CN103613670A - Hsa长效融合蛋白及其快速组装及分离纯化方法 - Google Patents

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CN103613670A CN201310594414.7A CN201310594414A CN103613670A CN 103613670 A CN103613670 A CN 103613670A CN 201310594414 A CN201310594414 A CN 201310594414A CN 103613670 A CN103613670 A CN 103613670A
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刘刚
邵妤
陈惠鹏
金晶
王微
曲国龙
阚乃鹏
谭俊杰
朱晨
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Abstract

本发明涉及一种HSA长效融合蛋白及其快速组装及分离纯化方法。该融合蛋白包含两个多肽区，第一区是由促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复序列组成，第二区是由人血清白蛋白HSA的序列组成，第一区的C-末端与第二区的N-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连，或第一区N-末端与第二区C-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连。促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复次数为1-4次，重复序列之间直接通过甘氨酸和丝氨酸相连。本发明利用Bglbrick的方法，能够随意的在HSA的N端或C端添加任意个数的Exendin-4，经过表达，纯化，得到高纯度的融合蛋白。

Description

HSA长效融合蛋白及其快速组装及分离纯化方法
技术领域
本发明涉及一种HSA（人血清白蛋白，Human serum albumin）长效融合蛋白及其快速组装及分离纯化方法，具体为利用Bglbrick方法进行HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化，属于长效融合蛋白药物技术领域。
技术背景
Biobrick/Bglbrick方法是基于连接或聚合思想的不同尺度的DNA体外组装方法，此方法的诞生，加速了合成生物学功能元件库、生物合成途径乃至酵母染色体的人工构建，促进了代谢工程，基因组编辑、诱导性多功能肝细胞等领域的迅速发展。
Biobrick/Bglbrick方法是依赖于同尾酶的方法，同尾酶（如BglⅡ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ）是指一类识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能产生相同粘性末端的限制性内切酶。当酶切后的两个片段相连时，原来的酶切位点将不复存在，也就不能被原有的限制酶所识别，达到“焊死”状态。因此，该种方法仅利用一种同尾酶，就可以实现DNA片段的多次组装。虽然Biobrick/Bglbrick两种方法在连接处均会产生疤痕，但后者疤痕处翻译后为甘氨酸与丝氨酸，对于融合蛋白表达无影响，所以Bglbrick是推荐使用的方法。
Exendin-4:促胰岛素分泌肽又称艾塞那肽，从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一个激素物质，由39个氨基酸组成，GLP-1相似性高达53%，并且生物学效应也几乎完全一致。其能够增加胞内cAMP浓度，刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌，即在血糖浓度高时刺激胰岛素分泌，低浓度和正常浓度时不刺激胰岛素分泌，抑制β-细胞凋亡，刺激β-细胞的增殖与新生，还具有降低饥饿及餐后血糖浓度和胰高血糖素浓度；减缓胃排空、抑制食物吸收，节葡萄糖在外周组织的转运等生物学效应。Exendin-4在刺激胰岛素分泌的作用时依赖于血糖浓度，不会因为持续分泌而发生低血糖反应；能够降低食欲；对神经细胞具有保护作用；对二肽酰基肽酶-IV的高耐受性使其在体内的半衰期为2-3h，远长于GLP-1的1-2min，稳定性和生物活性明显高于GLP-1，有更好的治疗效果等优点。Exendin-4虽然具有比GLP-1长的半衰期，但半衰期仍较短。天然产物含量较少，而化学合成的Exendin-4存在成本较高，价格昂贵，步骤多，收率低，合成过程涉及有害化学物质等缺点。蛋白药物在体内存留时间的长短，极大的影响到药物的使用剂量和治疗效果，近几年国内外学者主要从化学修饰、基因融合等方面延长蛋白药物的半衰期，化学修饰中最广泛应用的修饰剂是PEG，可以使半衰期延长几倍几十倍甚至上百倍，但大部分蛋白的免疫原性会有所降低，蛋白的生物活性也会不同程度的下降。
人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是血浆中的主要蛋白成分，也是许多内源因子和外源药物的载体，对维持体内渗透压和血浆体积起着非常重要的作用；正常情况下肾清除率较低。人血清白蛋白的分子量为66kD，是非糖基化蛋白，在体内的半衰期长达两周左右，因而是一种理想的生物活性蛋白载体。因此本发明提供了一种快速制备HSA长效融合蛋白及其分离纯化的方法以延长药物的半衰期，使这些药物的治疗效果等得到明显的改善。
发明内容
本发明的目的是提供一种HSA长效融合蛋白及其快速制备和分离纯化的方法。
本发明的技术方案：
一种HSA长效融合蛋白，包含两个多肽区，第一区是由促胰岛素分泌肽Exendin-4（见序列表中序列1）的重复序列组成，第二区是由人血清白蛋白HSA（见序列表中序列2）的序列组成，第一区的C-末端与第二区的N-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连，或第一区N-末端与第二区C-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连；第一区的促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复次数为1-4次，Exendin-4的重复序列之间直接通过甘氨酸和丝氨酸相连。
一种HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，为利用Bglbrick方法进行HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化，包括HSA cDNA的PCR扩增及重组质粒的构建；含有Exendin-4重组质粒的构建；HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装；HSA长效融合蛋白的酵母表达系统构建；HSA长效融合蛋白的表达及融合蛋白的分离纯化。
上述方法包括如下步骤：
（1）通过PCR从含有HSA cDNA的质粒中扩增获得HSA cDNA，同时在HSAcDNA片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，并将HSA cDNA片段连接在（克隆到）pPICZαA表达载体上；
（2）通过人工合成Exendin-4片段，同时在片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，并将片段连接在（克隆到）pPICZαA表达载体上；
（3）通过XhoⅠBamHⅠ和XhoⅠBglⅡ或XhoⅠBglⅡ和XhoⅠBamHⅠ两种组合对得到的两种载体质粒切割及片段的连接，进行HSA长效融合蛋白表达载体的快速组装；即将得到的两种质粒分别通过XhoⅠBglⅡ和XhoⅠBamHⅠ双酶切，回收的片段连接构建出HSA长效融合蛋白表达载体；同样的方法构建其他的HSA融合蛋白表达载体；
（4）HSA长效融合蛋白表达载体在宿主表达系统中进行表达，HSA长效融合蛋白表达载体被整合到宿主的染色体中；用同样的方法将其他的HSA融合体整合到宿主的染色体中；
（5）HSA长效融合蛋白的发酵液直接通过亲和层析纯化，制备到高纯度融合蛋白。
步骤（4）中，所述的宿主表达系统可以为细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞表达系统，宿主表达系统可优选酵母，酵母可进一步优选毕赤酵母，如毕赤酵母KM71H。
步骤（5）中，所述的亲和层析纯化时，所采用的亲和层析柱填料为HiTrap BlueHP，能够有效的结合HSA。
本发明上述方法的具体操作步骤包括：
（1）HSA cDNA的PCR扩增及重组质粒的构建：
利用PCR从含有HSA cDNA质粒中扩增出HSA cDNA（见序列表中序列3），同时在HSA cDNA片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，所用的引物为：
HSA-F：5’-CTCGAGAAAAGAAGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’
HSA-R：
5’-GCGGCCGCTTAGGATCCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’
50μl的反应体系中加入：25μl的2×Q5mix高保真聚合酶，100μmol/L的引物HSA-F和HSA-R各1μl，含有HSA cDNA的质粒0.3μg，加水补齐至50μl；PCR反应条件为：98℃充分变性30秒，98℃变性10秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；72℃延伸2分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用DNA胶回收试剂盒纯化出1784bp的目标条带；纯化好的目标片段，目标片段进行T-A克隆到pMD18-T中，在15μl的反应体系中加入1μl的pMD18-T载体，6.5μl的DNA片段，7.5μl SolutionⅠ在16℃下进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取菌落，接种于5ml100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对阳性克隆的单菌落进行DNA测序；测序正确的阳性克隆用通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA胶回收试剂盒回收，纯化好的目标片段和载体pPICZαA按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻存于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-HSA（目标基因的核苷酸序列见序列表中序列4），阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-HSA；
（2）含有Exendin-4重组质粒的构建：
通过人工合成Exendin-4的核苷酸序列片段（人工合成Exendin-4的核苷酸序列，见序列表中序列5），同时在片段N端和C端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，将合成好的片段和载体pPICZαA按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻存于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-E4（目标基因的核苷酸序列，见序列表中序列5），阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-E4；
（3）HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装：
分别接种阳性重组子TOP10-pPICZαA-HSA及TOP10-pPICZαA-E4于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；分别通过XhoⅠBglⅡ和XhoⅠBamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA胶回收试剂盒回收大片段和小片段，纯化好的大小片段按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-E4-HSA（阳性重组子中目标基因的核苷酸序列，见序列表中序列6），阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-E4-HSA；pPICZαA-HSA和pPICZαA-E4分别通过XhoⅠBamHⅠ和XhoⅠBglⅡ双酶切，回收小片段和大片段，用同上的方法构建出质粒，重组质粒命名为pPICZαA-HSA-E4（阳性重组子中目标基因的核苷酸序列，见序列表中序列7）；阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-HSA-E4；用同样的方法能够完成不同HSA长效融合蛋白质粒的快速组装；
（4）HSA长效融合蛋白的酵母表达系统构建：
取一支冻存的TOP10-pPICZαA-E4-HSA或TOP10-pPICZαA-HSA-E4，接种到5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，质粒经SacⅠ酶切后，电击转化毕赤酵母KM71H，通过酵母菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71H-pPICZαA-E4-HSA（目标蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列8）或KM71H-pPICZαA-HSA-E4（目标蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列9），用以上相同的构建方法得到其他HSA长效融合蛋白的酵母表达系统；
（5）HSA长效融合蛋白的表达：
将KM71H-pPICZαA-E4-HSA或KM71H-pPICZαA-HSA-E4接种至装有50mlBMGY250ml三角瓶中，200rpm30℃培养18h，将培养物1500×g离心5min收获菌体，重悬菌体于100mlBMMY500ml三角瓶中，使其起始OD600≈1.0，每12小时补加一次甲醇至终浓度0.5%，诱导5天，离心收集上清，SDS-PAGE法观察融合蛋白E4-HSA或HSA-E4的表达；其他HSA长效融合蛋白的酵母表达方法同上；
（6）融合蛋白的分离纯化：
将诱导完成的发酵液离心收获上清，稀释后直接通过HiTrap Blue HP柱，获得高纯度融合蛋白E4-HAS（蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列8）或HSA-E4（蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列9）。
用上述方法制备的HSA长效融合蛋白，包括由促胰岛素分泌肽Exendin-4的一个或多个重复序列构成的第一区和与由人血清白蛋白序列构成的第二区；促胰岛素分泌肽的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间由甘氨酸和丝氨酸连接；或与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，与促胰岛素分泌肽的第一区位于融合蛋白的C末端，中间由甘氨酸和丝氨酸连接。
本发明用BglBrick方法进行HSA长效融合蛋白快速组装以及从表达重组融合蛋白的毕赤酵母发酵液中进行分离纯化，本发明分别构建HSA和Exendin-4的表达载体，利用BglBrick的方法，能够随意的在HSA的N端或C端添加任意个数的Exendin-4，得到的融合表达载体在宿主系统中进行表达，被整合到宿主的染色体中；将整合有融合蛋白基因的毕赤酵母工程菌高密度发酵表达，随后将含融合蛋白的发酵液通过亲和层析进行纯化，制备得到高纯度的融合蛋白。
本发明方法能够快速的构建不同种类的HSA长效融合蛋白，而且制备所得的融合蛋白纯度较高，同时本发明操作简单、方便、省时。
附图说明
图1-1为本发明HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法示意图；图1-2为pPICZαA-E4-HSA构建示意图。
图2为HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装结果，其中HSA两端分别连接不同个数E4，1-4：pPICZαA/(E4)1-4–HSA；5-8：pPICZαA/HSA-(E4)1-4；9-10：pPICZαA/(E4)1-2–HSA-(E4)1-2。
图3为HSA长效融合蛋白的表达结果，其中，1：pPICZαA/HSA-E4；2：pPICZαA/HSA-(E4)2；3：pPICZαA/HSA-(E4)3；4：pPICZαA/HSA-(E4)4；5：pPICZαA/E4–HSA；6：pPICZαA/(E4)2–HSA；7：pPICZαA/(E4)3–HSA；8：pPICZαA/(E4)4–HSA；9：pPICZαA/E4–HSA-E4；10：pPICZαA/(E4)2–HSA-(E4)2。
图4为HSA长效融合蛋白的纯化结果，其中，1：pPICZαA/HSA-E4；2：pPICZαA/HSA-(E4)2。
具体实施方式
如图1-1和图1-2所示，为本发明HAS长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法和pPICZαA-E4-HSA构建示意图。本发明利用BglBrick方法进行HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化，通过PCR从含有HSA cDNA的质粒中扩增获得HSAcDNA，同时在HSA cDNA片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点；通过人工合成Exendin-4片段，同时在片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点；分别将两个片段连接在pPICZαA表达载体上，通过XhoⅠBamHⅠ和XhoⅠBglⅡ两种组合对载体质粒切割及片段的连接，可以进行HSA长效融合蛋白表达载体的快速组装；HSA长效融合蛋白表达载体在宿主系统中进行表达，HSA长效融合蛋白表达载体被整合到宿主的染色体中；HSA长效融合蛋白的发酵液直接通过亲和层析纯化，制备得到高纯度融合蛋白。
一、HSA cDNA的PCR扩增及重组质粒的构建
利用PCR从含有HSA cDNA质粒中扩增出HSA cDNA（见序列表中序列3），同时在HSA cDNA片段N端和C端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，所用的引物为：
HSA-F:5’-CTCGAGAAAAGAAGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’
HSA-R:5’-GCGGCCGCTTAGGATCCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’
50μl的反应体系中加入：25μl的2×Q5mix高保真聚合酶，100μmol/L的引物HSA-F和HSA-R各1μl，含有HSA cDNA的质粒0.3μg，加水补齐至50μl（2×Q5mix高保真聚合酶购自NEB公司）；在MyCyclerTM Thermal Cycler PCR反应仪上，PCR条件为：98℃充分变性30秒，98℃变性10秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；72℃延伸2分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用DNA胶回收试剂盒回收出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段，末端加多A碱基后和载体pMD18-T在15μl的反应体系中加入：1μl的pMD18-T载体，6.5μl的DNA片段，7.5μl SolutionⅠ在16℃下进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取菌落，接种于5ml100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对阳性克隆的单菌落进行DNA测序；测序正确的阳性克隆用通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA胶回收试剂盒回收，纯化好的目标片段备用；载体pPICZαA通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用DNA胶回收试剂盒回收出3.6kb的目标条带，纯化好的目标片段备用；HSA的cDNA片段和pPICZαA载体片段按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-HSA（见序列表中序列4），阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-HSA。
二、含有Exendin-4重组质粒的构建
通过人工合成Exendin-4片段（见序列表中序列5），同时在片段N端和C端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，合成好的片段备用；载体pPICZαA通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用DNA胶回收试剂盒回收出3.6kb的目标条带，纯化好的目标片段备用；Exendin-4片段和载体pPICZαA片段按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-E4（目标基因的核苷酸序列，见序列表中序列5），阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-E4。
三、E4-HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装
分别接种阳性重组子TOP10-pPICZαA-HSA及TOP10-pPICZαA-E4于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；分别通过XhoⅠBglⅡ和XhoⅠBamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA胶回收试剂盒回收5.4kb大片段和149bp小片段，纯化好的大小片段按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/mlZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/mlZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-E4-HSA（见序列表中序列6），阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-E4-HSA。其快速组装结果，如图2中的1所示。
pPICZαA-HSA和pPICZαA-E4分别通过XhoⅠBamHⅠ和XhoⅠBglⅡ双酶切，回收小片段和大片段，用同上的方法构建出质粒，重组质粒命名为pPICZαA-HSA-E4（阳性重组子中目标基因的核苷酸序列，见序列表中序列7）；阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-HSA-E4；其快速组装结果，如图2中的5所示。用同样的方法能够完成不同HSA长效融合蛋白质粒的快速组装。
四、HSA长效融合蛋白的酵母表达系统构建
取一支冻存的TOP10-pPICZαA-E4-HSA或TOP10-pPICZαA-HSA-E4，接种到5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基的试管中37℃培养过夜，用常规方法提取质粒，质粒经SacⅠ酶切后，电击转化毕赤酵母KM71H，转化物涂布于含有100μg/mlZeocinTM的YPDS平板，于30℃，培养2-3天；挑取YPDS平板上长出的菌落，通过酵母菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子，阳性重组子命名为KM71H-pPICZαA-E4-HSA（目标蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列8）或KM71H-pPICZαA-HSA-E4（目标蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列9）。
五、HSA长效融合蛋白的表达
将KM71H-pPICZαA-E4-HSA或KM71H-pPICZαA-HSA-E4接种至装有50mlBMGY（1%的酵母浸出物、2%蛋白胨、50mM磷酸钾，pH6.0、1.34%无氨基酸的酵母氮基、4×10-5%生物素、1%的甘油）250ml三角瓶中，200rpm30℃培养18h，将培养物1500×g离心5min收获菌体，重悬菌体于100mlBMMY（1%的酵母浸出物、2%蛋白胨、100mM磷酸钾，pH6.0、1.34%无氨基酸的酵母氮基、4×10-5%生物素、0.5%甲醇）500ml三角瓶中，使其起始OD600≈1.0，每12小时补加一次甲醇至终浓度0.5%，诱导5天，离心收集上清，SDS-PAGE法观察融合蛋白E4-HSA或HSA-E4的表达，如图3中的5或1所示。
六、融合蛋白的分离纯化
将诱导完成的融合蛋白E4-HSA发酵液9500rpm离心收获上清，20mM PB缓冲液稀释5倍后直接通过HiTrap Blue HP柱，用20mM PB1.5M NaCl洗脱，能够获得高纯度融合蛋白E4-HAS（蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列8）或HSA-E4（蛋白的氨基酸序列，见序列表中序列9）。
采用本发明的方法能够快速的构建不同种类的HSA长效融合蛋白，其含有第一区由1-4个与促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复序列组成，第二区是由人血清白蛋白HSA的序列组成，第一区的C-末端与第二区的N-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连，或第一区N-末端与第二区C-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连；第一区的促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复序列直接通过甘氨酸和丝氨酸相连。
如图2所示为HSA两端分别连接不同个数E4的HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装结果，其中1-4：pPICZαA/(E4)1-4–HSA；5-8：pPICZαA/HSA-(E4)1-4；9-10：pPICZαA/(E4)1-2–HSA-(E4)1-2。表明采用Bglbrick方法能够完成不同种类HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装。
如图3所示，为HSA长效融合蛋白的表达结果，其中，1：pPICZαA/HSA-E4；2：pPICZαA/HSA-(E4)2；3：pPICZαA/HSA-(E4)3；4：pPICZαA/HSA-(E4)4；5：pPICZαA/E4–HSA；6：pPICZαA/(E4)2–HSA；7：pPICZαA/(E4)3–HSA；8：pPICZαA/(E4)4–HSA；9：pPICZαA/E4–HSA-E4；10：pPICZαA/(E4)2–HSA-(E4)2。表明采用Bglbrick方法快速构建的不同种类HSA长效融合蛋白表达质粒均能够在毕赤酵母KM71H中表达出相应融合蛋白。
如图4所示，为HSA长效融合蛋白的纯化结果，其中，1：pPICZαA/HSA-E4；2：pPICZαA/HSA-(E4)2。表明采用HiTrap Blue HP柱能够快速的分离出高纯度的融合蛋白。
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Claims (9)

1.一种HSA长效融合蛋白，其特征在于：包含两个多肽区，第一区是由促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复序列组成，第二区是由人血清白蛋白HSA的序列组成，第一区的C-末端与第二区的N-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连，或第一区N-末端与第二区C-末端通过甘氨酸和丝氨酸两个氨基酸相连。
2.根据权利要求1所述的HSA长效融合蛋白，其特征在于：所述的促胰岛素分泌肽Exendin-4的重复次数为1-4次，重复序列之间直接通过甘氨酸和丝氨酸相连。
3.一种HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，包括如下步骤：
（1）通过PCR从含有HSA cDNA的质粒中扩增获得HSA cDNA，同时在HSAcDNA片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，并将HSA cDNA片段连接在pPICZαA表达载体上；
（2）通过人工合成Exendin-4片段，同时在片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，并将片段连接在pPICZαA表达载体上；
（3）通过XhoⅠBamHⅠ和XhoⅠBglⅡ或XhoⅠBglⅡ和XhoⅠBamHⅠ两种组合对得到的两种载体质粒切割及片段的连接，进行HSA长效融合蛋白表达载体的快速组装；
（4）HSA长效融合蛋白表达载体在宿主表达系统中进行表达，HSA长效融合蛋白表达载体被整合到宿主的染色体中；
（5）HSA长效融合蛋白的发酵液直接通过亲和层析纯化，制备到高纯度融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，其特征在于：所述的宿主表达系统为细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞或植物细胞表达系统。
5.根据权利要求4所述的HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，其特征在于：所述的宿主表达系统为酵母。
6.根据权利要求5所述的HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，其特征在于：所述的酵母为毕赤酵母。
7.根据权利要求6所述的HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，其特征在于：所述的酵母为毕赤酵母KM71H。
8.根据权利要求3所述的HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，其特征在于：所述的亲和层析纯化所采用的亲和层析柱填料为HiTrap Blue HP。
9.根据权利要求3所述的HSA长效融合蛋白的快速组装及分离纯化方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）HSA cDNA的PCR扩增及重组质粒的构建：
利用PCR从含有HSA cDNA质粒中扩增出HSA cDNA，同时在HSA cDNA片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，所用的引物为：HSA-F：5’-CTCGAGAAAAGAAGATCTGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’
HSA-R：
5’-GCGGCCGCTTAGGATCCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’
50μl的反应体系中加入：25μl的2×Q5mix高保真聚合酶，100μmol/L的引物HSA-F和HSA-R各1μl，含有HSA cDNA的质粒0.3μg，加水补齐至50μl；PCR反应条件为：98℃充分变性30秒，98℃变性10秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；72℃延伸2分钟；
通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用DNA胶回收试剂盒纯化出1784bp的目标条带；纯化好的目标片段，目标片段进行T-A克隆到pMD18-T中，在15μl的反应体系中加入1μl的pMD18-T载体，6.5μl的DNA片段，7.5μl SolutionⅠ在16℃下进行连接反应；连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取菌落，接种于5ml100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对阳性克隆的单菌落进行DNA测序；测序正确的阳性克隆用通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA胶回收试剂盒回收，纯化好的目标片段和载体pPICZαA按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻存于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-HSA，阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-HSA；
（2）含有Exendin-4重组质粒的构建：
通过人工合成Exendin-4的核苷酸序列片段，同时在片段N末端和C末端分别添加XhoⅠBglⅡ和BamHⅠNotⅠ酶切位点，将合成好的片段和载体pPICZαA按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻存于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-E4，阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-E4；
（3）HSA长效融合蛋白表达质粒的快速组装：
分别接种阳性重组子TOP10-pPICZαA-HSA及TOP10-pPICZαA-E4于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；分别通过XhoⅠBglⅡ和XhoⅠBamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA胶回收试剂盒回收大片段和小片段，纯化好的大小片段按照1：7的摩尔比用T4连接酶连接，连接好的产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化物涂布于含有25μg/ml ZeocinTM的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取单菌落，接种于5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒；通过XhoⅠ和NotⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存于含有30%甘油的LB中，冻于-20℃；重组质粒命名为pPICZαA-E4-HSA，阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-E4-HSA；
pPICZαA-HSA和pPICZαA-E4分别通过XhoⅠBamHⅠ和XhoⅠBglⅡ双酶切，回收小片段和大片段，用同上的方法构建出质粒，重组质粒命名为pPICZαA-HSA-E4；阳性重组子命名为TOP10-pPICZαA-HSA-E4；
（4）HSA长效融合蛋白的酵母表达系统构建：
取一支冻存的TOP10-pPICZαA-E4-HSA或TOP10-pPICZαA-HSA-E4，接种到5ml含有25μg/ml ZeocinTM的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，质粒经SacⅠ酶切后，电击转化毕赤酵母KM71H，通过酵母菌液PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71H-pPICZαA-E4-HSA或KM71H-pPICZαA-HSA-E4；
（5）HSA长效融合蛋白的表达：
将KM71H-pPICZαA-E4-HSA或KM71H-pPICZαA-HSA-E4接种至装有50mlBMGY250ml三角瓶中，200rpm30℃培养18h，将培养物1500×g离心5min收获菌体，重悬菌体于100mlBMMY500ml三角瓶中，使其起始OD600≈1.0，每12小时补加一次甲醇至终浓度0.5%，诱导5天，离心收集上清，SDS-PAGE法观察融合蛋白E4-HSA或HSA-E4的表达；
（6）融合蛋白的分离纯化：
将诱导完成的发酵液离心收获上清，稀释后直接通过HiTrap Blue HP柱，获得高纯度融合蛋白E4-HSA或HSA-E4。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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