CN114276417A - 一种在植物正常生理条件下鉴定全基因组dna鸟嘌呤四联体位点的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在植物正常生理条件下鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法，该方法在植物正常生理条件下，利用可以在植物体内表达的且特异结合DNA鸟嘌呤四联体位点的优化蛋白，在全基因组水平鉴定基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的高能量测序方法，属于生物技术应用领域。该方法是首次利用在植物中表达的G4P蛋白，在植物生理条件下，在全基因组水平鉴定鸟嘌呤四联体位点的方法。整个方法流程简单，耗时较短，DNA片段化可视化效果强。因此，利用本方法提供的核苷酸序列和操作步骤，理论上可在全基因组水平鉴定多种植物的DNA鸟嘌呤四联体位点。

Description

一种在植物正常生理条件下鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体 位点的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在植物正常生理条件下鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法；该方法通过密码子优化获得一种可特异地结合植物基因组中鸟嘌呤四联体(G4)位点的核苷酸序列，并通过构建Flag标签融合蛋白表达载体和瞬时转化，应用于在植物生理条件下，鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点。

背景技术

鸟嘌呤四联体(G-quadruplex,G4)是由富含鸟嘌呤(G)的DNA序列折叠形成的DNA二级结构。1962年Gellert等人利用X-ray的方法，首次在体外观测到G4结构的存在(Gellert et al.,1962，PNAS，48:2013-2018)。在生物体的基因组中，富含鸟嘌呤的序列主要通过Hoogsteen氢键形成鸟嘌呤四分体，多个四分体堆叠形成稳定的鸟嘌呤四联体结构(Daniela et al.,2015,Nucleic Acids Res.43:8627-8637)。

基于生物信息分析的预测结果显示，G4主要分布在一些功能性基因组区域，如端粒区、基因启动子区、内含子与外显子边界区等(Daniela et al.,2015,Nucleic AcidsRes.43:8627-8637)，这暗示了G4结构具有潜在的生物学功能。最近的研究结果表明，G4在端粒的稳定性、DNA损伤修复(Hansel-Hertsch,et al.,2017,Nat Rev Mol Cell Biol,18：279-284)、基因表达调控(Rigo et al.,2017,Biochemistry,56：4309-4312)以及表观遗传调控(Belotserkovskii et al.,2017,Nucleic Acids Res,45：6589-6599)等一系列重要的生物学过程具有明显的调控作用。特别是近年来，G4作为肿瘤治疗的靶点成为人类疾病治疗及药物基因组学研究的新热点(Reed et al.,2019,Sensor Actuat B-Chem,282:945-951)。因此，G4结构及其作用分子机制的研究将有利于推动医学、动植物学以及作物学等领域相关研究的发展。

目前，基于免疫学方法的G4鉴定主要利用BG4、D1、G4P等抗体(Giulia Biffi,2013,Nature Chemistry,5:182-186；Zheng et al.,2020,Nucleic Acids Res.48:11706-11720)。基于这些抗体的ChIP(Chromatin immunoprecipitation)技术可以在人和动物全基因组水平鉴定G4结构。在生理状态下，Giulia等人应用BG4重组蛋白鉴定了人体多种不同细胞系的全基因组G4位点(Hansel-Hertsch,et al.,2018,Nat Protoc,13:551-564)。Zheng等利用人工合成的G4P序列，该序列可在体外特异结合G4结构，构建了细胞中表达载体，该载体含有G4P序列及两端分别加入核定位序列(NLS)和3X FLAG标签，利用活细胞瞬时表达G4P同时结合ChIP-seq方法，在不同细胞系中成功捕获了G4序列(Zheng et al.,2020,Nucleic Acids Res.48:11706-11720)。这些技术为在植物系统中研究G4结构提供了重要的基础，不过目前G4P在全基因组水平鉴定植物基因组中G4结构还未见报道。

本方法与最新在人细胞系里报道的G4P-ChIP-seq方法具有一定的相似性。该方法目前主要在人、老鼠和鸡活细胞中鉴定了G4序列(Zheng et al.,2020,Nucleic AcidsRes.48:11706-11720)。它与一般的ChIP-seq方法相似，不同点在于首先在活细胞中表达G4P蛋白，表达的G4P可与活细胞中的G4结构相结合；其次通过对细胞系进行交联处理，增加G4P和G4结构的结合程度，再提取染色质片段化后得到G4P-G4复合物，然后将复合物与anti-FLAG beads孵育并捕获G4P-G4复合物，再将该复合物从beads上洗脱下来，经RNase A处理除去RNA污染和Proteinase K处理去除蛋白质后，经酚仿抽提结合酒精沉淀，获得G4序列富集的DNA用于建库，经二代测序及生物信息学分析，最终鉴定了细胞系的全基因组G4位点。但该G4P能否用于植物基因组DNA G4序列鉴定，目前还不是十分清楚。

我们发展了一种基于瞬时表达的G4P-ChIP-seq方法，简称G4P-ChIP-seq。首先，将该方法成功应用于鉴定正常生理状态下烟草叶片全基因组DNA G4位点，并研究了其基因组的分布特征。该方法主要步骤包括：将来自于人基因组的G4P表达序列进行密码子优化，构建至瞬时表达载体pBIN-eGFP4中，形成G4P-3xFlag-eGFP4融合蛋白，将目标载体导入农杆菌，通过在烟草叶片中瞬时表达融合蛋白，并结合荧光显微镜观察确认目标蛋白的正常表达和亚细胞定位，收集G4P正常表达的烟草叶片进行1％甲醛交联固定，提取和纯化细胞核，经超声波处理将细胞核中染色质片段化成为100-500bp的片段，将片段化染色质与Anti-Flag抗体进行孵育，捕获G4P特异结合的G4序列，经洗脱，解交联，RNase A和Proteinase K处理后，经酚仿抽提和酒精沉淀等步骤，最终获得G4富集的ChIPed-DNA，通过建库测序和生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定了烟草叶片正常生理状态下的G4位点。主要技术流程见图1所示。

总之，该方法的发展，将进一步推动植物基因组G4结构及其生物学功能的研究，为在全基因组水平解析植物或作物农艺性状与G4结构动态变化之间的关系提供技术或方法基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经过密码子优化、可特异结合植物基因组鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白及其编码序列，通过瞬时转化，分析其在植物细胞中的表达及亚细胞定位情况，通过ChIP-seq方法在全基因组水平鉴定G4P蛋白结合的DNA G4序列，为在植物生理状态下，鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点提供新的技术或方法基础。

本发明的另一目的在于提供一种在植物正常生理条件下鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种密码子优化的可特异结合植物基因组中鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白编码序列，该编码序列具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

如上述的G4P蛋白编码序列在植物中表达的优化蛋白。该蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

含有上述G4P蛋白编码序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述G4P蛋白编码序列、含有上述G4P蛋白编码序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或者上述的优化蛋白在鉴定植物基因组鸟嘌呤四联体位点中的应用。

一种利用G4P重组蛋白鉴定植物基因组DNA G4位鉴定植物基因组鸟嘌呤四联体位点的方法，该方法为利用上述的密码子优化的可特异结合植物基因组中鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白编码序列编码的蛋白鉴定植物在正常生理条件下的全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点。

作为一种优选技术方案：该方法包括以下步骤：

(1)密码子优化G4P蛋白编码序列得到上述的可特异结合植物基因组中鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白编码序列；

(2)构建G4P-3xFlag-GFP4融合蛋白表达载体；

(3)表达载体的农杆菌转化；

(4)农杆菌接种菌液的制备和植物的注射接种；

(5)共聚焦显微镜确认重组蛋白的表达和亚细胞定位；

(6)交联固定植物材料；

(7)提取并纯化植物材料的细胞核；

(8)对细胞核内染色质进行片段化处理；

(9)将Anti-Flag抗体加入到染色质片段化产物中，过夜反应得到ChIP反应复合物；

(10)回收过夜反应后由抗体-G4蛋白-DNA形成的ChIP反应复合物；

(11)从beads上洗脱ChIP反应复合物，解交联过夜，经酚仿抽提同时结合醇沉法回收DNA片段；

(12)将经过G4P富集的DNA片段进行建库和Illumina测序，经生物信息学分析在全基因组水平鉴定G4位点。

我们以人工合成的G4P蛋白质的氨基酸序列为基础，根据水稻基因组的密码子使用偏好性对其进行了密码子优化处理，人工合成了可用于植物细胞里表达的G4P序列，该序列包含两个G4结合结构域及位于两个结构域中间的18个氨基酸连接区，序列特征如SEQ IDNO.1所示。

我们以G4P氨基酸序列为基础，在其N端添加核定位信号序列(nuclearlocalization signal,NLS)，在其C端添加3xFLAG标签序列，该序列共编码105个氨基酸，序列特征如SEQ ID NO.2所示。

将上述编码105个氨基酸的核苷酸序列进行PCR扩增，PCR产物检测结果如图2的胶图所示。将上述PCR产物克隆至表达载体pBIN-eGFP4上，形成NLS-G4P-3xFlag-eGFP4的融合蛋白表达载体，构建成功的载体图如图3所示。将构建好的载体转化农杆菌，得到重组农杆菌，阳性菌液PCR检测结果如图4所示。将上述菌液摇菌、收集菌体和乙酰丁香酮处理，注射烟草叶片。取注射两天后的烟草叶片进行共聚焦显微镜观察，以融合mCherry红色荧光的细胞核定位蛋白为标记，确认重组蛋白已正常表达并定位于细胞核中，重组蛋白定位于细胞核中的结果如图5所示。

经显微镜观察确认G4P正常表达后，收集其叶片进行1％甲醛进行交联固定，提取并纯化叶片材料的细胞核，并经超声波破碎处理片段化细胞核内染色质，超声波对DNA的片段化效果如图6所示。加入Anti-Flag抗体过夜孵育，回收抗体-重组蛋白G4P-G4 DNA复合物。

经过洗脱、解交联、RNaseA和蛋白酶处理、DNA纯化等步骤，最终获得富集G4结构的DNA片段。能够构建测序文库和测序，其中Illumina测序文库胶图如图7所示。通过生物信息学分析，从而鉴定烟草叶片正常生理状态下的全基因组DNA G4位点，G4位点的可视化图如图8所示。

本发明所述技术方案的详细步骤为：

(1)G4P表达序列的密码子优化：

以人工合成的G4P蛋白的氨基酸序列为基础，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，优化了可以在水稻中表达G4P的核酸编码序列，序列如SEQ ID NO.3所示。随后，在G4P蛋白的N端添加核定位信号序列，在C端添加3xFlag标签序列，构建了包含105个氨基酸的NLS-G4P-3xFlag重组蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示。根据水稻基因组的密码子偏好性，以NLS-G4P-3xFlag重组蛋白为模板，人工合成了其核苷酸编码序列，序列如SEQ ID NO.4所示。

(2)构建G4P-3xFlag-eGFP4融合蛋白表达载体

以NLS-G4P-3xFlag重组蛋白编码序列为模板，设计引物进行PCR扩增，在Forward引物和Reverse引物5’端分别引入酶切位点和侧翼序列。将pBIN-eGFP4载体用相应的内切酶进行酶切，与PCR扩增产物进行重组，并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞。经过含有卡那霉素的LB平板筛选后，挑取菌斑摇菌和PCR检测，并选取阳性菌株送公司测序。选取测序正确的菌株进一步扩大摇菌，提取质粒备用。

(3)表达载体的农杆菌转化

将重组质粒DNA加入到GV3101农杆菌感受态细胞液中，进行农杆菌转化。经过含有卡那霉素和利福平的LB平板筛选后，挑取菌斑摇菌和PCR检测。选取PCR检测阳性克隆，加入终浓度为15％甘油保存于-80℃冰箱备用。

(4)农杆菌接种菌液的制备和烟草的注射接种

将上述保存的含有重组质粒的农杆菌划线，接种于含有卡那霉素和利福平的LB固体培养基上培养，挑取单克隆接种于含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基进行摇菌，并进一步扩大摇菌。待菌液培养至OD600为0.5左右，离心收集菌体，用重悬液重悬菌体至终浓度为0.6，重悬液置于室温黑暗条件下静置3h。载体pCAMBIA2300-35S::H2B-mCherry是组蛋白H2B编码基因与mCherry融合表达载体，作为细胞核定位的marker。将pBIN-35S::NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组质粒阳性菌液与pCAMBIA2300-35S::H2B-mCherry菌液等比例混合，用于注射共转化接种。

将培养至4片真叶期的烟草用于农杆菌注射。用去针头的注射器吸取农杆菌菌液，从烟草叶片背面注入农杆菌菌液，以整个叶面出现水泽状为佳，说明菌液已成功注射至子叶。将注射后的烟草进行12小时暗处理，随后进行正常光照周期培养2天。

(5)共聚焦显微镜确认重组蛋白的表达和亚细胞定位

用刀片取少量烟草叶片，制作切片，固定于载物台。用eGFP4荧光蛋白激发光进行观察，确认NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组蛋白已正常表达。用mCherry蛋白激发光进行荧光观察，确认eGFP4绿色荧光与mCherry红色荧光共定位于细胞核中。

(6)植物材料交联

选取3g需要G4P瞬时表达的实验材料，剪成碎片(宽度约0.2cm)浸泡于1％的甲醛交联固定液中，在真空条件于4℃交联10分钟。向交联固定液中加入终浓度为125mM的甘氨酸溶液，在4℃条件下继续真空处理5分钟。用灭菌蒸馏水冲洗3次，吸干水分，将交联后的叶片用锡铂纸包裹后，于液氮中速冻10分钟，放置于-80℃冰箱中保存备用。

(7)提取并纯化交联材料的细胞核：将交联后的叶片用液氮研磨成粉末，取10ml粉末用于细胞核提取和纯化。往粉末中加入等体积核提取缓冲液(H1B)，搅拌成匀浆后将离心管平放于冰上振荡。将匀浆离心过滤，弃上清，加入H1B Washing Buffer并重悬细胞核，然后上下轻轻颠倒混匀，离心12分钟，重复该步骤3次，所得沉淀为纯化的细胞核。用RSB缓冲液重新悬浮细胞核，离心并保留沉淀，即为纯化后的细胞核。

(8)对纯化后细胞核染色质进行片段化处理：向纯化后的细胞核中加入lysisbuffer重悬细胞核，用经过预冷的非接触式超声波破碎仪高能破碎7～13个循环。取10μl混合物经快速解交联法提取DNA，用琼脂糖凝胶检测超声波片段化效果。

(9)将Anti-Flag抗体加入到片段化的染色质溶液中，于4℃过夜反应，得到Anti-Flag-G4P-G4 DNA反应复合物：选取片段化效果在100～500bp均匀分布的反应，离心、取上清，用ChIP buffer配置成2,000μl体系，取1/20体积的反应混合液作为Input，并于4℃保存。其余混合液按照每个反应取950μl染色质加入30μl Anti-Flag抗体。将反应混合物放置于混匀仪上，于4℃，10rpm旋转反应过夜。

(10)回收Anti-Flag-G4P-G4 DNA反应复合物；

重悬保存在冰箱中的protein G beads，并按照40μl每个反应分装beads到新的离心管中。用1ml经过预冷的1×ChIP Buffer重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，弃去上清，重复3次。将过夜反应ChIP反应混合液加入到beads中，低温混匀反应5h；用磁板收集beads，弃去ChIP反应液。

(11)从beads上洗脱ChIP反应复合物，过夜解交联之后，用醇沉法回收DNA片段：用Washing buffer重悬beads，静止1分钟后用磁板收集beads并弃去上清液，重复此步骤3次。用Elution buffer在65℃水浴条件下，洗脱结合在beads上的Anti-Flag-G4P蛋白-DNA复合物，每次保温10min，洗脱2次，取上清于1个新的离心管中，此时取出保存在冰箱中的Input，与洗脱的DNA一并加入终浓度为0.2M NaCl中，于65℃保温反应解交联过夜。次日加入Proteinase K，在55℃条件下消化1h。反应完成后，用酚仿抽提，离心后取上清液加入1/10体积(V)的3M醋酸钠，20μg Glycogen和2.5倍体积的预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱放置1h，离心并用70％酒精清洗DNA沉淀，等DNA沉淀晾干后溶解于1XTE buffer。溶解后的DNA放置于-20℃冰箱中保存或直接进行下一步实验。

(12)将经过富集的G4 DNA片段进行建库和Illumina测序，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定G4位点：取出7μl经ChIP富集的DNA用于构建Illumina测序文库，分离并纯化200-600bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序。

与现有的方法相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供了一个新的G4P蛋白编码序列，该序列已进行过密码子优化，包含192个碱基，序列如SEQ ID NO.3所示，编码G4P蛋白，可在植物中进行高效表达。

(2)通过在G4P蛋白N端增加核定位信号序列NLS，使G4P蛋白能够在植物叶片中高效表达，且定位于细胞核中。

(3)将G4P蛋白在烟草叶片中瞬时表达后，通过ChIP-seq技术可以有效富集基因组DNA鸟嘌呤四联体位点，表明G4P蛋白可以在正常生理条件下，鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点。

(4)本发明所优化的G4P蛋白编码序列可在植物正常生理状态下表达，该结果至今未见过报道，表达的G4P蛋白能在全基因组水平有效、特异结合并鉴定DNA中鸟嘌呤四联体位点。

附图说明

图1.G4P-ChIP-seq方法主要步骤流程图。

图2.NLS-G4P-3xFlag蛋白编码序列PCR产物检测胶图。

图3.构建的瞬时表达载体pBIN-NLS-G4P-3xFlag-eGFP4载体图谱。

图4.重组农杆菌检测胶图。

图5.NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组蛋白在烟草叶片中的表达及亚细胞定位图。

图6.超声波破碎烟草基因组染色质DNA的琼脂糖电泳检测图。

图7.Illumina测序文库的PCR胶图。

图8.烟草叶片G4位点的可视化图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

实施例1：

(1)G4P表达序列的密码子优化：

我们以人工合成的G4P蛋白质的氨基酸序列为基础，根据水稻基因组的密码子使用偏好性对其进行了密码子优化处理，人工合成了可用于植物细胞里表达的G4P序列，该序列包含两个G4结合结构域及位于两个结构域中间的18个氨基酸连接区，序列特征如SEQ IDNO.1所示。

我们以G4P氨基酸序列为基础，在其N端添加核定位信号序列(nuclearlocalization signal,NLS)，在其C端添加3xFLAG标签序列，该序列共编码105个氨基酸，序列特征如SEQ ID NO.2所示。

以G4P蛋白和添加核定位信号序列NLS、3xFlag标签的NLS-G4P-3xFlag重组蛋白为模板(序列如SEQ ID NO.2所示)，根据水稻基因组的密码子偏好性，对重组蛋白的核苷酸编码序列进行优化(序列如SEQ ID NO.4所示)，人工合成了该编码序列。核苷酸编码序列由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

(2)构建G4P-3xFlag-eGFP4融合蛋白表达载体

以NLS-G4P-3xFlag重组蛋白编码序列为模板，设计引物进行PCR扩增，在Forward引物5’端引入Kpn I酶切位点和15bp侧翼序列，在Reverse引物5’端引入BamH I酶切位点和15bp侧翼序列，所用引物G6321F/R序列见表1，PCR产物扩增结果如图2所示。将pBIN-eGFP4载体(Liu et al.,2014,Nat Commun,5:4686)用Kpn I和BamH I内切酶进行双酶切，酶切载体片段纯化后与PCR扩增产物进行重组，并将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5a。经过含有卡那霉素的LB平板筛选后，挑取菌斑摇菌和PCR检测，所用引物PBF/R序列见表1，选取阳性菌株送公司测序，构建好的重组载体如图3所示。选取测序正确的菌株进一步扩大摇菌，提取质粒备用。

表1：扩增所用引物

(3)pBIN-NLS-G4P-3xFlag-eGFP4表达载体的农杆菌转化

取1μg构建好的pBIN-NLS-G4P-3xFlag-eGFP4质粒DNA加入到100μL的农杆菌GV3101感受态细胞中，冰上放置30min；然后于液氮下速冻处理5min；取出后立即放于37℃水浴热激5min；加入1mL不加抗生素的液体LB培养基，于28°摇床220rpm振荡培养复苏2h；6000rpm离心处理2min后，把沉淀悬浮于100μL的剩余的液体LB中；菌液均匀涂布于含有卡那霉素(50μg mL^-1)和利福平(25μg mL^-1)的LB固体培养基上，28℃下倒置培养2～3天；然后从平板上挑取阳性单菌落于1mL包含卡那霉素的液体LB培养基中，28℃摇床上培养1～2天；菌液PCR检测菌液，所用引物PBF/R序列见表1，检测结果如图4所示。检测的阳性克隆农杆菌中加入终浓度为15％的甘油保存于-80℃备用。

(4)农杆菌接种菌液的制备和烟草的注射接种

将上述保存的含有pBIN-NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组质粒的农杆菌划线接种于含有卡那霉素(50μg mL^-1)和利福平(25μg mL^-1)的LB固体培养基上培养2-3天，挑取单克隆接种于含有卡那霉素(50μg mL^-1)和利福平(25μg mL^-1)的LB液体培养基中28℃震荡培养48h。待菌液培养至OD600为0.5左右，3,000rpm离心10min收集菌体。用重悬液重悬浮3次。最终调节菌液浓度使OD600为0.6，室温黑暗条件下静置3h。载体pCAMBIA2300-35S::H2B-mCherry(由pCAMBIA2300质粒改造，是组蛋白H2B编码基因与mCherry融合表达载体)，为细胞核定位的marker。将pBIN-35S::NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组质粒阳性菌液与p2300-35S::H2B-mCherry菌液等比例混合，用于注射共转化接种。

将培养至4片真叶期的烟草用于农杆菌注射。用去针头的注射器吸取农杆菌菌液1ml，从烟草叶片背面注入农杆菌菌液，每棵烟草注射中部2片叶子，以整个叶面出现水泽状为佳。将注射后的烟草进行12小时暗处理，随后进行16h光生长与8h暗培养循环生长2天。

所述重悬液的配方为：10mM MgCl₂,10mM MES,pH 5.7,150μM乙酰丁香酮。

(5)共聚焦显微镜确认重组蛋白的表达和亚细胞定位

用刀片取少量烟草叶片，制作切片，固定于载物台。使用激光共聚焦显微镜(ZeissLSM 780,Germany)进行荧光观察。首先用eGFP4荧光蛋白激发光进行观察，确认NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组蛋白已正常表达。随后用mCherry蛋白激发光进行荧光观察，确认eGFP4绿色荧光与mCherry红色荧光共定位于细胞核中。NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组蛋白与H2B-mCherry蛋白共定位于细胞核的结果如图5所示。

(6)植物材料交联

选取3g经激光共聚焦显微镜确认G4P正常表达的烟草叶片，剪成约0.2cm的条状碎片浸泡于终浓度为1％甲醛(v/v)的交联固定液中，在真空条件于4℃交联10min。向交联固定液中加入终浓度为125mM的甘氨酸溶液，在4℃条件下真空处理5min。弃去所有交联固定液，用灭菌的蒸馏水冲洗3次，将所有叶片置于吸水纸上，于空气中干燥10min，待所有叶片表面水份吸干后，将交联后的叶片用锡铂纸包裹后于液氮中速冻10min，将叶片取出放置于-80℃冰箱中保存备用。

所述交联固定液的配方为：50mM HEPES(试剂pH＝7.5)、1mM EDTA(试剂pH＝8.0)、0.1M NaCl、1mM PMSF和终浓度为1％(v/v)的甲醛；

所述甘氨酸溶液的终浓度为125mM。

(7)提取并纯化交联材料的细胞核：

将固定交联后的叶片用液氮研磨成粉末，取10ml粉末用于提取细胞核。向样品中加入等体积核提取缓冲液(H1B)，搅拌成匀浆后将离心管平放于冰上，在摇床于100rpm摇晃6min。将匀浆过滤于新的50ml离心管中，4℃，3,000rpm升降速为8离心12min。弃去上清，加入2ml H1B Washing Buffer(HIBW)，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用3ml HIBW冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同1个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀3至5次，3,000rpm升降速为8离心12min，重复该步骤3次，直到细胞核颜色为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。用5ml的RSB缓冲液重新悬细胞核，4℃，3,000rpm升降速为8离心12min，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。用400μl的RSB缓冲液重新悬浮细胞核，并将细胞核转移到1个新的1.5ml离心管中；4℃，3,000rpm升降速为8离心12min，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。

所述核提取缓冲液H1B的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mM spermine、40％(v/v)Glycerol、0.1％(v/v)Mercaptoethanol；

所述细胞核清洗液H1BW的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mM spermine、40％(v/v)Glycerol、0.1％(v/v)Mercaptoethanol、0.5％(v/v)TritonX-100；

所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl(试剂pH＝7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl2。

(8)对细胞核染色质进行片段化处理

将纯化后细胞核重新悬浮于200μl Lysis Buffer中，将样品放置于经4℃预冷的非接触式超声波破碎仪支架上(超声波破碎仪的参数设置为High能量，30s开启，30s停止为一个循环)，高能量处理7～13个循环。

染色体片段化状况检测：从超声破碎的缓冲液中取出10μl用lysis buffer配制到50μl体系，100℃快速解交联，随后用Proteinase K处理后，用酚仿抽提，取上清液用醋酸钠和无水乙醇进行沉淀，用70％酒精清洗离心后的DNA沉淀，晾干后溶解于1XTE buffer。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测超声波片段化效果。

超声波破碎烟草基因组DNA的琼脂糖电泳检测结果如图6所示。选取DNA均匀分布在100-500bp间的反应，于12,000rpm,4℃离心10min，取上清液于1个新的2ml离心管中。

所述Lysis Buffer的配方为：10mM Tris-HCl,5mM EDTA,150mM KCl,0.5mM DTT,0.5％NP-40,及终浓度为1％的SDS(w/v，g/100ml)。

(9)将Anti-Flag抗体加入到片段化染色质溶液中，于4℃过夜反应得到Anti-Flag-G4P-G4 DNA ChIP反应复合物：

选取片段化效果在100～500bp均匀分布的反应，离心、取上清。配置好2×ChIPBuffer，并按照比例加入至上述染色质混合液中，配置成终浓度为1×ChIP反应混合液，最终反应体积为2,000μl；取1/20体积的反应混合液作为Input，并于4℃保存。其余混合液按照每个反应取950μl染色质加入30μl Anti-Flag抗体。将反应混合物放置于混匀仪上，于4℃，10rpm旋转反应过夜。

所述ChIP Buffer的配方为：10mM Tris-HCl,5mM EDTA,150mM KCl,0.5mM DTT,0.5％NP-40,pH＝7.4。

(10)回收抗体-G4P蛋白-G4 DNA的ChIP反应复合物

重悬保存在冰箱中的Anti-Flag beads，并按照40μl每个反应分装beads到新的离心管中。用1ml经过4℃预冷的1×ChIP Buffer重悬beads，静置1min后用磁板回收beads，弃去上清，重复3次；最后1次尽量去除上清，将过夜反应的ChIP反应混合液加入到beads中，4℃，10rpm反应5h；用磁板收集beads，弃去ChIP反应液。

(11)从beads上洗脱ChIP反应复合物，解交联过夜后，用醇沉法回收DNA片段

用1ml经过预冷的Washing Buffer重悬beads，静止1min后用磁板收集beads并弃去上清液，重复此步骤3次；最后1次尽量除去上清；用200μl Elution Buffer在65℃水浴条件下，将结合在beads上的抗体DNA复合物洗脱，每次反应10min，洗脱2次，取上清于1个新的离心管中。取出保存在冰箱中的Input，与洗脱的DNA一并加入16μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)，于65℃保温解交联反应过夜。次日加入3μl Proteinase K，在55℃条件下，反应1h，反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)抽提后，12,000rpm，4℃离心10min，取上清于1个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC，20μg Glycogen，2.5倍体积经预冷的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃冰箱中放置1h后，12,000rpm，4℃，离心15min，回收DNA，用75％乙醇洗沉淀两次，室温晾干后，用17μl 1XTE buffer溶解DNA。溶解后的DNA放置在-20℃冰箱中保存或直接进行下一步实验。

所述解交联试剂的配方为：终浓度为0.2M的NaCl，解交联反应条件为65℃反应过夜。

所述的Washing Buffer配方为：10mM Tris-HCl,150mM KCl,1％(v/v)Tween20。

所述的Elution Buffer配方为：0.1M NaHCO₃,1％SDS(w/v，g/100ml，质量百分比，原始SDS溶液的质量百分比为20％)。

(12)将经过富集的G4 DNA片段进行建库和Illumina测序，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定DNA G4位点。

取出7μl经检测符合要求的ChIP富集的DNA用于构建Illumina测序文库，具体实验方案按照试剂盒给出的实验方案操作，测序文库胶图如图7所示。分离纯化分布在200-600bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序，G4位点的可视化如图8所示。

实验结果显示：

(1)本实验所建立的G4P-ChIP-seq体系流程如图1所示

(2)PCR扩增NLS-G4P-3xFlag蛋白编码序列结果如图2所示

(3)构建的瞬时表达载体pBIN-NLS-G4P-3xFlag-eGFP4载体图谱如图3所示

(4)重组质粒转化后的农杆菌检测结果如图4所示

(5)注射烟草后，NLS-G4P-3xFlag-eGFP4重组蛋白在烟草叶片中的瞬时表达及亚细胞定位如图5所示

(6)超声波破碎烟草基因组DNA，DNA片段均匀分布在100～500bp范围内，结果如图6所示

(7)取适量的DNA用于构建Illumina测序文库，并纯化200-600bp大小片段，回收测序，文库构建检测如图7所示

(8)通过生物信息学分析，在全基因组水平鉴定DNA G4位点，G4位点的可视化效果图如图8所示。

本发明方法是首次利用在植物中表达的G4P蛋白，在植物生理条件下，在全基因组水平鉴定鸟嘌呤四联体位点的方法。整个方法流程简单，耗时较短，DNA片段化可视化效果强。因此，利用本方法提供的核苷酸序列和操作步骤，理论上可在全基因组水平鉴定多种植物的DNA鸟嘌呤四联体位点。

相关技术术语的名词解释

交联固定液：用于固定染色质上蛋白质和DNA的一种缓冲溶液。

核提取缓冲液(HIB)：用于提取细胞核的缓冲溶液。

核清洗液(H1BW)：用于纯化细胞核。

RNaseA：一种降解RNA的核糖核酸酶。

Glycogen：糖原。

Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷。

HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

EDTA：乙二胺四乙酸。

PMSF：苯甲基磺酰氟。

Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚。

mM：毫摩尔。

M:摩尔。

bp：碱基对。

Proteinase K：蛋白酶K，主要降解蛋白质。

DNA G4：基因组DNA上鸟嘌呤通过氢键形成的四螺旋结构

Illumina测序文库：基于第二代DNA测序技术而建立的DNA文库。

PCR：又称多聚酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。

qPCR：实时荧光定量核酸扩增检测系统

ChIP,Chromatin immunoprecipitation:染色质免疫沉淀

SEQ ID NO.1

人工合成的G4P蛋白序列

HPGHLKGREIGMWYAKKQGQKNKGTGSGAGTGSGAGTGSGAHPGHLKGREIGMWYAKKQGQKNK

SEQ ID NO.2

NLS-G4P-3xFlag蛋白序列

MPKKKRKVRSATMHPGHLKGREIGMWYAKKQGQKNKGTGSGAGTGSGAGTGSGAHPGHLKGREIGMWYAKKQGQKNKGTGSGADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK

SEQ ID NO.3

优化的G4P蛋白编码序列

CACCCAGGACATCTTAAGGGCCGCGAGATCGGCATGTGGTACGCCAAGAAGCAGGGCCAGAAGAACAAAGGCACAGGCTCTGGTGCTGGCACAGGTTCAGGCGCCGGAACAGGCTCCGGCGCTCATCCAGGCCACCTCAAAGGCAGAGAAATTGGAATGTGGTATGCGAAGAAACAAGGACAAAAGAACAAA

SEQ ID NO.4

优化的NLS-G4P-3xFlag蛋白编码序列

ATGCCGAAGAAGAAGCGCAAGGTCAGGTCCGCCACAATGCACCCAGGACATCTTAAGGGCCGCGAGATCGGCATGTGGTACGCCAAGAAGCAGGGCCAGAAGAACAAAGGCACAGGCTCTGGTGCTGGCACAGGTTCAGGCGCCGGAACAGGCTCCGGCGCTCATCCAGGCCACCTCAAAGGCAGAGAAATTGGAATGTGGTATGCGAAGAAACAAGGACAAAAGAACAAAGGCACCGGCAGCGGCGCTGACTACAAGGATCATGACGGCGATTACAAGGACCACGACATCGACTATAAGGACGACGACGACAAGTGA

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种在植物正常生理条件下鉴定全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Pro Gly His Leu Lys Gly Arg Glu Ile Gly Met Trp Tyr Ala Lys

1 5 10 15

Lys Gln Gly Gln Lys Asn Lys Gly Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Gly

20 25 30

Ser Gly Ala Gly Thr Gly Ser Gly Ala His Pro Gly His Leu Lys Gly

35 40 45

Arg Glu Ile Gly Met Trp Tyr Ala Lys Lys Gln Gly Gln Lys Asn Lys

50 55 60

<210> 2

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Arg Ser Ala Thr Met His Pro Gly

1 5 10 15

His Leu Lys Gly Arg Glu Ile Gly Met Trp Tyr Ala Lys Lys Gln Gly

20 25 30

Gln Lys Asn Lys Gly Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Gly Ser Gly Ala

35 40 45

Gly Thr Gly Ser Gly Ala His Pro Gly His Leu Lys Gly Arg Glu Ile

50 55 60

Gly Met Trp Tyr Ala Lys Lys Gln Gly Gln Lys Asn Lys Gly Thr Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp

85 90 95

Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

100 105

<210> 3

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacccaggac atcttaaggg ccgcgagatc ggcatgtggt acgccaagaa gcagggccag 60

aagaacaaag gcacaggctc tggtgctggc acaggttcag gcgccggaac aggctccggc 120

gctcatccag gccacctcaa aggcagagaa attggaatgt ggtatgcgaa gaaacaagga 180

caaaagaaca aa 192

<210> 4

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgccgaaga agaagcgcaa ggtcaggtcc gccacaatgc acccaggaca tcttaagggc 60

cgcgagatcg gcatgtggta cgccaagaag cagggccaga agaacaaagg cacaggctct 120

ggtgctggca caggttcagg cgccggaaca ggctccggcg ctcatccagg ccacctcaaa 180

ggcagagaaa ttggaatgtg gtatgcgaag aaacaaggac aaaagaacaa aggcaccggc 240

agcggcgctg actacaagga tcatgacggc gattacaagg accacgacat cgactataag 300

gacgacgacg acaagtga 318

Claims (8)

1.一种密码子优化的可特异结合植物基因组中鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白编码序列，其特征在于：该编码序列具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的G4P蛋白编码序列在植物中表达的优化蛋白。

3.含有权利要求1所述G4P蛋白编码序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求1所述G4P蛋白编码序列在鉴定植物基因组鸟嘌呤四联体位点中的应用。

5.权利要求2所述的优化蛋白在鉴定植物基因组鸟嘌呤四联体位点中的应用。

6.权利要求3所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在鉴定植物基因组鸟嘌呤四联体位点中的应用。

7.一种鉴定植物基因组鸟嘌呤四联体位点的方法，其特征在于：该方法为利用权利要求1所述的密码子优化的可特异结合植物基因组中鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白编码序列编码的蛋白鉴定植物在正常生理条件下的全基因组DNA鸟嘌呤四联体位点。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)密码子优化G4P蛋白编码序列得到如权利要求1所述的可特异结合植物基因组中鸟嘌呤四联体位点的G4P蛋白编码序列；

(2)构建G4P-3xFlag-GFP4融合蛋白表达载体；

(3)表达载体的农杆菌转化；

(4)农杆菌接种菌液的制备和植物的注射接种；

(5)共聚焦显微镜确认重组蛋白的表达和亚细胞定位；

(6)交联固定植物材料；

(7)提取并纯化植物材料的细胞核；

(8)对细胞核内染色质进行片段化处理；

(9)将Anti-Flag抗体加入到染色质片段化产物中，过夜反应得到ChIP反应复合物；

(10)回收过夜反应后由抗体-G4蛋白-DNA形成的ChIP反应复合物；

(11)从beads上洗脱ChIP反应复合物，解交联过夜，经酚仿抽提同时结合醇沉法回收DNA片段；

(12)将经过G4P富集的DNA片段进行建库和Illumina测序，经生物信息学分析在全基因组水平鉴定G4位点。

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