CN109929003B - 含唾液酸糖基单元的四苯乙烯化合物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用聚集诱导发光探针检测唾液酸酶活性，具体地，本发明涉及两种含唾液酸糖基单元的四苯乙烯类化合物，其制备方法及在唾液酸酶检测上的应用。本发明中所设计的化合物，具有式(I和II)所示的结构，唾液酸糖基单元为3个或4个，唾液酸糖基是通过三氮唑以及季戊四醇连接到四苯乙烯上。本发明中的化合物可应用于唾液酸酶的检测，在诊断与唾液酸酶相关的疾病中具有应用价值。

Description

含唾液酸糖基单元的四苯乙烯化合物、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基于聚集诱导发光效应的荧光探针研究领域，具体地，本发明涉及两种通过三氮唑和/或季戊四醇连接的含多唾液酸糖基的四苯乙烯类化合物，其制备方法及其在唾液酸酶活性检测中的应用。

背景技术

唾液酸酶，即神经氨酸酶，其酶学代码为EC 3.2.1.18，可催化水解天然的或合成的α-唾液酸糖苷化合物。唾液酸酶广泛存在于细菌、病毒和动物细胞中，如可产唾液酸酶的细菌包括肺炎链球菌、产气荚膜梭菌、霍乱弧菌等；病毒包括流感病毒、腮腺炎病毒、仙台病毒等。很多危害人类健康的疾病都与唾液酸酶有关，如霍乱弧菌唾液酸酶可分解肠粘膜上皮细胞表面的神经节苷脂，继而扰乱细胞正常的离子通道功能，导致人体脱水等。流感病毒的唾液酸酶可催化水解宿主细胞表面唾液酸残基与流感病毒表面红血球凝集素间的糖苷键，加快新形成的流感病毒在体内的扩散。另外，患细菌性阴道炎的妇女，其阴道分泌物中含有可产生唾液酸酶的细菌，唾液酸酶的活性与细菌性阴道炎密切相关。

基于糖苷键断裂后，发色团光学性质的变化，一些单唾液酸苷化合物，如5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神经氨酸及其盐，2′-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰基神经氨酸等应用于唾液酸酶的检测(Bioorganic&Medicinal Chemistry,1,147-149,1993；Analytical Biochemistry,94,287-296,1979)。这些检测底物与唾液酸酶作用后，其光学信号要么依赖于进一步的显色反应，要么受到检测分子自身光学性质的影响，在实际应用中存在一定的局限性。开发新的设计思路，发展新型的唾液酸酶检测底物，可以为唾液酸酶抑制剂筛选、细菌性阴道炎诊断等提供更加便利的研发工具。

聚集诱导发光类探针由于其独特的光学性质受到普遍关注，当该类分子以单分子状态溶解在溶液中时，分子不发荧光；当分子发生聚集导致分子内运动受限时，分子发出强烈的荧光，该类分子已广泛应用于生物分子检测相关领域。本发明中所设计的唾液酸酶检测底物具有新颖的分子结构，是一类具有聚集诱导发光效应的荧光探针。

发明内容

本发明的目的在于提供两种含多唾液酸糖基单元的四苯乙烯类化合物，其结构如式(I和II)所示。

本发明的另一目的是将上述两种化合物作为唾液酸酶检测底物，以提供一种检测唾液酸酶活性的新方法。

为达到上述发明目的，本发明提出以下技术方案：

本发明的三氮唑以及季戊四醇连接的含多唾液酸糖基单元的四苯乙烯类化合物(I和II)的制备方法采用模块法制备，即保护基保护的叠氮化唾液酸糖苷模块1、季戊四醇连接模块2、炔基或叠氮基取代的四苯乙烯模块3或4。不同模块通过click反应连接在一起，最后脱掉唾液酸基团上的保护基得到最终化合物。

具体步骤如下：

步骤A、利用(p-Tol)₂SO/Tf₂O预活化策略构建唾液酸糖苷键的方法，制备保护基保护的含叠氮的唾液酸糖苷模块1。

步骤B、以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，制备四炔丙基季戊四醇连接模块2。

步骤C、通过McMurry反应制备叠氮基或炔基取代的四苯乙烯类化合物3和4。

步骤D、模块间通过铜催化的click反应进行组合，将不同个数的唾液酸糖基单元连接到四苯乙烯母核上。

步骤E、用甲醇钠的甲醇溶液和氢氧化锂的四氢呋喃/水溶液先后处理，脱除唾液酸糖基单元上的保护基，得到式I、II化合物。

本发明所制备的含多唾液酸糖基单元的四苯乙烯类化合物，采用了模块法合成，合成路线灵活可控。由于唾液酸糖基单元良好的水溶性和四苯乙烯分子的聚集诱导发光性质，含多唾液酸的四苯乙烯类化合物在水中有很好的溶解度，荧光强度很弱。唾液酸酶可以作用于天然的或合成的唾液酸糖苷类底物，切断唾液酸糖苷键，当式I和式II化合物分子被唾液酸酶裂解后，可溶性的唾液酸基团从分子中脱去，四苯乙烯荧光团母核在水溶液中的溶解度骤减，分子发生聚集，荧光强度增强。通过可溶性糖基单元的连接和断裂来调控式I和式II分子的溶解性，根据该机理，式I和式II化合物可实现唾液酸酶活性的检测。由于唾液酸酶可以同时与式I和式II化合物中的多个糖苷键位点发生作用，使得唾液酸酶活性检测灵敏度提高。此外，本发明所述的化合物是典型的具有聚集诱导发光效应的化合物、具有良好的光稳定性和化学稳定性等优点。

检测时，含不同量的唾液酸酶样品和20μM底物(式I、II所述化合物)在pH7.1的磷酸盐缓冲溶液中充分混合摇匀，另以不加唾液酸酶样品溶液为对照，于37℃震荡60min。用荧光光谱仪在380nm激发测定荧光强度，观察溶液荧光强度的变化，根据510nm处荧光强度增强倍数，可以检测溶液中唾液酸酶的活性。我们所发明的唾液酸酶活性检测方法在检测唾液酸酶相关疾病方面具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为本发明中所提供式I化合物的合成路线图；

图2为本发明中所提供式II化合物的合成路线图；

图3为本发明中20μM式I化合物与不同浓度唾液酸酶作用1小时后的荧光光谱图；

图4为本发明中20μM式I化合物荧光增强倍数与唾液酸酶活性关系图；

图5为本发明中20μM式II化合物与不同浓度唾液酸酶作用1小时后的荧光光谱图；

图6为本发明中所提供式I和式II化合物化学结构式图

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步的说明：

实施例1

式I化合物的合成。

附图1示出了式I化合物的合成路线图。

步骤A：N-乙酰基-7，8，9-三-O-乙酰基-5-N,4-O-噁唑烷酮-2-(3-叠氮基丙氧基)唾液酸甲酯(化合物1)

分子筛加入长反应瓶中，加热灼烧除水，冷却后加入N-乙酰基-7，8，9-三-O-乙酰基-5-N,4-O-噁唑烷酮保护的唾液酸对甲基苯硫苷(化合物1-1，136.4mg，0.235mmol)，对甲苯基亚砜(108.1mg，0.469mmol)，密封反应管，用氩气置换气体3次，加入无水二氯甲烷(8mL)。反应管置于-70℃下搅拌15分钟，用微量注射器加入三氟甲磺酸酐(47μL)，-70℃下搅拌30分钟，加入3-叠氮-1丙醇(35.6mg，0.352mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液。反应在-70℃搅拌2小时后，再在-50℃搅拌2小时。加入三乙胺(0.2mL)淬灭反应，反应体系用二氯甲烷稀释，硅藻土过滤，滤液用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥。过滤浓缩后，粗产品用柱层析分离纯化得到中间化合物1(108.8mg，83.1％)。

步骤C：1,1,2,2-四-(4-乙炔基苯基)-乙烯(化合物3)

化合物3根据附图1中的流程，以4,4'-二溴二苯甲酮和三甲基硅炔为起始原料经过两步反应制备。

步骤D：click偶合产物5

将化合物1(119.7mg,0.214mmol)和化合物3(18.3mg,0.0427mmol)溶于四氢呋喃中(6mL)，先后加入新制备的抗坏血酸钠的水溶液(8.5mg/mL,1mL)和五水硫酸铜的水溶液(5.4mg/mL,1mL)。将上述混合液置于50℃的油浴中搅拌4小时，再加1mL新制备的抗坏血酸钠的水溶液(8.5mg/mL)和1mL五水硫酸铜的水溶液(5.4mg/mL)于反应体系中。混合体系在50℃氩气环境下反应30小时。将反应液冷却至室温后，加入饱和氯化铵的水溶液20mL，混合物用二氯甲烷萃取两次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化得到化合物5(61mg，产率53.6％)。¹H NMR(400MHz,)δ7.81(s,1H),7.58(d,J＝8.2Hz,2H),7.13(d,J＝8.2Hz,2H),5.56(dd,J＝8.4,1.3Hz,1H),5.41(td,J＝7.9,2.7Hz,1H),4.61(dd,J＝9.4,1.3Hz,1H),4.57–4.41(m,2H),4.36(dd,J＝12.2,2.7Hz,1H),4.05–3.93(m,2H),3.91–3.81(m,1H),3.77–3.66(m,4H),3.44–3.30(m,1H),2.83(dd,J＝12.1,3.4Hz,1H),2.48(s,3H),2.27–2.15(m,2H),2.13–2.02(m,7H),1.99(s,3H).¹³C NMR(151MHz,)δ172.14,170.87,170.35,170.15,168.78,153.73,147.49,143.44,140.74,132.06,129.15,125.27,120.23,99.16,75.62,74.91,71.82,68.84,63.43,62.44,59.13,53.23,47.37,36.58,30.53,24.78,21.23,21.03,20.88.MS(ESI)计算值(M+Na)⁺C₁₂₂H₁₄₀N₁₆O₅₂Na，2683.8695；实际值2683.9348。

步骤E：式I化合物的合成

化合物5(60mg,0.0225mmol)溶于3mL甲醇中，逐滴加入甲醇钠的甲醇溶液(5.4M,0.1mL)。常温反应3小时后，将反应液用酸性树脂中和至中性。过滤除去树脂，旋蒸除去溶剂，残余物溶于四氢呋喃和水的混合液(四氢呋喃：2mL；水：1mL)中。加入一水合氢氧化锂(26mg)，室温搅拌过夜。再加入酸性树脂调pH至中性，过滤除去树脂，旋蒸除去溶剂。残余物用P2聚丙烯酰胺凝胶柱分离，得式I化合物(40.5mg，产率90％)。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.98(s,1H),7.44(s,2H),6.96(s,2H),4.55–4.15(m,2H),3.84–3.33(m,10H),2.67–2.49(m,1H),2.01(s,1H),1.94(s,3H),1.58–1.42(m,1H).¹³C NMR(101MHz,D₂O)δ175.61,174.08,147.25,144.16,132.59,128.53,125.67,100.99,73.26,72.25,68.82,68.69,62.96,61.74,52.68,48.41,40.93,30.29,22.69.HRMS(ESI)计算值(M+H)⁺C₉₀H₁₁₇N₁₆O₃₆，1998.7844；实际值1998.7851。

实施例2

式II化合物的合成。

附图2示出了式II化合物的合成路线图。

步骤A：N-乙酰基-7，8，9-三-O-乙酰基-5-N,4-O-噁唑烷酮-2-(3-叠氮基丙氧基)唾液酸甲酯(化合物1)，根据实施例1步骤A所述方法制备。

步骤B：四炔丙基季戊四醇(化合物2)

季戊四醇(1.3615g，10mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中(35mL)，冰盐浴下慢慢加入油分散的氢化钠(120mmol)，搅拌30分钟后，慢慢加入炔丙基溴(6mL)。反应液在40℃反应2.5小时后，再补加3mL炔丙基溴。反应液置于50℃的油浴中反应16小时，冷却至室温后，加水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取两次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗产品用柱层析纯化，得中间体化合物2(2.747g，91.8％)。

步骤C：1，1-二(4-甲氧基苯基)-2-苯基-2-(4-叠氮基苯基)乙烯(化合物4)

根据附图2中的流程，先通过McMurry反应合成化合物4-1。接着，化合物4-1(528mg，1.12mmol)，叠氮化钠(291mg，4.48mmol)，抗坏血酸钠(33.3mg，0.168mmol)，碘化亚铜(64mg,0.336mmol)和N,N’-二甲基乙二胺(44.4mg，0.5mmol)溶解在用氩气脱气后的异丙醇和水的混合溶剂中(异丙醇：28mL；水：12mL)。在避光条件和氩气气氛中，反应液回流搅拌7小时。冷却后，反应液用水稀释，用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。粗产物用柱层析分离纯化得到1，1-二(4-甲氧基苯基)-2-苯基-2-(4-叠氮基苯基)乙烯(化合物4)(365.6mg，75.3％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.12(d,J＝6.9Hz,3H),7.06–6.86(m,8H),6.78(d,J＝8.3Hz,2H),6.66(dd,J＝13.8,8.6Hz,4H),3.75(d,J＝10.0Hz,6H).¹³C NMR(101MHz)δ158.30,158.23,144.13,141.35,140.56,138.25,137.63,136.27,136.25,132.91,132.69,132.67,131.47,127.90,126.37,118.49,113.28,113.12,55.22,55.19.

步骤D：click偶合产物6和7

1)click偶合产物6的合成

化合物4(200mg,0.461mmol)和四炔丙基季戊四醇2(1.33g,4.61mmol)溶于四氢呋喃中(12mL)，氩气气氛下，加入抗坏血酸钠的水溶液(9.15mg/mL,4mL)和五水硫酸铜的水溶液(5.75mg/mL,4mL)。反应液在70℃反应1.5h，冷却至室温后，加入饱和氯化钠溶液和乙酸乙酯，收集有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物用柱层析分离，得到化合物6(150.2mg,45.1％)。¹H NMR(600MHz)δ7.95(s,1H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.18–7.08(m,5H),7.03(d,J＝7.9Hz,2H),7.00–6.89(m,4H),6.65(dd,J＝12.9,8.8Hz,4H),4.71(s,2H),4.12–4.09(m,6H),3.74(d,J＝3.0Hz,6H),3.54(s,2H),3.53(s,6H),2.42–2.32(m,3H).¹³C NMR(151MHz)δ158.50,158.42,146.47,145.22,143.80,141.53,137.78,135.96,135.94,134.93,132.73,132.66,131.47,128.03,126.57,120.37,119.90,113.41,113.19,80.14,74.31,69.38,69.09,65.32,58.84,55.22,45.07.HRMS(ESI)计算值(M+Na)⁺C₄₅H₄₃N₃O₆Na，744.3044；实际值744.3048。

2)click偶合产物7的合成

化合物1(134.6mg，0.241mmol)和6(43.5mg，0.06mmol)加入到反应瓶中，密封，用氩气置换气体3次，加入6mL四氢呋喃。搅拌均匀后，分两次共加入抗坏血酸钠(19mg)和五水硫酸铜(12mg)的水溶液4mL。混合物在60℃搅拌36小时，加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，再加入二氯甲烷萃取两次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物用柱层析纯化，得到化合物7(77.8mg,53.9％)。¹H NMR(600MHz)δ7.97(s,1H),7.64(s,3H),7.49(d,J＝8.0Hz,2H),7.16(d,J＝8.1Hz,2H),7.14–7.07(m,3H),7.02(d,J＝7.5Hz,2H),6.94(dd,J＝19.0,8.2Hz,4H),6.64(dd,J＝12.0,8.5Hz,4H),5.58(d,J＝8.3Hz,3H),5.47–5.26(m,3H),4.65–4.34(m,20H),4.13–3.96(m,6H),3.91–3.83(m,3H),3.78(s,9H),3.73(s,9H),3.55–3.42(m,8H),3.40–3.30(m,3H),2.83(dd,J＝12.0,3.1Hz,3H),2.47(s,9H),2.20–2.04(m,27H),2.00(s,9H).¹³C NMR(101MHz)δ172.12,170.82,170.29,170.15,168.80,158.51,158.42,153.74,145.92,145.25,143.83,141.56,137.72,135.93,134.80,132.77,132.73,132.65,131.46,130.19,128.02,126.54,122.97,120.78,119.78,113.40,113.18,99.17,75.63,74.96,71.82,69.34,68.89,65.14,63.34,62.45,59.13,55.22,53.21,47.34,45.49,36.61,30.54,29.80,24.79,21.24,21.06,20.89.MS(ESI)计算值(M+H)⁺C₁₁₁H₁₃₄N₁₅O₄₅，2397.8686；实际值2397.9267。

步骤E：式II化合物的合成

化合物7(77.8mg，0.0325mmol)溶解在3mL甲醇中，加入甲醇钠的甲醇溶液(5.4M，0.1mL)，反应液在室温搅拌2h。加入酸性数值中和反应液pH至7，过滤，浓缩。加入2mL四氢呋喃和1mL水，再加入26mg一水合氢氧化锂。混合物室温搅拌过夜，加入酸性树脂中和pH至7，过滤，浓缩，通过P2聚丙烯酰胺凝胶柱分离纯化，真空冷冻干燥后得到式II化合物(43.1mg，70％)。¹H NMR(600MHz)δ7.85(s,4H),7.19(s,2H),7.00–6.23(m,15H),4.50–4.20(m,13H),4.09–2.81(m,48H),2.68(s,3H),2.15–1.85(m,15H),1.61(s,3H).MS(ESI)计算值(M+H)⁺C₈₇H₁₁₆N₁₅O₃₃，1898.7854；实际值1898.7951。

实施例3

式I化合物检测唾液酸酶性能测试

1)原理：唾液酸酶可以作用于天然的或合成的唾液酸糖苷类底物，目标化合物与唾液酸酶作用后，糖苷键断裂，助溶性的唾液酸单元离去，分子溶解度下降，发生聚集诱导发光现象。通过荧光变化，可灵敏地检测唾液酸酶的活性。

2)测试材料：

市售唾液酸酶(该唾液酸酶产于产气荚膜梭菌，1个活力单位的定义为：以唾液酸(2→3)乳糖为底物在pH 5.0和37℃下，一单位本品可每分钟释放出1.0μmol N-乙酰基神经氨酸。

磷酸盐缓冲溶液：pH 7.1.

式I化合物：10mM储备液。

3)测试方法：

不同浓度的唾液酸酶与式I化合物在在pH7.1的磷酸盐缓冲溶液中充分混合摇匀，式I化合物的终浓度为20μM，混合溶液在37度震荡1小时，测定溶液荧光强度变化，激发波长为380nm，发射波长为510nm，对照实验为不加唾液酸酶、只含20μM式I化合物的磷酸盐缓冲溶液。测定结果见附图3所示。将含不同唾液酸浓度的溶液荧光强度相对于空白实验增强的倍数，对唾液酸酶浓度作图，可得曲线图如附图4所示。根据结果，可看出随着唾液酸酶浓度的增高，荧光增强倍数逐渐增高，增强倍数最高可以达到原来的45倍左右(I/I₀)，呈现出很高的检测灵敏度。

实施例4

式II化合物检测唾液酸酶性能测试

类比实施例3，不同浓度的唾液酸酶样品和20μM式II所述化合物在pH7.1的磷酸盐缓冲溶液中充分混合摇匀，另以不加唾液酸酶样品溶液为对照，于37℃震荡60min。用荧光测试仪在380nm激发下测定荧光强度，观察溶液荧光强度的变化，测定结果见附图5所示，显示式II化合物可以应用于唾液酸酶的检测。

Claims (2)

1.一种含唾液酸糖基单元的四苯乙烯化合物，其特征在于，具有以下式I或II所述结构：

2.制备权利要求1所述的化合物的方法，为模块法，包括以下步骤：

步骤A、利用(p-Tol)₂SO/Tf₂O预活化策略构建唾液酸糖苷键，制备含保护基的叠氮化唾液酸糖基单元1；

步骤B、碱性条件下，季戊四醇和炔丙基溴反应制备炔基取代的季戊四醇连接单元2；

步骤C、通过McMurry反应制备炔基或叠氮基取代的四苯乙烯类化合物3或4；

步骤D、通过一价铜催化的click反应，将唾液酸糖基单元1通过连接单元连接到四苯乙烯母核上；

步骤E、用甲醇钠的甲醇溶液和氢氧化锂的四氢呋喃/水溶液先后处理，脱掉唾液酸糖基单元上的保护基，得到权利要求1所述的化合物。

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