DE3015462A1 - Verfahren zur bestimmung von interferon und reagens zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von interferon und reagens zur durchfuehrung des verfahrens

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DE3015462A1 DE19803015462 DE3015462A DE3015462A1 DE 3015462 A1 DE3015462 A1 DE 3015462A1 DE 19803015462 DE19803015462 DE 19803015462 DE 3015462 A DE3015462 A DE 3015462A DE 3015462 A1 DE3015462 A1 DE 3015462A1
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Description

u.Z.: P 607
Case: T/398
YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY LTD, Rehovot, Israel
" Verfahren zur Bestimmung von Interferon und Reagens zur Durchführung des Verfahrens"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Interferonen in Körperflüssigkeiten, Körpergeweben, Zellkulturen, Züchtungsmedien und dergleichen. Ferner betrifft die Erfindung Reagentien, vorzugsweise in Form einer Testpackung, zur Durchführung dieses Verfahrens.
Interferone sind Glycoproteine, die in Zellkulturen zu einer verringerten Virusvermehrung führen. Aufgrund dieser antiviralen Aktivität sind Interferone wertvolle Wirkstoffe bei; der Behandlung von viralen Erkrankungen beim Menschen. Interferone gelten auch als mögliche Wirkstoffe zur Krebsbekämpfung. Interferonbestimmungen werden z.Zt. so durchgeführt, dass man die Verringerung des Wachstums von bestimmten Viren in Zellen, die einer Interferoneinwirkung ausgesetzt worden sind, misst. Diese Bestimmungen sind sehr zeitraubend und müssen stark variiert werden, da eine Infektion durch Viren erforderlich ist.
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Γ "I
Herkömmliche Interferonbestimmungen beruhen auf einer 10-bis 20-stündigen Vorbehandlung der Zellen mit Interferon und einer anschliessenden mindestens 8- bis 10-stündigen und im allgemeinen 24- bis 48-stündigen Infektion mit einem Testvirus. Hierauf wird ein virales Produkt oder eine zytopathische Wirkung gemessen. Die Infektion der Zellen stellt einen Unsicherheitsfaktor dar und macht zusätzliche Kontrollen beim Test erforderlich.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung von Interferon und ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens zur Verfügung zu stellen, bei dem eine Virusinfektion entfällt.
Die Erfindung beruht auf dem Befund, dass bei Zusatz von Interferon zu Zellkulturen der Gehalt an spezifischen Enzymen zunimmt. Diese Zunahme stellt unter kontrollierten Bedingungen ein Mass für die Interferonmenge dar. Die Bestimmung kann auch an Zellen, wie weissen Blutkörperchen und insbesondere menschlichen Leukozyten durchgeführt werden. Der Gehalt an bestimmten Enzymen ist ein Mass für die vorherige Interferoneimvirkung, denen die Zellen im menschlichen Körper ausgesetzt waren.
Die erfindungsgemässe Bestimmung wird mit sehr geringen Enzymmengen durchgeführt. Das Bestimmungsverfahren ist sehr empfindlich und genau.
Es gibt eine Reihe von Enzymen, deren Menge eine Funktion der Interferoneinwirkung auf Zellen ist. In Anwesenheit von Interferon nimmt die Menge dieser Enzyme zu. Diese Zunahme erfolgt allmählich und beginnt nach einer Induktionszeit von einigen Stunden. Nach etwa 3 Stunden lässt sich unter physiologischen Bedingungen eine Zunahme messen. Die Zunahme erreicht nach etwa 12 bis 24 Stunden ihr Maximum. Bei Durchführung der Bestimmung unter kontrollierten Bedingungen ist
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^ es vorteilhaft, die Enzymmenge nach etwa 8 Stunden zu messen. Es können aber auch andere Zeitspannen gewählt werden. Die Anwesenheit von Interferon bewirkt eine mengenmässige Zunahme folgender Enzyme:
1. Protein-kinase, die spezifisch die kleine Untereinheit des Initiationsfaktors eIF„ phosphoryliert
2. Oligo-isoadenylat-synthetase, die aus ATP ein spezifisches Oligonucleotid, (2',5M-PPpApApA, bildet,
3. Phosphodiesterase, die (2r ,5')-Dinucleosidnionophosphate, wie £',5M-ApA, abbaut.
Wird Interferon oder ein Interferon enthaltendes Medium zu einer Zellkultur gegeben, so nimmt der Gehalt an diesen Enzymen in den Zellen zu. Es kann auch der Gehalt an anderen
Enzymen, deren Menge durch Interferoneinwirkung zunimmt, für die Bestimmung herangezogen werden.
Wird eine geringe Menge an Zellen einer Zellkultur, die vorher einer Interferoneinwirkung ausgesetzt worden ist, nach
einer vorbestimmten Zeit mit einem entsprechenden Extraktionsmittel extrahiert, so kann im Extrakt der Enzymgehalt der Zellen ermittelt werden. Die Menge von einem oder mehreren Enzymen ist ein Mass für die Interferonmenge, der die Zellen ausgesetzt worden sind. Die Bestimmung kann auch mit
Leukozyten, die einer Extraktionsbehandlung unterzogen worden sind, durchgeführt werden. Der Enzymgehalt der Zellen wird durch den erfindungsgemässen. Test, der zur Messung äusserst geringer Enzymmengen geeignet ist, bestimmt. Der Enzymgehalt ist, wie bereits erwähnt, ein Mass für die Menge an Inter-
feronen, denen die Zellen im Körper ausgesetzt worden sind. Dies erlaubt Rückschlüsse auf den Krankheitszustand von Patienten.
Die zu bestimmenden Zellen werden mit einem geeigneten Ex-
traktionsmittel, beispielsweise einem nicht-ionogenen grenzflächenaktiven Mittel extrahiert. Ein Beispiel für ein ent-
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sprechendes grenzflächenaktives Mittel ist Nonidet P40, der Firma Paz Company, Israel. Die Extraktion kann auch auf andere Weise vorgenommen werden. Die Zunahme der Enzymmenge in den der Interferoneinwirkung ausgesetzten Zellkulturen ist ausgeprägt. Für die drei vorstehend aufgeführten Enzyme ergeben sich folgende Zunahmen: Für das Enzym (1) um den Faktor 10, für das Enzym (2) um einen Faktor von 20 bis 100 und um den Faktor 3 beim Enzym (3).
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird der Enzymgehalt (von Enzymen, deren Menge durch Einwirkung von Interferonen auf die entsprechenden Zellen zunimmt) in der Probe ermittelt. Aus der Enzymmenge wird auf die Interferonmenge, der die
Zellen ausgesetzt waren, geschlossen. 15
Die Beispiele erläutern die Bestimmung von Interferonen durch Messung eines der drei vorstehend genannten Enzyme, deren Gehalt nach Interferoneinwirkung auf die Zellen zunimmt.
-Wie vorstehend erwähnt, verläuft die Zunahme des Enzymgehalts von Zellen, die einer Interferoneinwirkung ausgesetzt sind, allmählich. Eine merkliche Zunahme lässt sich nach etwa 3-stündiger Einwirkung nachweisen. Eine Bestimmung nach 8-stündiger Einwirkung erweist sich als zufriedenstellend, da zu diesem Zeitpunkt eine wesentliche Zunahme stattgefunden hat. Der Enzymgehalt erreicht je nach dem Enzym sein Maximum nach 12 bis 24 Stunden. Bei einer· Bestimmung nach 8-stündiger Einwirkung kann der erhaltene Wert zur Bestimmung der Interferonmenge herangezogen werden, indem man sich einer unter 30
gleichen Bedingungen erstellten Eichtabelle bedient.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 mung von Int QPK-i)
Bestimmung von Interferon durch Messen von Protein-kinase
In den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Kunststoff
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(96 Vertiefungen) werden Interferon-Reihenverdünnungen von 0 bis 50 Einheiten/ml hergestellt, wobei in 5 aufeinanderfolgenden Verdünnungsschritten mit dem Faktor 1 : 5 jeweils mit Gewebekulturmedium mit einem Gehalt an 10 Prozent Kälberserum verdünnt wird. Sodann wird eine frisch trypsinierte Suspension von Mäuse-L-zellen oder menschlichen diploiden Fibroplasten zugesetzt. In jede Vertiefung gelangen etwa 25000 Zellen. Das Endvolumen beträgt 0,1 ml. Nach 8 Stunden wird das Medium von der Mikrotiterplatte entfernt. Sodann werden 0,025 ml einer Lösung von 0,5-prozentigem Nonidet P40 in 20 millimolärem Hepes-Puffer vom pH-Wert 7,5 (5 millimolar MgCl2, 120 millimolar KCl, 1 millimolar Dithiothreit und 10 Prozent Glycerin) zugesetzt. Mach 6 bis 9 Minuten wird die Platte 5 Minuten bei 4000 U/min in einem mit einem entsprechenden Adapter versehenen Zentrifugenrotor zentrifugiert. Von jeder.Vertiefung wird ein Volumen von 0,015 ml entfernt und jeweils mit 0,5/ig/ml doppelstrangiger Polyinosin-polycytidyl-säure (poly(rl): (rC)) mit 0,5 millimolärem ATP versetzt. Das Endvolumen beträgt 0,02 ml. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 300C inkubiert. Sodann werden 5 /ig des als eukariotischer Initiationsfaktor 2 bezeichneten Proteins (gereinigt aus Kaninchen-Retikulozyten gemäss Benne u. Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 7675 bis 7681) sowie 0,075 millimolar _/~32P_7-/"-ATP (16 Ci/mMol) zugesetzt. Die
*° Inkubation wird 15 Minuten bei 300C fortgesetzt. Die in das Protein eIF2 eingebaute Radioaktivität wird nach Säurefällung oder vorzugsweise nach Elektrophorese des Gemisches in einem 12-prozentigen Polyacrylamidgel mit einem Gehalt an 0,1 Prozent Natriumdodecylsulfat gemessen. Anschliessend wird ein Röntgenfilm mehrere Stunden dem getrockneten Gel ausgesetzt. Nach der Entwicklung zeigt der Film eine einem Molekulargewicht von 35000 entsprechende Bande. Die Bandenintensität wird densitometrisch bei 600 nm in einem aufzeichnenden Spektrophotometer gemessen. Die Intensität der
^ 35000 Mr-Bande stellt ein direktes Mass für die Menge des
32
in das Protein eIF„ eingebauten P-Phosphats und ein Mass für die Aktivität der Proteinkinase PKrL dar. In entsprechen-
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Γ
der Weise kann auch eine Elektrophorese auf Celluloseacetat durchgeführt werden.
In Tabelle I ist die Zunahme der PK-i-Aktivität bei einer Interferonmenge von 2 Einheiten pro ml im Vergleich zu unbehandelten Zellen wiedergegeben. Die niedrigste Interferonkonzentration, die die Vermehrung von vesikulärem Stomatitisvirus auf den Zellen zu mehr als 90 Prozent hemmt, erzeugt die maximale Zunahme der Aktivität von Protein-kinase Pk-i. In Tabelle II ist der zeitliche Verlauf der PK-i-Zunahme bei Mäuse-L-zellen erläutert. Die Zunahme beginnt 3 Stunden nach der Interferoneinwirkung auf die Zellen und erreicht nach 24 Stunden ihr Maximum. Nach 8-stündiger Interferonbehandlung
ist die halbmaximale Zu.iahme erreicht. 15
Beispiel2
Interferonbestimmungen durch Messung von Oligo-isoadenylatsynthetase und Phosphodiesterase
Die Zunahme der Mengen von zwei weiteren Enzymen wird in den gleichen Nonidet P40-Extrakten von mit Interferon behandelten Zellen bestimmt: Oligo-isoadenylat-synthetase und 2'-Phosphodiesterase. Als Beispiel wird die Zunahme der Oligo-isoadenylat-synthetase E nach Interferonbehandlung erläutert. Die Zellen werden gemäss Beispiel 1 mit Nonidet P40 lysiert und mit Polyinosin-polycytidylsäure (doppelstrangig) (poly-(rl): (rC)), gebunden an Sepharose-Kügelchen (gemäss dem Verfahren von Wagner u. Mitarb., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 45 (1971)', S. 184 bis 189) versetzt. Die Kügelchen werden gewaschen und in einem gleichen Volumen (25^uI) an Nonidet P40-Zellextrakten suspendiert. Das nicht-adsorbierte Material wird entfernt. Das Kügelchen-Pellet wird 20 Stunden bei 300C in 1 millimolar _/_~"^2P_7cx'-ATP (3 Ci/mMol) und 1 millimolar Dithiothreit inkubiert. Der Überstand (10^1) wird 60 Minuten bei 37°C mit 0,35 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase in 30 millimolarer Tris-Base behandelt. Das Produkt wird 4 Stunden bei 3000 V der Papierelektrophorese an Whatman
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Γ "1
3MM-Papier oder vorzugsweise der Dünnschichtehromatographie an Polyäthylenimin-Cellulose unter Verwendung von Essigsäure unterzogen. Die (2',5')-ApA und (2f,5')-ApApA entsprechenden Flecken werden ausgeschnitten und der Szintillationszählung unterzogen. Die Zunahme an Oligo-isoadenylat-synthetase wird angegeben als die Menge des in das(2',5')-Diadenylat-monophos-
op
phat und/oder (2' ,5 ' )-Triadenylat-diphosphat aus dem ]_ P_/-oC-ATP eingebauten radioaktiven Phosphats.
Ein schnelleres und einfacheres Verfahren· besteht darin,dass das der Phosphatasebehandlung unterzogene Produkt auf kleine Einweg-Aluminiumoxidsäulen (Säulenvolumen 0,3 ml), die vorher mit 1 m Glycin-0,75 η HCl-Puffer vom pH-Wert 2 äquilibriert worden sind, aufzusetzen. Hierauf werden 3 ml des gleichen Puffers über die Säule gegeben. Das Eluat wird in für die Szintillationszählung zur Messung der Radioaktivität bestimmten Flaschen aufgefangen.
Die gleichen Ergebnisse erhält man bei menschlichen diploiden Vorhaut-Fibrob'lasten, die mit menschlichem Fibroblast-Interferon behandelt worden sind. Die Hauptvorteile des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens sind:
(1) Das Verfahren ist nicht von einer Virusinfektion der der Interferonbehandlung unterzogenen Zellen abhängig.
(2) Das Verfahren verläuft genau, reproduzierbar und rasch.
(3) Das Verfahren kann nicht nur zur Messung von Interferonmengen in unbekannten Lösungen sondern auch zur Prüfung der Frage, ob Zellen eines bestimmten Gewebes mit Interferon reagiert haben, angewendet werden.
Wird beispielsweise Interferon einem Patienten injiziert, kann in einer Blutprobe bestimmt-werden, ob die weissen Blutkörperchen (Lymphozyten) erhöhte Mengen an Protein-kinase PK-i enthalten. Die gleiche Bestimmung kann an kleinen Biopsieproben von der Konjunktiva oder von Haut, die einer topischen Interferonbehandlung ausgesetzt worden sind, durchgeführt werden. Ähnliche Messungen mit Phosphidiesterase führen zu ana-
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Γ "1
logen Ergebnissen. Die Phosphodiesterase wird unter Verwendung von 1 raillimolar (2',5')-ApA als Substrat und 10^1 Zellextrakten gemessen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wird das Reaktionsgemisch der Dünnschichtchromatographie an Polyäthylenimin-Cellulose unter Verwendung von 0,32 m LiCl unterzogen. Die Menge an gebildetem 5'-AMP ist ein Mass für die Phosphodiesterase-Menge. 5'-AMP wird mit 0,7 m MgCIp von der Cellulose eluiert und durch Bestimmung der Absorption
bei 250 mu gemessen.
10
Die Messungen können an den gleichen Zellen, wie in Beispiel 1 für die Messung von Protein-kinase angegeben sind, durchgeführt werden.
Beispiel3
Konzentration an Oligo-isoadenylat-synthetase in menschlichen Blutzellen
Die Bestimmung von durch Interferon induzierten Enzymen ermöglicht ein neues und zweckmässiges Verfahren zur Bestimmung 20
der biologischen Reaktion von Zellen oder Geweben menschlichen
oder tierischen Ursprungs auf Interferon. Beispielsweise werden Messungen der Oligo-isoadenylat-synthetase an Blutzellen von menschlichen Spendern oder Patienten mit verschiedenen pathologischen Zuständen durchgeführt. Durch Ve-25
nenpunktion wird eine 2 ml-Blutprobe entnommen. Die weissen Blutkörperchen werden von den übrigen Blutbestandteilen abgetrennt. Beispielsweise wird Ficoll-Paque der Firma Pharmacia zur Gewinnung von Blut-Lymphozyten und anderen einkernigen Zellen verwendet. Die Zellen werden in einer Konzentra-γ
tion von 10 Zellen/ml suspendiert und mit dem in Beispiel 1 angegebenen Nonidet PUO enthaltenden Puffer lysiert. Aliquotmengen (5 bis 10^uI) des Lysats werden mit poly-(rl): (rC)-Agarose- oder-Sepharose-Kügelchen vermischt und gemäss Beispiel 2 mit l_ P_/ATP inkubiert. Die Menge an gebildetem
(2',5')-01igo-isoadenylat wird durch Hochspannungselektrophorese oder durch Säulenchromatographie an Aluminiumoxid gemäss Beispiel 2 gemessen.
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Die in Tabelle III zusammengestellten Daten zeigen die unterschiedlichen Konzentrationen an Oligo-isoadenylat-synthetase, die in menschlichen weissen Blutkörperchen unter verschiedenen pathologischen Zuständen beobachtet worden sind.
Daraus geht klar hervor, dass bei zwei verschiedenen Formen von akuter Leukämie die erhaltenen Werte 10-fach niedriger als in normalem Blut sind. Bei einer dritten Form von akuter Leukämie liegen die Werte nur geringfügig unter dem Normalwert. Bei chronischer lymphatischer Leukämie ergeben sich niedrige Werte, die aber höher als bei akuter lymphatischer Leukämie sind. Bei einer Art einer Autoimmunerkrankung, nämlich Lupus erythematodes ergibt sich eine erhöhte Enzymkonzentration.
Durch Inkubation von leukämischen Zellen mit Interferon kann die Konzentration an Oligo-isoadenylat auf den Normalwert zurückgebracht werden (vgl. Tabelle III). Die erwähnten Enzyme stellen daher wertvolle Hilfsmittel zur Verfolgung der Reaktion von Leukämiepatienten auf eine Interferontherapie dar. Die Messungen können in geringen Blutmengen (weniger als 2 ml) innerhalb von weniger als 24 Stunden durchgeführt werden. Die Bestimmung eignet sich für verschiedene Arten von Blutzellen und für Gewebe. Beispiele für pathologische Zustände, deren Untersuchung von Interesse ist, sind Krebserkrankungen, infektiöse Erkrankungen und immunologische Störungen .
Beispiel 4 Testpackung zur Interferonbestimmung
a) Bestimmung von Protein-kinase: Zur Durchführung des Tests sind folgende Reagentien· erforderlich:
1) Lysis-Puffer (0,5 Prozent Nonidet P40, 20 millimolar .\Hepes-HCl-Puffer vom pH-Wert 7,5, 5 millimolar MgCl2, 120 millimolar KCl, 1 millimolar Dithxothreit, 10 Prozent Glycerin) (Hepes = 4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazine äthansulfonsäure)
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2) Poly-(rl): (rC)-Adenosin-triphosphat (ATP)-Gemisch (in konzentrierter Form)
3) gereinigtes Kaninchenprotein eIF? (mehr als 100 ^ig/ml)
4) /"32P-T-^-ATP (mehr als 10 Ci/mMol und 1 mCi/ml) 5
Diese Reagentien werden in Form einer Testpackung zur Verfügung gestellt. Die Bestandteile liegen in gefriergetrockneter Form vor und können entsprechend den Angaben vor der Verwendung gelöst werden. Platten zur Zellzüchtung sind von der Firma Nunc Company erhältlich. Ferner können handelsübliche Vorrichtungen zur Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Röntgenfilme verwendet werden. Die Testpackungen enthalten Interferon-Eichlösungen (beispielsweise von der Mausoder vom Menschen) für Eichzwecke.
15
b) Oligo-isoadenylat-synthetase-Test
Folgende Reagentien sind erforderlich: 1) Lysis-Puffer
2) an Sepharose gebundene Poly-(rl): (rC)
3) /~32P_7-oC-ATP (mehr als 3 Ci/mMol und 1 mCi/ml)
4) bakterielle alkalische Phosphatase
5) 2',5'-Diadenosinmonophosphat, 2',5'-Triadenosindiphosphat
6) kleine Einweg-Säulen mit einem Gehalt an 0,3 ml Aluminiumoxid
7) Elutionspuffer für das Aluminiumoxid: 1 m Glycin-0,75 η HCl vom pH-Wert 2
Die Reagentien werden in Form einer Testpackung zur Verfügung gestellt. Für die Papierelektrophorese und die Dünnschichtchromatographie werden handelsübliche Einrichtungen eingesetzt .
Die Reagentienmenge kann je nach Art der durchzuführenden Bestimmungen variieren.
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Tabelle I Interferon-induzierte Enzyme und antiviraler Zustand in
L-Zellen
Interferon, VSVRNA Protein- Oligo-isoade- Phsophodi-U/ml kinase nylat-synthe- esterase
PK-i tase E 2'-PDi
O 100 15 4 25
2 20 35 5 72
10 5 80 20 86
50 2 100 42 100
250 0 66
1250 0 100 100
Die Ergebnisse sind in Prozent der maximalen Aktivität angegeben. Die Messung der vesikulären Stomatitisvxrus (VSV)-RNA-Synthese erfolgt gemäss Weissenbach und Mitarb., European J. Biochem., 197, 9S, S. 1 bis 8.
Tabelle II Kinetik der Enzyminduktion durch Interferon
Zeit nach der Interferonzugabe
Mäuse-L-Zellenx
Protein-kinase PK^-i
Menschliche
blastenxs
Oligo-i soadenylat*
synthetase
Stunden
0 2 4 8
10 24
Phsophorylierung der 35OCXX
Untereinheiten von eIF2,
willkürliche Einheiten
"15
15
30
55
75
100
(2',5')-Oligo A Synthese, Zählung/min
900
900
1500
3750
6500
13500
mit 200 Einheiten/ml Mäuse-Interferon
XX
mit 50 Elnheiten/ml menschlichem Fibroblast^-Interferon
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Tabelle III Änderungen der Oligo-isoadenylat-synthetase-Konzentration
in menschlichen weissen Blutkörperchen unter verschiedenen 5
pathologischen Zuständen
Blutquelle Oligo-isoadenylat-
synthetase
Z~32p7( 2',V)-OlIgO A, ^q Zählung/min χ 10 ^
Normale Spender akute lymphatische Leukämie chronische lymphatische Leukämie akute monozytäre Leukämie
akute myeloide Leukämie
dto, über Nacht mit menschlichem Interferon54 inkubiert
Lupus erythematodes
Verfahren: 2 ml Blut —ν Ficoll-Gradient —
zyten-Zellen/ml —&. Lysis mit NP40 —» Bindung an Agarose-
—32 ~— poly (rl) : (rC) -Kügelchen —*■ Inkubation mit / P/-ATP —> Analyse mit (2',5')-oligo A durch Hochspannungselektrophorese oder Aluminiumoxidsäulen. ^menschliches Leukozyten-Interferon 500 Einheiten/ml
200 - 240
20 - 25
50 - 70
160 - 200
20
200
270 - 300
1O7 Leuko-
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Claims (11)

VOSSIUSVOSSIUS-TA1J CHNER · Ht. UNEMANN - RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4· · 8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O75 CABLE: SENZOUPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-29453 VOPAT D u.Z.: P 607 Case: T/398 YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD. Rehovot, Israel " Verfahren zur Bestimmung von Interferon und Reagens zur Durchführung des Verfahrens" Priorität: 22. April 1979, Israel,Nr. 57108 15 Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen, die vorher einer Interferoneinwirkung ausgesetzt worden sind, mit einem Extraktionsmittel extrahiert und im Extrakt die Menge eines Enzyms misst, dessen Gehalt in der Zelle eine Funktion der Interferonmenge ist, der die Zelle vorher ausgesetzt worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Zellkultur mit einem Substrat, dessen Interferongehalt bestimmt werden soll, versetzt, die Zellkultur nach einer bestimmten Zeitdauer mit einem entsprechenden Extraktionsmittel extrahiert und die Enzymaktivität im Extrakt bestimmt, wobei die Enz,ymmenge den Interferongehalt des Substrats anzeigt.
Γ "I
3- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Extraktionsmittel ein grenzflächenaktives Mittel verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein nicht-ionogenes grenzflächenaktives Mittel verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Enzym Protein-kinase (PK-i), Oligoisoadenylat-synthetase oder Phosphodiesterase bestimmt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, dass man als Zellkultur eine Kultur von Leukozyten, Lymphozyten, menschlichen Fibroblasten oder Mäuse-L-zellen verwendet.
7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mar die EnzymbeStimmung durch Einbau
von radioaktiven Indikatoren und Bestimmung dieser Indikatoren durchführt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7> dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen extrahiert, nachdem die
,
Zellkultur 3 bis 24 Stunden dem Substrat ausgesetzt worden ist.
9- Reagens (Testpackung) zur Bestimmung von Interferonen,
enthaltend eine Kombination aus Lysispuffer, Reaktionspuffer, Substrate, Aluminiumoxidsäulen, Reagentien mit einem Gehalt an radioaktivem ATP und Poly(rl): (rC),
sämtliche Bestandteile in vorbestimmten Konzentrationen.
10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass
ob
die entsprechenden Reagentien in lyophilisierter Form
• in Einheitsdosen vorliegen.
L 030044/0870
γ -ι
11. Reagens nach Anspruch 9 oder 10, enthaltend Interferon-Standardlösungen für Eichzwecke.
L 030044/0870
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