CN102978228A

CN102978228A - 一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102978228A
Application number: CN2012104670037A
Authority: CN
Inventors: 任宏伟; 凡复; 林昳; 郑和东; 郑宇�
Original assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Current assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明涉及一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途。重组虎纹克胰肽载体包括1或1个以上拷贝虎纹克胰肽，虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。其制备方法为：获得虎纹克胰肽基因；以获得的虎纹克胰肽基因为模板，进行扩增，酶切，连接，得到1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；将1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体进行酶切连接，再以连接产物为扩增模板，进行第二次扩增，所得到的扩增产物与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；重复上述步骤，依次得到2个以上拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。本发明的重组虎纹克胰肽载体表达量高、制备方法简单，与天然提取的虎纹克胰肽在生物活性上无明显差异。

Description

一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术，尤其涉及一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途。

【背景技术】

胰蛋白酶抑制剂是一种抑制丝氨酸蛋白酶活性的蛋白质或其他分子，在体内调控很多重要的生理过程，是维持体内环境稳定的重要因素；胰蛋白酶抑制剂的来源广泛，抗原性相对较弱，毒性低。因此，胰蛋白酶抑制剂在疾病的临床诊断、治疗等方面有广阔的应用前景，广泛应用于急性胰腺炎、外科手术、脑血管疾病、妇产科疾病、休克以及抗肿瘤治疗。虎纹克胰肽，即虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂（HWTX-XI），是第一个从蜘蛛毒素中分离的具有Kunitz型结构模体的胰蛋白酶抑制剂，是至今为止发现的胰蛋白酶抑制活性最强的天然多肽，其抑制活性比BPTI高两个数量级（BPTI即牛胰蛋白酶抑制剂，或称为抑肽酶，aprotinin，被广泛的应用于临床），而且HWTX-XI具有较高的稳定性、没有明显毒性和易于基因工程表达等优势，表明HWTX-XI在治疗与胰蛋白酶相关的疾病中有较好的应用前景。

目前天然虎纹克胰肽的来源有限，故急需一种能高效生产虎纹克胰肽且活性与天然虎纹克胰肽一致的方法。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是：提供一种高效生产虎纹克胰肽的重组载体。该重组载体包括1个或1个以上拷贝的虎纹克胰肽的重组载体，所述虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ IDNO:9所示。

为实现上述目的，本发明提供一种重组虎纹克胰肽载体的制备方法，包括如下步骤，

获得虎纹克胰肽基因；具体为得到成熟虎纹克胰肽的原始碱基序列；再通过引物引入突变位点，扩增得到突变的虎纹克胰肽基因序列。所述引物还引入了切割位点序列。切割位点序列为根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，所述切割位点序列编码单个氨基酸或两个氨基酸或6个氨基酸，更优选地，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K；两个氨基酸为D-P或N-G；三个氨基酸为R-K-R或R-R-R；6个氨基酸为L-V-P-R-G-S。

获得1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体：以获得的虎纹克胰肽基因为第一次扩增模板，进行第一次扩增，双酶切，与重组载体连接，得到1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；

优选地，还可以包括以下步骤，获得2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体：将1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体进行双酶切，回收小片段，加入酶后连接，再以连接产物为扩增模板，进行第二次扩增，所得到的扩增产物与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；

优选地，还可以重复上述步骤，依次得到2个以上拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。

所述切割位点序列可被化学试剂或酶切割，优选地，化学试剂为溴化氰、甲酸或羟胺，酶试剂为胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶。

所述获得1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体为，以所述虎纹克胰肽基因为第一次扩增模板，使用含有一定双酶切位点的引物进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物进行双酶切，与同样双酶切的载体连接得到重组载体，即为1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；

所述获得2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体为：将所得的1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体双酶切后回收小片段，加入用于双酶切的两个酶，T4连接酶进行连接，得到连接产物；以所得的连接产物为模板，进行扩增，将扩增产物回收小片段，与载体双酶切后进行连接得到2个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体。

所述载体为可在原核表达系统中或真核表达系统中进行表达，优选地，原核表达系统为pET系统、pGEX系统或pMAL系统，所述真核表达系统为pPIC9K系统、pCMVp系统、pEGFP系统、pEGFT系统、pSV2系统或CMV4系统。

本发明还保护虎纹克胰肽重组载体或根据所述方法制备的虎纹克胰肽重组载体用于制备药物的用途。

本发明提供的方法具有如下设计方案：

1、从Genebank数据库获得HWTX-XI基因编码区碱基序列，设计HWTX-XI上下游引物，使用PCR方法从虎纹捕鸟蛛毒腺中获得HWTX-XI基因。本发明的HWTX-XI基因序列或氨基酸序列也可以人工合成获得。

2、设计的HWTX-XI突变体与野生的虎纹克胰肽相比，有一个氨基酸序列的变动，并且在末尾处多出一个氨基酸。

3、设计的HWTX-XI引物具有如下特征：编码链和模板链的5’端上游及3’端下游含有具有同尾酶特性的不同的酶切位点，使得每个HWTX-XI基因片段之间可以头尾相连，头头或尾尾相连的片段可以经由同尾酶进行消化。

4、在HWTX-XI基因的5’端上游序列引入切割位点序列，切割位点序列具有如下特征：根据密码子规则编码的氨基酸序列可被化学试剂或酶切割。优选的，所述切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或6个氨基酸，确切的，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K；两个氨基酸为D-P或N-G；三个氨基酸为R-K-R或R-R-R；6个氨基酸为L-V-P-R-G-S。所述的英文大写字母为氨基酸的代码，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸，M表示甲硫氨酸，D表示天冬氨酸，E表示谷氨酸，P表示脯氨酸，N表示天冬酰氨,G表示甘氨酸,K表示赖氨酸,L表示亮氨酸,V表示缬氨酸,S表示丝氨酸。遵守20种氨基酸的密码子表。

6、所述多拷贝构建体亚克隆至原核表达载体或真核表达载体中形成原核表达构建体或真核表达构建体。所述构建体可在原核表达系统中或真核表达系统中进行表达，所述原核表达系统包括pET系统、pGEX系统、pMAL系统等，所述真核表达系统包括pPIC9K系统、pCMVp系统、pEGFP系统、pEGFT系统、pSV2系统、CMV4系统等，不排除其他原核或真核表达系统。

7、所述原核或真核表达产物可被化学试剂或酶切割，获得纯化的HWTX-XI重组蛋白，确切的，化学试剂包括，但不限于溴化氰、甲酸和羟胺，酶试剂包括胰蛋白酶(Trypsin)、梭菌蛋白酶(Clostripain)、弗林蛋白酶(Furin)、凝血酶(Thrombin)和亮氨酸氨肽酶(Leucineaminopeptidase)。

8、所述纯化后的HWTX-XI重组蛋白，采用滴定法测定比活性，具有显著生物活性，与天然提取的虎纹克胰肽无明显差异。

【附图说明】

图1为虎纹克胰肽空间结构图。

图2为虎纹克胰肽突变体菌液PCR的电泳图。

图3为虎纹克胰肽定向多拷贝克隆PCR的电泳图。

图4为虎纹克胰肽的定向多拷贝克隆pMD 19-T质粒EcoR I/sal I双酶切电泳图。

图5为虎纹克胰肽定向多拷贝克隆经DNAMAN的序列比对图。

图6为虎纹克胰素1-6串联表达载体EcoR I/Not I双酶切鉴定图。

图7单拷贝重组虎纹克胰素的Tricine-SDS-PAGE分析结果图。

【具体实施方式】

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：定向多拷贝表达方法高效生产重组HWTX-XI

1：采用PCR方法从虎纹捕鸟蛛毒腺中获取HWTX-XI基因

采用TRIzol法从虎纹捕鸟蛛毒腺(蒋立平博士学位论文，虎纹捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及功能研究，2008年11月，湖南师范大学生命科学学院)中快速提取总RNA，经反转录获得cDNA。从GeneBank数据库获得HWTX-XI成熟肽编码基因序列，设计HWTX-XI上下游引物：

HWTX-XI-F：5’-ATAGATACATGCCGT-3’(SEQ ID NO:1)

HWTX-XI-F：5’-TGCTTTTGCACATCTT-3’(SEQ ID NO:2)

引物由Invitrogen生物科技有限公司合成。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，HWTX-XI-F和HWTX-XI-R各2μL，模板即为反转录获得的cDNA1μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃30S，58℃30s，72℃延伸1m；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃。获得HWTX-XI基因，回收后TA克隆至pMD-19T克隆质粒载体（购于TAKARA）中，转入大肠杆菌DH5α。其中HWTX-XI基因序列或氨基酸序列也可以人工合成获得。

成熟虎纹克胰肽的原始碱基序列为：

5’-ATAGATACATGCCGTTTGCCCTCTGACCGTGGGAGATGCAAGGCATCCTTTGAACGTTGGTACTTCAATGGCAGAACATGCGCTAAGTTTATTTATGGAGGCTGCGGTGGCAACGGTAATAAGTTCCCAACTCAAGAGGCCTGCATGAAAAGATGTGCAAAAGCA-3’(SEQ ID NO:3)

成熟虎纹克胰肽的原始氨基酸序列为：

IDTCRLPSDRGRCKASFERWYFNGRTCAKFIYGGCGGNGNKFPTQEACMKRCAKA(SEQ ID NO:4)

2：构建HWTX-XI基因的突变体

为了利于后期多个串联HWTX-XI的切割与纯化，必须将原始的HWTX-XI进行一定的改造。通过文献的研读，发现第49位的蛋氨酸（Met,M）并不是关键残基，改变此处的M并不会改变HWTX-XI的生物学活性。将145-147位的碱基从原来的ATG突变为ATA，氨基酸序列从原来49处的蛋氨酸（M）突变成异亮氨酸（Ile,I），并在HWTX-XI首尾处再引入一个蛋氨酸（M），即引入溴化氰的切割位点，因此通过定点诱变的方法将M诱变为I，设计诱变引物序列如下：

HWTX-XI-Mu-F2：5’-GAGGCCTGCATAAAAAGATGTG-3’(SEQ ID NO:5)

HWTX-XI-Mu-R2：5’-CACATCTTTTTATGCAGGCCTC-3’(SEQ ID NO:6)

HWTX-XI-SalI-F1：5’-GTCGACATGATAGATACATGCCG-3’(SEQ ID NO:7)

HWTX-XI-Mu-R1：5’-CTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAG-3’(SEQ ID NO:8)

引物由Invitrogen生物科技有限公司合成。先以野生质粒(蒋立平博士学位论文，虎纹捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及功能研究，2008年11月，湖南师范大学生命科学学院)为模板，分别以HWTX-XI-SalI-F1、HWTX-XI-Mu-R2和HWTX-XI-Mu-F2、HWTX-XI-Mu-R1为引物进行扩增，PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，引物各2μL，模板1μL，加双蒸水至20μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃30S，58℃30s，72℃延伸1m；循环结束后再72℃保持5min，冷却至4℃。再以这两次的PCR产物为模板，以F1、R1为引物进行扩增，PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，F1和R1各2μL，模板1μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃30S，58℃30s，72℃延伸1m；循环结束后再72℃保持5min，冷却至4℃。回收目的片段，克隆于pMD19-T载体上。结果见附图2，图中M为DL2000 marker，泳道1为使用pMD19-T载体通用引物BcaBEST^TMSequencing Primer RV-M和BcaBEST^TMSequencing Primer M13-47，虎纹克胰肽突变体阳性菌株为模板的PCR结果，从图中可以看出，片段大小为328bp。对诱变产物经Invitrogen生物科技有限公司测序。

BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M:GAGCGGATAACAATTTCACACAGG(SEQ IDNO:13)

BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ IDNO:14)

改造后成熟HWTX-XI部分的碱基序列为：

5’-ATAGATACATGCCGTTTGCCCTCTGACCGTGGGAGATGCAAGGCATCCTTTGAACGTTGGTACTTCAATGGCAGAACATGCGCTAAGTTTATTTATGGAGGCTGCGGTGGCAACGGTAATAAGTTCCCAACTCAAGAGGCCTGC

AAAAGATGTGCAAAAGCA-3’(SEQ ID NO:9)加框区域为突变区域

改造后成熟HWTX-XI部分的氨基酸序列为：

IDTCRLPSDRGRCKASFERWYFNGRTCAKFIYGGCGGNGNKFPTQEAC

KRCAKA(SEQ ID NO:10)加框区域为突变区域

3：引入适当的酶切位点，构建HWTX-XI突变体的定向多拷贝克隆载体

以上述步骤2的虎纹克胰肽突变体为模板，使用含有SalI和XhoI酶切位点的引物进行PCR扩增，引物为：

HWTX-XI-SalI-F：5’-GTCGAC

ATAGATACATGCCG-3’(SEQ ID NO:11)下划线所示为SalI酶切位点。加框区域为N端引入的蛋氨酸密码子。

HWTX-XI-XhoI-R：5’-TATCTCGAG

TGCTTTTGCACATCT-3’(SEQ ID NO:12)下划线所示为XhoI酶切位点。加框区域为C端引入的蛋氨酸密码子

PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，上述引物各2μL，模板1μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃30S，58℃30s，72℃延伸1m；循环结束后再72℃保持5min，冷却至4℃。回收目的片段后，克隆至pMD19-T载体上，对所得质粒进行SalI和XhoI37℃双酶切过夜，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收虎纹克胰肽基因片段，根据同尾酶头尾相连的原理，使用T4连接酶进行连接，同时加入SalI酶和XhoI酶，将头头或尾尾相连的拷贝消化成单拷贝，16℃过夜。以连接产物为模板，使用含有SalI和XhoI酶切位点的引物即SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR，结果见附图3，其中泳道M为karkerDL2000，泳道1，2为阳性定向多拷贝克隆菌落PCR电泳图，呈现明显的ladder条带。电泳回收目的拷贝数的产物，双酶切后连接上同样双酶切的pMD 19-T载体，转化入大肠杆菌DH5α，进行菌液PCR鉴定和EcoR I/Sal I双酶切鉴定，鉴定正确的即为pMD 19-T－2HWTX-XI。按照上述克隆方法，得到各种拷贝数的HWTX-XI重组载体，HWTX-XI突变体各种拷贝数的pMD-19T载体双酶切结果见附图4。泳道M为DL2000Marker，泳道1为单拷贝的虎纹克胰肽，泳道2为3个拷贝的虎纹克胰肽，泳道3为4个拷贝的虎纹克胰肽，泳道4为5个拷贝的虎纹克胰肽，泳道5为7个拷贝的虎纹克胰肽。

挑取阳性菌液送往Invitrogen公司测序，经DNAMAN软件比对正确后保存，结果见附图5。图5将3、4、5拷贝的虎纹克胰肽突变体T载体测序结果进行比对，结果显示构建成功的定向多拷贝克隆序列与预先设计的完全一致。

构建成功的含有2个HWTX-XI突变体多拷贝的目标序列为：

5’-ATGCTCGACATGATAGATACATGCCGTTTGCCCTCTGACCGTGGGAGATGCAAGGCATCCTTTGAACGTTGGTACTTCAATGGCAGAACATGCGCTAAGTTTATTTATGGAGGCTGCGGTGGCAACGGTAATAAGTTCCCAACTCAAGAGGCCTGCATAAAAAGATGTGCAAAAGCAATGCTCGACATGATAGATACATGCCGTTTGCCCTCTGACCGTGGGAGAT GCAAGGCATCCTTTGAACGTTGGTACTTCAATGGCAGAACATGCGCTAAGTTTATTTA TGGAGGCTGCGGTGGCAACGGTAATAAGTTCCCAACTCAAGAGGCCTGCATAAAAAG ATGTGCAAAAGCA-3’(SEQ ID NO:15)下划线为HWTX-XI重复序列

其它不同拷贝数HWTX-XI的碱基序列以此类推。

4：将pMD-19T克隆载体中多拷贝HWTX-XI基因亚克隆至表达载体

以真核表达系统毕赤酵母为例，用成功构建的HWTX-XI突变体定向多拷贝克隆为模板，用含有EcoR I和Not I酶切位点的引物进行PCR扩增。

含有EcoR I和Not I酶切位点的引物序列为：

HWTX-XI-EcoRI-F：5’-GCGAATTCGACATGATAGATACAT-3’(SEQ ID NO:16)下划线所述为EcoRI酶切位点

HWTX-XI-NotI-R：5’-TAGCGGCCGCCTAGAGCATTGCTTTTGCACA-3’(SEQ IDNO:17)下划线所示为NotI酶切位点

PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，HWTX-XI-EcoRI-F和HWTX-XI-NotI-R各2μL，模板即为步骤3所得的HWTX-XI突变体定向多拷贝克隆载体1μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃30S，58℃30s，72℃延伸1m；循环结束后再72℃保持5min，冷却至4℃。回收目的片段，TA克隆至pMD-19T克隆载体上，转化至大肠杆菌DH5α，扩增提取足量的质粒，与pPIC9K(购于Invitrogen公司)表达载体均进行EcoR I/Not I双酶切，再使用T4连接酶进行连接，最后转化至大肠杆菌DH5α，测序完全正确后-20℃进行保存。构建好的表达载体经双酶切鉴定后再经测序鉴定，双酶切鉴定结果见图6。酶切鉴定图谱图6的泳道M为DL2000Marker；泳道1-6为1-6拷贝串联表达载体双酶切结果；从图6可以看出，每个质粒都被酶切出两条明显的条带，虎纹克胰肽1-8拷贝基因片段明显，且大小与理论值相符。

5：多拷贝HWTX-XI定向多拷贝克隆的真核表达纯化

构建好的表达载体用SalⅠ单酶切24h使其线性化，用等体积的酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，再加入1/10体积的3M pH5.2醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，12000rpm离心5min，用70%乙醇洗涤2次，在超净台上吹干，用灭菌双蒸水溶解后稀释为终浓度为1μg/μL，取10μL以2kV，25μF，200Ω的条件下电转化至毕赤酵母GS115（购于Invitrogen公司，）。电击转化后，转化产物转移到5ml离心管于30℃静置1.5-2h，取0.1ml均匀涂布于含0.25mg/mL G418的YPD选择平板上，30℃培养5天。

将具有G418抗性的最初转化子菌落，通过影印法克隆到MM平板(1.34%YNB，4×10-5%biotin，0.5%methanol，1.5%agar)和MD平板(1.34%YNB，4×10-5%biotin，2%dextrose，1.5%agar)上，30℃培养3d，挑选在两种培养基上都生长良好的Mut+菌落。将筛选到的阳性重组子先经BMGY(2%蛋白胨、1%酵母浸出物、1.34%酵母氮源(Yeast Nitrogen Base,YNB)、0.4mg/L生物素、1%甘油、100mmol/L磷酸盐缓冲液)培养基培养至A600达到3-6，利用通用鉴定引物α-Factor和3’AOX进行菌液PCR鉴定。

其中通用鉴定引物α-Factor和3’AOX序列（Invitrogen公司合成）分别如下：

α-Factor：TACTATTGCCAGCATTGCTGC（SEQ ID NO:18）

3’AOX：GGCAAATGGCATTCTGACATCCT（SEQ ID NO:19）

PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，α-Factor和3’AOX引物(10μmol/L)各5μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。对检测出目的条带的菌株离心收集菌体重悬于BMMY(2%蛋白胨、1%酵母浸出物、1.34%YNB、0.4mg/L生物素、0.5%甲醇、100mmol/L磷酸盐缓冲液)培养基中进行28℃，250rpm诱导表达96小时，分别于24、48、72和96小时取2mL菌液，10000rpm 4℃离心5min，取上清离心进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果显示见图7，其中泳道M为Protein molecular marker，泳道1-4为单拷贝虎纹克胰素菌落诱导24、48、72和96h表达结果,重组虎纹克胰肽分子量大小与虎纹克胰肽的理论值相符。诱导表达结束后离心收集培养上清，-20℃冻存，用于纯化分析。

纯化：利用

purifier 100（General Electric）经阳离子纯化柱亲和层析纯化HWTX-XI重组蛋白。收集表达上清经DE52去除色素之后将pH值调到4.2左右，上CM-Sepharose阳离子交换柱进行分步洗脱分离，用0.5M NaCl洗脱，收集洗脱峰，经tricine-SDS-PAGE鉴定，结果和理论分子量一致。

6：重组虎纹克胰素活性鉴定：

用等温滴定量热法测定重组虎纹克胰肽的生物活性。活性结果显示，重组虎纹克胰肽与胰蛋白酶的结合位点数为1.021，解离常数为2.3×10^-10M，摩尔结合焓ΔH为-8.94kcal/mol，说明上述步骤所得的重组虎纹克胰肽具有生物活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门北大之路生物工程有限公司

<120> 一种重组虎纹克胰肽载体及其制备方法和用途

<130> P6791

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atagatacat gccgt 15

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tgcttttgca catctt 16

<210> 3

<211> 165

<212> DNA

<213> 虎纹捕鸟蛛毒腺

<400> 3

atagatacat gccgtttgcc ctctgaccgt gggagatgca aggcatcctt tgaacgttgg 60

tacttcaatg gcagaacatg cgctaagttt atttatggag gctgcggtgg caacggtaat 120

aagttcccaa ctcaagaggc ctgcatgaaa agatgtgcaa aagca 165

<210> 4

<211> 55

<212> PRT

<213> 虎纹捕鸟蛛毒腺

<400> 4

Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser

1 5 10 15

Phe Glu Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr

20 25 30

Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys

35 40 45

Met Lys Arg Cys Ala Lys Ala

50 55

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggcctgca taaaaagatg tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cacatctttt tatgcaggcc tc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gtcgacatga tagatacatg ccg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctttgttagc agccggatct cag 23

<210> 9

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atagatacat gccgtttgcc ctctgaccgt gggagatgca aggcatcctt tgaacgttgg 60

tacttcaatg gcagaacatg cgctaagttt atttatggag gctgcggtgg caacggtaat 120

aagttcccaa ctcaagaggc ctgcataaaa agatgtgcaa aagca 165

<210> 10

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Ile Asp Thr Cys Arg Leu Pro Ser Asp Arg Gly Arg Cys Lys Ala Ser

1 5 10 15

Phe Glu Arg Trp Tyr Phe Asn Gly Arg Thr Cys Ala Lys Phe Ile Tyr

20 25 30

Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gly Asn Lys Phe Pro Thr Gln Glu Ala Cys

35 40 45

Ile Lys Arg Cys Ala Lys Ala

50 55

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtcgacatga tagatacatg ccg 23

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tatctcgagc attgcttttg cacatct 27

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 15

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

atgctcgaca tgatagatac atgccgtttg ccctctgacc gtgggagatg caaggcatcc 60

tttgaacgtt ggtacttcaa tggcagaaca tgcgctaagt ttatttatgg aggctgcggt 120

ggcaacggta ataagttccc aactcaagag gcctgcataa aaagatgtgc aaaagcaatg 180

ctcgacatga tagatacatg ccgtttgccc tctgaccgtg ggagatgcaa ggcatccttt 240

gaacgttggt acttcaatgg cagaacatgc gctaagttta tttatggagg ctgcggtggc 300

aacggtaata agttcccaac tcaagaggcc tgcataaaaa gatgtgcaaa agca 354

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gcgaattcga catgatagat acat 24

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tagcggccgc ctagagcatt gcttttgcac a 31

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tactattgcc agcattgctg c 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ggcaaatggc attctgacat cct 23

Claims

1.一种虎纹克胰肽重组载体，包括1个或1个以上拷贝的虎纹克胰肽的重组载体，所述虎纹克胰肽的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。

2.一种制备权利要求1所述虎纹克胰肽重组载体的方法，其特征在于，包括如下步骤，

获得虎纹克胰肽基因；

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述获得虎纹克胰肽基因为得到成熟虎纹克胰肽的原始碱基序列；再通过引物引入突变位点，扩增得到突变的虎纹克胰肽基因序列。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述引物还引入了切割位点序列。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于，切割位点序列为根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，所述切割位点序列编码单个氨基酸或两个氨基酸或6个氨基酸，更优选地，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K；两个氨基酸为D-P或N-G；三个氨基酸为R-K-R或R-R-R；6个氨基酸为L-V-P-R-G-S。

6.根据权利要求4的方法，其特征在于，所述切割位点序列可被化学试剂或酶切割，优选地，化学试剂为溴化氰、甲酸或羟胺，酶试剂为胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶。

7.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述获得1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体为，以所述虎纹克胰肽基因为第一次扩增模板，使用含有一定双酶切位点的引物进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物进行双酶切，与同样双酶切的载体连接得到重组载体，即为1个拷贝数的虎纹克胰肽重组载体；

8.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述载体为可在原核表达系统中或真核表达系统中进行表达，优选地，原核表达系统为pET系统、pGEX系统或pMAL系统，所述真核表达系统为pPIC9K系统、pCMVp系统、pEGFP系统、pEGFT系统、pSV2系统或CMV4系统。

9.权利要求1所述的虎纹克胰肽重组载体或根据权利要求2所述方法制备的虎纹克胰肽重组载体用于制备药物的用途。