DE4119085A1

DE4119085A1 - Verfahren zur detektion und/oder quantitativen bestimmung von 9-n/o-acetylierten sialinsaeuren

Info

Publication number: DE4119085A1
Application number: DE19914119085
Authority: DE
Inventors: Gert Zimmer; Gerd Dr Reuter; Roland Prof Dr Schauer
Original assignee: Pallmann Biotechnik Dr GmbH
Current assignee: Pallmann Biotechnik Dr GmbH
Priority date: 1991-06-10
Filing date: 1991-06-10
Publication date: 1992-12-17
Also published as: EP0589983A1; WO1992022672A1; DE4119085C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung von 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren, die an Trägermoleküle gebunden sind. Bei den Trägermolekülen kann es sich um Kohlenhydrate, insbesondere komplexe Kohlenhy drate, Zellen, Gewebe oder andere biologische Materialien han deln. Die Sialinsäuren können synthetisch oder natürlich 9- N/O-acetyliert sein.

Die Neuraminsäure ist als N- und O-acetylierte Verbindung weit verbreitet. Es gibt etwa ca. 30 Abkömmlinge, die man zusammen fassend als Sialinsäuren bezeichnet, die Bestandteil vieler bakterieller und tierischer Glykolipide und Glykoproteine sind. Sialinsäuren kommen im menschlichen Körper überall vor, insbesondere im Blut, in schleimigen Absonderungen (Mucinen) und in Zellmembranen. Sie überziehen als Bestandteil von Gly koproteinen und Glykolipiden alle Zellen höherer Tiere und des Menschen mit einer elektronegativen Schicht und haben dort vielfältige biologische Funktionen. Einige dieser Funktionen stehen im engen Zusammenhang mit bestimmten Modifikationen der N-Acetylneuraminsäure, insbesondere mit ihrer häufig in der Natur vorkommenden Veresterung mit Essigsäure an der Position 9 (9-O-Acetylierung). Als Beispiel hierfür kann man nennen: Schutz gegenüber Sialidaseeinwirkung; Vermittlung der Bindung von Influenza-C-Viren und Coronarviren an ihren Wirtszellen; Maskierung der Rezeptoren für Influenza-A- und B-Viren; Anti genität von bakteriellen Kapseln. Ferner ist bekannt, daß das 9-O-acetylierte Gangliosid GD3 ein Tumormarker beim malignen Melanom des Menschen ist. Beim Mamma-Karzinom des Menschen wurde eine vermehrte Bildung von Neu5,9Acz auf T-Lymphozyten festgestellt. Änderungen gibt es auch während der Entwicklung von Gehrin und anderen Geweben und Zellen von Säugetieren. Bei Tumoren des menschlichen Dickdarms ist die 9-O-Acetylie rung verringert. Auch gibt es Lektine mit einer Spezifität für 9-O-acetylierte Sialinsäuren.

Es besteht daher ein Bedürfnis danach, Sialinsäuren und insbe sondere 9-O-acetylierte Sialinsäuren erkennen oder bestimmen zu können, um aus den erhaltenen Daten beispielsweise schlie ßen zu können, ob eine Tumorerkrankung vorliegt oder nicht.

Gängige Methoden zur Untersuchung von Sialinsäuren in biologi schen Materialien beruhen noch heute weitgehend auf chemisch analytischen Verfahren. Die meisten dieser Methoden machen es notwendig, die Sialinsäure entweder enzymatisch oder chemisch von den Trägermolekülen, beispielsweise komplexen Kohlenhydra ten, abzuspalten und zu reinigen. Es kann dann das Problem auftreten, daß die Sialinsäuren nur unvollständig abgespalten werden. Auch kann die labile Acetylgruppe zerstört werden. Für viele dieser Methoden sind im übrigen erhebliche Materialmen gen erforderlich. Die Bedeutung der 9-O-acetylierten Sialin säuren, insbesondere die veränderte Biosynthese bei verschie denen Tumorarten, macht daher die Bereitstellung neuer, die genannten Nachteile vermeidender Analysenverfahren erforder lich.

Es ist bekannt, daß sich Influenza-C-Viren an 9-O-acetylierte Sialinsäuren binden können.

Diese Influenza-C-Viren infizieren im übrigen die oberen Atem wege des Menschen und verursachen bei Kindern bis zum 10. Le bensjahr leichte fiebrige Infekte. Altere Personen sind auf grund hoher Antikörpertiter im Blut gegenüber Infektionen mit Influenza-C-Viren weitgehend geschützt, so daß keine aufwendi gen Schutzmaßnahmen für die Arbeit mit diesen Viren erforder lich sind.

Die Influenza-C-Viren können in bestimmten Zellkulturen oder in befruchteten Hühnereiern relativ leicht vermehrt werden. Die damit im Zusammenhang stehenden Arbeitsweisen bzw. Ar beitstechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Bei diesen Viren handelt es sich um allgemein zugängliche Viren.

Die Influenza-C-Viren sind von einer Membranhülle umgeben, in welcher mehrere Kopien eines viralen Glykoproteins in Form so genannter "Spikes" verankert sind. Auf diesem Glykoprotein sind drei voneinander unabhängige Aktivitäten lokalisiert, die bei der Infektion der Wirtszellen eine wichtige Rolle spielen. Es handelt sich dabei zum einen um das Hämagglutinin, welches einen Abschnitt auf dem Molekül mit Lektincharakter darstellt. Das Hämagglutinin erkennt spezifisch 9-N/O-acetylierte Sialin säuren als Rezeptordeterminanten und vermittelt die Bindung der Viren an ihre Wirtszellen. Eine andere Aktivität ist die Sialat 9-O-Acetylesterase. Es handelt sich dabei um ein Enzym, das die Rezeptoren zerstört, indem es die 9-O-Acetylgruppen, nicht jedoch die 9-N-Acetylgruppen von den Sialinsäuren ab spaltet. Eine weitere Aktivität ist die Fusionsaktivität, die im Rahmen der vorstehenden Betrachtungen jedoch keine ent scheidende Rolle spielt.

Ähnliche Verhältnisse werden auch bei verschiedenen Coronarvi ren gefunden, die ebenfalls 9-O-acetylierte Sialinsäuren als Rezeptordeterminante benutzen und ein O-Acetylesterase besit zen. Auch hier sind Hämagglutinin und Esterase zwei Aktivitä ten eines Glykoproteins.

Es ist auch schon versucht worden, Influenza-C-Viren als "analytisches Instrument" zur Detektion bzw. Bestimmung von 9- O-acetylierten Sialinsäuren einzusetzen. Dabei taucht jedoch das Problem auf, daß die virale Esterase die Virusbindung wie der aufhebt, indem es die 9-O-Acetylgruppen abspaltet. Es wurde daher auch schon versucht, die Esteraseaktivität der In fluenza-C-Viren mit dem hochtoxischen Esterasehemmer Diisopro pylfluorophosphat (DFP) spezifisch zu hemmen, um die Bindung von mit Biotin markierten Viren an rote Blutkörperchen der Maus mit Avidinkonjugaten nachzuweisen. Eine derartige Vorgehensweise hat unter anderem den Nachteil, daß Biotin von sich aus bereits in biologischen Materialien vorkommt, wodurch die Zuverlässigkeit der gewonnenen analytischen Daten beeinträchtigt wird. Außerdem kann die chemische Modifikation der Viren mit Biotin deren Bindungseigenschaften unkontrolliert beeinflussen oder sogar aufheben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung von an Trägermoleküle gebundenen 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren bereitzustellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Lehre des Anspruchs 1.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein biologisches Testsy stem dar, das die spezifische Bindung von Influenza-C-Viren oder Coronarviren an natürlich oder synthetisch 9-N/O-acety lierte Sialinsäuren, die an Trägermoleküle gebunden sein kön nen, direkt mit Hilfe der viralen O-Acetylesterase enzymatisch nachweist. Als Trägermoleküle können dabei Kohlenhydrate, ins besondere komplexe Kohlenhydrate, Zellen, Gewebe und jedes an dere beliebige biologische Material dienen. Es ist auch mög lich, in der Natur vorkommende frei 9-O-acetylierte Sialinsäu ren sowie künstlich synthetisierte 9-N-acetylierte Sialinsäu ren zu detektieren bzw. zu bestimmen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur die Viren als Einheit eingesetzt werden, sondern es ist auch möglich, die viralen Glykoproteine in isolierter oder rekombinanter Form zur Anwendung zu bringen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es beispielsweise mög lich, das generelle Vorkommen 9-N/O-acetylierter Sialinsäuren nachzuweisen. Ferner ist es möglich, die Menge der vorhandenen Rezeptoren quantitativ abzuschätzen. Eine weitere Anwendungs möglichkeit ist die Substanzidentifizierung bei vorhergehender Auftrennung (beispielsweise durch Elektrophorese, Dünnschicht chromatographie).

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Da ten ermöglichen Rückschlüsse beispielsweise darüber, ob eine Tumorerkrankung vorliegt oder nicht.

Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt zwei der oben geschilder ten biologischen Aktivitäten des viralen Glykoproteins aus, nämlich einerseits die spezifische Bindung der Viren an Trä germoleküle, insbesondere komplexe Kohlenhydrate, mit 9-N/O- acetylierten Sialinsäuren über ihr Hämagglutinin und anderer seits die Esteraseaktivität der gebundenen Viren zu deren Nachweis.

Es ist als äußerst überraschend anzusehen, daß es möglich ist, die Esteraseaktivität der gebundenen Viren zu deren Nachweis einsetzen zu können, denn diese Esterase würde normalerweise die Virusbindung wieder aufheben, indem es die 9-O-Acetylgrup pen abspaltet. Dieses Problem der Rezeptorzerstörung durch dieses Enzym wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die bei den Aktivitäten, nämlich Hämagglutinin und Esterase, zeitlich getrennt bei verschiedenen Temperaturen aktiv sind. Daher ist es auch nicht erforderlich, wie dies im Stand der Technik be schrieben ist, die Esterase zu hemmen. Vielmehr kann ihre Ak tivität für die Detektion der gebundenen Viren genutzt werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Bindung der In fluenza-C-Viren bzw. Coronarviren an die Trägermoleküle bei einer Temperatur, bei der die Esterase praktisch inaktiv ist. Man arbeitet dabei vorzugsweise bei einer Temperatur von 2 bis 6°C und insbesondere bei etwa 4°C. Man kann auch bei Tempera turen arbeiten, die oberhalb von 6°C liegen, z. B. bis zu 10°C. Jedoch wird die Esterase umso aktiver, je höher die Temperatur ist.

Vorzugsweise immobilisiert man außerdem die die Sialinsäuren tragenden Trägermoleküle an einem Trägermaterial. Dieses wäscht man dann nach der Bindung der Viren gründlich, so daß alle nicht oder unspezifisch gebundenen Viren fortgespült wer den.

Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet man ein insbesondere synthetisches Esterasesubstrat an, zum Bei spiel 4-Methylumbelliferyl-Acetat (MU-Ac) oder α-Naphthyl-Ace tat. Außerdem erhöht man die Temperatur auf solche Werte, bei denen die Enzymreaktion ablaufen kann, z. B. auf 37°C oder auf Raumtemperatur. Nur dort, wo Viren gebunden sind, entwickelt sich eine Fluoreszenz bzw. eine Farbreaktion. Da die Viruspar tikel zahlreiche Glykoproteinspikes auf ihrer Oberfläche be sitzen, kommt es auf diese Weise zu einem Verstärkereffekt, der mit isolierten Glykoproteinen nicht zu erzielen ist. Die Loslösung der Viren von ihren Rezeptoren aufgrund der Esteraseaktivität spielt zu diesem Zeitpunkt keine Rolle mehr. Wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise in Mikroti terplatten ausgeführt, dann bleiben die Viren in den einzelnen Vertiefungen gefangen, die nicht mehr gewaschen werden.

Benutzt man als Trägermaterialien Nitrocellulose-Membranen oder Dünnschichtplatten, dann verwendet man vorzugsweise das chromogene Substrat α-Naphthyl-Acetat, welches durch die vi rale Esterase um ein Vielfaches schneller gespalten wird als jedes natürliche Substrat. Das freie Naphthol reagiert sofort mit Diazoniumionen zu einem unlöslichen Farbstoff weiter, der unmittelbar dort ausfällt, wo die Viren gebunden sind. Die Verfahren zur Detektion und/oder zur Quantifizierung der Esterase-Substrat-Reaktion sind im übrigen bekannt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Influ enza-C-Viren eingesetzt, da ihre Affinität zu 9-O-Acetyl-N- Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac2) größer ist als die von Co ronarviren. Die Spezifität des Influenza-C-Virus Hämaggluti nins für 9-N/O-acetylierte Sialinsäure konnte mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens im übrigen hinreichend abgesi chert werden. Zum Beispiel hat eine Verseifung des Estergruppe zur Folge, daß die Virusbindung vollständig verlorengeht. Estergruppen an anderen Positionen der N-Acetylneuraminsäure, wie etwa an der Position 4 oder 7, können dagegen keine Virus bindung bewirken. Dieser einzigartigen Spezifität steht eine bemerkenswerte Vielfalt gegenüber, denn Influenza-C-Viren er kennen sowohl Ganglioside als auch so unterschiedliche Glyko proteine wie Mucine (Schleime), Serumglykoproteine oder mem brangebundene Glykoproteine, vorausgesetzt sie besitzen 9-N/O- acetylierte Sialinsäuren.

Erfindungsgemäß wird somit ein hochspezifischer Test für 9- N/O-acetylierte Sialinsäuren bereitgestellt, welche an eine Vielfalt von Trägermolekülen gebunden sein können. Das gebun dene Virus wird durch seine Enzymaktivität direkt nachgewie sen. Eine Markierung der Viren durch radioaktive Isotope, Bio tin oder Digoxigenin entfällt.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Auswertung, wobei unter quantitativ sowohl semi-quantitativ als auch voll-quantitativ verstanden wird. Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahren ist außerordentlich hoch. So konnten beispielsweise mit einem 9-O- acetylierten Gangliosid (GD1a) als Rezeptor, immobilisiert auf Polystyrol-Mikrotiterplatten, mit MU-Ac als Substrat noch 20 pg (57 fmol) Neu5,9Ac2 nachgewiesen werden.

Zudem können unterschiedliche Trägermaterialien, wie Mikroti terplatten (Polystyrol, PVC), Nitrocellulose, Dünnschichtplat ten (Kieselgel, Cellulose), eingesetzt werden. Ferner können Gewebedünnschnitte (z. B. histologische Schnitte) zur Anwendung gebracht werden. In letzterem Fall kann man somit Gewebe, das die hier in Rede stehenden Sialinsäuren aufweist, direkt ein setzen bzw. untersuchen. Die sialinsäurehaltigen Trägermole küle müssen nicht erst an einem "künstlichen" Trägermaterial immobilisiert werden. Das Gewebe selbst stellt somit das Trä germaterial dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und schnell durch führbar. Das erfindungsgemäße Testsystem kann auch mit Anti körpern oder Lektinen kombiniert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden, be vorzugte Ausführungen beschreibenden Beispiele näher erläu tert:

Beispiele Test 1

Immobilisierung von Glykoproteinen, Gangliosiden oder Zellen auf Mikrotiterplatten. Nachweis des gebundenen Virus mit einem fluorigenen Substrat (z. B. MU-Ac).

Materialien

Mikrotiterplatten: Immo-Module Maxisorp F8, Fa. Nunc, Ros kilde, Dänemark
Fluorimeter: 1000 M, Perkin-Elmer, Überlingen, oder ein Gerät für die Fluoreszenzmessung in Mikrotiterplatten.

Puffer:

(a) PBS, pH 7,2
8,0 g NaCl
	0,2 g KCl
	1,15 g Na₂HPO₄×2 H₂O
	0,2 g KH₂PO₄
	ad 1 l, aq. bidest.
(b) Blockierungspuffer (PBS/BSA)	PBS+1% (2%) Rinderserumalbumin
(c) Waschpuffer (PBS/Tween)	PBS+0,05% Tween 20
(d) Substrat	60 µm MU-Ac in PBS

Influenza-C-Viren

Influenza-C-Viren (z. B. Stamm Johannesburg (1/66) werden ange zogen und gereinigt wie beschrieben. Die Viren werden in be fruchteten Hühnereiern bei 33°C angezogen und die Allantois flüssigkeit nach 3 Tagen entnommen. Die Viren werden durch Differentialzentrifugation in zwei Schritten angereichert, in PBS + 1% BSA aufgenommen, sterilfiltriert und bei -70°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

Untersuchungsmaterial

Glykoproteine; für die Immobilisierung auf Mikrotiterplatten eignen sich besonders sezernierte Glykoproteine wie etwa Schleime (Muzine) oder Plasmaproteine. Diese Verbindungen sind leicht zugänglich und können dem Patienten bei Routineuntersu chungen (Endoskopie, Punktion) entnommen werden. Für den Test kann frisches oder gefriergetrocknetes Material eingesetzt werden. Für Glykoproteine, die mit Hilfe von Detergenzien aus Plasmamembran herausgelöst werden müssen, ist Nitrocellulose als Trägermaterial (siehe unten) besser geeignet.

Ganglioside: Diese Glykolipide sind Bestandteile der Cytoplas mamembran und werden aus kleinen Gewebeproben (ca. 1 g) mit organischen Lösungsmitteln extrahiert.

Zellen

- Kulturen
- Gewinnung aus Blut, Trennung verschiedener Zellpopulationen mit Dichtegradienten- Zentrifugation, Adhärenzverhalten usw.
- Gewinnung aus Gewebe, mechanisch, enzymatisch

Vorgehen

1. Beschichten der Platten: Gefriergetrocknete Glykoproteine werden in PBS gelöst und 100 µl dieser Lösung in jeden Napf pipettiert. Die Adhäsion er folgt über Nacht bei 4°C oder bei Raumtemperatur während 1-2 h.

Ganglioside werden in Methanol gelöst und 100 µl dieser Lösung in jeden Napf gegeben. Das Lösungsmittel verflüchtigt sich bei Raumtemperatur. Adhärierend wachsende Zellen (Zellkultur) werden 3× mit PBS gewaschen (Test in kleinen Kulturschalen).

Nicht-adhärierende Zellen werden zu 1-2% in PBS suspendiert und jeweils 100 µl in die mit Poly-l-Lysin vorbehandelten Näpfe gegeben. Nach 30 bis 45 min bei 37°C wird die Platte 3× mit PBS gewaschen.

2. Entfernen des Puffers durch Ausschlagen der Platten. Dieser Schritt entfällt bei Gangliosiden und Zellen.

3. Blockieren noch freier Bindungsstellen auf der Platte mit PBS/1% BSA (200 µl/Napf) während 1 h Inkubation bei Raumtem peratur (Ganglioside: 2% BSA).

4. 2× Waschen der Platte mit PBS/Tween (200 µl/Napf), für Zellen und Ganglioside wird nur PBS verwendet.

5. Zugabe einer Virussuspension in PBS (100 µl/Napf) mit einer Acetylesteraseaktivität von 10 mU/ml, Inkubation für 1 h bei 4°C.

6. 3× Waschen (vgl. 4.).

7. Zugabe von jeweils 100 µl Substratlösung, Inkubation für 45 min bei 37°C.

8. Stoppen der Reaktion mit jeweils 100 µl Ethanol abs.

9. Messung der Fluoreszenz: Transfer der Lösungen in Eppendorf-Reaktionsgefäße, Zugabe von 800 µl H₂O, Messen gegen Kontrolle 1 im Fluorimeter (Anregung: 365 nm, Emission; 450 nm).

Kontrollen

1. Inkubation der immobilisierten komplexen Kohlenhydrate mit PBS statt mit Influenza-C-Viren (vgl. 5.) - Detektion von nicht-viralen Esterasen im biologischen Material.

2. Durchführung des Tests mit verseiften komplexen Kohlenhy draten (0,2 N NaOH, 1 h, 25°C, Entsalzen) oder mit Zellen, die mit isolierter 9-O-Acetylesterase behandelt und anschließend gewaschen wurden.

3. Inkubation von Substratpuffer bei 37°C - Überprüfen des nicht-enzymatischen Zerfalls des Substrates.

4. Positive Kontrollen (komplexe Kohlenhydrate mit bekannter weise 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren): z. B. Rattenserum, Rin dersubmandibularmuzin, Rinderhirnganglioside.

Test 2

Zellen oder komplexe Kohlenhydrate werden nicht direkt an die feste Phase gebunden sondern mit Hilfe von vorher an das Trä germaterial adsorbierten Antikörpern, Lektinen oder Zellen, die selber keine 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren besitzen (Negativkontrolle nach Test 1 erforderlich). Der Nachweis der 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren auf den so gebundenen komple xen Kohlenhydraten oder Zellen erfolgt dann wie in Test 1 be schrieben.

Test 3

Nachweis von O-acetylierten Gangliosiden auf Dünnschichtplat ten unter Verwendung präzipitierender, chromogener Substrate (z. B. α-Naphthyl-Acetat).

Materialien (vgl. auch Test 1)

Densitometer: CD 60, Desaga, Heidelberg Dünnschichtplatten: HPTL-Kieselgel-Platten auf Aluminium; 5× 7,5 cm, Schichtdicke 0,2 mm (Merck, Darmstadt)
Fixativ: 0,5% Polyisobutylmethacrylat in Diethylether
Substrat: 1 mM α-Naphthyl-Acetat in PBS + 0,1% 2-Amino-5- Chlortoluol × ZnCl₂, filtriert

Vorgehen

1. Dünnschichtchromatographische Auftrennung eines Lipidex traktes aus 1 g frischem Gewebe (Laufmittel z. B. Chloro form/Methanol/0,02% CaCl₂ × 2 H₂O).

2. Trocknen der Platte

3. Eintauchen der Platte in das Fixativ für 2 min bei Raumtem peratur.

4. Trocknen der Platte.

5. Eintauchen in PBS/1% BSA für 60 min bei Raumtemperatur, leicht Schütteln.

6. Eintauchen in Influenza-C-Virussuspension (PBS/0,5% BSA) mit einer Acetylesterase-Aktivität von 10 mU/ml für 60 min bei 4°C, leicht Schütteln.

7. Waschen der Platte, 3 × je 3 min in PBS/Tween bei 4°C.

8. Inkubieren der Platte mit Substratlösung für 30 bis 45 min bei Raumtemperatur.

9. Stoppen der Raumtemperatur durch Eintauchen der Platte in H₂O bei 4°C und anschließendem Trocknen.

10. Quantifizierung der Farbreaktion mit dem Densitometer.

Kontrollen

1. Halbierung der Dünnschichtplatte mit parallel aufgetragenen Proben nach Schritt 2. Eine Hälfte wird mit Orcinol-Reagenz eingesprüht und so alle sialinsäurehaltigen Verbindungen sichtbar gemacht, mit der anderen Hälfte wird in Schritt 3-10 beschrieben verfahren.

2. Verseifung einer Parallelen mit NH₃.

3. Bekannte O-acetylierte Ganglioside als Standards.

Weitere Anwendungen

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von gebundenen Influenza-C-Viren über ihre Esteraseaktivität ist in analoger Weise auch auf andere Systeme anwendbar:

- Immobilisierung von Glykoproteinen auf Nitrocellulosemembra nen, entweder direkt ("dot-blot") oder nach Auftrennung im SDS-Polyacrylamidgel ("western-blot").
- Nachweis von Zellen mit 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren im Gewebedünnschnitt.
- Markierung von biologischen Sonden wie z. B. Antikörpern oder Lektinen mit 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren oder Analogen da von (z. B. 9-N-Acetyl-Neu5Ac). Detektion der Bindung dieser Sonden an ihre Liganden mit dem oben beschriebenen Prinzip. Die oben aufgeführten %-Angaben beziehen sich, sofern nichts anderes angegeben ist, auf Gew.-%.

Claims

1. Verfahren zur Detektion und/oder quantitativen Bestimmung von 9-N/O-acetylierten Sialinsäuren, die an Trägermole küle (Kohlenhydrate, insbesondere komplexe Kohlenhydrate, Zellen, Geweben oder andere biologische Materialien) ge bunden sein können, wobei man

a) die sialinsäurehaltigen Trägermoleküle mit Viren, die sich an die 9-N/O-acetylierten Sialinsäure spezifisch binden können und über eine Esteraseaktivität zur Abspal tung der 9-O-Acetylgruppe der Sialinsäuren verfügen, bei einer Temperatur, bei der die Esteraseaktivität praktisch nicht aktiv ist, zur Reaktion bringt,
b) zu den in Stufe a) erhaltenen sialinsäurehaltigen Trä germolekülen mit den darin gebundenen Viren ein Substrat für die virale Esterase hinzugibt und die Temperatur so weit erhöht, daß die Esterase mit dem hinzugegebenen Sub strat reagiert, und
c) die Esterase-Substrat-Reaktion detektiert und/oder quantifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Viren Influenza-C-Viren einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe a) bei 2 bis 6°C, insbesondere bei etwa 4°C durchführt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur in Stufe b) auf Raumtemperatur bis zu 37°C erhöht.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die sialinsäurehaltigen Trägermoleküle vor der Durchführung der Stufe a) an einem Trägermaterial immobi lisiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Trägermaterial zur Entfernung aller nicht oder unspezifisch gebundenen Viren vor der Durchführung der Stufe b) gründlich wäscht bzw. spült.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägermaterial Mikrotiterplatten, Nitrocellu lose-Membranen oder Dünnschichtplatten einsetzt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Gewebeschnitte einsetzt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat für die virale Esterase ein synthe tisches Substrat, insbesondere 4-Methylumbelliferyl-Ace tat (Mu-Ac) oder α-Naphthyl-Acetat einsetzt.