RU2787531C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy - Google Patents
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787531C1 RU2787531C1 RU2022121012A RU2022121012A RU2787531C1 RU 2787531 C1 RU2787531 C1 RU 2787531C1 RU 2022121012 A RU2022121012 A RU 2022121012A RU 2022121012 A RU2022121012 A RU 2022121012A RU 2787531 C1 RU2787531 C1 RU 2787531C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thy
- tnf
- protein
- pet32a
- hybrid protein
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 142
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 142
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 title claims description 26
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 title abstract 2
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 title abstract 2
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 title abstract 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 title description 13
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 title description 11
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 title description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims abstract description 23
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 21
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000001718 repressive Effects 0.000 claims abstract description 11
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims abstract description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 120
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 64
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 60
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 16
- 210000003000 Inclusion Bodies Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 9
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 claims description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl β-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003381 solubilizing Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 abstract description 9
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 abstract description 4
- 241000702371 Enterobacteria phage F1 Species 0.000 abstract description 3
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 110
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 57
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 56
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 39
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 25
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 24
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 22
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 20
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 19
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 15
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 239000002609 media Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 12
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 8
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000011068 load Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- XXXSILNSXNPGKG-ZHACJKMWSA-N Crotoxyphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(C)=C\C(=O)OC(C)C1=CC=CC=C1 XXXSILNSXNPGKG-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M Potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000006635 beta-Lactamases Human genes 0.000 description 4
- 108020004256 beta-Lactamases Proteins 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005364 simax Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 3
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 3
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 3
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 3
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229960000640 Dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L Magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 102100009534 TNF Human genes 0.000 description 2
- NZVYCXVTEHPMHE-UHFFFAOYSA-N Thymosin α 1 Chemical compound CC(=O)NC(CO)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N Bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001608 Connective Tissue Cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase family Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000012523 bacterial endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002318 immunoblotting Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710030587 ligN Proteins 0.000 description 1
- 101700077585 ligd Proteins 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004215 spores Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- -1 that is Proteins 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli BL21/PET32a-TNF-THY, который может быть использован для получения гибридного белка альфа-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (TNF-Thy), применяемого в медицинской промышленности. Рекомбинантная плазмида pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивает синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 20,5 кДа, и содержит структурные элементы: промотор Т7 и оператор 1асО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter). Изобретение позволяет повысить эффективность получения белка TNF-Thy, а именно увеличение выхода гибридного белка TNF-Thy из биомассы штамма с чистотой не менее 97% за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента гибридного белка TNF-Thy, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход гибридного белка TNF-Thy за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 10 раз при сохранении содержания общего белка и доли гибридного белка TNF-Thy в общем белке клетки. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli BL 21/РЕТ32а- TNF-Thy, который может быть использован для получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (далее белок TNF-Thy), применяемого в медицинской промышленности.
Гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 известен из уровня техники и обладает рядом преимуществ по сравнению с α-фактором некроза опухоли в качестве терапевтического препарата: имеет низкую системную токсичность, сохраняя противоопухолевую активность природного α-фактора некроза опухоли, и кроме того, показывает иммуностимулирующие свойства. (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР, а.с. N1707078, C12N 15/12, 1992)
Из уровня техники известна рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315, кодирующая гибридный белок TNF-Thy, а так же известен способ получения гибридного белка TNF-Thy (RU 2077586, C12N 15/12, 20.04.1997; RU 2055896, С 12 Р 21/00, 03.10.1996). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315 имеет молекулярную массу 2,1 МДа (3,23 т.п.н.), кодирует гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 с молекулярной массой 20,46 кДа и состоит из: фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 и терминатор транскрипции фага λ, а также имеет генетический маркер селекции, ген β-лактамазы, придающий устойчивость к антибиотику ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy315.
Недостатком рекомбинантной плазмиды является то, что маркер ампициллинрезистентности, приводит к недостаточно эффективной селекции. Фермент β-лактамаза, расщепляющий ампициллин, является секретируемым белком, то есть β-лактамаза в ходе культивирования штамма накапливается в культуральной среде. Это приводит к инактивации как имевшегося изначально в среде, так и добавляемого вновь ампициллина. В результате в ферментере накапливаются клетки штамма, утратившие плазмиду и неспособные синтезировать рекомбинантный белок. Что, в свою очередь, ведет к падению продуктивности трансформированного штамма.
Известен способ получения гибридного белка TNF-Thy, который включает культивирование клеток трансформированного штамма Escherichia coli SG20050 введением плазмиды pThy315, кодирующей синтез указанного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка (RU 2055896, С12Р 21/00, 29.07.1992). При этом культивирование проводят при 36-38°С в среде, содержащей до 1,4% пептона или триптона, до 1,6% дрожжевого экстракта, до 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина. При этом используют свежеполученные трансформанты или отобранные на начальной фазе экспоненциального роста и хранившиеся при минус 20-40°С в бульоне с 40% глицерина. После лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6-5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5-5,8 и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0-8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1,0 М NaCl, с последующим диализом при рН 7,2-7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.
Недостатком такого способа получения является использование при хроматографической очистке белка сорбента с иммобилизованным красителем (голубой). Этого типа сорбенты подвергаются в процессе использования частичной деградации, при этом краситель (голубой) отделяется от сорбента и самопроизвольно элюируется с колонки в виде связанного с белком комплекса. Такие примеси недопустимы для приготовления лекарственных препаратов.
Наиболее близкими аналогами к заявляемым объектам изобретения являются рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1 (RU, 2225443, C12N 1/70, 25.07.2002). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy316 для экспрессии в клетках Escherichia coli гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1, имеющая размер 3,77 т.п.н. и содержащая промоторы А2 и A3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1; расположенный после промотора A3 рибосомосвязывающий сайт; ген, кодирующий гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α1, заключенный между сайтами рестрикции XbaI и ClaI и включающий второй сайт рестрикции ClaI; следующую за геном гибридного белка и ограниченную двумя сайтами рестрикции XbaI терминаторную область; ген устойчивости к ампицилину; ген устойчивости к аминогликозидам (канамицину, неомицину и G-418), содержащий третий сайт рестрикции ClaI; а также уникальные сайты рестрикции: PstI в гене р-лактамазы; XhoI, HindIII и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы; KpnI между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом; EcoRI между промоторами A3 и А2. А способ основан на культивировании клеток штамма Escherichia coli SG20050 или BL21, который трансформирован введением плазмиды pThy316, являющегося модификацией ранее описанной плазмиды pThy315, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка TNF-Thy. При этом культивирование штамма, трансформированого введением плазмиды pThy316, проводят при 37°С в среде, содержащей 1% пептона или триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 50 мкг/мл канамицина. После лизиса клеток лизат центрифугируют, осадок отмывают 1-2 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины с 10 мМТрис-НС1, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 7,5 с элюцией тем же буфером в градиенте концентрации 0-1 М NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на гидроксидапатит, уравновешенный 20 мМ натрий фосфатным буфером рН 6,8 с 7 М мочевины и элюируют белок градиентом концентрации 20-400 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,8 с 7 М мочевиной. Полученный раствор наносят на сорбент Сефадекс G-50, уравновешенный 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, проводят хроматографию для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка.
Недостатком данного способа является отсутствие штамма-продуцента и применение в качестве основы для создания плазмидного вектора плазмиды pThy315. В качестве промотора в ней применяется тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7. Данный тандем является неоптимальным для экспрессии рекомбинантных белков. Кроме того, с его помощью обеспечивается конститутивная экспрессия белка, что создает дополнительное метаболическое давление на клетки продуцента Escherichia coli. Это, в свою очередь, приводит к достижению ими более низких плотностей по сравнению с продуцентами с индуцибельными промоторами и снижает продуктивность. В итоге конечная продуктивность указанного способа получения гибридного белка TNF-Thy оказывается низкой, что делает эффективность производства на его основе довольно низкой, а трудоемкость - высокой.
Штамм на основе плазмид для продуцирования гибридного белка TNF-Thy из уровня техники не известен.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание впервые штамма -продуцента гибридного белка TNF-Thy на основе сконструированной плазмиды, направляющей синтез гибридного белка TNF-Thy с целью повышения эффективности и снижения трудоемкости получения гибридного белка TNF-Thy, увеличении выхода и чистоты гибридного белка TNF-Thy.
Поставленная задача достигается за счет создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез белка имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5кДа и содержащая структурные элементы: промотор Т7 и оператор 1асО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter),
Так же заявляется штамм Escherichia coli BL 21/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy.
Еще одним заявляемым объектом настоящего изобретения является способ получения гибридного белка TNF-Thy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy, при этом после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента гибридного белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy, путем анионно-обменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией и с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%
При этом, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy можно проводить в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов
А индукцию биосинтеза предпочтительно осуществлять изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом.
Выделение гибридного белка TNF-Thy можно осуществлять путем отделения клеток от культуральной жидкости, дезинтеграции клеток, выделения тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизацию тел включений.
Очистку гибридного белка TNF-Thy предпочтительно осуществлять с использованием анионно-обменной и гель-проникающей хроматографии при концентрации мочевины 7М-9М, рН 7,2-8,5
А разбавление мочевинного раствора предпочтительно осуществлять до концентрации мочевины не более 0,4 М
Настоящее изобретение относится к гибридному белку TNF-Thy, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, содержащему α-фактор некроза опухолей и тимозин-al.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами:
На Фиг. 1 представлены SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 (аминокислотная последовательность TNF-Thy и нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента, кодирующая TNF-Thy)
На Фиг. 2 изображена Карта плазмиды, содержащая:
f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1,
AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),
ori- ориджин репликации colE1,
Т7 promoter - промотор бактериофага Т7,
TNF-Thy - ген гибридного белка TNF-Thy,
Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7,
LacI - ген лактозного репрессора LacI.
На Фиг. 3 представлена фотография электрофоретического разделения тотального клеточного лизата:
1 -- до начала индукции
2 - в момент индукции
3 - 2 часа после индукции
4 - 4 часа после индукции
5 - 5 часов после индукции
6 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
Заявляемый штамм имеет преимущество в том, что впервые получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET32a-TNF-Thy согласно настоящему изобретению. Необходимо отметить, что штамм - продуцент был получен только за счет оригинального конструирования уникальной плазмиды pET32a-TNF-Thy, что обеспечивает эффективную экспрессию гена, позволяющую нарабатывать значительное количество биомассы, содержащей гибридный белок TNF-Thy
В заявляемом техническом решении поставленная задача решается посредством создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy для экспрессии указанного гибридного белка, впервые полученным высокопродуктивным бактериальным штаммом-продуцентом BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, а также способа получения гибридного белка TNF-Thy, позволяющего получать гибридный белок TNF-Thy с высоким выходом и высокой степенью чистоты.
Предложенный штамм и способ очистки имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с известными из уровня техники, в т.ч. ранее указанными источниками.
Т.к. гибридный белок используется при производстве лекарственных средств, надо учитывать, что для обеспечения постоянства свойств лекарственного препарата, содержащего допустимые примеси в определенном диапазоне, должен соблюдаться целый ряд требований при ферментации, экспрессии белка и очистке.
Получение для ферментации трансформационной смеси, как в ближайшем аналоге, а не штамма, не позволяет проводить процесс в строго определенных условиях, описанных в стандартных операционных процедурах, что сказывается на качестве получаемого гибридного белка, соответственно это сказывается и на лекарственном препарате. Создание впервые штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy позволяет получить эталонную культуру, заложить на хранение рабочую культуру клеток штамма и проводить процесс ферментации при стандартизованных условиях. В настоящее время это является одним из требований надлежащей производственной практики (GMP). В заявляемом изобретении выход биомассы с 1 л культуральной жидкости составляет от 50 до 80 г. А в вышеуказанном патенте получают биомассу 8 г/л. Соответственно, эффективность заявляемой ферментации увеличилась в 6-10 раз.
Необходимо отметить, что проведение хроматогафии на колонне с сорбентом SepraPrep™Q более эффективно по сравнению с ДЕАЕ-целлюлозой, т.к. позволяет значительно сократить время проведения стадии.
Так же впервые заявлен способ хроматографии на Сефадексе G-100 в денатурирующих условиях. Растворенные и даже очищенные от посторонних примесей тельца включений дают гибридный белок TNF-Thy в различных олигомерных формах. Описанная в ближайшем аналоге хроматография на гидроксилапатите не позволяет разделить эти формы и не является способом, значительно увеличивающим чистоту гибридного белка. Заявляемый способ с использованием хроматографии в мочевине на Сефадексе G-100 позволил разделить олигомеры TNF-Thy и тримерную активную форму гибридного белка. Кроме того, во время проведения этой стадии происходит очистка от посторонних высокомолекулярных примесей. Выход активной тримерной формы составляет 25-30% от всего белка. Чистота на данном этапе составляет 90%, что позволяет проводить эффективно следующую важную стадию процесса - получение правильно свернутого гибридного белка TNF-Thy
Последующая хроматография описанная в ближайшем аналоге проводится на колонке Сефадексе G-50, уравновешенном 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, выполняют для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка. При этом колоночная хроматография не позволяет получить высокий уровень ренатурации гибридного белка. Как показали проведенные исследования, способ, описанный в ближайшем аналоге с учетом не отделения от олигомеров дает низкий выход ренатурированного гибридного белка за счет его агрегации (20-50%). Заявляется более точный и упрощенный способ ренатурированного гибридного белка, путем разбавления мочевинного раствора, без использования дорогих сорбентов, при сокращении времени процесса, что позволяет увеличить выход правильно свернутого гибридного белка до 90-100%, при этом чистота гибридного белка составляет 97%.
После проведения хроматографии ренатурированного белка получаем продукт со следующими параметрами:
- Молекулярная масса мономера составляет 20,5±0,2кДа. Содержание мономера продукта с молекулярной массой около 20,5 кДа должно быть не менее 97%.(электрофорез 17,5% ПААГ, ДСН)
- Положение основной полосы иммунокомплекса в иммуноблотинге должно быть выше полосы иммунокомплекса сертифицированного референсного образца ФИО (CRS). Разница в положении полос должна соответствовать примерно 3 кДа.
- Примеси белковой природы, олигомеры, агрегаты и мономеры - не более 3%;Содержание клеточной и векторной ДНК не более 100 пкг/106ЕД
- Молекулярно- массовое распределение не менее 97% тримера (61±2)кДа
- Бактериальные эндотоксины не более 0,5 ЕЭ на 104 ЕД активности
Удельная активность 2,0×10бЕД/1 мг белка
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности получения белка TNF-Thy, а именно, увеличение выхода гибридного белка TNF-Thy из биомассы штамма с чистотой не менее 97% за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента гибридного белка TNF-Thy, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход гибридного белка TNF-Thy за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 10 раз при сохранении содержания общего белка и доли гибридного белка TNF-Thy в общем белке клетки.
Указанный технический результат достигается созданием штамма на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy и способом получения белка с использованием такого штамма.
Рекомбинантная плазмида pET32a-TNF-Thy для экспрессии гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, имеющей длину 5929 пар оснований и состоящей из следующих ключевых генетических элементов:
- промотора Т7 и оператора 1асО;
- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQIDNO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy;
- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);
- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (Laclpromoter);
- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).
В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ32а. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO 2, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ-32а по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.
Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET32a-TNF-Thy, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с Фиг. 1:
- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);
- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
- промотора Т7 и оператора 1асО;
- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (Laclpromoter);
- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, кодирующей гибридный белок Tnf-Thy (SEQ ID NO 1), включающий в себя α-фактор некроза опухолей и тимозин-α1.
Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на Фиг. 2.
В вышеуказанной плазмиде ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter) предназначен для его экспрессии.
Ориджин репликации бактериофага f1 /AnalysisofGenesandGenomes, JohnWiley&Sons, 2004, S. 140/ широко используется для создания экспрессионных векторов.
Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ IDN O 2 является полипептид последовательности SEQ ID NO 1, включающий α-фактор некроза опухолей и тимозин-α1.
После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток Escherichia coli BL 21(DE3).
Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е. coli BL21 (DE3) Генотип Е. coli six. В /HaeyoungJeong, ValerieBarbe, ChoongHoonLee, DavidVallenet, DongSuYu, Sang-HaengChoi, ArnaudCouloux, Seung-WonLee, SungHoYoon, LaurenceCattolico, Cheol-GooHur, Hong-SeogPark, BeatriceSegurens, SunChangKim, TaeKwangOh, RichardE. Lenski, F. WilliamStudier, PatrickDaegelen, JihyunF. Kim, Genome Sequences of Escherichia coli BstrainsREL606 and BL21(DE3), JournalofMolecularBiology, Volume 394, Issue 4, 2009, 644-652/. Экспрессионной плазмидой длиной 5929 п. о., состоящей из ключевых генетических элементов, расположенных друг относительно друга так, как представлено наФиг.2, трансформируют клетки штамма E.coli BL21 (DE3). Для введения плазмиды в клетки Е. coli BL21 (DE3) могут использоваться методы трансформации, известные из уровня техники, например, электропорация, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е. coli BL21 (DE3) плазмиды, представленной на Фиг. 2, могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий стадии:
a) культивирования штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy согласно настоящему изобретению с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy согласно настоящему изобретению;
b) выделения гибридного белка TNF-Thy согласно настоящему изобретению из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);
c) очистки гибридного белка TNF-Thy, полученного на стадии Ь).
В предпочтительном воплощении, однако, без ограничения, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy, в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy осуществляют на 3 часе культивирования при помощи изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида
Важным этапом получения более чистого гибридного белка явилось применение гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, позволяющей разделить олигомеры и тример белка, что повышает чистоту гибридного белка TNF-Thy (не менее 97% чистоты).
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления.
Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V.239, №4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p.5463-5467.].
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода. Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ32а (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCb, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractll. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE. Олигонуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 1, получают полным нуклеотидным синтезом. Полученную синтетическую последовательность SEQ ID NO 2 обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractll. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Описанный выше полученный синтетический фрагмент в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды рЕТ32а, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ гАТР, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт.Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С. Помещают на лед пробирки с компетентными клетками (XL 1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчета одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4-ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое легким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20--30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (плюс 42°С) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лед и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объемов предварительно подогретую до 37°С среду SOB, перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диамтером 60 мм (Перинт).
Аликвоту полученной плазмидной ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET32a-TNF-Thy. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 2. Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy и характеристика его продуктивности
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в Примере 1.
Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. coli BL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники /TamaraKleber-Janke, Wolf-MeinhardBecker, UseofModifiedBL21(DE3) Escherichia coli Cellsfor High-LevelExpressionofRecombinantPeanutAllergensAffectedbyPoorCodonUsage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3,2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки.
Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерленмейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра ShimadzuCS-930. Результаты представлены на Фиг. 3. 5 -- клеточный лизат, 6 - стандарты молекулярных масс. Выход гибридного белка TNF-Thy по результатам денситометрического анализа составляет не менее 20% относительно суммарного белка клетки.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy характеризуется следующими признаками:
а) Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
б) Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде «LB» (на 1 литр 10 г пептон, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 20 г агара) - колонии сероватые, слабовыпуклые, влажные, блестящие, пастообразной консистенции.
в) Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения, включающие пептон, триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
г) Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Пример 3. Способ получения гибридного белка TNF-Thy Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С.Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис-HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А254, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C18.
Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAE SepharoseFast Flow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор ренатурированного гибридного белка, в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.
Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.
Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают настерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2) С.
Определение активности
Для исследования противоопухолевой активности белка использовали штамм диплоидных клеток подкожной соединительной ткани мыши (NCTCclone 929 [Lcell, L-929, derivativeofStrainL], ATCC® CCL-1™). Ампулу с клетками переносят из жидкого азота в водяную баню с температурой (40±0,1)°С.Клетки после оттаивания асептически переносят в пластиковый матрац, вместимостью 500 мл и в него с интервалом 1,5-2 мин добавляют ростовую среду (среда ДМЕМ - 90% по, эмбриональная телячья сыворотка жидкая - 10%) в количестве 0,25; 0,25; 0,5; 0,5; 0,75; 1,0; 1,0; 2,0; 2,0; 10,0 мл. После подсчета количества клеток концентрацию клеток в суспензии доводят до посевной путем добавления ростовой среды с добавлением антибиотиков (канамицина 100 ЕД/мл, гентамицина 80-160 ЕД/мл). Клетки формируют монослой с типичной морфологией на 4-е сутки.
Для определения активности препарата контролируют количество пассажей культуры клеток, которых должно быть не более 30 пассажей.
Монослой клеток, полученный в матраце вместимостью 500 мл снимают со стекла 0,125% раствором трипсина и суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс.клеток. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48-72 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации СО2 (5,0±0,5) %.
Для определения активности готовят сначала десятикратные разведения: 1:10, 1:100, 1.Т000 и 1:10000, а затем последовательные двукратные разведения: 1:20000, 1:40000, 1:80000,1:160000, 1:320000, 1:640000, 1:1280000, 1:2560000 исследуемого образца в ростовой среде. Из планшета с монослоем клеток удаляют среду в стакан для отходов и вносят в лунки по 100 мкл последовательных разведений образца и по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д в концентрации 2 мкг/мл. На каждое разведение используют не менее 4 лунок с культурой клеток. 4 лунки с культурой оставляют в качестве контрольных. В контрольные лунки дополнительно вносят по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации СО2 (5,0±0,5) %.
Предварительную оценку состояния монослоя проводят через 24 часа. Дальнейший учет активности TNF-Thy проводят, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. Окончательный учет проводят через 48 часов. Для этого монослой отмывают от погибших клеток стерильным физиологическим раствором. Для этого из лунок сначала удаляют ростовую среду, вносят по 200 мкл физраствора, который также удаляют. Повторяют 2-3 раза. Затем содержимое лунок окрашивают 0,2% раствором кристаллического фиолетового. Для этого, после удаления ростовой, в лунки вносят по 100 мкл спирта этилового 96% и выдерживают в течение 10 минут. Спирт удаляют и промывают лунки водой очищенной, внося по 100 мкл в лунку и удаляя ее стряхиванием. Процедуру промывки повторяют три раза. Затем планшеты высушивают на воздухе в течение 30 минут. Затем в каждую лунку вносят по 200 мкл 0,2% раствора кристаллического фиолетового и выдерживают планшет в течение 20 минут при энергичном покачивании. Краситель удаляют стряхиванием и промывают планшеты водой очищенной как указано выше. Для удаления связавшегося красителя в лунки вносят по 100 мкл кислоты уксусной 10%, которую затем удаляют стряхиванием. Учет результатов проводят визуально (с помощью инвертированного микроскопа) или автоматически, на планшетном спектрофотометре, при длине волны 540 нм.
За активность испытуемого образца принимают величину, обратную разведению, при котором имеет место 50±5% гибель клеток.
Расчет специфической активности проводят по формуле
где - разведение образца, при котором наблюдается 50% повреждение монослоя (снижение оптической плотности на 50% контрольной).
Расчет удельной активности:
Получают гибридный белок с чистотой 97, 5% и удельной биологической активностью не менее 2,0×106 ЕД на 1 мг белка.
Пример 4. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2, но после индукции биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ культуральную жидкость инкубируют в течение 6 часов. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С.Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С.Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А260, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C18.
Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAE Sepharose Fast Р1о\уобъемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка со стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.
Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.
Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ). Также отбирают пробу на определение биологической активности.
Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.
Определение активности проводят как описано в Примере 3.
Получают гибридный белок с чистотой 98% и удельной биологической активностью не менее 2,0×10б ЕД на 1 мг белка.
Пример 5. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С.Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Тпуна «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thyu проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 8,5 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А260, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С18.
Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thyc чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAE Sepharose Fast Flowo объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.
Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ). Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2) С. Определение активности проводят как описано в Примере 3.
Получают гибридный белок с чистотой 98,5% и удельной биологической активностью не менее 2,0×106 ЕД на 1 мг белка.
Пример 6. Способ получения гибридного белка TNF-Thy
Культивирование штамма- продуцента
Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).
100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.
Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl,7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч.Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy нa «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100
Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thyu проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.
В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А280, А260. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН).
Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.
В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А280, А260, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C18. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thyc чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.
Ренатурация белка TNF-Thy
Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 90 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.
Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow
Используют колонку с DEAESepharoseFastFlow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.
Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности.
Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.
Определение активности проводят как описано в Примере 3.
Получают гибридный белок с чистотой 97% и удельной биологической активностью не менее 2,0×10бЕДна 1 мг белка.
Claims (8)
1. Рекомбинантная плазмида pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 20,5 кДа, и содержащая структурные элементы: промотор Т7 и оператор 1асО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter).
2. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy - продуцент гибридного белка TNF-Thy, полученный трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy по п. 1.
3. Способ получения гибридного белка TNF-Thy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включающий культивирование штамма - продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, при этом после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy и выдерживают 4-6 часов с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента гибридного белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/рЕТ32а-TNF-Thy проводят в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что индукцию биосинтеза осуществляют изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом.
6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что выделение гибридного белка TNF-Thy осуществляют путем отделения клеток от культуральной жидкости, дезинтеграции клеток, выделения тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизации тел включений.
7. Способ п. 3, отличающийся тем, что очистку гибридного белка TNF-Thy осуществляют с использованием анионообменной и гель-проникающей хроматографии при концентрации мочевины 7-9 М, рН 7,2-8,5.
8. Способ по п. 3, отличающийся тем, что разбавление мочевинного раствора осуществляют до концентрации мочевины не более 0,4 М.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2787531C1 true RU2787531C1 (ru) | 2023-01-10 |
Family
ID=
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2055896C1 (ru) * | 1992-07-29 | 1996-03-10 | Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИНА a1 |
RU2077586C1 (ru) * | 1992-10-07 | 1997-04-20 | Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 |
RU2225443C1 (ru) * | 2002-07-25 | 2004-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 |
CN100457189C (zh) * | 2002-04-30 | 2009-02-04 | 莫尔梅德股份有限公司 | 细胞因子与肿瘤靶向蛋白的融合物 |
US8652468B2 (en) * | 1999-01-21 | 2014-02-18 | Genentech, Inc. | Methods of binding TNF-α using anti-TNF-α antibody fragment-polymer conjugates |
US20180296690A1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-10-18 | Tdw Group | Protein conjugates |
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2055896C1 (ru) * | 1992-07-29 | 1996-03-10 | Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИНА a1 |
RU2077586C1 (ru) * | 1992-10-07 | 1997-04-20 | Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a1 |
US8652468B2 (en) * | 1999-01-21 | 2014-02-18 | Genentech, Inc. | Methods of binding TNF-α using anti-TNF-α antibody fragment-polymer conjugates |
CN100457189C (zh) * | 2002-04-30 | 2009-02-04 | 莫尔梅德股份有限公司 | 细胞因子与肿瘤靶向蛋白的融合物 |
RU2225443C1 (ru) * | 2002-07-25 | 2004-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Фармаклон" | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 |
US20180296690A1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-10-18 | Tdw Group | Protein conjugates |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6728294B2 (ja) | たんぱく質精製の新規な方法 | |
JPH11514530A (ja) | (2.5―dkg)リダクターゼの各種改良型変異体 | |
RU2787531C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy | |
RU2809355C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 (DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | |
EP0420894B1 (en) | Large scale method for purification of high purity heparinase | |
RU2787131C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-IFG144, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI JM109/pET32a-IFG144 ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА ИНТЕРФЕРОН ГАММА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА | |
SU1703690A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека | |
RU2441916C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pACYC-LANS(KM), ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3), ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК pACYC-LANS(KM), И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ Erwinia carotovora | |
CN107384888B (zh) | 一种经过突变改造的耐高温海藻糖合酶及其应用 | |
JP2000509992A (ja) | コバラミンを製造し得る生合成方法 | |
RU2707525C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген шаперона HFQ Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli - суперпродуцент шаперона HFQ Vibrio cholerae | |
CN117586415A (zh) | 一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法 | |
RU2055896C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИНА a1 | |
RU2426787C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET32M/mTrx-rhIL-11, КОДИРУЮЩАЯ ИНТЕРЛЕЙКИН -11 ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pET32M/mTrx-rhIL-11 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-11 | |
RU2140453C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк p ua bc22, кодирующая модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, нетранслируемый днк-элемент - искусственная межгенная последовательность мгп14 и штамм бактерий escherichia coli - продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа | |
SU1458388A1 (ru) | Способ получени эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью узнавать и расщепл ть последовательности нуклеотидов 5 @ -GPUCGPYC-3 @ и 5 @ -CATG-3 @ | |
CN117511915A (zh) | 制备甲酰胺嘧啶dna糖基化酶的方法 | |
CN117050152A (zh) | 一种耐高温的黄素单核苷酸结合荧光蛋白及其应用 | |
SU1703693A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека | |
CN116103360A (zh) | 一种酶法制备硒代氨基酸的方法 | |
JPS633800A (ja) | 菌体外分泌による蛋白質の製造法 | |
RU2313575C1 (ru) | ПЛАЗМИДА pNAN5, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ L-АСПАРАГИНАЗЫ ЕсА2, ШТАММ BACILLUS CEREUS 1576-pNAN5 - ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ ЕсА2 И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | |
CN113980881A (zh) | 一种高产恩拉霉素的杀真菌素链霉菌工程菌 | |
RU2099421C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного интерлейкина-3 человека, рекомбинантная плазмидная днк p3pteil3, кодирующая рекомбинантный интерлейкин-3 человека, штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-3 человека | |
CN114230644A (zh) | 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用 |