CN113336853A - 针对agr3蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于单克隆抗体领域，具体公开了针对AGR3蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用。该抗体由保存编号CGMCC‑No.20780的小鼠单克隆抗体细胞株9F10分泌；单克隆抗体在制备检测或诊断AGR3蛋白的试剂中的应用，以及制备抑制结直肠癌转移的药物或试剂中的应用。本发明的单克隆抗体能够特异性识别结肠癌细胞如LoVo细胞及结肠癌组织中的AGR3蛋白，灵敏度高；能够有效抑制AGR3蛋白促进的结肠癌转移。

Description

针对AGR3蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种特异性针对AGR3的单克隆抗体、其制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是全球第二大死亡原因，传统的手术和药物治疗已经难以满足目前的临床需求。在针对恶性肿瘤的治疗方法中，抗体靶向治疗逐渐受到人们的重视，单克隆抗体具有特异性强，靶向性好的优点，目前已有不少单克隆抗体药物应用于临床，并取得了较好的疗效。识别新的肿瘤治疗靶点并开发相应的靶向单克隆抗体具有重要的临床价值和意义。
前梯度蛋白3(anterior gradient protein 3，AGR3)属于PDI家族(蛋白质二硫键异构酶)中的一员，主要定位于内质网，同时也可分泌至细胞外。有研究报道AGR3与多种肿瘤的发生发展密切相关，AGR3在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中的表达均出现显著上调。AGR3也被认为是肝内胆管癌的诊断标志物。更为重要的是，分泌型AGR3可以促进乳腺癌细胞的转移。AGR3 蛋白可以促进结直肠癌细胞的迁移，提示AGR3可能作为肿瘤转移治疗的潜在靶点，因此有必要开发针对AGR3的单克隆抗体，为肿瘤的靶向治疗提供新的思路和方法。
发明内容
本发明目的在于提供了一种单克隆抗体、制备及其应用，主要解决了目前技术中缺少相应有效阻断AGR3促进肿瘤细胞转移作用的物质，缺少相应单克隆抗体制备方法等问题。
单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，
构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体；
诱导表达并通过镍柱亲和层析纯化得到AGR3重组蛋白；
使用AGR3蛋白免疫ICR鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得单克隆细胞，筛选出能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水，纯化抗体。
一种方式，pET-28a-AGR3-His重组表达载体构建方式为，
利用人的基因组cDNA为模板扩增AGR3开放阅读框序列，与酶切后的 pET28a载体进行融合重组，酶切位点为BamHI和HindIII。
一种方式，所述能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其为保藏号CGMCC No.20780的鼠单抗细胞株。
保藏号为CGMCC No.20780的杂交瘤细胞。
一种方式，其由下述方法制备而得，
构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体；
诱导表达并通过镍柱亲和层析纯化得到AGR3重组蛋白；
使用AGR3蛋白免疫ICR鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得单克隆细胞，筛选出能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
单克隆抗体，能特异性识别、靶向AGR3蛋白，其中，所述单克隆抗体表现出对AGR3促进肿瘤细胞转移具有抑制作用。
一种方式，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.20780的鼠单抗细胞株分泌。
前述单克隆抗体在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
一种方式，单克隆抗体作为AGR3对肿瘤细胞转移促进作用的抑制剂。
一种方式，所述肿瘤疾病包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
前述单克隆抗体在制备检测或诊断AGR3蛋白的试剂中的应用。
检测或诊断AGR3蛋白的试剂盒，包含前述的单克隆抗体。
分泌所述AGR3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为9F10。该细胞株于 2020年9月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No.20780，分类命名为小鼠杂交瘤细胞株，保藏地址为中国北京。
本发明的有益效果是：
单克隆抗体能特异性识别结肠癌细胞(如LoVo，DLD1)中的AGR3，灵敏度高。此外，该单克隆抗体可阻断AGR3促进的结肠癌细胞(LoVo细胞) 转移。
附图说明
图1显示pET-28a-AGR3-His质粒构建示意图；
图2显示诱导大肠杆菌表达后，AGR3蛋白在细菌裂解上清中的表达情况；
图3显示细菌裂解上清中的AGR3蛋白经过镍柱亲和层析纯化后的效果；
图4显示通过Westernblot筛选特异性识别结肠癌细胞系(LoVo，DLD1 细胞)中内源性AGR3蛋白的免疫小鼠血清；
图5显示通过迁移小室实验筛选能够阻断AGR3蛋白促进的结肠癌细胞 (LoVo)迁移效果的免疫小鼠血清；
图6显示通过Westernblot筛选特异性识别结肠癌细胞系(LoVo，DLD1 细胞)中内源性AGR3蛋白的AGR3单克隆抗体；
图7显示通过迁移小室实验筛选对AGR3蛋白促进的结肠癌细胞(LoVo) 迁移有阻断效果的AGR3单克隆抗体；
图8显示编号9F10的单克隆细胞分泌的AGR3单克隆抗体纯度检测结果；
图9显示编号9F10的单克隆细胞分泌的AGR3单克隆抗体阻断AGR3蛋白促进的结肠癌细胞(LoVo)迁移；
图10显示Westernblot检测AGR3单克隆抗体9F10特异性识别结肠癌细胞系(LoVo，DLD1)中内源性AGR3蛋白表达，Ctrl:1号小鼠血清；
图11显示组织免疫荧光检测AGR3单克隆抗体9F10特异性识别结肠癌组织中内源性AGR3蛋白表达，C906N:结直肠癌癌旁组织；C906T:结直肠癌组织。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步技术说明。说明书中的术语均是本领域公知的专业术语，无法采用专业术语的，说明书会进行解释及说明，使得本领域技术人员理解其含义。
单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤，
构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体；
诱导表达并通过镍柱亲和层析纯化得到AGR3重组蛋白；
使用AGR3蛋白免疫ICR鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得单克隆细胞，筛选出能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水，纯化抗体。
pET-28a-AGR3-His重组表达载体构建方式为，
利用人的基因组cDNA为模板扩增AGR3开放阅读框序列，与酶切后的 pET28a载体进行融合重组，酶切位点为BamHI和HindIII。
所述能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其为保藏号 CGMCCNo.20780的鼠单抗细胞株。
保藏号为CGMCC No.20780的杂交瘤细胞。
上述杂交瘤细胞其由下述方法制备而得，
构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体；
诱导表达并通过镍柱亲和层析纯化得到AGR3重组蛋白；
使用AGR3蛋白免疫ICR鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得单克隆细胞，筛选出能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
单克隆抗体，能特异性识别、靶向AGR3蛋白，其中，所述单克隆抗体表现出对“AGR3促进肿瘤细胞转移”具有抑制作用。
AGR3蛋白DNA序列如SEQ ID NO1所示。
所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.20780的鼠单抗细胞株分泌。
上述单克隆抗体在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
单克隆抗体作为AGR3对肿瘤细胞转移促进作用的抑制剂。
所述肿瘤疾病包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等其他相关性癌症。
上述单克隆抗体在制备检测或诊断AGR3蛋白的试剂中的应用。
检测或诊断AGR3蛋白的试剂盒，包含前述限定的单克隆抗体。
实施例1构建AGR3重组表达质粒
设计引物(AGR3-F、AGR3-R)，利用人的基因组cDNA为模板扩增AGR3 开放阅读框(ORF)序列，与酶切后的pET28a载体进行融合重组，酶切位点为BamHI和HindIII，构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体，测序验证。载体的克隆位点示意图如图1所示。
步骤1)扩增AGR3全长开放阅读框
以人基因组cDNA为模板，AGR3-F、AGR3-R为引物PCR扩增AGR3 开放阅读框。
用于扩增AGR3全长开放阅读框的引物体系如下：
Figure BDA0003075282120000051
PCR体系如下：
Figure BDA0003075282120000052
Figure BDA0003075282120000061
扩增条件：95℃预变性5min；95℃ 15s、56℃ 15s、72℃ 30s，循环35 次；72℃延伸5min。
步骤2)pET-28a载体酶切
用BamHI和HindIII双酶切pET-28a载体，酶切体系如下：
Figure BDA0003075282120000062
37℃酶切1小时。
步骤3)融合重组
将步骤1)及步骤2)所得的AGR3扩增片段及酶切后的载体进行切胶回收，用诺唯赞公司提供的质粒重组试剂盒进行融合重组，体系如下：
Figure BDA0003075282120000063
37℃孵育30分钟。
步骤4)重组质粒转化，提取及鉴定
将步骤3)得到的重组产物加入感受态细菌(DH5α)中，冰置20分钟， 42℃水浴热激90秒，冰置5分钟，加入1ml LB培养基37℃孵育1小时，离心收集适量菌液，涂于含有30ug/ml卡那霉素的LB平板中，37℃培养过夜后挑取单克隆菌株，在含有30ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中培养，测序验证后提取pET-28a-AGR3质粒。
实施例2 AGR3-His重组蛋白的表达与纯化
步骤1)AGR3-His蛋白表达与鉴定
将100ng pET-28a-AGR3质粒加入感受态细菌(BL21)中，冰置20分钟， 42℃水浴热激90秒，冰置5分钟，加入1ml LB培养基37℃放置1小时，离心收集适量菌液，涂于含有30ug/ml卡那霉素的LB平板中，37℃恒温培养箱过夜后挑取单克隆菌株；
将单克隆菌株在2ml含有30ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养， 37℃培养箱200rpm培养至OD值为0.5，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达2h；离心弃掉上清，加入150ul预先加入蛋白酶抑制剂的PBS重悬菌液，冰上超声裂解细菌，离心收集上清及沉淀；
将沉淀用100ul RIPA裂解液溶解重悬，取50ul上清及沉淀蛋白加入蛋白上样缓冲液99℃煮10分钟，SDS-PAGE跑胶，考马斯亮蓝染色；如图2所示，AGR3蛋白在细菌裂解上清及沉淀中均有表达。我们选择细菌裂解上清中的AGR3用于后续实验。
步骤2)AGR3蛋白大量表达
将步骤1)转化有pET-28a-AGR3的BL21大肠杆菌加入到200ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD值达到0.5，加入终浓度为1mM 的IPTG诱导表达2h；离心弃掉上清，加入15ml预先加入蛋白酶抑制剂的PBS 重悬菌液，冰上超声裂解细菌，离心收集上清。
步骤3)AGR3蛋白纯化
本发明采用镍柱亲和层析法纯化AGR3蛋白。用Binding Buffer清洗并平衡镍柱，将含有AGR3蛋白的裂解上清用0.45um的滤器过滤后过柱，收集流穿液，用Binding Buffer洗去未结合的杂蛋白，然后用Elution Buffer洗脱AGR3 蛋白，SDS-PAGE跑胶鉴定AGR3蛋白浓度及纯度。结果如图3所示，1标准品，2第一次洗脱液，3第二次洗脱液，4第三次洗脱液，5第四次洗脱液。
对纯化的AGR3蛋白进行透析。透析液咪唑浓度从200mM开始逐渐降至 30mM，透析48小时后收集蛋白，将蛋白分装放置-80℃冰箱保存。
所用到的溶液配制方法如下：
Figure BDA0003075282120000081
实施例3AGR3单克隆抗体的制备及筛选
用上述纯化的AGR3蛋白对SPF级ICR雌鼠进行免疫，具体步骤如下：
步骤1)小鼠免疫
用纯化的AGR3蛋白皮下初次免疫4只SPF级BALB/c雌性小鼠，剂量为60ug/只小鼠，小鼠编号为1、2、3、4。2周后皮下加强免疫，剂量为30ug/ 只小鼠，共加强免疫5次。
步骤2)检测血清免疫效价
用纯化的AGR3蛋白(2ug/ml)包被ELISA板子，4℃过夜；2％牛奶37℃封闭2h；小鼠眼眶取血，加入小鼠血清，血清从200倍开始2倍梯度稀释，洗液洗涤3次后加入二抗，37℃孵育1h；洗液洗涤3次后显色，显色时间为 5min；每孔加入50ul终止液终止后测吸光度值。空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。结果为表1所示，经过初次免疫和五次加强免疫后，四只小鼠的血清ELISA效价均较高。
表1小鼠血清效价
Figure BDA0003075282120000082
注：效价为大于最大OD/2的最小OD读数所对应的稀释度
步骤3)小鼠血清对AGR3蛋白的检测
将结肠癌细胞用PBS洗三遍，刮取细胞，离心取细胞沉淀，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解10min；12000rpm，4℃离心15min后取细胞裂解上清；BCA蛋白定量；加入蛋白上样缓冲液99℃水浴10min；SDS-PAGE 胶电泳后，180mA恒流转膜2h；5％脱脂牛奶室温封闭1h；1#、2#、3#、4# 号小鼠血清(1:200稀释)4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，二抗室温孵育1h， TBST洗膜三次后曝光，结果如图4所示，1#、3#、4#小鼠血清均能检测出 LoVo和DLD1细胞中AGR3的表达。
步骤4)小鼠血清阻断效果测定
将Transwell小室放入24孔培养板中，小室下层加入含有150ng/ml的AGR3蛋白和小鼠血清的500ul DMEM完全培养基，小室上层加入含有5x104细胞数量的LoVo细胞悬液；培养14小时后取出Transwell小室，4％多聚甲醛室温固定15分钟后结晶紫染色20分钟，用棉签擦拭掉小室上层没有穿过的细胞，显微镜观察并拍照。图5显示1#小鼠血清阻断外源性AGR3对LoVo 细胞的促迁移作用最显著，因此接下来选择1#小鼠进行细胞融合实验。在细胞融合之前，再进行腹腔冲击免疫一次(50ugAGR3蛋白)。
步骤5)细胞融合实验
将1#小鼠眼球取血，脱颈处死后取小鼠的脾脏和胸腺轻轻研磨；将碾好的胸腺细胞加入15ml离心管中，再加入2ml的HAT和2ml的HT后备用；将碾好的脾脏细胞吸入到装sp2/0细胞的离心管中，1500rad/min离心5分钟；倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞重悬，1500rad/min离心5分钟；倒掉上清，轻轻拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃水浴，缓慢加入1ml 的PEG后静置1分钟。然后缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着缓慢加入8ml无血清的IMDM，1000rad/min离心5分钟；倒掉上清，用10ml的血清重悬细胞，加入前面备用的胸腺细胞，再加入25ml半固体培养基充分混匀；倒入30个细胞培养皿中，将细胞培养皿放入湿盒中，在孵箱中培养。
步骤6)单克隆细胞初筛
融合细胞培养10天后，挑单克隆细胞培养于96孔板中(事先用胸腺细胞铺板)，10板x93个；采用ELISA对挑选的单克隆做第一次筛选，得到14 株阳性杂交瘤细胞株。具体步骤为：
用纯化的AGR3蛋白(2ug/ml)包被ELISA板子，4℃过夜；2％牛奶37℃封闭2h；加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照 (PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 1：1000倍稀释)，37℃孵箱1h；洗液洗涤3次；加入二抗，37℃孵育1h；洗液洗涤3次后显色，显色时间为5min；每孔加入50ul终止液终止后测吸光度值。
结果如表2-表11所示，共筛选出14株阳性单克隆细胞株(加粗字体为筛选的阳性克隆)。
表2融合细胞板筛选(板1)
Figure BDA0003075282120000101
表3融合细胞板筛选(板2)
Figure BDA0003075282120000102
表4融合细胞板筛选(板3)
Figure BDA0003075282120000111
表5融合细胞板筛选(板4)
Figure BDA0003075282120000112
表6融合细胞板筛选(板5)
Figure BDA0003075282120000113
表7融合细胞板筛选(板6)
Figure BDA0003075282120000114
表8融合细胞板筛选(板7)
Figure BDA0003075282120000115
Figure BDA0003075282120000121
表9融合细胞板筛选(板8)
Figure BDA0003075282120000122
表10融合细胞板筛选(板9)
Figure BDA0003075282120000123
表11融合细胞板筛选(板10)
Figure BDA0003075282120000124
步骤7)单克隆细胞二筛
将步骤6)得到的14株阳性细胞株，分别用AGR3蛋白和His标签蛋白包板，采用ELISA方法，进行第二次筛选。结果如表12所示，AGR3蛋白测定结果阳性且标签蛋白测定结果为阴性的单克隆细胞株共有4株，分别为3E6、 8G3、8G4、9F10。
表12对14个阳性克隆用AGR3蛋白和标签蛋白进行ELISA筛选
Figure BDA0003075282120000131
注：标签指标签蛋白His；灰色背景为阳性克隆。
步骤8)AGR3单克隆细胞亚类鉴定
对步骤7)筛选得到的4株单克隆阳性细胞株进行亚类鉴定。用PBS稀释包被抗体至0.5ug/ml，每孔100ul，4℃过夜；PBS-T洗2次；每孔加入200ul 封闭液，37℃孵育2h；PBS-T洗3次；每孔加入100ul杂交瘤上清，37℃孵育1h；PBS-T洗3次；用封闭液1：1000(κ，λ)或1：2000(其它的)稀释的HRP 标记的抗体0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h；PBS-T洗3次；加50ul底物溶液，于双波长(450，630)测吸光值。
如表13所示，这4株单克隆细胞株均为IgG类型阳性杂交瘤细胞株。
表13对4株阳性细胞株进行亚类鉴定
Figure BDA0003075282120000132
步骤9)Western Blot和Transwell筛选单克隆细胞株
实验方法与步骤3)及步骤4)相似，但此步骤中使用的是单克隆细胞培养上清作为一抗检测。图6显示3E6、8G3、8G4和9F10(1：4稀释)均能够检测出LoVo和DLD1细胞中内源性AGR3蛋白的表达；图7结果显示3E6、 8G3、8G4和9F10单克隆细胞培养上清(1：4稀释)均能明显阻断外源性AGR3对LoVo细胞的促迁移作用，其中9F10的效果最为明显。
步骤10)纯化AGR3单克隆抗体
我们将9F10杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔内，一周后抽取小鼠腹水，用 ProteinA/G进行抗体纯化；图8显示SDS-PAGE检测该抗体在重链区(55KDa) 和轻链区(25KDa)均有清晰条带，抗体纯度大于90％；表14显示9F10细胞分泌的AGR3抗体ELISA检测抗体亲和常数为1.47E+10。
表14 ELISA检测抗体的亲和常数注：亲和常数≈150000xA/抗体浓度；A＝1/2OD值所对应的稀释倍数
Figure BDA0003075282120000141
实施例4 AGR3单克隆抗体的阻断效果
采用迁移小室方法(Transwell)检测9F10细胞分泌的单克隆抗体的阻断效果，实验方法与实施例3中步骤4)相似，不同之处在于本实施例中Transwell 下室加入的是纯化后的9F10单克隆抗体(浓度1.3mg/ml)。
结果如图9所示，9F10细胞分泌的单克隆抗体能够阻断AGR3蛋白促进的LoVo细胞迁移。
实施例5 AGR3单克隆抗体的特异性
1)WesternBlot检测单克隆抗体的特异性
实验方法与实施例3中步骤3)相似，不同之处在于本实例中使用的一抗为单克隆抗体(1:1000稀释)。
结果如图10所示，9F10分泌的单克隆抗体可以检测到LoVo和DLD1细胞中的内源性AGR3蛋白，且特异性高。
2)组织免疫荧光检测AGR3单克隆抗体的特异性
结肠癌组织切片，室温放置60min；二甲苯浸泡2次，每次10min；依次用无水乙醇、95％乙醇、70％乙醇浸泡5min；PBS洗两次，每次5min；柠檬酸钠缓冲溶液(PH6.0)加热至95℃，放入组织切片加热10min，等缓冲液冷却取出；PBS洗三次，加入5％正常山羊血清，封闭半小时；滴加AGR3单克隆抗体9F10(1：1000)，4℃过夜；PBS洗三次，滴加荧光二抗，室温避光孵育1h；PBS洗三次，DAPI染色10min，PBS洗三次；封片拍照。如图11所示，该AGR3单克隆抗体能特异性识别结肠癌组织中内源性AGR3蛋白表达。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120> 针对AGR3蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> AGR3蛋白(1)
<400> 1
atccagaata catttccaac aagagcactg gccaagtcag cttcttctga gagagtctct 60
agaagacatg atgctacact cagctttggg tctctgcctc ttactcgtca cagtttcttc 120
caaccttgcc attgcaataa aaaaggaaaa gaggcctcct cagacactct caagaggatg 180
gggagatgac atcacttggg tacaaactta tgaagaaggt ctcttttatg ctcaaaaaag 240
taagaagcca ttaatggtta ttcatcacct ggaggattgt caatactctc aagcactaaa 300
gaaagtattt gcccaaaatg aagaaataca agaaatggct cagaataagt tcatcatgct 360
aaaccttatg catgaaacca ctgataagaa tttatcacct gatgggcaat atgtgcctag 420
aatcatgttt gtagaccctt ctttaacagt tagagctgac atagctggaa gatactctaa 480
cagattgtac acatatgagc ctcgggattt acccctattg atagaaaaca tgaagaaagc 540
attaagactt attcagtcag agctataaga gatgatggaa aaaagccttc acttcaaaga 600
agtcaaattt catgaagaaa acctctggca cattgacaaa tactaaatgt gcaagtatat 660
agattttgta atattactat ttagtttttt taatgtgttt gcaatagtct tattaaaata 720
aatgtttttt aaatctga 738
<210> 2
<211> 166
<212> PRT
<213> AGR3蛋白(1)
<400> 2
Met Met Leu His Ser Ala Leu Gly Leu Cys Leu Leu Leu Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Ser Ala Leu Ala Ile Ala Ile Leu Leu Gly Leu Ala Pro Pro Gly
20 25 30
Thr Leu Ser Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ile Thr Thr Val Gly Thr Thr
35 40 45
Gly Gly Gly Leu Pro Thr Ala Gly Leu Ser Leu Leu Pro Leu Met Val
50 55 60
Ile His His Leu Gly Ala Cys Gly Thr Ser Gly Ala Leu Leu Leu Val
65 70 75 80
Pro Ala Gly Ala Gly Gly Ile Gly Gly Met Ala Gly Ala Leu Pro Ile
85 90 95
Met Leu Ala Leu Met His Gly Thr Thr Ala Leu Ala Leu Ser Pro Ala
100 105 110
Gly Gly Thr Val Pro Ala Ile Met Pro Val Ala Pro Ser Leu Thr Val
115 120 125
Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ala Thr Ser Ala Ala Leu Thr Thr Thr Gly
130 135 140
Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Ile Gly Ala Met Leu Leu Ala Leu Ala
145 150 155 160
Leu Ile Gly Ser Gly Leu
165

Claims (12)

1.单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体；
诱导表达并通过镍柱亲和层析纯化得到AGR3重组蛋白；
使用AGR3蛋白免疫ICR鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得单克隆细胞，筛选出能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水，纯化抗体。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：
pET-28a-AGR3-His重组表达载体构建方式为：
利用人的基因组cDNA为模板扩增AGR3开放阅读框序列，与酶切后的pET28a载体进行融合重组，酶切位点为BamHI和HindIII。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其为保藏号CGMCC No.20780的鼠单抗细胞株。
4.保藏号为CGMCC No.20780的杂交瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的杂交瘤细胞，其特征在于：其由下述方法制备而得，
构建pET-28a-AGR3-His重组表达载体；
诱导表达并通过镍柱亲和层析纯化得到AGR3重组蛋白；
使用AGR3蛋白免疫ICR鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得单克隆细胞，筛选出能分泌针对AGR3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
6.单克隆抗体，能特异性识别、靶向AGR3蛋白，其中，所述单克隆抗体表现出对AGR3促进肿瘤细胞转移具有抑制作用。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo.20780的鼠单抗细胞株分泌。
8.权利要求6或7中的单克隆抗体在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：单克隆抗体作为AGR3对肿瘤细胞转移促进作用的抑制剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤疾病包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。
11.权利要求6或7中的单克隆抗体在制备检测或诊断AGR3蛋白的试剂中的应用。
12.检测或诊断AGR3蛋白的试剂盒，其特征在于：包含权利要求6所述的单克隆抗体。
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