RU2077586C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2077586C1 RU2077586C1 SU5065134/13A SU5065134A RU2077586C1 RU 2077586 C1 RU2077586 C1 RU 2077586C1 SU 5065134/13 A SU5065134/13 A SU 5065134/13A SU 5065134 A SU5065134 A SU 5065134A RU 2077586 C1 RU2077586 C1 RU 2077586C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pthy
- plasmid
- hybrid protein
- thymosin
- eco
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология. Сущность изобретения: предложена рекомбинантная плазмида pThy 315, предназначенная для получения в бактериальных клетках гибридного белка "α фактор некроза опухоли-тимозин a1", имеющая мол. массу 2,IМДа и содержащая фрагмент плазмиды pThy 314 размером 3,23 m.n.н. с тандемом ранних промоторов А2 и А3 бактериофага TZ, участком связывания рибосом, геном названного гибридного белка и терминатором транскрипции фага S, ген β-лактамазы в качестве генетического маркера и уникальные сайты рестрикции в следующих положениях (т.п.н.): Eco RI - 0 и 0,11; Bgl III - 0,78; Cla I - 0,27 и 0,73; Eco 47111 - 0,66; Eco 911 - 0,65; KpnI - 0,25; pst - 2,48 и XbaI - 0,83 и 0,93. 2 ил.
Description
Предполагаемое изобретение относится к биотехнологии и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ген, кодирующий синтез гибридного белка, α-фактор некроза опухолей-тимозин-a1 (ФНО-Т).
Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pThy 314 авторов В.Г.Коробко, Е. Ф. Болдыревой, С. А.Филиппова, В.Н.Добрынина, О.А.Амосовой (Институт биоорганической химии им. М. М.Шемякина АН СССР, а.с. N1707078, кл.C12N 15/12, 1992). Указанная плазмида кодирует синтез гибридного белка ФНО-Т, а также белки устойчивости к антибиотикам лактамазу и хлорамфениколацетилтрансферазу. Гибридный белок ФНО-Т получают культивированием штамма E.coli SG 20050 (pThy 314) (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов, ВНИИ генетика) и используют для выщепления пептида, аналогичного тимозину α1, бромциановым гидролизом. Недостатками использования плазмиды pThy 314 и штамма SG 20050 (pThy 314) являются: наличие в цитоплазме клеток наряду с гибридным белком ФНО-Т в равном количестве белка лорамфениколацетилтрансферазы (фиг. 2), что существенно затрудняет процесс очистки гибридного белка.
Задачей изобретения является: получение рекомбинантной плазмидной ДНК pThy 315, кодирующей синтез гибридного белка ФНО-Т, являющегося мажорным белком. Указанная задача решается за счет делеции участка между Hind III и xba I-сайтами плазмиды pThy 314. При этом удаляется вся последовательность гена хлораммфениколацетилтрансферазы, а терминатор транскрипции, находящийся между xba I сайтами, приближается к концу гена гибридного белка. Указанные изменения приводят к получению плазмиды pThy 315, имеющей молекулярную массу 2,1 МДа (3,23 т.п.н.), кодирующей гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-a1 с молекулярной массой 20,46 КДа и состоящей из:
фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy 314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и А3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-a1, терминатор транскрипции фага;
генетического маркера селекции, гена β-лактамазы, придающего устойчивость к антибиотику ампициллину клетками Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy 315;
уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенных на расстоянии в т. п.н. EcoRI 0 и 0,11, BgIII 0,78, ClaI 0,27 и 0,73, Eco 47111 0,66, Eco 911 0,65, KpnI 0,25, Pst I 2,48, XbaI 0,83 и 0,93.
фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy 314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и А3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-a1, терминатор транскрипции фага;
генетического маркера селекции, гена β-лактамазы, придающего устойчивость к антибиотику ампициллину клетками Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy 315;
уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенных на расстоянии в т. п.н. EcoRI 0 и 0,11, BgIII 0,78, ClaI 0,27 и 0,73, Eco 47111 0,66, Eco 911 0,65, KpnI 0,25, Pst I 2,48, XbaI 0,83 и 0,93.
Предлагаемая плазмида обеспечивает увеличение синтеза гибридного белка на 50% Он является единственным мажорным белком клеток, содержащих плазмиду pThy 315.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.
Фиг. 1 схема получения рекомбинантной плазмидной ДНК pThy 315.
Фиг. 2 электрофореграмма в 15% ПААГ-ДСН лизатов клеток 20050, содержащих плазмиды: 1 pThy 314, 2 pThy 315, 3 маркеры молекулярных масс белков.
Пример 1.
Получение рекомбинантной плазмидной ДНК pThy 315.
Плазмидную ДНК pThy 314 в количестве 10 мкг растворяют в 100 мкл буфера, содержащего 50 Мм NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5 и 3 Мм b-меркаптоэтанола. Добавляют 10 ед. активности рестриктазы HindIII и 5 ед. XbaI, инкубируют при 37oC в течение часа. После инкубации реакцию останавливают прогреванием при 70oC в течение 10 мин. В реакционную смесь добавляют по 1 мкл растворов dАTP, dТТР, dGTP, dСТР с концентрацией 10 мМ и 5 ед. активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli. Инкубируют 1 ч при 20oC, после чего экстрагируют 200 мкл смеси равных объемов фенола и хлороформа. ДНК осаждают, добавляя 1 мкл 5 М NaCl и 250 мкл 96% этанола. После инкубации при -20oC в течение часа и центрифугирования 10 мин при 8000 g спирт сливают. ДНК высушивают под вакуумом и растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ и 5 мМ дитиотрейтола. Добавляют 10 ед. активности Т4 ДНК-лигазы и инкубируют 18 ч при 15oC. 25 мкл этой смеси используют для трансформации компетентных клеток по следующей методике. Выращивают ночную культуру штамма НВ1010 в 5 мл бульона, содержащего 0,5% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl рН 7,2 (LB), при температуре 37oC. Разводят культуру свежим LB в 50 -100 раз и растят на качалке при температуре 37oC до оптической плотности при 590 нм, равной 0,3. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 3000 g в течение 10 мин и температуре 4oC. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М кальция хлористого, охлажденного на льду. Инкубируют 20 мин на льду. Повторно осаждают в 3 мл 0,1 М кальция хлористого, осажденного на льду. Переносят 0,2 мл компетентных клеток в пробирку и добавляют плазмидную ДНК. Инкубируют на льду 1 ч, затем 5 мин при температуре 42oC. Добавляют 2 3 мл теплого (37oC) LB без антибиотика и инкубируют при температуре 37oC 1 1,5 ч. Высевают по 0,1 мл на чашки Петри с L-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37oC в течение ночи. Выросшие колонии перекладывают на чашки Петри, одну с ампициллином, другую с хлорамфениколом. Отбирают колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к хлорамфениколу, засевают в 5 мл LB, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37oC. Осаждают клетки центрифугированием 5 мин при частоте вращения 6000 об/мин. Осадок суспендируют в 350 мкл мМ трис-HCl рН 7,5 с 0,1 М натрия хлористого. Добавляют по 0,3 мл фенола и хлороформа, перемешивают, центрифугируют 5 мин при частоте вращения 6000 об/мин. Переносят верхнюю фазу, добавляют 0,2 мл 5 М ацетата аммония и 1 мл 96% этанола, перемешивают, инкубируют 20 30 мин при температуре 4oC. Центрифугируют 5 мин при частоте вращения 8000 об/мин. Спирт сливают, осадок высушивают под вакуумом, растворяют в 150 мкл 10 мМ трис-HCl рН 7,5. Добавляют 1 мкл РНК-азы (1 мг/мл), прогревают 10 мин при температуре 70 -75oC. Анализируют 15 мкл электрофорезом в 0,7% агарозе. Полученные таким образом плазмидные ДНК анализируют с помощью рестриктаз Hind III, XbaI, EcoRI, BgIII при раздельном или совместном гидролизе в условиях, как указано выше. Отбирают варианты плазмидной ДНК, утратившие один EcoRI и Hind III сайты и фрагмент размером 0,75 т.п.н. расположенный между BgIII и XbaI сайтами, при этом должны быть сохранены оба XbaI сайта. Нуклеотидную последовательность области делеции между Clal и XbaI сайтами проверяют по методу Сенгера. Схема конструирования плазмиды pThy 315, ее рестрикционная карта и нуклеотидная последовательность в области делеции показаны на фиг. 1. Полученную указанным способом плазмидную ДНК pThy 315 и ДНК плазмиды pThy 314 трансформируют в клетки штамма E.coli SG 20050. Трансформированные клетки засевают в бульон, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и культивируют при 37oС в течение 18 - 20 ч. Выращенные клетки анализируют на наличие гибридного белка в 15% ПААГ-ДСН. Спектр и количество синтезируемых белков показаны на фиг. 2.
Claims (1)
- Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy 315, кодирующая гибридный белок α-фактор некроза опухоли тимозин a1 размером 3,23 т.п.н. имеющая мол.м. 2,1 МДа и содержащая фрагмент ДНК плазмиды pThy 314 размером 3,23 т.п.н. с тандемом ранних промоторов А2 и А3 бактериофага Т7, участком связывания рибосом, геном гибридного белка α-фактор некроза опухоли тимозин a1 и терминатором транскрипции фага λ;-генетический маркер ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции на расстоянии (в т.п.н.): EcoRI 0 или 0,11, BglIII 0,78, ClaI 0,27 и 0,73, Eco 47111 0,66, Eco 911 0,65, KpnI 0,25, PstI 2,48, XbaI 0,83 и 0,93.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5065134/13A RU2077586C1 (ru) | 1992-10-07 | 1992-10-07 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5065134/13A RU2077586C1 (ru) | 1992-10-07 | 1992-10-07 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2077586C1 true RU2077586C1 (ru) | 1997-04-20 |
Family
ID=21614649
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5065134/13A RU2077586C1 (ru) | 1992-10-07 | 1992-10-07 | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2077586C1 (ru) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102191303A (zh) * | 2010-11-26 | 2011-09-21 | 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 | 基因重组Tα1的表达和制备方法 |
CN108220289A (zh) * | 2016-12-13 | 2018-06-29 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 一种聚核苷酸、转化子及其应用 |
WO2020005097A1 (ru) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Георгий Георгиевич ЧУМБУРИДЗЕ | Стабилизированная композиция |
RU2787531C1 (ru) * | 2022-08-02 | 2023-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Рефнот-Фарм" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy |
-
1992
- 1992-10-07 RU SU5065134/13A patent/RU2077586C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Авторское свидетельство СССР N 1707078, кл. C 12 N 15/12, 1992. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102191303A (zh) * | 2010-11-26 | 2011-09-21 | 扬子江药业集团北京海燕药业有限公司 | 基因重组Tα1的表达和制备方法 |
CN108220289A (zh) * | 2016-12-13 | 2018-06-29 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 一种聚核苷酸、转化子及其应用 |
CN108220289B (zh) * | 2016-12-13 | 2021-09-03 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 一种聚核苷酸、转化子及其应用 |
WO2020005097A1 (ru) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Георгий Георгиевич ЧУМБУРИДЗЕ | Стабилизированная композиция |
RU2787531C1 (ru) * | 2022-08-02 | 2023-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Рефнот-Фарм" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy |
RU2809357C1 (ru) * | 2022-12-26 | 2023-12-11 | Общество с ограниченной ответственностью "Рефнот-Фарм" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Steiert et al. | A Gene Coding for a Membrane–Bound Hydrolase is Expressed as a Secreted, Soluble Enzyme in Streptomyces Lividans | |
JPH06261746A (ja) | 高収量の組換え産物の産生宿主体 | |
JPH0773499B2 (ja) | 組換えdna発現ベクタ−およびペニシリウム・クリソゲナムのイソペニシリンnシンセタ−ゼをコ−ドしているdna化合物 | |
JPH07108221B2 (ja) | レンニンの製造方法 | |
EP0235410B1 (en) | Prokaryotic expression system | |
KR920009543B1 (ko) | β-유로가스트론 유전자, 상응하는 재조합 플라스미드, 상응하는 형질전환체 및 그의 제조방법, 및 β-유로가스트론의 제조방법 | |
JPH0787788B2 (ja) | イソペニシリンn合成酵素をコ−ドしているdna化合物および組換えdna発現ベクタ− | |
JP4446600B2 (ja) | 高発現エシェリキアコリ発現ベクター | |
US4795706A (en) | Novel expression control sequences | |
US4332898A (en) | Hybrid plasmid and process of making same | |
RU2077586C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 | |
CN111117942B (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
Tsuyoshi et al. | Construction and characterization of an Escherichia coli mutant with a deletion of the metZ gene encoding tRNAf1Met | |
JPH0746994A (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
Chon et al. | Studies with FtsA-LacZ protein fusions reveal FtsA located inner-outer membrane junctions | |
RU2153535C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii | |
US6844169B1 (en) | Constructs for controlled expression of recombinant proteins in prokaryotic cells | |
Maeda et al. | Colicinogenic mutant of ColE1 plasmid that fails to confer immunity to colicin E1 | |
Liang et al. | Autogenous regulation of the regA gene of bacteriophage T4: derepression of translation. | |
KR20050093757A (ko) | 플라즈미드가 없는 대장균 dsm 6601 균주의 클론 | |
Gramajo et al. | Expression of cloned genes by in vivo insertion of tac promoter using a mini-Mu bacteriophage | |
SU1532585A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 33, кодирующа метилазу S @ 11, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент метилазы S @ 11 | |
RU1387414C (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк psth 2191, кодирующая синтез соматотропина человека, и штамм escherichia coli - продуцент соматотропина человека | |
SU1730151A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК р 9 F МД, кодирующа гибридный полипептид Р199 - ASp PRo CYS CYS - VP1 /200 - 213/ - PRo PRo SeR PRo - Vp1 /131 - 152/ PRo CYS GLY и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI продуцент гибридного полипептида Р199 - ASp PRo CYS GLY - VP1 /200 - 213/ PRo PRo SeR PRo - VP1 /131 - 152/ - PRo CYS GLY | |
Takebe et al. | In vitro construction of the tufB-lacZ fusion: analysis of the regulatory mechanism of tufB promoter |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20050512 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071008 |