CN1384205A - 一种大规模制备重组人肝细胞生长因子rhHGF的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备rhHGF的生产方法,它是通过真核基因工程方法特别是酵母表达系统生产具有野生活性的HGF蛋白质,其技术路线包括hHGF基因的获取,构建rhHGF的酵母表达质粒,用表达载体转化毕氏酵母并筛选高效表达株、重组人干细胞生长因子的诱导表达、重组人干细胞生长因子的纯化等,该方法工艺简单,容易放大,纯度较高,有利于大规模生产。
Description
技术领域：
本发明涉及一种制备rhHGF的生产方法。该方法是通过真核基因工程方法特别是酵母表达系统生产具有野生活性的HGF蛋白质。
背景技术：
肝细胞生长因子(HGF)是强有力的细胞分裂促进因子，它可以促进肝细胞及多种内皮细胞、上皮细胞的分裂、分化；参与肝脏及其他重要组织器官损伤后修复和生理条件下死亡细胞的再生，具有重要的生理功效和药用价值，是治疗各种肝病的最理想药物。肝病是东亚人群中发病率最高的疾病之一，我国更是高发地区，对HGF的需求量极大，但HGF的来源问题还尚未解决。以往使用的HGF均从含量极微的组织中提取，过程复杂、成本昂贵，很难适应HGF研究和开发的需要。寻找并建立一个体外大量获得HGF的方法和途径是国内外许多实验室竞相努力的目标。90年代开始，本发明就用基因工程方法研究重组人肝细胞生长因子rhHGF的构建和表达，并建立了成熟的原核和真核表达体系，生产出了具有野生活性的rhHGF，但由于所说的表达体系尚属于实验室阶段，没有实现HGF的大规模生产，因此难以满足广大肝病患者的要求。迄今，国内外尚未见到相关的研究和报道，建立一种大量制备rhHGF的生产工艺显得尤为重要了。
发明内容：
本发明的目的在于用基因工程的手段建立一种大量制备rhHGF的生产工艺，即用一种酵母表达系统大量制备rhHGF，该系统既具备原核表达体系成本低、产量高和易扩大生产的优点，又具有真核表达系统的优越性，包括蛋白质翻译后的化学修饰及高级结构的折叠形成。rhHGF在酵母中表达后分泌到培养液中，这一分泌过程使rhHGF在进行空间结构的修饰、折叠及其在构象上能与天然重组人肝细胞生长因子保持一致，同时用该系统表达的rhHGF纯化过程比较简单。为达到上述目的，，本发明采用了以下技术路线和步骤：
一、技术路线：
1.hHGF基因的获得；
2.构建rhHGF的酵母表达质粒；
3.用表达载体转化毕氏酵母并筛选高效表达株；
4.重组人肝细胞生长因子诱导表达；
5.重组人肝细胞生长因子的纯化。
二、步骤：
1.hHGF基因的获取
1)引物的设计和合成：
根据已知的人HGFcDNA序列，设计并合成两个引物，序列如下：
上游引物是：5’-ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA-3’
下游引物是：5’-ACATGAATTCCTTCAGCTATGACTGT-3’
上游引物长度为27个核苷酸，含有EcoRI识别位点，起始密码ATG及与编码HGF的N末端基因相同的18个核苷酸；下游引物长度为26个核苷酸，含有终止密码子，EcoRI识别位点及与编码HGF的C末端基因互补的20个核苷酸。
2)以重组质粒pRC/CMV-HGF(由美国著名科学家闫占清馈赠)为模板，通过聚合酶链反应(PCR)，扩增得到大小为2.2kb的片段。
2.rhHGF的酵母表达质粒的构建：
PCR产物经EcoRI酶切后，与经过酶切的穿梭质粒pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选具有Zeocin耐药性的转化株，从这些耐药株中提取质粒，用酶切和测序分析筛选得到含有HGF的正确质粒，将这种质粒命名为pPIC9K/HGF。
3.高效表达rhHGF的毕氏酵母重组株GS115/pPIC9K/HGF的构建和筛选：
用限制性核酸内切酶切开环型表达质粒/pPIC9K/HGF，将其线性化并将其转化毕氏酵母株GS115，筛选具有Zeocin耐药性的转化体。将所有耐Zeocin转化体分别接种于少量培养液并用甲醇诱导表达，离心收集上清，用SDS-PAGE检测rhHGF的表达量，从中筛选高表达株。
4.rhHGF的摇瓶表达与纯化：
1)rhHGF的表达：
将单个GS115/pPIC9K/HGF菌落接种于BMGH培养液，30℃振摇培养过夜，次日接种于较大体积的同种培养液，30℃继续培养至光密度值OD600达到16-20。离心收集细胞，将细胞悬浮于BMMH诱导培养液，加入甘油，30℃振摇培养，以后每24小时加入甲醇和甘油，使其最终浓度为1％，3天后离心收集上清。
2).rhHGF的纯化制备：
上述收集的上清经超滤浓缩，用凝胶过滤和阴离子交换层析纯化，SDS-PAGE上呈单一的分子量为82kDa的蛋白带。将柱层析所收集的含有rhHGF的蛋白溶液经PBS透析脱盐后，冻干，干燥，-70℃保存。
5.rhHGF的高密度发酵与制备：
1)发酵：
将保存的GS115/pPIC9K/HGF菌株于平板上活化，接种于YPD培养基上，30℃振摇培养至OD600＝18作为种子液，接种于10L发酵罐。发酵起始生长以甘油为碳源，温度30℃，pH3-6，空气流量为30L/min，溶氧40％，经过24小时培养，菌浓度达到OD600＝100，流加甘油约4小时，甘油补液浓度600g/L，补液速度3ml/L，补液完毕菌浓度为OD600＝150，甲醇补料至浓度为0.5-5％，溶氧控制为30％，诱导至72小时以上表达达到最高峰，放罐，此时菌浓度为OD600＞250。离心收集发酵上清，取少量做SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定目的蛋白表达量，用Western-blot鉴定目的蛋白的免疫反应性。
2)rhHGF的纯化制备：
将发酵上清用外压式中空纤维柱超滤浓缩、脱盐，浓缩上清，过柱；
凝胶过滤层析：用Sephadex G 75装柱(1.5×40cm)，柱床用1～3mmol/LEDTA，20～50mmol/LTris-Cl，pH8.0，溶液平衡，将浓缩后样品直接上样，蛋白浓度8mg/mL，洗脱液流速0.5ml/min；收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白所在峰；
阴离子交换层析：填料：POROS HQ，平衡液：50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，将目的蛋白所在峰的溶液浓缩后上样，洗脱液：50mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0～3mmol/LNaCL梯度洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白所在峰。将层析所收集的含有rhHGF的蛋白溶液经PBS透析脱盐后，冻干，干燥，分装，-70℃保存。发明效果：
重组人肝细胞生长因子(rhHGF)是一种能有效促进肝细胞损伤后有序再生的重要细胞因子。它在肝炎、肝硬化、肝癌等肝损伤的修复中起着不可替代的作用。目前市场无此类作用药物。近年来，国内外许多科研机构都致力于对HGF的研制与开发，但由于受到来源和相关技术的限制，一直未能投入生产。本发明提供了一种极具商业价值，大规模生产制备rhHGF的生产工艺，其突出优点在于构建了酵母高表达GS115/pPIC9K/HGF工程菌，再结合优化的发酵工艺，可使蛋白表达量高达3-5g/L；纯化工艺简单，容易放大，精制的rhHGFRP-HPLC纯度大于98％，生物学活性达到20u/ng，与国际标准品一致。这对于大量制备HGF并研究肝细胞生长调控，肝特异性蛋白的表达等基础领域方面也具有重要的意义和价值。
Claims (7)
1.一种大规模制备重组人肝细胞生长因子rhHGF的生产方法，其特征在于：首先，克隆hHGF基因，构建rhHGF表达载体和高效表达菌株；然后，用发酵的方式高密度表达rhHGF；最后，采用超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析等纯化技术的顺序组合，大量纯化回收rhHGF。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是克隆hHGF基因的步骤在于合成以下的引物：上游引物是：5’-ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA-3’下游引物是：5’-ACATGAATTCCTTCAGCTATGACTGT-3’上游引物长度为27个核苷酸，含有EcoRI识别位点，起始密码ATG及与编码HGF的N末端基因相同的18个核苷酸；下游引物长度为26个核苷酸，含有终止密码子，EcoRI识别位点及与编码HGF的C末端基因互补的20个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是rhHGF表达载体的构建，是将hHGF基因与穿梭质粒pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5a，经筛选、酶切和测序分析得到含有HGF的正确质粒pPIC9K/HGF。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是：rhHGF高效表达菌株的构建，是用限制性核酸内切酶酶切质粒/pPIC9K/HGF并将其线性化，转化毕氏酵母株GS115，经筛选、甲醇诱导表达、离心，从中筛选出高表达株。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是rhHGF的摇瓶表达所用的培养基为BMGH，培养温度为30℃，pH3-6，诱导剂为甲醇和甘油。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是rhHGF的高密度发酵采用BMGH培养液，30℃培养，10L发酵罐，发酵起始生长以甘油为碳源，pH3-6，空气流量为30L/min，溶氧40％，经过24小时培养，流加甘油约4小时，甘油补液浓度600g/L，补液速度3ml/L，甲醇补液至浓度为0.5-5％，溶氧控制为30％，诱导至72小时以上表达达到最高峰。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是rhHGF的纯化包括以下步骤：摇瓶培养：收集上清经超滤浓缩，用凝胶过滤和阴离子交换层析，将柱层析所收集的含有rhHGF的蛋白溶液经PBS透析，脱盐，冻干，干燥；发酵罐发酵：将发酵上清用外压式中空纤维柱超滤浓缩，浓缩上清过柱，含目的蛋白溶液浓缩上样，洗脱，PBS透析，脱盐，冻干，干燥。
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| CN 02117824 CN1384205A (zh) | 2002-05-22 | 2002-05-22 | 一种大规模制备重组人肝细胞生长因子rhHGF的生产工艺 |
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| CN (1) | CN1384205A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100365130C (zh) * | 2004-01-08 | 2008-01-30 | 上海交通大学 | 毕氏酵母发酵批过程的补料优化方法 |
| CN100543031C (zh) * | 2006-01-18 | 2009-09-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种分离纯化汉逊酵母表达的重组乙肝表面抗原的方法 |
| CN102068391A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-05-25 | 广州赛莱拉化妆品科技有限公司 | 人干细胞生长因子在化妆品中的应用 |
-
2002
- 2002-05-22 CN CN 02117824 patent/CN1384205A/zh active Pending
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