CN109021102A - 抗sma蛋白单克隆抗体及其用途 - Google Patents

抗sma蛋白单克隆抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.15597)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB237。本发明还涉及单克隆抗体UMAB237在制备用于检测SMA蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB237的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB237在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与SMA蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了SMA蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

Description

抗SMA蛋白单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明涉及肿瘤学和医学领域，具体涉及可特异结合SMA蛋白的单克隆抗体UMAB237、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于肿瘤分型的方法和用途。
背景技术
由SMA基因编码的平滑肌肌动蛋白是平滑肌细胞的标志性蛋白。平滑肌肌动蛋白能与平滑肌、肌上皮细胞和某些及纤维母细胞反应，不与骨骼肌和心肌反应。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对SMA蛋白的单克隆抗体对IHC检测SMA表达水平具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的SMA蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测SMA蛋白的免疫检测工具中的应用。
本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为CGMCC No.15597。
本发明还提供了一种特异性结合SMA蛋白的单克隆抗体UMAB237，由上述杂交瘤细胞株产生。
本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
(1)合成多肽的氨基酸序列：EEEDSTALVC
(2)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的SMA蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗SMA特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB237，亚型鉴定为IgG2a；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得SMA单克隆抗体UMAB237。分别通过WesternBlot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。
本发明还提供了单克隆抗体UMAB237在制备用于检测SMA蛋白的免疫检测工具中的应用。
具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB237，可检测组织细胞中SMA的表达状况。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的蛋白与SMA的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于平滑肌瘤组织。
与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.15597)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB237。本发明还提供了单克隆抗体UMAB237在制备用于检测SMA蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB237的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB237在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与SMA蛋白特异性结合，真实反映肿瘤细胞内SMA蛋白表达水平，可应用于平滑肌瘤组织SMA蛋白表达水平的检测。
保藏信息
用于保藏的杂交瘤细胞株UMAB237的分类命名为：SMA鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2018年4月26日；
保藏编号：CGMCC No.15597。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1～7示实施例2福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、扁桃体、平滑肌瘤组织免疫组化结果图(一抗为SMA单克隆抗体UMAB237)；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、SMA单克隆抗体的制备与筛选
根据标准方法用合成的SMA蛋白片段用于对Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：
1、动物免疫：经过纯化的SMA抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄Balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。
2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用Balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用SMA纯化重组蛋白进行ELISA测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为UMAB237。
4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×106/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株UMAB237产生的单抗为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、WB检测、分装、冻存在-20℃。
实施例2、单克隆抗体UMAB237为一抗的免疫组化检测
(1)、实验方法：
1、取福尔马林固定的人乳腺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、扁桃体、平滑肌瘤组织块进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为3μm。
2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次
3、加入抗原修复液(0.001M，pH8.5EDTA缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。
4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。
5、加上封闭液(PBS+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。
6、去除封闭液，勿冲洗，加入SMA单抗(UMAB237)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。PBST(0.02％Tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。
7、滴加Polink-试剂盒2(Catlog No.D37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Polink-2试剂盒(Catlog No.D37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。
8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。
9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。
10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。
11、镜检，见图1-7。
(2)、实验结果：
由图1～7结果可见，在乳腺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、扁桃体和平滑肌瘤的平滑肌细胞中可见到特异性胞质染色。结果与SMA在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体UMAB237可用于免疫组织化学检测SMA蛋白的水平。
<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司
<120>抗SMA蛋白单克隆抗体及其用途
<210> 1
<211>2961
<212> DNA
<213>合成肽的氨基酸序列：
（EEEDSTALVC）
<400>
GluGluGluAspSerThrAlaLeuVal
//

Claims (6)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，其与平滑肌肌动蛋白(SMA)特异性结合；
所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株UMAB237产生，保藏编号为CGMCC No.15597。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测平滑肌肌动蛋白的免疫检测工具中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
4.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于标记组织细胞的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述组织细胞为平滑肌瘤组织。
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