，反应4-8h后加入酸性试剂，调pH至2-3，后旋蒸掉极性溶剂并经反相纯化得到式（II）结构化合物即产物β-D-葡萄糖醛酸。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、卤素、CN、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、C1-C6烷基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，式（I）、（II）中R1、R2分别独立地选自H、甲基、异丙基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，式（I）、（II）中R1、R2同时为H，或者R1为甲基、R2为异丙基。
8.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，式（I）结构化合物与乙酰溴-α-D-葡萄糖醛酸甲酯的摩尔比为1:1-1:1.5；式（I）结构化合物与偶联试剂的摩尔比为1:1-1:1.5。
9.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，式（I）结构化合物与碱性试剂的摩尔比为1:1-1:1.5。
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