CN101736029A - 一种利用植物油体蛋白表达系统生产人胰岛素样生长因子-i的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属基因工程技术领域，提供了一种利用植物油体表达系统表达和纯化人胰岛素样生长因子-I(human insulin-like growth factor I，hIGF-I)的方法。本发明方法按照植物密码子的偏爱性设计合成了人胰岛素样生长因子-I基因，将所述人胰岛素样生长因子-I基因与油体蛋白基因融合，构建成用种子特异性表达启动子驱动的植物表达载体，将该载体转化受体植物，在转化植株种子中高效表达具有生物学活性的人胰岛素样生长因子-I。本方法得到的胰岛素样生长因子-I可应用于儿童IGF-I不足和生长激素(GH)基因缺失的治疗以及其他临床和实验室的研究。

Description

一种利用植物油体蛋白表达系统生产人胰岛素样生长因子-I的方法

技术领域

本发明属基因工程技术领域，涉及一种转基因植物中表达外源蛋白的方法。具体地，本发明涉及一种利用植物油体表达系统在植物种子中高效表达人胰岛素样生长因子-I的方法。

背景技术

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)，又称类胰岛素生长因子，是一种多功能细胞增殖调控因子。1978年Humbel等首次纯化到两种形式的IGF，IGF-I和IGF-II，因其化学结构与胰岛素原(proinsulin)类似而得名。其中IGF-I对细胞正常生长、胚胎发育、神经生长、肿瘤免疫、能量代谢等方面起着十分重要而广泛的作用，IGF-I生物学作用广泛，其生物学效应主要有促有丝分裂作用(如促进细胞分化，刺激RNA、DNA的合成和细胞增殖)和类胰岛素原作用(如抑制肝糖释放，增加葡萄糖摄取和转化，抑制脂肪分解，减少游离脂肪酸和氨基酸的血液浓度，促进脂质和糖元以及蛋白质的合成)。IGF在临床治疗上的应用价值正在被广泛的认识和研究，目前临床研究表明IGF在侏儒症、骨质疏松、抗胰岛素糖尿病、出血性溃疡症及烧伤和末梢神经损伤等许多疾病治疗中都具有重要的应用价值。用大肠杆菌生产的重组人IGF-I已经被批准应用于儿童IGF-I不足和生长激素(GH)基因缺失的治疗。

随着对IGF-I、IGF-I受体和IGF-I结合蛋白(IGFBP)研究的深入，IGF-I在临床疾病治疗方面的潜在应用价值将被进一步开发，社会对IGF-I的需求也越来越大。但天然IGF-I的纯化存在很多困难，因此利用基因工程的方法获得IGF-I有着广阔的研究及生产前景。随着基因工程技术的发展，人们已经尝试在多个表达系统中生产IGF-I，这些系统包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等。这些方法都存在一定的局限性，如大肠杆菌中表达的IGF-I难以形成正确的二硫键，往往以包涵体的形式进行表达，需要经过繁琐的复性和纯化过程才能得到有活性的产品。而用哺乳动物细胞生产则因为需要昂贵的设备和培养基而导致过高的生产成本。

植物转基因技术的出现给重组蛋白表达系统提供了一个新的选择，从1983年首次获得转基因植物至今，植物基因工程的研究和应用取得了飞速发展。近年来，人们发现利用植物作为重组蛋白的表达宿主具有很多优势，用植物生产药用蛋白越来越受到了人们的重视，成为国际上植物基因工程发展的一个新趋势。目前已经有多个重要药用蛋白在植物中表达成功，如水蛭素、胰岛素、干扰素、人血清白蛋白、人表皮生长因子等以及多种抗体和疫苗，为利用植物作为生物反应器生产药用蛋白打下了基础。

在众多的利用植物表达外源药用蛋白的策略中，油体蛋白表达系统在外源蛋白的表达和纯化上有巨大的应用潜力，近年来备受关注。油体蛋白是油菜、玉米、拟南芥等植物种子中的一类丰富的存在于储存细胞器油体表面的结构蛋白，含量达到种子总蛋白的2～4％。从结构来看，油体蛋白可以分为三个部分，物种间保守性较高的中间疏水域和N-端、C-端的两亲性结构域，疏水域对油体蛋白正确定位至油体的功能非常重要，而油体蛋白N-端或C-端氨基酸序列的改变不会影响油体蛋白在油体上的定位。1994年人们在油菜中表达油体蛋白和β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase，GUS)的融合蛋白获得成功，融合蛋白正确定位至油体上，且蛋白能在种子中长期储存或提取后放置3-4周仍然能保持活性，证实了油体蛋白作为载体表达外源蛋白的可行性。有关水蛭素(hirudin)、胰岛素(insulin)等均在该系统中表达取得成功。

在重组蛋白表达系统中，重组表达的蛋白通常需要从表达的宿主中提取出来并进行纯化后才能得到应用，特别是对于药用蛋白，蛋白的纯化在整个生产过程中要占到80％以上的成本，因此纯化策略的选取在植物作为生物反应器的过程中是一个非常重要的因素。在植物油体蛋白表达系统中，利用油体亲脂疏水并且密度比水小的性质，可以通过“悬浮-离心”(flotation-centrifugation)的方法方便地将油体与其他多数细胞组分分离开来。经过多次洗涤后，油体蛋白及与其融合的目标蛋白也在油体中得到富集和纯化。总之，与其他植物表达系统相比，油体蛋白表达系统具有重组蛋白表达量高、目标蛋白稳定性好、蛋白提取纯化方便等优势，同时，油体蛋白表达系统的宿主植物主要是油菜、大豆、玉米等农作物，这些作物种植和种子加工技术都在传统的食品工业中得到发展，而且分离目标蛋白种子中的油等其他部分仍然可以利用，在这些作物的种子中表达外源蛋白大大增加了农产品的附加值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物油体表达系统生产人胰岛素样生长因子-I(human insulin-like growth factor I，hIGF-I)的方法，利用这种方法得到的胰岛素样生长因子-I可以应用于儿童IGF-I不足和生长激素(GH)基因缺失的治疗以及其他临床和实验室的研究。

本发明首先按植物密码子的偏爱性设计、通过基于PCR的基因合成方法(PCR-based gene synthesis)人工合成了hIGF-I基因的全序列，该序列如SEQ IDN0.1所示；

进一步，本发明构建了含有油体蛋白基因与上述hIGF-I基因的融合蛋白基因的表达载体，所述的油体蛋白基因为拟南芥18.5kDa油体蛋白基因，两个基因之间设计的编码烟草蚀刻病毒蛋白水解酶(Tobacco etch virus protease，TEVP)的识别序列的核苷酸序列，表达载体所选用的启动子为拟南芥18.5kDa油体蛋白的启动子；

然后，将上述表达载体转入根癌农杆菌中，通过农杆菌介导法转化植株，将带有油体蛋白启动子、油体蛋白-胰岛素样生长因子融合基因及rbsS polyA终止子的表达盒整合到植物基因组中，筛选和培养出带有上述融合基因的转基因植株，进一步育种得到后代不发生分离的纯合植株，该植株所产生的种子中含所述hIGF-I蛋白；并且，该植株的性状能长期稳定遗传到下一代，所述的hIGF-I具有正确的生物学活性。

具体地，本发明包括如下的步骤：

(1)按照植物密码子偏爱性设计和合成hIGF-I基因；

(2)从拟南芥基因组中分离得到拟南芥18.5kDa油体蛋白基因及其启动子；

(3)将hIGF-I基因核苷酸序列连接到油体蛋白基因核苷酸序列的3’端，将整个融合蛋白基因置于油体蛋白启动子下游，以植物表达载体pHB为骨架构建hIGF-I的油体蛋白表达载体；

(4)将步骤(3)所得到的植物表达载体转化至根癌农杆菌菌株GV3101中；

(5)用步骤(4)中所得到的含有hIGF-I的油体蛋白表达载体的农杆菌转化适当的宿主植物(如拟南芥、油菜)；

(6)通过抗性和PCR的方法筛选转基因阳性植株；

(7)筛选hIGF-I表达量高的植株，培育数代直至性状不发生分离；

(8)将步骤(7)所得到的转基因植株种子经过粉碎、悬浮-离心法纯化得到油体蛋白-人胰岛素样生长因子-I的融合蛋白；

(9)用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y检验步骤(8)中所得到的蛋白的活性。

所述人hIGF-I基因是指，人工合成的经过植物偏爱密码子优化的hIGF-I基因序列；

所述油体蛋白启动子是指，为了提高基因的表达效率，本发明采用了拟南芥18.5kDa油体蛋白基因启动子，该启动子驱动的油体蛋白基因是拟南芥种子中表达量最高的油体蛋白基因。本发明所指油体蛋白基因的启动子还包括其他的植物种子特异性启动子，如菜豆球蛋白启动子，油菜油体蛋白启动子等。

所述的通过PCR检测获得转基因阳性植株是指，分别设计合成油体蛋白基因和hIGF-I基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因阳性植株。

所述融合蛋白的纯化是指，通过“悬浮-离心”的方法将油体蛋白-人胰岛素样生长因子-I融合蛋白从种子中分离出来。

所述hIGF-I的生物学活性检验是指，利用hIGF-I能促进SH-SY5Y细胞进行分化的性质，将表达的hIGF-I蛋白添加至SH-SY5Y细胞培养基中，观察发现该细胞发生了分化。

采用本发明的方法生产人胰岛素样生长因子-I具有如下优点：

1、高等植物表达蛋白质的修饰加工机制和哺乳动物类似，植物中表达的外源蛋白，能进行正确的折叠和组装，这对于具有生物学活性的药用蛋白的生产十分重要。

2、利用植物生产外源蛋白可以避免动物病原体的感染及大肠杆菌中内毒素的污染。

3、采用油体蛋白表达系统生产hIGF-I，可以大大简化目的蛋白的分离纯化过程，降低生产成本，同时有利于hIGF-I的产业化。

4、采用拟南芥中含量最高的油体蛋白及其启动子作为表达hIGF-I载体的元件，提高了人胰岛素样生长因子-I的表达量。

5、在油体蛋白和hIGF-I之间设计了烟草蚀刻病毒蛋白水解酶(TEVP)的识别序列，为hIGF-I的纯化进一步降低了成本。

附图说明

图1是基于PCR方法的人胰岛素样生长因子-I基因的合成。

图2是油体蛋白和hIGF-I融合基因载体pBS-SK-AtOle-hIGF构建过程示意图。

图3是植物油体表达载体pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF构建过程示意图。

图4是表达载体pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF中融合基因结构详细示意图。

图5是hIGF-I在拟南芥种子中表达的Western检测图。

图6是表达hIGF-I的拟南芥种子油体蛋白纯化结果

图7是拟南芥种子中表达的hIGF-I活性实验检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人胰岛素样生长因子-I基因的制备及序列测定

根据Genbak中已报道的hIGF-I蛋白序列，在其N-端设计烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEVP)的识别位点，按照植物密码子使用偏爱，设计出经植物密码子优化的hIGF-I基因核苷酸序列。为了构建载体的方便，在其两端分别设计限制性酶切位点Bgl II和Pst I。根据该核苷酸序列，利用软件Primer Premier设计合成了5条引物，每条引物长度40～80bp不等，相邻两条引物之间重叠18～20bp，通过基于PCR合成的方法合成全长hIGF-I基因。

上述引物是：

hIGF-Ia：5′-AGATCTGAAAACCTTTACTTCCAGGGACCTGAGACCCTCTGTGGAGCA-3′

hIGF-Ib：5′-GACCCTCTGTGGAGCAGAACTTGTTGATGCTCTCCAATTCGTGTGTGGAGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACTG-3′

hIGF-Ic：5′-TCCGGTTTGAGGTGCTCTCCTAGATGAAGATCCGTATCCAGTTGGCTTGTTGAAGTAG-3′

hIGF-Id：5′-GAGCGCAGTACATCTCAAGTCTCCTAAGATCGCATGATCTGAAACAGCACTCATCAACGATTCCGGTTTGAGGTGCTC-3′

hIGF-Ie：5′-GGTAACCTGCAGTTAAGCAGACTTAGCTGGCTTAAGAGGAGCGCAGTACATCTCAAG-3′

hIGF-I全长基因的合成使用高保真酶KOD(TaKaRa公司)按照如下体系和程序进行反应：

反应体系：

10×KOD bufffer            5μL

25mM MgSO4                    3μL

2mM dNTPmix(2.5mM)            2μL

Primer hIGF-Ia(10μmol/L)     2μL

Primer hIGF-Ib(1μmol/L)      2μL

Primer hIGF-Ic(1μmol/L)      2μL

Primer hIGF-Id(1μmol/L)      2μL

Primer hIGF-Ie(10μmol/L)     2μL

ddH2O                         29μL

KOD                           1μL

                                       

Total volume                  50μL

反应程序：94℃ for 2min，(94℃ for 15sec，61℃ ramp to 56℃ for 15sec，72℃for 25sec)×10cycles，(89℃ for 15sec，58℃ for 15sec，72℃ for 25sec)×25cycles，72℃ for 8min。

待上述PCR过程反应完成后，加入1μL Taq plus酶于72℃继续反应20min以在PCR产物的3’端添加A碱基用于T vector连接。

反应产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收约250bp的片段(见附图1)，连接到pMD18-T vector中，经过测序序列正确后得到含有经大肠杆菌密码子优化的hIGF-I基因序列的载体，该载体命名为pMD18-T-hIGF。经DNA序列测定表明，本发明设计合成的hIGF-I核苷酸序列与设计一致。

实施例2

人胰岛素样生长因子-I油体表达载体的构建

1.拟南芥18.5kDa油体蛋白基因的克隆

按照已发表的拟南芥18.5kDa油体蛋白基因序列(Genbak登录号：X62353)设计引物AtOleF1(5′-GGATCCATGGCGGATACAGCTAGAG-3′，加下划线为Nco I酶切位点)和AtOleR1(5′-AGATCTTTAAGTAGTGTGCTGGCCA-3′，加下划线为Bgl II酶切位点)，以拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA为模板通过PCR的方法获得拟南芥油体蛋白基因编码区。反应条件：94℃ for 5min，(94℃ for 40sec，59℃for 40sec，72℃ for 1min)×33cycles，72℃ for 8min。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离得到约530bp的片段，回收后连接到pMD18-T vector中，得到载体pMD18-T-AtOle，测序结果表明所得到的片段与报道序列一致。

2.拟南芥18.5kDa油体蛋白基因启动子的克隆

设计引物AtOPF1(5′-GAATTCCCTCGGTCTTGGTCAC-3′，加下划线为EcoR I酶切位点)和AtOPR1(5′-GGATCCTTTTTTGTTCTTGTTTACTA-3′，加下划线为BamH I酶切位点)以同上的方法获得拟南芥油体蛋白基因启动子。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离得到约860bp的片段，回收后连接到pMD18-Tvector中，得到载体pMD18-T-AtOP，经测序表明所得序列正确。

3.人胰岛素样生长因子-I植物油体表达载体的构建

用Nco I和Bgl II双酶切上述含有拟南芥18.5kDa油体蛋白的质粒pMD18-T-AtOle，将得到的约530bp片段连接到同样酶切的中间载体pBS-SK中，得到载体pBS-SK-AtOle；用Bgl II和Pst I双酶切含有hIGF-I基因的质粒pMD18-T-hIGF，将得到的约250bp片段连接到同样酶切的载体pBS-SK-AtOle中，得到载体pBS-SK-AtOle-hIGF(见附图2)。用EcoR I和BamH I分别双酶切带有拟南芥油体蛋白启动子的载体pMD18-T-AtOP和植物表达载体pHB，连接构建成载体pHB-AtOP；用BamH I和Pst I双酶切质粒pBS-SK-AtOle-hIGF，将得到的片段连接到同样酶切的载体pHB-AtOP中，得到hIGF-I基因的植物表达载体pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF(见附图3)。该载体在AtOle的上游插入了一段编码myc标签的序列，用于检测目标蛋白的表达。

实施例3

农杆菌介导的拟南芥转化与筛选

1.农杆菌转化

利用冻融法将上述载体pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF转入根癌农杆菌菌株GV3101中。将5μL质粒加入200μL农杆菌GV3101感受态细胞中混合均匀，冰浴30分钟；置液氮中速冻5分钟后，迅速取出转至37℃水浴锅中温育5分钟。加入800μL无抗生素LB，在低于200rpm的28℃摇床上复苏培养3小时；复苏后取200μL菌液均匀涂布于含利福平25mg/L、庆大霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的LB平板上，28℃倒置培养2天。挑取分离良好的单克隆菌落接种于含利福平25mg/L、庆大霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于28℃摇床培养过夜；

取2μL菌液用于PCR检测，反应条件：94℃ for 3min，(94℃ for 40sec，58℃ for 40sec，72℃ for 1min)×33cycles，72℃ for 8min。反应结束后取10μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.拟南芥转化与筛选

采用浸花(floral-dip)法转化拟南芥。

将上述含有目标基因载体的农杆菌于28℃培养过夜，至OD₆₀₀≈2.0，4500rpm离心10分钟收集菌体；菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中(MS 4.41g/L，蔗糖50g/L，6-BA 10μg/L，SILWET-77400μL/L，pH 5.8)，至终浓度为OD₆₀₀≈0.8。取生长一个月左右、生长状况良好的植株，将拟南芥地上部分全部花苞被浸没于上述悬浮好的菌液中约5秒；用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放于一个密封的小盒内以保持湿度，避光过夜；第二天将植物取出，竖直，转移到正常条件下生长，直至种子成熟。

T_o代种子完全成熟后将其收获，种子消毒后均匀播种于含潮霉素50mg/L的MS固体培养基上，于4℃春化2天后移到培养室中，在22℃，16h光/8h暗的条件下生长一周；然后选取抗性幼苗将其移栽至土中继续培养。待植株长大后提取叶片DNA进行PCR检测确认阳性植株，待种子成熟后收获种子进行蛋白表达分析。

实施例4

转基因拟南芥的PCR检测

以上述不同独立转化植株的基因组DNA为模板，分别用拟南芥油体蛋白基因两端引物和人胰岛素样生长因子-I基因两端引物进行PCR检测，反应条件：94℃for 3min，(94℃ for 40sec，59℃ for 40sec，72℃ for 1min)×33cycles，72℃ for 8min。反应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离检测，分别得到与预期大小一致的530bp和250bp的条带。

实施例5

拟南芥种子中油体蛋白的提取

40mg拟南芥种子用250μL油体提取buffer 1(0.4M蔗糖，0.5M NaCl，50mMTris-HCl，pH 8.0)研磨，于10000g离心10min；取出顶层油相，用100μL buffer 2(50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5M NaCl)重悬，10000g离心10min，重复三次；顶层油相用buffer 3(50mM Tris-HCl，pH 8.0)重悬，10000g离心10min后重悬在磷酸buffer 3中，稀释后用于Bradford法测定蛋白浓度。用于蛋白电泳的样品加入1/10体积的50mM Tris-HCl，pH 8.0，2％SDS溶液中，煮沸后离心，取水相加入蛋白样品缓冲液后进行电泳。结果见附图6，第一道为蛋白质分子量标准，第二道为非转基因拟南芥种子油体蛋白，第三道为转基因种子油体蛋白，箭头所示为融合蛋白。

实施例6

拟南芥种子中融合蛋白的Western Blot检测

1.蛋白SDS-PAGE电泳及转膜

种子油体蛋白按照

的方法用10％不连续Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶在Bio-red公司的垂直电泳装置中进行电泳分离，条件为30V电泳1小时后改为80V电泳至溴酚蓝条带跑出凝胶。电泳结束后用Bio-red公司的蛋白电泳转移装置，将蛋白转移至0.45μm PVDF膜上，条件为30mA恒流过夜。

2.膜的杂交

膜的杂交操作按照QIAGEN公司的操作手册The QIAexpressionist进行，一抗使用兔抗人胰岛素样生长因子-I多克隆抗体，二抗使用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG，使用Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase(Promega公司)进行显色。Western blot结果表明，在转基因拟南芥种子油体蛋白中有hIGF-I的表达，产物大小约为34kDa，与融合蛋白预期大小一致。

Western blot分析结果见图5，第1道为阳性对照，第2道为预染蛋白质分子量标准，第3道为非转基因拟南芥种子蛋白，第4～10道为独立转化植株种子蛋白。

实施例7

拟南芥中表达的人胰岛素样生长因子-I的生物学活性检测

将液氮中冻存的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y迅速放入37℃水浴中，轻轻摇匀使细胞快速溶解，转到15mL离心管中，加入预先37℃温热的9mL添加10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基中。800g，室温离心3分钟后吸去上清，加入5mL培养液重悬，转移到25cm²细胞培养瓶中，于37℃，5％CO₂条件下培养。24小时后换液，去除死细胞。待细胞生长至互相接触，将细胞传代，先吸去原有培养液，用PBS洗去残留血清。加入0.5mL胰酶于37℃消化2分钟，轻轻拍打瓶壁使细胞脱落。加入2.5mL培养液中和胰酶，用移液管吹打成单细胞。

800g，室温离心3分钟，弃上清，加入1mL培养液，重悬细胞。取10μL细胞悬液和30μL台酚蓝溶液混匀，转移到血小板计数器上计数。以每培养瓶约5×10⁴个细胞接种平行的4瓶。培养12小时待细胞贴壁后加入蛋白样品，继续培养36小时观察结果。

人胰岛素样生长因子-I对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的促分化结果见附图7，A为不加蛋白样品的培养基作为空白对照；B为50ng/mL hIGF-I作为阳性对照；C为非转基因拟南芥种子油体蛋白样品作为阴性对照；D为含hIGF-I 50ng/mL的转基因拟南芥种子油体蛋白。结果表明拟南芥种子中表达的hIGF-I能够促进SH-SY5Y细胞进行分化，具有生物学活性。

序列表：

<110>复旦大学

<120>一种利用植物油体蛋白表达系统生产人胰岛素样生长因子-I的方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>249

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Designed DNA coding for human insulin-like growth factor I based

     on codon usage in plants

<400>1

agatct gaa aac ctt tac ttc cag gga cct gag acc ctc tgt gga gca     48

       Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala

         1               5                  10

gaa ctt gtt gat gct ctc caa ttc gtg tgt gga gac aga ggt ttc tac    96

Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr

 15                  20                  25                  30

ttc aac aag cca act gga tac gga tct tca tct agg aga gca cct caa   144

Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln

                 35                  40                  45

acc gga atc gtt gat gag tgc tgt ttc aga tca tgc gat ctt agg aga   192

Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg

             50                  55                  60

ctt gag atg tac tgc gct cct ctt aag cca gct aag tct gct taactgc   241

Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala

         65                  70                  75

aggttacc                                                        249

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Designed peptide of Tobacco etch virus protease cleavage site

<400>2

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

  1               5

<210>3

<211>70

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe

  1               5                  10                  15

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly

             20                  25                  30

Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys

         35                  40                  45

Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu

     50                  55                  60

Lys Pro Ala Lys Ser Ala

 65                  70

<210>4

<400>4

000

Claims (11)

1.一种在植物种子中高效表达融合基因的载体，其特征在于，该载体上的表达盒自5′至3′依次包含以下元件：油体蛋白启动子或种子特异表达启动子、外源目标蛋白基因和油体蛋白基因的融合基因、终止子序列rbsS polyA。

2.如权利要求1所述的表达载体，所述外源目标蛋白为人胰岛素样生长因子-I。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述人胰岛素样生长因子-I基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该基因所用的密码子为植物偏爱性密码子，其5′端具有编码烟草蚀刻病毒蛋白水解酶识别位点序列的核苷酸序列，该基因所编码的蛋白质经TEVP酶切后具有与人体内成熟的人胰岛素样生长因子-I蛋白完全一致的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体的启动子为拟南芥油体蛋白启动子。

5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的融合基因的油体蛋白基因为拟南芥18.5kDa油体蛋白基因，该基因5′端添加了一段编码Myc tag序列的核苷酸序列。

6.如权利要求1～5所述的表达载体，其为pHB-myc-AtOP-AtOle-hIGF。

7.权利要求1～6所述的表达载体在制备人胰岛素样生长因子-I中的应用。

8.一种利用植物种子油体生产人胰岛素样生长因子-I的方法，其包括如下步骤：

(1)用权利要求1～5所述的表达载体转化受体植物，筛选得到含有目的基因的转化植株；

(2)筛选获得种子中目的基因表达量高的植株；

(3)通过遗传育种的方法获得纯系；

(4)从上述植株种子中分离纯化得到人胰岛素样生长因子-I；

9.如权利要求8所述的方法，其中受体植物为油菜、拟南芥、红花、向日葵、或棉花。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述(1)中转化受体植物的方法是农杆菌介导法。

11.权利要求8所述的方法得到的转基因植物组织、植株和种子。

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