CN111196828A - 硒单糖代谢标志物的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人体尿液中占主导丰度的硒代谢标志物：1β‑甲基硒‑N‑乙酰基‑D‑半乳糖胺的合成方法，以全乙酰化D‑半乳糖胺为底物，经水相氯取代1α‑乙酸酯基，得“1α‑氯半乳糖胺四乙酸酯”中间体；然后用“一锅法”与二甲基二硒醚和硼氢化钠反应，生成1β‑甲基硒衍生物；最后在碱性条件中水解全部的醋酸酯以获得目标硒糖。

Description

硒单糖代谢标志物的合成方法

技术领域

本发明涉及含硒化合物合成技术领域，尤其涉及一种硒单糖代谢标志物的合成方法。

背景技术

硒是人体必需的微量矿物质，土壤中的硒浓度决定饮食中硒的成分与形式。硒缺乏所致“克山病”在我国北方和中西部偏远地区普遍发生，因此建立评价硒营养水平的生化指标极其必要。根据已知的硒合成代谢，作为人血浆硒库的蛋白P1(selenoprotein P1，简称SEP1)存在表达阈值，而其系列无机硒或其甲基化的产物测量误差较大，二者皆难与摄取的硒元素量之间建立起对应关系，所以皆不适宜于作为医学诊断、健康监测、食品安全评价等的有效标志物。鉴于此，尿液中的硒排除量有望成为潜在的评估终点。目前，已经通过液相色谱串联质谱分析发现并证实，人体尿液中存在硒排泄物，其中含量占据绝对主导的是一个学名为“1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺”的含硒单糖(selenosugar)。为进一步确立该糖型排出物与外源摄入硒之间的定量联系，有必要制定针对该硒代结构的科学计量方法，其关键在于标准曲线的测绘。然而，该内源性小分子(分子量300.035)的一般浓度水平极低(纳摩尔以下，即<10^-9M)，无法通过对生物样本的直接分离、富集得到上述甄定所需的高纯度标准试剂。于是，相比采用复杂的生物技术进行特种糖的炼制、提取，人工合成该天然产物便成为了一个更加简便、易行的方案。例如，文献“硒的生物标志物”(许嘉文等,国外医学医学地理分册2016,37(1))中虽然公开了多种硒的生物标志物，但却未提及这些物质的制备；文献“含硒化合物研究进展”(郭利等,中国新药杂志2000,3(9))则报道了多种含硒化合物的研究进展，其中也未涉及“1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺”的化学合成法。

1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺作为人体尿液中占主导丰度的硒代谢标志物，是一种含硒单糖分子，化学式为C₉H₁₈O₅Nse，结构式如下：

1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的传统有机制备流程是以D-半乳糖胺为原料，(a)首先与无水乙酸酐(CH₃CO)₂O和吡啶(C₅H₅N)过夜反应得到完全酯化的前驱体：D-半乳糖胺五乙酸酯；(b)蒸干上述体系的溶剂后，以二氯甲烷(CH₂Cl₂)为溶剂，加入四氯化钛(TiCl₄)，在40℃下隔绝水分回流3h生成1α-氯取代的半乳糖胺四乙酸酯；其后，(c)先将甲基二硒醚(CH₃Se)₂和硼氢化钠(NaBH₄)在不含水的乙腈(CH₃CN)溶剂中混合、回流40min生成甲硒酸钠(CH₃SeNa)，(d)再与上步所得中间体反应1h，得到1β-甲基硒衍生物；(e)最后，在甲醇钠(CH₃ONa)、甲醇(CH₃OH)中水解、去除乙酰基(-COCH₃)，获得目标硒糖化合物。

以上制备1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的过程中，采用的原料D-半乳糖胺为D-半乳糖胺五乙酸酯还原精制产品，成本较高，且存储不便；而且1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的整个合成过程步骤繁琐，条件苛刻，要求无水氛围，产物难以与杂质和副产物分离，导致产物产率和纯度较低。例如，在步骤(b)中，传统技术所使用的四氯化钛(TiCl₄)作为活性氯供体。该过渡金属盐极易水解变成[TiO(OH)]⁺等氧合阳离子的形式，导致氯阴离子(Cl^-)被大量电离而损失，失去亲核取代用氯自由基的功能。因此，必须搭配弱极性的非质子溶剂如二氯甲烷(CH₂Cl₂)，整体要求严格的无水氛围。另外，为保证在40℃加热时溶剂不挥发，还需架设回流冷凝装置。最严重的问题是，反应后加水将多余的Ti⁴⁺转变成TiO₂凝胶沉淀、再分液祛除，此过程会吸附1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯，致使其不能与杂质、副产物等完全相分离，往往造成该步的薄层色谱(thin-layer chromatography，简称TLC)分析零结果或纯度偏低(～50％)。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种硒单糖代谢标志物的合成方法，本发明不仅简化了1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的制备步骤和反应条件，还降低了必需化学品与能源动力的消耗，节约了整体操作、加工的成本，使整套流程表现得更加环境友好兼具原子经济性，产物产率和纯度较高。

本发明的一种1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的合成方法，包括以下步骤：

(1)将D-半乳糖胺五乙酸酯和乙酸酐(CH₃CO)₂O在酸性有机溶剂中反应，反应温度为20～25℃，得到1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯；

(2)将1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯和二甲基二硒醚(CH₃Se)₂在硼氢化钠(NaBH₄)的作用下，在醇和水混合溶液中反应，反应温度为20～25℃，得到1-甲基硒衍生物；

(3)将1-甲基硒衍生物在非质子碱性条件下，于20～25℃下水解，以将羧酸酯基全部还原成醇羟基，得到1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺；反应路线如下：

进一步地，在步骤(1)中，酸性有机溶剂包括浓盐酸(HCl)和有机溶剂。

进一步地，有机溶剂为乙醚(CH₃OCH₃)。

进一步地，在步骤(1)中，酸性有机溶剂的pH值为1～2。

进一步地，在步骤(1)中，将D-半乳糖胺五乙酸酯和乙酸酐的摩尔比为1：200。

进一步地，步骤(1)的反应时间为16h。

与传统技术相比，步骤(1)直接以全乙酰化的D-半乳糖胺、即D-半乳糖胺五乙酸酯为初始原料，其是微生物工程糖酵解的直接产物，发酵生产的成本低廉，国内化学品市场早已有现成的高纯度(>99％)商品货源。而传统方法使用的原料D-半乳糖胺实则是D-半乳糖胺五乙酸酯还原精制的产品。另一方面，不同于粉末性状、不吸水的全乙酰D-半乳糖胺，D-半乳糖胺五乙酸酯易潮解结块、自聚变色，须额外的干燥储存、干热称量、前处理等系列操作条件。因此，本发明简化了1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的有机合成步骤，降低了采购成本，并毋须吡啶(C₅H₅N)、无水乙酸酐(CH₃CO)₂O等低沸点、易挥发、易燃、环境不友好的化学媒介。

此外，在(1)中，不需传统技术所使用的四氯化钛(TiCl₄)作为活性氯供体。相比之下，本发明的反应条件温和，全程在极性溶剂中进行，无须加热，而且对体系含水量没有严格的要求。容易成功，在16h左右即可获得～75％的初产率，多次重复实验的平均产率超86％，由核磁共振氢谱(简称¹H NMR)鉴定的纯度在80％左右，反应相的其他成分也易蒸馏分离干净。

进一步地，在步骤(2)中，1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯、二甲基二硒醚和硼氢化钠的摩尔比为1：1：500。

进一步地，在步骤(2)中，醇为乙醇(C₂H₅OH)、甲醇(CH₃OH)或异丙醇(i-C₃H₇OH)。

进一步地，步骤(2)的反应时间为3h。

步骤(2)的合成过程中，相对于传统技术中二甲基二硒醚(CH₃Se)₂必须预先单独地被过量硼氢化钠(NaBH₄)还原成甲硒酸钠(CH₃SeNa)、从中分离出再添加至无水乙腈(CH₃CN)溶解的1α-氯代半乳糖胺四酸酯中用于取代氯。本发明采用极性更大的醇做为反应介质，将步骤(1)所得中间产物直接与按先后顺序与按先后顺序投放的(CH₃Se)₂和NaBH₄快速混合，促成1α位氯被1β位的硒甲基取代。将分步反应合并成“一壶”，减少了易燃易爆的高活性还原剂的用量和转移操作；反应时间短，时效高，产率达90％，而纯度接近95％，从而有效保证了最终脱脂产物的产出量和纯度。

进一步地，在步骤(3)中，以醇钠作溶质，以醇(CH₃OH)为溶剂以提供非质子碱性条件。

进一步地，醇钠为甲醇钠(CH₃ONa)、乙醇钠或异丙醇钠；醇为甲醇、乙醇或异丙醇。

进一步地，步骤(3)的反应时间为1h。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明以全乙酰化D-半乳糖胺为底物，经水相氯取代1α-乙酸酯基，得“1α-氯半乳糖胺四乙酸酯”中间体；然后用“一锅法”与二甲基二硒醚和硼氢化钠反应，生成1β-甲基硒衍生物；最后在碱性条件中水解全部的醋酸酯以获得目标硒糖。

本发明不仅简化了该硒单糖代谢标志物的制备步骤和反应条件，还降低了必需化学品与能源动力的消耗，节约了整体操作、加工的成本，使整套流程表现得更加环境友好兼具原子经济性，适用于高纯(>95％)甲基硒化单糖的批量化工生产及其进一步提纯精制，有助于推动硒代谢物鉴定之国家标准的颁布、和相关即时检验产品的设计开发。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1是本发明制备的1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯的¹H NMR谱图；

图2是本发明制备的1-甲基硒衍生物的¹H NMR谱图；

图3是本发明制备的1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的¹H NMR谱图；

图4是1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的ChemBioDraw Ultra v12.0软件模拟¹HNMR谱；

图5是本发明制备的1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的HPLC分离报告。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例：硒单糖代谢标志物1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的合成方法

合成路线如下：

具体步骤如下：

(1)向反应瓶中加入D-半乳糖胺五乙酸酯0.5g，并加入浓盐酸(HCl)0.25mL、乙醚(CH₃OCH₃)15mL和乙酸酐(CH₃CO)₂O10 mL，室温下搅拌反应，使得乙酸酐取代D-半乳糖胺五乙酸酯上的1α-乙酰基(-COCO₃)，得1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯。反应16小时后，结束反应，在乙酸乙酯/乙醚(9:1v/v)的混合溶剂中重结晶。产物产率为75％，¹H-NMR测试(图1)结果表明，产物纯度为80％。

(2)以15mL乙醇(C₂H₅OH)水溶液(90wt.％)为反应介质，加入步骤(1)所得物料“1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯”、0.5g硼氢化钠(NaBH₄)和30mg二甲基二硒醚(CH₃Se)₂，转化生成1-甲基硒衍生物。反应1小时后，结束反应，先用含30mg无水硫酸钠的氯仿溶液稀释糖浆状残留物、并过滤，再让滤液在乙酸乙酯/丙酮(9:1v/v)的混合溶剂中重结晶。产物产率为90％，¹H-NMR测试(图2)结果表明，纯度接近95％。

(3)用0.3mL 1M的甲醇钠(CH₃ONa)作溶质、4mL甲醇(CH₃OH)为溶剂，在该非质子碱性条件下，室温水解、去除其余四个羧酸脂的乙酰基，将其尽数还原成醇羟基。向所得溶液通入饱和CO₂中和pH值，再经阳离子交换树脂处理，减压蒸去水分，最后在甲醇/乙醚(9:1v/v)的混合溶剂中重结晶，获得目标硒单糖1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺。

将步骤(3)所得终产物溶于氘代二甲亚砜，经400MHz ¹HNMR谱图表征(图3)，呈现了与ChemBioDraw Ultra v12.0软件模拟结果一致的特征峰(详见图4)，表明本发明得到了目标产物。图3中，核磁峰归属如下：δ1.793(1β-SeCH₃)，δ1.957(2α-COCH₃)，δ3.320、δ3.337(4-CH)，δ3.477、δ3.479、δ3.491、δ3.495、δ3.505(3β,4β,5β-OH)，δ3.701、δ3.917、δ3.942(5-CH)，δ4.471、δ4.497(5β-CH₂)，δ4.521、δ4.531(2-CH)，δ4.584、δ4.599(3-CH)，δ4.662、δ4.678(1-CH)，δ7.631、δ7.654(2α-NH)。

根据电导率检测仪的结果，以环己烷:氯仿(1:1v/v)为流动相，由高效液相色谱(HPLC)的保留时间与峰面积积分，确定终产物的成分单一(图5)；最后，通过质谱(MS)的碎片峰，其主要集中在质量/电荷比(m/z)为299.0左右，与理论结构对应的化学式量300.0非常接近，同样表明本发明得到了目标产物。

图5中，目标产物峰对应的参数如表1所示：

表1图5中峰参数

	保留时间(min)	高度	高度％	峰宽(min)	面积	面积％
							1	0.533	107.587	100.00	0.050	354.852	100.00

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将D-半乳糖胺五乙酸酯和乙酸酐在酸性有机溶剂中反应，反应温度为20～25℃，得到1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯；

(2)将所述1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯和二甲基二硒醚在硼氢化钠的作用下，在醇和水混合溶液中反应，反应温度为20～25℃，得到1-甲基硒衍生物；

(3)将所述1-甲基硒衍生物在非质子碱性条件下，于20～25℃下水解，以将羧酸酯基全部还原成醇羟基，得到所述1β-甲基硒-N-乙酰基-D-半乳糖胺；反应路线如下：

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述酸性有机溶剂包括浓盐酸和有机溶剂。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙醚。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述酸性有机溶剂的pH值为1～2。

5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述将D-半乳糖胺五乙酸酯和乙酸酐的摩尔比为1：200。

6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述1α-氯代半乳糖胺四乙酸酯、二甲基二硒醚和硼氢化钠的摩尔比为1：1：500。

7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述醇为乙醇、甲醇或异丙醇。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：在步骤(3)中，以醇钠作溶质，以醇为溶剂以提供非质子碱性条件。

9.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于：所述醇钠为甲醇钠、乙醇钠或异丙醇钠；所述醇为甲醇、乙醇或异丙醇。

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