CN101519649A - 杂交瘤细胞株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的杂交瘤细胞株及其制备方法，制备杂交瘤细胞株具体为：表达hAG2蛋白；免疫小鼠；制备滋养细胞；制备小鼠脾细胞；将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合；细胞融合及培养；检测融合细胞，选取阳性杂交瘤细胞，反复克隆培养，得到杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC－C200902。用上述杂交瘤细胞注射小鼠，收集腹水，离心，收集上清液，纯化、鉴定即得hAG2单克隆抗体。本发明的杂交瘤细胞株可稳定、高分泌率地分泌hAG2单克隆抗体，本发明的hAG2单克隆抗体滴度达1×10－6，能与天然及变性的hAG2蛋白结合，且抗原表位位于hAG2蛋白的表面。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的杂交瘤细胞株及其制备方法，具体是一种分泌hAG2(人类前梯度蛋白2，缩写为hAG2或AGR2)单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。
背景技术
在癌症的诊断和治疗中，单克隆抗体(mAb)及其相关技术日渐显示其不可替代的作用。癌症诊断和治疗的研究需要很多特异性好、高质量的单克隆抗体。hAG2(human anterior gradient 2，人类前梯度蛋白2)是原发性和继发性肿瘤的标识蛋白，并且是循环系统检出肿瘤细胞的标识蛋白，hAG2基因定位于7p21.3。hAG2在乳腺癌细胞系中与雌激素受体共表达，与雌激素敏感性乳腺癌的分化表型及预后负相关，可作为激素敏感的乳腺癌的诊断和治疗的靶标。hAG2在前列腺癌中为雄激素诱导分泌蛋白，并在前列腺癌中高表达，可作为前列腺癌诊断和治疗的靶标。hAG2的表达量与患者的生存率成反比，可作为前列腺癌患者的预后指标。
经对现有技术的文献检索发现，Florian Rudolf Fritzsche等在《ClinicalCancer Research》(临床癌症研究)2006年第6期12卷第1728-1734页发表了《Prognostic Relevance of AGR2 Expression in Breast Cancer》(乳腺癌中hAG2的表达与患者预后的相关性)一文，文中指出，用一种兔抗人hAG2多肽的多克隆抗体(稀释1000倍)，以Western blot分析来检测人前列腺癌细胞系PC-3中hAG2蛋白的表达，在分子量20kD处检测到了hAG2蛋白的特异性条带，但在分子量20kD以上还有一条明显的非特异条带，而本发明所制备的单克隆抗体能够针对性的解决这种不足，提高实验的精确度，可信度，同时这也是单克隆抗体与多克隆抗体相比，其优势所在--特异性高。
发明内容
本发明的目的在于提供分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法。本发明的杂交瘤细胞株可稳定、高分泌率地分泌hAG2单克隆抗体，本发明的hAG2单克隆抗体滴度达1×10-6，能与天然及变性的hAG2蛋白结合，且抗原表位位于hAG2蛋白的表面。
本发明是通过以下技术方案实现的，
本发明所涉及的杂交瘤细胞株，名称为杂交瘤细胞株18A4，已提交中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC—C200902，保藏期限为2009年1月19日日起的30年。
本发明所涉及的杂交瘤细胞株的制备方法，具体步骤如下：
步骤一，在pMa1-c2载体中原核表达hAG2蛋白；
步骤二，利用步骤一得到的hAG2免疫4-12周龄BALB/c雌性小鼠，得到免疫后的小鼠；
步骤三，将HAT培养液注入正常小鼠腹腔，揉捏小鼠腹部后回抽腹腔内液体，离心，在沉淀下来的滋养细胞中加HAT培养液，注入96孔培养板进行培养；
步骤四，将步骤二得到的免疫后的小鼠处死，消毒，取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，经静置、离心、稀释、计数、RPMI-1640基础培养液洗涤，得到小鼠脾细胞；
步骤五，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心，弃去上清液，加入RPMI-1640基础培养液，离心，留下沉淀；
步骤六，在沉淀中加入HAT培养液，混匀后注入步骤三中的96孔培养板进行培养；
步骤七，检测96孔培养板中的融合细胞，冲洗下阳性杂交瘤细胞，培养，选取阳性杂交瘤细胞，反复培养杂交瘤细胞100％的分泌hAG2单克隆抗体为止，得到稳定分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
步骤二中，所述免疫具体为，加弗氏完全佐剂乳化hAG2，将乳化后的hAG2注射进小鼠背部和腹腔，注射hAG2的剂量为0.1mg，进行首次免疫，首次免疫3周后进行加强免疫，每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量同首次免疫，加强免疫用弗氏不完全佐剂，直至抗体滴度≧1∶10000，然后静脉注射未乳化的hAG2进行冲击免疫，冲击免疫3天后小鼠可用于步骤四。
步骤五中，所述混合具体为，脾细胞与骨髓瘤细胞按(3～5)：1的个数比例进行混合。
步骤五中，所述加入RPMI-1640基础培养液具体为，在弃去上清液之后，弹动离心管使细胞沉淀形成糊状，在37℃水浴条件下进行如下操作，水浴2min，然后在1min内加入1mL PEG4000，边加边摇动离心管，之后摇动45s，然后分4次在7min内加入RPMI-1640基础培养液26mL，第一次1min内加入1mL RPMI-1640基础培养液，第二次2min内加入5mL RPMI-1640基础培养液，第三次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，边加培养液边摇动离心管；其中，RPMI-1640基础培养液为：RPMI-1640培养液中加100U/ml青霉素-链霉素。
步骤六中，所述培养具体为，37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度，培养3-5天后用HAT培养液半量换液一次，继续培养10天后用HT培养液半量换液一次，培养至第20天用RPMI-1640完全培养液半量换液；其中，RPMI-1640完全培养液为：RPMI-1640基础培养液中加体积分数为10％的胎牛血清；HT培养液为：RPMI-1640完全培养液中加1×10-4M的次黄嘌呤以及1.6×10-5M的胸腺嘧啶；HAT培养液为：HT培养液中加4×10-7M氨基喋呤。
步骤三和步骤七中，所述培养具体为，37℃、CO2的体积浓度为5％、饱和湿度。
本发明涉及的由杂交瘤细胞株CCTCC—C200902分泌的hAG2单克隆抗体，其制备方法包括如下步骤：
步骤一，将液体石蜡注入6-12周龄BALB/c雄性小鼠腹腔，7天后将分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC—C200902注入小鼠腹腔；
步骤二，处死接种杂交瘤细胞的小鼠，消毒，收集腹水，4℃、180g的条件下离心5min，弃去上层油脂和下层沉淀，吸取中层淡黄色腹水，然后在4℃、10000g的条件下离心10min，弃去沉淀，保留腹水；
步骤三，将步骤二得到的腹水纯化，之后透析，最后得到hAG2单克隆抗体。
本发明具有如下的有益效果：本发明分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC—C200902可稳定、高分泌率地分泌hAG2单克隆抗体；杂交瘤细胞株CCTCC—C200902经体外连续传代培养，液氮冻存半年以上，复苏后仍生长良好，分泌单克隆抗体的性能稳定；本发明制备出的hAG2单克隆抗体的滴度达1×10-6，两次鉴定后其特异性高，能应用于免疫荧光及免疫沉淀，该单克隆抗体能与天然的及变性的hAG2蛋白结合，且抗原表位位于hAG2蛋白的表面。
附图说明
图1为抗hAG-2单克隆抗体特异性的Western blot分析图；
图2为抗hAG-2单克隆抗体对转染后细胞的Western blot分析图；
图3为抗hAG-2单克隆抗体在MCF7细胞中免疫荧光检测hAG-2的图；
图4为抗hAG-2单克隆抗体免疫沉淀后Western blot分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本部分涉及的相关溶液具体为，
RPMI-1640基础培养液具体为：RPMI-1640培养液(购于GIBCO公司)中加100U/ml青霉素-链霉素；
RPMI-1640完全培养液具体为：RPMI-1640基础培养液中加体积分数为10％的胎牛血清；
HT培养液具体为：1640完全培养液中加1×10-4M的次黄嘌呤(缩写为H)，1.6×10-5M的胸腺嘧啶(缩写为T)；
HAT培养液具体为：HT培养液中加4×10-7M氨基喋呤(缩写为A)；
PBS具体为：0.01M磷酸盐缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于1L蒸馏水中，pH值为7.4，0.01M指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，Na离子和K离子是用来调节渗透压的；
弗氏完全佐剂具体为：体积分数85％液状石蜡，体积分数15％单油酸甘露聚糖甘，1mg/ml灭活的结核分支杆菌；
弗氏不完全佐剂具体为：体积分数85％液状石蜡，体积分数15％单油酸甘露聚糖甘。
实施例1
本实施例提供了一种杂交瘤细胞株CCTCC—C200902，具体制备步骤包括：
步骤一，在pMa1-c2载体中原核表达hAG2蛋白；
步骤二，用Bradford法测定蛋白浓度，测定步骤参见Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用操作说明书。取0.1mg的hAG2，加入0.25mL生理盐水，再加入与hAG2和生理盐水混合液体积相等的弗氏完全佐剂乳化hAG2，将乳化后的hAG2分两点注射进6周龄BALB/c雌性小鼠背部，每一点注射20μg，其余的注射进小鼠腹腔；首次免疫注射后第3周进行第一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，选用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂；直至抗体滴度≧1∶10000，然后静脉注射与首次免疫注射剂量相同但不添加佐剂、未经乳化的hAG2，3天后小鼠可用于后续步骤实验；
步骤三，将正常8周龄BALB/c雌性小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于体积分数为75％的酒精中5min，然后立即在超净工作台中剪开小鼠腹部皮肤，注意切勿剪破小鼠腹膜，避免污染及腹腔液外流，用酒精棉球擦拭腹膜，将5mL-10mL HAT培养液注入小鼠腹腔，注射器停留不动，揉捏小鼠腹部1min～3min后回抽腹腔内液体5mL注入离心管，在180g的条件下离心10min，弃去上清液，细胞沉淀加20mL-50mL HAT培养液，重悬细胞，计数50个/μL-100个/μL后注入96孔培养板，每孔滴加80μL-120μL，在37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度环境中培养、观察，生长良好的滋养细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强；
步骤四，将步骤二得到的小鼠拉颈脱臼处死，用体积分数为75％的酒精消毒后取出小鼠脾脏，去除结缔组织，放入RPMI-1640完全培养液中制成脾细胞悬液，将脾细胞悬液注入离心管静置10min，弃去组织块沉淀，将不含有沉淀组织块的上悬液移至另一离心管，在180g条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入20mL RPMI-1640基础培养液悬浮沉淀，从悬浮液中抽取10μL悬浮液用磷酸盐缓冲液稀释100-200倍，计数，再用40mL RPMI-1640基础培养液洗涤小鼠脾细胞2-3次，得到小鼠脾细胞；
步骤五，骨髓瘤细胞的活细胞数>95％，细胞生长密度过大的弃去不用，用RPMI-1640基础培养液将生长良好的从培养容器壁上冲洗下来，收集冲洗下来的骨髓瘤细胞并加入20mL RPMI-1640基础培养液，在180g条件下离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入20mL RPMI-1640基础培养液悬浮沉淀，从悬浮液中抽取10μL悬浮液用PBS稀释10-20倍，计数，再用40mL RPMI-1640基础培养液洗涤骨髓瘤细胞2-3次，得到骨髓瘤细胞；其中骨髓瘤细胞具体为由绵羊红细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞与P3X63Ag8骨髓瘤细胞融合而成的SP2/0；不分泌免疫球蛋白；对20ug/ml 8-氮鸟嘌呤有抗性，对HAT敏感；用于杂交瘤技术与B细胞融合，购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；
步骤六，将步骤四的小鼠脾细胞与步骤五的骨髓瘤细胞按(3～5)：1的细胞个数比例进行混合，将脾细胞与骨髓瘤细胞混合液在180g条件下离心5min，弃去上清液，轻轻弹动离心管使细胞沉淀形成糊状，在37℃水浴条件下进行如下操作，水浴2min，然后在1min内加入1mL PEG4000(聚乙二醇4000)，边加边摇动离心管，之后轻轻摇动45s，然后分4次在7min内加入RPMI-1640基础培养液26mL，第一次1min内加入1mL RPMI-1640基础培养液，第二次2min内加入5mL RPMI-1640基础培养液，第三次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，边加培养液边不停的摇动离心管，培养液加入完成立即在180g条件下离心5min，弃去上清液，留下沉淀；
步骤七，向上一步细胞沉淀中缓慢加入100mL HAT培养液，重悬混匀后注入步骤三中有滋养细胞的96孔培养板，在37℃，CO2体积浓度为5％，饱和湿度的环境中培养，培养3-5天后用HAT培养液半量换液一次，继续培养10天后用HT培养液半量换液一次，培养至第20天用RPMI-1640完全培养液半量换液；
步骤八，克隆化阳性杂交瘤细胞：第一次克隆用HT培养液，否则用RPMI-1640完全培养液，96孔培养板中融合细胞数量等于、大于105个/mL，采用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞，RPMI-1640完全培养液将阳性杂交瘤细胞冲洗下来，并用RPMI-1640完全培养液将细胞稀释至2500-3200个/mL，取0.1ml即约300个细胞加入10ml HT培养液，细胞浓度约为30个/ml；滴96孔板：1.2.3列0.2ml/孔即每孔约6个细胞，4.5.6列，0.1ml/孔即每孔约3个细胞，加HT培养液，将剩余细胞稀释3倍，细胞浓度约为10个/ml；7.8.9列加0.2ml/孔即每孔约2个细胞。10.11.12列0.1ml/孔即每孔约1个细胞。然后将96孔培养板置于37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度的环境中克隆化培养，培养1周后用RPMI-1640完全培养液半量换液培养，继续培养10-14天取培养上清液用间接ELISA方法检测并选取阳性杂交瘤细胞再次克隆化，置于37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度的环境中反复克隆化培养至100％的杂交瘤细胞分泌hAG2抗体为止，即获得稳定分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实施例2
本实施例提供了一种杂交瘤细胞株CCTCC—C200902分泌的hAG2单克隆抗体，该抗体制备方法包括：
步骤一，将0.5mL液体石蜡注入10周龄BALB/c雄性小鼠腹腔一周后，将在180g条件下离心5min后重悬浮于生理盐水中的杂交瘤细胞株CCTCC—C200902注入小鼠腹腔；
步骤二，拉颈脱臼处死接种杂交瘤细胞7-12天腹部明显膨大的小鼠，消毒后收集腹水，腹水在4℃、180g的条件下离心5min，弃去上层油脂和下层沉淀，吸取中层淡黄色腹水，在4℃、10000g的条件下离心10min，弃去沉淀保留淡黄色腹水，-80℃的保存；
步骤三，采用G蛋白亲和层析技术纯化淡黄色腹水中的hAG2单克隆抗体，G蛋白亲和层析纯化步骤参见Amersham Biosciences公司HiTrap Protein GHP(HiTrap affinity columns)试剂盒使用操作说明书；之后，将装有hAG2单克隆抗体的透析袋放入盛有1L PBS的容器中，透析24h，透析过程中透析液PBS更换2次，即得到hAG2的单克隆抗体。
单克隆抗体的特异性鉴定是通过间接ELISA法、Ig亚类鉴定试剂盒及Western blot分析进行的；通过质粒构建及转染后的Western blot分析对其特异性进一步鉴定；用免疫荧光和免疫沉淀对其应用进行了确认，
(1)细胞蛋白提取的方法，具体步骤如下：
步骤一，MCF7(乳腺癌细胞系)、MDA-MB-231(乳腺癌细胞系)、293T(转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制)细胞长至培养皿底面积的90％，倒掉RPMI-1640完全培养液后置于冰上，PBS冲液洗涤2次，然后加10mLPBS，将细胞刮下，180g于4℃离心5min，弃上清，留细胞沉淀；
步骤二，向步骤一得到的细胞中加细胞沉淀5倍体积的加蛋白酶抑制剂的NP40裂解液，混匀，4℃裂解20min，然后20000g于4℃离心1min，收取上清，Bradford法蛋白定量；NP40裂解液具体为：50mM Tris.Cl pH6.8、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％ NP-40；
(2)单克隆抗体的特异性鉴定的方法，具体步骤如下：
步骤一，滴度测定采用间接ELISA法，以1mg/L hAG-2-MBP融合蛋白包被酶标板，依次加入不同浓度的纯化后单克隆抗体及1∶10000的HRP-山羊抗小鼠IgG，加TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)显色后，用酶标仪测定A450值；其中，不同浓度的纯化后单克隆抗体具体为：1：101，1：102，1：103，1：104，1：105，1：106；1：107；
步骤二，Ig类和亚类的鉴定：按Ig亚类鉴定试剂盒的说明书(购自HyCultbiotechnology bv公司)进行；
步骤三，特异性鉴定：采用Western blot分析；取hAG-2-MBP融合蛋白，MBP(麦芽糖结合蛋白)及细胞蛋白提取的方法中提取的MCF7蛋白，经15％SDS-PAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜上；滴加脱脂奶粉24℃封闭1h后，依次加单克隆抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜3次及1∶10000HRP-山羊抗小鼠IgG 24℃孵育1h，TBST洗膜3次；将硝酸纤维素膜用ECL Plus处理5min后，于暗室曝光到X-胶片上，显影、定影。
结果标明：单克隆抗体的滴度达1×10-6；亚类测定结果表明：hAG2的单克隆抗体为IgG型，其中重链为IgG1，轻链为κ。图1为抗hAG-2单克隆抗体特异性的Western blot分析图，图中：1.AGR2-MBP融合蛋白；2.MBP；3.MCF7细胞提取蛋白。由图1可知，单克隆抗体与AGR2-MBP融合蛋白在分子量约为60000处出现1条清晰的带，与融合蛋白预期的分子量一致(MBP的分子量为40kD，hAG-2的分子量为20kD)，而与MBP未结合，与MCF7在分子量约为20000处出现1条清晰的带，说明此单克隆抗体的特异性，该单克隆抗体能与变性的hAG2蛋白结合。
(3)质粒构建及转染后对单克隆抗体的特异性进一步鉴定，具体步骤如下：
步骤一，根据NCBI中提供的AGR2碱基序列，结合primer 5.0软件(加拿大Premier公司)设计引物，其上游引物设计Xba I酶切位点，下游引物设计Xho I酶切位点，片段全长528个碱基(57～585氨基酸)，以MCF7乳腺癌细胞系cDNA为模板进行PCR反应；
步骤二，回收扩增的目的片段，然后与经Xba I和Xho I双酶切后的pcDNA3载体进行连接；
步骤三，转染MDA-MB-231，293T细胞，未连接的pcDNA3载体做阴性对照；转染步骤如下：将生长状态良好的MDA-MB-231，293T细胞铺至6孔板，贴壁后PBS洗涤2次，加入500μL转染液培养2h，PBS洗涤3次，换RPMI-1640完全培养液，培养过夜；第二天，换新的RPMI-1640完全培养液，其中转染液具体为在0.05mL RPMI-1640基础培养液中加0.02mg的DNA、15μg的PEI(聚乙烯亚胺)，混匀，24℃孵育8min后加入0.45mL含体积分数为10％的胎牛血清的RPMI-1640基础培养液；
步骤四，24h—48h后，提取蛋白，进一步验证单克隆抗体的特异性；
步骤五，同单克隆抗体的特异性鉴定方法如步骤三。
图2为抗hAG-2单克隆抗体对转染后细胞的Western blot分析图，图2中，1.MCF7细胞提取蛋白；2.转然后MDA-MB-231细胞提取蛋白；3.未转染MDA-MB-231细胞提取蛋白；4.转然后293T细胞提取蛋白；5.未转染293T细胞提取蛋白。由图2可知，单克隆抗体与MCF7，转染后的MDA-MB-231、293T，在分子量约为20000处出现1条清晰的带，进一步说明此单克隆抗体的特异性。
(4)单克隆抗体免疫荧光应用的方法，具体步骤如下：
步骤一，将MCF7、MDA-MB-231、293、293T细胞从细胞培养皿转入6孔培养板；
步骤二，24h后，倒掉RPMI-1640完全培养液，PBS洗涤1次，质量分数为4％的多聚甲醛，24℃，固定10min-20min，PBS洗涤1次；
步骤三，0.5％ TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚，中文名为曲拉通X-100)24℃孵育2min-10min，PBS洗涤3次，每次5分钟；
步骤四，加抗hAG-2单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5分钟；
步骤五，加荧光标记的山羊抗小鼠二抗，24℃孵育30min，PBS洗涤3次，每次5分钟；
步骤六，DAPI染色2min-5min，PBS洗涤2次，每次5分钟；
步骤七，荧光显微镜观察。
图3为抗hAG-2单克隆抗体在MCF7细胞中免疫荧光检测hAG-2的图，图中，(a)为加制备的单克隆抗体的免疫荧光检测示意图；(b)为未加单克隆抗体的免疫荧光检测示意图。由图3可知，在400倍荧光显微镜镜下可见抗hAG-2单克隆抗体与MCF7细胞的hAG-2蛋白结合。
(5)单克隆抗体免疫沉淀应用的方法，具体步骤如下：
步骤一，制备与抗体结合的Protein G Beads(G蛋白珠，购自Santa Cruz公司)同时制备MBP-Beads(麦芽糖结合蛋白-G蛋白珠)对照及无单克隆抗体对照：将0.05ml protein G Beads，加入盛有10ml PBS的离心管中，混匀，24℃孵育30min后，200g离心2min，去上清10ml，约剩0.05ml。取含抗hAG2单克隆抗体或抗MBP单克隆抗体的RPMI-1640基础培养液10ml分别加入0.02ml上述制备的Protein G Beads，混匀，24℃孵育2h；200g离心去上清，用10mlPBS洗涤2次，将与抗体结合的Protein G beads分别转入1.5ml离心管，加PBS至0.08ml，4℃保存备用；
步骤二，免疫沉淀：细胞蛋白提取的方法中提取的MCF7蛋白1mg加抗体-protein G beads悬浮液0.05ml，并用MBP-beads，protein G beads作对照，混匀后4℃孵育过夜，200g离心去上清，用PBS 1ml洗涤4次，5×PAGE proteinloading buffer悬浮沉淀，95℃加热5min；
步骤三，免疫沉淀后Western blot分析：用以5×PAGE protein loadingbuffer悬浮hAG2-MBP融合蛋白即抗原、单克隆抗体进行免疫沉淀形成的抗原-抗体复合物、纯化后的抗hAG-2单克隆抗体后于95℃加热5min，置于冰上冷却10min，将上述3种样品经12g/L SDS-PAGE分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，以后的步骤同单克隆抗体的特异性鉴定的方法中的步骤三。
图4为抗hAG-2单克隆抗体免疫沉淀后Western blot分析图，图4中，1.MCF7细胞提取蛋白；2.免疫沉淀复合物；3.单克隆抗体；4.未加单克隆抗体的免疫沉淀复合物。由图4可知，单克隆抗体与MCF7提取蛋白在分子量大约为20000处出现1条清晰的带，同时与其免疫沉淀形成的抗原-抗体复合物，分别在分子量大约为20000、55000、25000处出现3条清晰的带，分别与hAG-2、IgG的重链及轻链分子量相符；纯化后的抗hAG-2单克隆抗体作为抗原虽不能与一抗即制备的单克隆抗体结合但可与二抗即HRP-山羊抗小鼠IgG结合而显色，因而在分子量大约为55000和25000处出现2条清晰的带，与抗体重链及轻链分子量相符，可知，该单克隆抗体可与天然状态的hAG-2蛋白结合，并且亲和力高。
Claims (7)
1、一种杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株18A4，保藏号为CCTCC—C200902，其能分泌hAG2单克隆抗体。
2、一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，在pMal-c2载体中原核表达hAG2蛋白；
步骤二，利用步骤一得到的hAG2免疫4-12周龄BALB/c雌性小鼠，得到免疫后的小鼠；
步骤三，将HAT培养液注入正常小鼠腹腔，揉捏小鼠腹部后回抽腹腔内液体，离心，在沉淀下来的滋养细胞中加HAT培养液，注入96孔培养板进行培养；
步骤四，将步骤二得到的免疫后的小鼠处死，消毒，取小鼠脾脏制成脾细胞悬液，经静置、离心、稀释、计数、RPMI-1640基础培养液洗涤，得到小鼠脾细胞；
步骤五，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心，弃去上清液，加入RPMI-1640基础培养液，离心，留下沉淀；
步骤六，在沉淀中加入HAT培养液，混匀后注入步骤三中的96孔培养板进行培养；
步骤七，检测96孔培养板中的融合细胞，冲洗下阳性杂交瘤细胞，培养，选取阳性杂交瘤细胞，反复培养杂交瘤细胞100％的分泌hAG2单克隆抗体为止，得到稳定分泌hAG2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3、根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤二中，所述免疫具体为，加弗氏完全佐剂乳化hAG2，将乳化后的hAG2注射进小鼠背部和腹腔，注射hAG2的剂量为0.1mg，进行首次免疫，首次免疫3周后进行加强免疫，每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量同首次免疫，加强免疫用弗氏不完全佐剂，直至抗体滴度≧1∶10000，然后静脉注射未乳化的hAG2进行冲击免疫，冲击免疫3天后小鼠可用于步骤四。
4、根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤五中，所述混合具体为，脾细胞与骨髓瘤细胞按(3～5)：1的个数比例进行混合。
5、根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤五中，所述加入RPMI-1640基础培养液具体为，在弃去上清液之后，弹动离心管使细胞沉淀形成糊状，在37℃水浴条件下进行如下操作，水浴2min，然后在1min内加入1mL PEG4000，边加边摇动离心管，之后摇动45s，然后分4次在7min内加入RPMI-1640基础培养液26mL，第一次1min内加入1mL RPMI-1640基础培养液，第二次2min内加入5mL RPMI-1640基础培养液，第三次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，第四次2min内加入10mL RPMI-1640基础培养液，边加培养液边摇动离心管；其中，RPMI-1640基础培养液为：RPMI-1640培养液中加100U/ml青霉素-链霉素。
6、根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤六中，所述培养具体为，37℃、CO2体积浓度为5％、饱和湿度，培养3-5天后用HAT培养液半量换液一次，继续培养10天后用HT培养液半量换液一次，培养至第20天用RPMI-1640完全培养液半量换液；其中，RPMI-1640完全培养液为：RPMI-1640基础培养液中加体积分数为10％的胎牛血清；HT培养液为：RPMI-1640完全培养液中加1×10-4M的次黄嘌呤以及1.6×10-5M的胸腺嘧啶；HAT培养液为：HT培养液中加4×10-7M氨基喋呤。
7、根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征是，步骤三和步骤七中，所述培养具体为，37℃、CO2的体积浓度为5％、饱和湿度。
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