CN104672334B - 重组长链人胰岛素样生长因子-i的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组长链人胰岛素样生长因子‑I的制备方法。具体地,本发明提供一种融合蛋白以及基于该融合蛋白的生产工艺,该工艺适合高效制备高纯度和高活性的重组人长链胰岛素样生长因子‑I(LR3IGF‑1)。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地来说,本发明涉及重组蛋白的表达和制备工艺,特别是利用基因重组技术制备重组人长链胰岛素样生长因子-I的制备方法。
背景技术
上世纪五十年代,Salmon和Daughaday发现有这么一类生物活性物质,它能促进软骨对硫的吸收,从而促进人体骨骼的生长,当时他们将之命名为“硫化因子”(SulphateFactor SF)。后来经进一步研究发现,该因子具有与胰岛素相类似的功能,如降血糖、降血脂的作用,所以又被冠名为“胰岛素样生长因子”(Insulin-like Growth Factors,IGFs),该称谓就延用至今。
已知胰岛素样生长因子(IGFs)是由两类物质组成,即IGF-I和IGF-II。在人体内,IGF-I是主要部分,能分泌IGF-I的人体细胞有肝细胞、肾细胞、脾细胞等多达十几种。而IGF-II更多的是参与胚胎的发育,在人体内的重要性及功能的广泛性不及IGF-I。
胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因位于12号染色体,编码分子量为7648的70个氨基酸组成的单链多肽,含三个二硫键。它的结构、生物学性质和化学性质与胰岛素有相似之处。有关研究证明IGF-I介导生长激素的作用而促进生物的生长,因此像骨骼生长、细胞复制和另外一些与生长相关的过程均受IGF-I水平的影响。现已证明IGF-I在人体内有极其重要并且丰富的生物学功能,如促生长、促分化、参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢等,与生长荷尔蒙的作用相类似,都是起非常作用的生长因子。
胰岛素样生长因子-I的生理浓度受甲状腺疾病、糖尿病和营养不良的影响。胰岛素样生长因子-I与另外一些生长因子有协同作用,如它可以促进软组织和间叶组织损伤的修复,也可以促进哺乳动物细胞在无血清培养基中的生长等。近年来胰岛素样生长因子-I在国外主要用于ALS(肌营养不良性脊髓侧索硬化症)、周围神经疾病、运动神经元疾病和脊髓灰质炎后综合症。
Cephalon公司的基因工程产品重组胰岛素样生长因子-I已获得美国FDA批准,投入市场,用于治疗原发性IGF-I缺陷引起的侏儒症。另有Pharmcia用之于生长激素受体缺乏症(GHRD)的治疗和生长迟缓抗体阳性GH缺乏症LA的治疗也已进入三期临床工作。此外Genentech公司用于糖尿病的治疗和Chiron公司用于肾衰的治疗也都进入了二期临床实验阶段。
此外,国内外也在开发人胰岛素样生长因子的衍生物及类似物。其中Gropep公司是其中的典型代表,该公司的美国专利US5679771A公开了一系列特定的长链胰岛素样生长因子,其中长链人胰岛素样生长因子LR3IGF-1是由83个氨基酸残基组成的人胰岛素样生长因子衍生物。该LR3IGF-1是由人胰岛素样生长因子序列上将第三位的氨基酸残基Glu取代为Arg并在IGF1的N末端添加13个氨基酸而形成的多肽。在专利US5679771A中,Gropep公司称这种IGF1的衍生物能保持人胰岛素样生长因子的生物学活性,促进细胞和组织生长增殖,有利于提高基因工程细胞的蛋白表达水平。
目前LR3IGF-1已经在抗体药物生产工艺中细胞表达中得到广泛的应用,然而,目前的生产工艺尚难以令人满意,不适合大规模生产。例如对于常用的酵母细胞分泌表达而言,酵母细胞生产周期较长,产量不高,纯化难度大且在发酵过程中有降解产物出现。此外,大肠杆菌分泌表达的表达量低,提取劳动强度大,成本太高,难以大量制备高纯度和高活性的LR3IGF-1。
因此,本领域迫切需要开发能够高效生产高纯度LR3IGF-1的工艺,以便进行大规模生产。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效生产高纯度LR3IGF-1且适合大规模生产的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种融合蛋白,所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示结构:
A-B-C-D-E-F 式I
式中,
A为硫氧还蛋白(Thioredoxin)元件(TRX);
B为任选的第一连接肽元件;
C为纯化标签元件;
D为第二连接肽元件;
E为肠激酶识别位点元件(EK);
F为胰岛素样生长因子或胰岛素样生长因子衍生物元件;
“-”表示连接上述元件的肽键。
在本发明的一个实施例中,所述第二连接肽元件的序列如SEQ ID NO.:1中第123-127位所示(PDLGT)。
在本发明另一个实施例中,F为胰岛素样生长因子衍生物LR3IGF-1。
在本发明的另一个实施例中,所述的胰岛素样生长因子衍生物LR3IGF-1的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述的胰岛素样生长因子衍生物元件选自下组:
(a)SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列;
(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有胰岛素样生长因子的功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的一个实施例中,C为6×HIS序列。
在另一优选例中,所述的肠激酶识别位点元件为DDDDK。
在另一优选例中,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,其中:
第1-109位为Thioredoxin的氨基酸序列;
第110-116位为第一连接肽的氨基酸序列;
第117-122位为纯化标签HHHHHH的氨基酸序列;
第123-127位为第二连接肽的氨基酸序列;
第128-132为肠激酶识别位点DDDDK的编码序列;
第133-215为LR3IGF1的编码序列(经优化)。
本发明的第二个方面提供了一种分离的多核苷酸,所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。
在另一优选例中,所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1或6所示。
其中,第1-327位为Thioredoxin的编码序列;
第328-348位为第一连接肽的编码序列;
第349-366位为纯化标签HHHHHH的编码序列
第367-381位为第二连接肽的编码序列;
第382-396为肠激酶识别位点DDDDK的编码序列;
第397-648为LR3IGF1的编码序列(经优化)。
在本发明的第三方面,提供了一种载体,它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞,它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为原核细胞,较佳地为大肠杆菌。
本发明的第五方面,提供了一种产生蛋白的方法,它包括步骤:
在适合表达的条件下,培养本发明第六方面所述的宿主细胞,从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白。
在本发明的第六方面,提供了一种制备蛋白的方法,包括步骤:
(i)用肠激酶对本发明第一方面所述的融合蛋白酶切,从而获得酶切产物,该酶切产物包括对应于F元件的胰岛素样生长因子或胰岛素样生长因子衍生物;和
(ii)从酶切产物中分离或纯化出所述的胰岛素样生长因子或胰岛素样生长因子衍生物。
在另一优选例中,所述的胰岛素样生长因子衍生物是LR3IGF-1。
在另一优选例中,步骤(i)中进行酶切反应的条件包括:20IUEK/mg融合蛋白。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一赘述。
附图说明
图1显示了本发明一个实例中制备的产物(LR3IGF-1)的蛋白质相对分子质量分析结果。测定结果与理论分子量9111相一致。
图2显示了反相纯度比较图。结果显示,纯度大于95%。
图3显示了pET32-T和pET32b融合蛋白酶切效果的比较图。其中,各泳道如下:泳道1,6为分子量标准,从上到下依次为98kDa,66.2kDa,45kDa,31kDa,20kDa,14.4kDa(下同);泳道2为pET32-T-LR3IGF1融合蛋白未加肠激酶酶切对照样品,泳道3为pET32b-LR3IGF1融合蛋白加入肠激酶酶切样品,泳道4为pET32-T-LR3IGF1融合蛋白加入肠激酶酶切样品,泳道5为pET32b-LR3IGF1融合蛋白未加肠激酶酶切对照样品。
图4显示了TRX融合表达和GST融合表达比较图。其中,各泳道如下:泳道3为分子量标准;泳道1为pET32-T-LR3IGF1(全优化)的融合表达情况(诱导后),泳道2为pET32-T-LR3IGF1(全优化)的融合表达情况(诱导前),泳道4为GST融合表达构建pGEX-LR3IGF1(全优化)的融合表达情况(诱导前),泳道5为GST融合表达构建pGEX-LR3IGF1(全优化)的融合表达情况(诱导后)。
图5显示了天然序列LR3的表达效果图。其中,各泳道如下:泳道1为分子量标准;泳道2为未诱导的全菌蛋白,泳道3为诱导表达后的全菌蛋白,泳道4为诱导表达后的上清组分,泳道5为诱导表达后的沉淀部分。
图6显示了优化后序列LR3的表达效果图。其中,各泳道如下:泳道1为分子量标准;泳道2为未诱导的全菌蛋白,泳道3为诱导表达后的全菌蛋白,泳道4为诱导表达后的上清组分,泳道5为诱导表达后的沉淀部分。
图7显示了最终的纯品电泳图。其中,各泳道如下:泳道1为分子量标准;泳道2为纯品。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,对LR3IGF-1等胰岛素样生长因子的表达条件进行了大量的摸索,意外地发现,式I所示的融合蛋白特别适合作为制备LR3IGF-1的中间体。利用该融合蛋白,不仅可以高效地表达生产融合蛋白,而且该融合蛋白在后续的酶切处理过程中,几乎彻底避免了非特异性酶切的技术难题,从而可以高效地进行后续纯化工艺。此外,本发明人还对LR3IGF-1的编码序列进行了优化,从而进一步显著提高了融合蛋白和LR3IGF-1的表达量。在此基础上完成了本发明。
具体地,本发明人通过基因工程方法表达和纯化得到的蛋白产物是LR3IGF-1。本发明人通过对融合蛋白、表达方式以及基因优化等优化措施,实现了该衍生物融合蛋白的高表达;同时本发明人设计了精巧的纯化和酶切方案,可以方便高效地制得RP-HPLC纯度>95%的蛋白产物。通过平行的物理和生物学分析证明,本发明所得到的蛋白和市售的LR3IGF-1(购自SIGMA公司)完全一致。
术语
如本文所用,术语“胰岛素样生长因子元件”指式I中的元件F,即胰岛素样生长因子或胰岛素样生长因子衍生物元件。
如本文所用,术语“LR3IGF-1”或“LR3IGF-1”指在专利US5679771A中所公开的83个氨基酸残基组成的人胰岛素样生长因子衍生物。LR3IGF-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示,其原始编码序列如SEQ ID NO.:4所示。一种优化的编码序列如SEQ ID NO.:5所示
如本文所用,术语“第一连接肽”指位于元件A和元件C之间的连接肽。该第一连接肽是可有可无的。第一连接肽一般应具有足够的长度和柔韧性,以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。连接肽的长度一般为0-10个氨基酸,较佳地1-8个氨基酸。
如本文所用,术语“第二连接肽”指位于元件C和元件E之间的连接肽。
如本文所用,术语“硫氧还蛋白”或“TRX”可互换使用,指Thioredoxin。一种典型的硫氧还蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第1-109位所示。当然,在本发明中,该术语还包括具有与SEQ ID NO.:1中第1-109位所示的TRX相同功能的衍生蛋白或活性片段。
第二连接肽
在本发明的融合蛋白中,一个关键元件是第二连接肽。
本发明人通过大量的摸索,意外地发现,该第二连接肽的结构对于消除非特异性酶切至关重要。
具体地,当采用SEQ ID NO.:7所示的连接肽时,虽然也能够获得构象正确的融合蛋白和LR3IGF-1,然而在肠激酶酶切融合蛋白的酶切过程中始终存在一定量的非特异性酶切,导致存在与目标产物(如LR3IGF-1)分子量极为接近(仅比目标蛋白大2k分子量左右)的杂质蛋白质。
通过对各种不同结构连接肽的筛选,本发明人最终确定了一种特别优选的第二连接肽,即SEQ ID NO.:1中第123-127位所示的第二连接肽(PDLGT)。
序列优化
在本发明中,LR3IGF-1等元件的编码序列可以采用原始的或野生型的核苷酸序列,但更优选的是采用序列优化过的核苷酸序列。
在本发明中,还提供了优化的、特别适合在大肠杆菌中表达的LR3IGF-1蛋白的编码序列。
LR3IGF-1的原始核苷酸序列是已知的(如SEQ ID NO:4所示),其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明人先根据大肠杆菌密码子偏爱性,在不改变其氨基酸序列的前提下对LR3IGF-1的DNA序列进行了优化。然而,本发明人发现,仅依据密码子偏爱性而获得的优化序列并不适合在大肠杆菌中表达。
因此,本发明人还根据其他因素进行了针对性的二次优化,其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构),改变基因中A+T组成、改变G+C含量、改变mRNA5'及3'非翻译区(UTR)、和/或改变mRNA的二级结构及翻译起始密码子的AUG旁侧序列等。
经过测试和筛选,在众多修饰序列中获得了一个特别优化的LR3IGF-1编码序列。此优化的LR3IGF-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,与LR3IGF-1原始序列的同源性较低,仅约78.5%。本发明优化的LR3IGF-1编码序列仍然编码相同的LR3IGF-1蛋白(SEQ ID NO.:3)。
本发明的优化的LR3IGF-1编码序列可用常规方法获得,例如通过全基因合成。
融合蛋白及其制备
在本发明中,“重组融合蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用,指具有式I所述结构,即含有包括硫氧还蛋白元件和胰岛素样生长因子元件(优选LR3IGF-1)的融合蛋白。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外,应理解,所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的重组融合蛋白”是指重组融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化重组融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文所用,术语“引物”指的是在与模板配对,在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸,但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如,在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列,这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合,非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物,从而进行扩增。
本发明融合蛋白或其元件(如VEGFR1D2)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
表达、酶切和纯化
利用本发明的式I融合蛋白,可以高效简便地制备高纯度的LR3IGF-1。
在本发明的一个具体的优选例中,包括下列几个方面:
以商业化载体PET32b为基础,进行了改造(改造第二连接肽),从而解决了肠激酶非特异性酶切的问题。改造后的新质粒命名为PET32-T。
在LR3IGF-1编码序列前加入肠激酶识别位点DDDDK的识别位点,保证融合蛋白在经过肠激酶的酶解后能够获得和标准LR3IGF-1一样的N端残基序列;
将含有编码本发明式I所示融合蛋白的编码序列的载体(如PET32-T-LR3IGF-1)转入大肠杆菌(如菌株BL21(DE3)),得到工程菌。
将工程菌在诱导剂(如IPTG)的诱导下表达融合蛋白(记为TRX-6XHIS-EK-LR3IGF-1),该融合蛋白以包涵体形式表达;
融合表达的TRX-6XHIS-EK-LR3IGF-1的大肠杆菌经过裂菌、包涵体溶解、金属螯合纯化等步骤得到纯化的融合蛋白;
对融合蛋白进行复性;
对复性后的融合蛋白进行透析和酶切,得到含LR3IGF-1的酶切产物;
对酶切产物进行分离纯化,从而得到分离的或纯化的LR3IGF-1。
典型地,该分离纯化可包括多个步骤:
(a)离子交换,反相等层析步骤得到LR3IGF-1粗品;
(b)对LR3IGF-1粗品通过反相纯化,最终得到反相纯度大于95%的LR3IGF-1,在SDS-PAGE电泳上显示为单一条带。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明提供的制备方法产量高;
(b)制备的LR3IGF-1纯度非常高,无分子量相近的杂质;
(c)本发明的生产工艺稳定,有利于大规模生产。
(d)本发明制备的LR3IGF-1纯品和市售的LR3IGF-1的分子量和生物活性完全一致。
(e)生产低成本,工艺稳定。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
蛋白纯化实验均按照GE Healthcare提供的技术手册操作,所有纯化填料均购自GE Healthcare。
实施例1表达载体pET32-T的构建
人工合成以下两条引物:
引物R:5'GGTACCCAGATCTGGATGATGATGATGATGGTGCATATGGCCAG3'(SEQ ID NO.:8)
引物F:5'CCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAA3'(SEQ ID NO.:9)
另外,从上海生工生物工程有限公司购买两条通用引物(T7Promoter和T7Terminator)。
分别以引物R和T7Promoter为引物,以质粒pET32b(购自Novagen公司)为模板以及引物F和T7Terminator为引物,PET32b为模板做PCR反应,反应条件为:95℃变性5分钟,然后以95℃变性30秒,62℃退火30秒并68度延伸1分钟进行30个循环,最后以68℃延伸10分钟并降温至4℃。
琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物,回收一个约450bp和约200bp的片段,以引物T7Promoter和T7Terminator为引物,两个回收产物分别取1ul混合作为PCR的模板做PCR反应,反应条件为:95℃变性5分钟,然后以95℃变性30秒,62℃退火30秒并68度延伸1分钟进行30个循环,最后以68度延伸10分钟并降温至4℃。
琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物,回收一个约650bp的片段,用Xba I和HindIII双酶切该片段,并与经过这两个内切酶酶切的pET32b(购自Novagen公司)用T4DNA连接酶进行连接,转化到大肠杆菌DH5α中。
挑出阳性克隆,抽出其中的质粒,经过测序验证无误后命名为质粒pET32-T。
实施例2编码本发明LR3IGF-1基因序列的优化设计和全基因合成
通过软件分析,找出天然IGF-1中存在稀有密码子以及不稳定的二级结构,通过大肠杆菌偏爱密码子数据以及同义密码子的置换,最终得到优化的LR3IGF-1编码核酸序列SEQ ID NO.:5。
在优化后的序列N端加入限制性内切酶Kpn I位点以及肠激酶识别序列DDDDK的编码序列,在C端加入限制性内切酶Hind III位点,设计得到的一核苷酸序列SEQ ID NO.:10,其中编码区位于第22-270位。
GGTACCGACGACGACGACAAGATGTTTCCGGCGATGCCGCTGAGCAGCCTGTTTGTGAACGGCCCACGTACCCTGTGTGGTGCTGAACTGGTAGATGCTCTGCAGTTCGTGTGCGGTGACCGTGGCTTCTACTTTAACAAGCCGACTGGTTACGGTTCTTCTTCCCGCCGTGCCCCGCAGACCGGCATCGTTGATGAATGCTGCTTCCGTAGCTGCGACCTGCGCCGTCTGGAGATGTATTGTGCGCCGCTGAAACCGGCGAAATCTGCATAAGCTT(SEQ ID NO.:10)
委托上海生工生物工程有限公司全基因合成该SEQ ID NO.:10序列,通过上述酶切位点克隆入市售的pUC19载体(购自上海生工生物工程有限公司)中,经测序验证后命名为pUC19-LR3IGF-1(优化)。
同时基于LR3IGF-1的天然序列(SEQ ID NO.:4)也按上述方案加入肠激酶识别位点以及限制性内切酶Kpn I和Hind III位点,全基因合成该序列,并同样克隆到pUC19载体中,经测序验证后命名为pUC19-LR3IGF-1(天然)。
实施例3表达LR3IGF-1的载体构建
在本实施例中,采用优化的表达载体为pET32-T(为实施例1中所得到的载体),从而使得融合蛋白中的第二连接肽为优选的PDLGT。
方法:将pET32-T和pUC19-LR3IGF-1(优化)用限制性内切酶Kpn I和HindIII做双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收,再用T4连接酶连接,连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。挑出阳性克隆,抽出其中的质粒,经过测序验证无误后命名为pET32-T-LR3IGF-1。
重复上述步骤,不同点在于用pUC19-LR3IGF-1(天然)替换pUC19-LR3IGF-1(优化),从而构建得到pET32-T-LR3IGF-1(天然)。
实施例4表达LR3IGF-1蛋白的工程菌构建及诱导表达分析
将质粒pET32-T-LR3IGF-1转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)中,离心后取细菌涂布在含100ug/ml的氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜,在LB平板上挑单克隆培养,经过菌落PCR鉴定,得到单克隆转化子pET32-T-LR3IGF-1/BL21(DE3)。
得到的单克隆转化子pET32-T-LR3IGF-1/BL21(DE3)接种于3ml的含100ug/ml的氨苄青霉素的LB培养液中,37℃培养过夜;按2%的接种量取过夜培养的大肠杆菌接种到新鲜的LB培养液中37℃培养,当细菌密度OD600值达到0.6-1.0之间时,加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导融合蛋白表达,继续培养3.5小时后,收集菌体。通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
电泳结果见图6。结果分析显示,对于pET32-T-LR3IGF-1而言,融合蛋白以包涵体形式表达,融合蛋白表达量占细菌总蛋白的35%左右。
实施例5LR3IGF-1蛋白的发酵生产与分离纯化
1.发酵生产
将pET32-T-LR3IGF-1/BL21(DE3)接种于LB培养基中37℃培养过夜,第二天按2%的接种量接入新鲜的TB(甘油5克/升,蛋白胨12克/升,酵母膏24克/升,K2HPO412.54克/升,KH2PO42.31克/升)发酵液体培养液中,37℃培养到细菌OD600值达到1,加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导融合蛋白表达,继续培养4小时后收集菌体。
2.包涵体获取
融合蛋白以包涵体形式表达,为了获得包涵体,用PBS按1:10的比例重悬菌体,设置匀浆压力为750pa,匀浆两次,15000g的离心条件下离心收集沉淀部分;绝大部分包涵体蛋白在收集的沉淀部分中。
3.融合蛋白的溶解和纯化
包涵体按1:20的比例用溶液1(20Mm Tris-HCL,500mM NaCl,20mMImidazole,8MUrea20mM2-Mercaptoethanol pH8.0)充分溶解,15000g的离心条件下离心20分钟,取上清组分做进一步的纯化。
上清组分通过NI2+metal chelating chromatography在变性条件下纯化得纯的融合蛋白,融合蛋白处在含8M Urea的变性溶液中,加入终浓度为5mM的DTT处理融合蛋白,室温下防止过夜。
4.变性蛋白的重折叠(蛋白复性)
经过处理的变性蛋白滴加到复性液中(复性液配方为100mM Tris-HCL,500mMNaCl,0.5M Arginine,1%triton X-100,10%glycerol,1mM EDTA,1mM GSH,0.5mM GSSGpH8.0)滴加完后4℃冷库放置48-72小时,保证充分复性。
5.复性后蛋白的回收
充分复性的蛋白溶液装入透析袋对缓冲液(20mM PB,pH7.4)透析,每次透析4小时,总共透析3次;透析后,用阴离子柱Q回收目的蛋白。
6.融合蛋白肠激酶酶切
阴离子柱Q回收的融合蛋白中加入20IU/mg融合蛋白的肠激酶,加入磁力搅拌子缓慢搅拌,保证充分酶切,酶切条件:44℃,16-24小时。
7.酶切后纯化
经过酶切后的融合蛋白溶液,主要为二种成分:融合表达标签蛋白和LR3IGF-1,以及少量未酶切的完整融合蛋白,其中融合表达标签蛋白和完整融合蛋白都含有6xHis纯化标签,通过Ni2+金属亲和色谱法可以结合这两部分蛋白,LR3IGF-1不能结合到NI2+金属螯合柱而存在于流穿部分中。
8.LR3IGF-1的反相层析浓缩、精制和冻干
用购自GE Healthcare的partisil40ODS-3填料装填的反相层析柱,用100mM HAC做酸化剂浓缩和精制LR3IGF-1,精制后的蛋白溶液通过真空冷冻干燥法冻干成粉末状干粉,以便于保存和后续使用。
实施例6LR3IGF-1反相纯度分析
采用常规的HPLC分析方法,对本发明制备的LR3IGF-1,购自SIGMA公司的LongR3IGF-1做平行的RP-HPLC。
分析结果见图2,图中显示了pET32-T-LR3IGF1为序列未优化全基因合成的融合表达情况。
此外,本发明制备的LR3IGF-1的蛋白质的相对分子质量分析结果如图1所示,测定结果与理论分子量9111道尔顿一致。
本发明制备的最终的纯品电泳结果如图7所示。
实验结果表明:
1.本发明制备的LR3IGF-1和购自SIGMA公司的LongR3IGF-1在同一条件下,在反相柱C18上主峰的保留时间完全一致,表明两中蛋白为同一物质;
2.本发明制备的LR3IGF-1主峰面积占总峰面积的95%以上,而购自SIGMA公司的LongR3IGF-1主峰面积占总峰面积的65%左右,和SIGMA公司提供的说明书吻合,但是远远低于本发明制备的LR3IGF-1的95%。
实施例7LR3IGF-1促细胞增殖活性的测定
采用常规的MTT法测定本发明制备的LR3IGF-1,购自SIGMA公司的LongR3IGF-1以及空白对照对细胞的促增殖作用。过程如下:
用含10%胎牛血清的DMEM(购自Gibco公司)培养液将Balb-3T3细胞(购自美国ATCC,编号为ATCC20864)稀释成2×104个细胞/ml。
在96孔培养板中每孔分别接种200ul上述稀释好的细胞悬浮液,于37℃、5%CO2培养24小时。然后,吸去孔中的培养液,分别加入200ul用0.5%胎牛血清的DMEM培养液稀释成不同浓度的本发明制备的LR3IGF-1,购自SIGMA公司的LongR3IGF-1和空白对照(空白对照为不含任何添加的0.5%胎牛血清的DMEM培养液),于37℃、5%CO2培养24小时。培养结束后向每孔中加入20ul5mg/ml的MTT液,于37℃、5%CO2培养4小时。培养结束后吸去孔中的培养液,加入150ul DMSO,37℃放置1小时,DMSO购自SIGMA公司。酶联免疫检测仪检测490nm处的吸光度,估算活细胞数量(活细胞数和吸光度成正比)。
结果如下表所示。相比较空白对照,本发明制备的LR3IGF-1,购自SIGMA公司的LongR3IGF-1都有明显地促进细胞增殖的能力。而且本发明制备的LR3IGF-1的活性更优于购自SIGMA公司的市售的LR3IGF-1产品(LongR3IGF-1),可能原因是与市售产品相比,本发明制备方法制备出的产物有着更高的纯度,活性成分占比更高。
对比例1
融合蛋白C1
重复实施例3、4和5,不同点在于,用市售的pET32b替换pET32-T,从而构建得到表达载体,并表达得到第二连接肽为SEQ ID NO.:7的融合蛋白,该融合蛋白记为C1,该融合蛋白C1中的各元件除了第二连接肽之外,与SEQ ID NO.:1完全相同。
对该融合蛋白C1同样进行肠激酶酶切。然而,在肠激酶酶切融合蛋白的酶切过程中,始终存在一定量的非特异性酶切,导致存在与目标产物(如LR3IGF-1)分子量极为接近(仅比目标蛋白大2k分子量左右)的杂质蛋白质(含量为5%左右,SDS-PAGE分析结果见图3)。这导致后续的纯化几乎难以去除该杂质蛋白质。
对比例2
融合蛋白C2
在实施例2的基础上,用PCR方法把经过优化的LR3IGF-1的DNA序列通过BamH I和NotI位点克隆到表达载体pGEX-6p-1(购自GE healthcare)中,经DNA测序分析正确后命名为pGEX-LR3IGF-1;pGEX-LR3IGF-1和pET32-T-LR3IGF1(全优化)平行转化到宿主菌BL21(DE3)中,按实施例4中的步骤做诱导表达分析。
结果如图4所示,pGEX-LR3IGF-1和pET32-T-LR3IGF1(全优化)都有明显表达,其中pGEX-LR3IGF-1的表达量约占总蛋白的10%左右,而pET32-T-LR3IGF1(全优化)的表达量高达总蛋白的35%以上,远远高于pGEX-LR3IGF-1的表达水平。
这表明,与GST形成的融合蛋白相比,LR3IGF-1与TRX形成的融合蛋白更适合在大肠杆菌中表达。
对比例3
融合蛋白C3
实施例3中得到的表达载体pET32-T-LR3IGF1和pET32-T-LR3IGF1(天然)同时转化到大肠杆菌宿主BL21(DE3)中,按实施例4中相同的步骤得到单克隆转化子,单克隆转化子通过培养和IPTG诱导表达,最终表达情况通过SDS-PAGE电泳分析。
LR3IGF-1编码序列为原始序列情况下的融合蛋白的表达约占菌体总蛋白的15%左右,结果如图5所示;LR3IGF-1编码序列为优化后编码序列情况下的融合蛋白的表达约占菌体总蛋白的35%左右,结果如图6所示。这表明,与优化后编码序列的表达情况相比,采用未经优化的编码序列时,在大肠杆菌中的表达量难以令人满意。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白从N端到C端具有式I所示结构:
A-B-C-D-E-F 式I
式中,
A为硫氧还蛋白(Thioredoxin)元件(TRX);
B为任选的第一连接肽元件;
C为纯化标签元件;
D为第二连接肽元件;
E为肠激酶识别位点元件(EK),并且所述的肠激酶识别位点元件为DDDDK;
F为胰岛素样生长因子衍生物LR3IGF-1元件;
“-”表示连接上述元件的肽键;
且所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,其中:
第1-109位为Thioredoxin的氨基酸序列;
第110-116位为第一连接肽的氨基酸序列;
第117-122位为纯化标签HHHHHH的氨基酸序列;
第123-127位为第二连接肽的氨基酸序列;
第128-132为肠激酶识别位点DDDDK的氨基酸序列;
第133-215为LR3IGF1的氨基酸序列。
2.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:1或6所示。
4.一种载体,其特征在于,它含有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种产生蛋白的方法,其特征在于,它包括步骤:
在适合表达的条件下,培养权利要求5所述的宿主细胞,从而表达出权利要求1所述的融合蛋白。
7.一种制备蛋白的方法,其特征在于,包括步骤:
(i)用肠激酶对权利要求1所述的融合蛋白酶切,从而获得酶切产物,该酶切产物包括对应于F元件的胰岛素样生长因子衍生物LR3IGF-1;和
(ii)从酶切产物中分离或纯化出所述的胰岛素样生长因子衍生物LR3IGF-1。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(i)中进行酶切反应的条件包括:20IUEK/mg融合蛋白。
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High-level soluble expression of hIGF-1 fusion protein in recombinant Escherichia coli;Zhang Danping et al;《Process Biochemistry》;20101231;1401-1405 |
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