CN112941159A - 一种在全基因组水平鉴定植物基因组dna鸟嘌呤四联体位点的方法 - Google Patents

一种在全基因组水平鉴定植物基因组dna鸟嘌呤四联体位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点的方法，该方法包括如下步骤：(1)交联固定植物材料；(2)提取并纯化细胞核；(3)对细胞核内染色质进行片段化处理回收DNA片段；(4)将回收的DNA片段进行变复性反应；(5)制备IP反应复合物；(6)用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物；(7)从Beads上洗脱IPed DNA，回收DNA片段；(8)用qPCR方法检测DNA G4富集程度；(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序，经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。整个方法流程简单，耗时较短，DNA片段化可视化效果强，理论上适合应用于多数植物物种。

Description

一种在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体位点 的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用BG4重组蛋白在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体(G4)位点的新方法。
背景技术
在真核生物基因组中，双链或单链DNA中富含鸟嘌呤(G)的某些区域，通过形成Hoogsteen氢键来稳定四个鸟嘌呤的平面结构，多个鸟嘌呤结构能够形成一个三维立体的四鸟嘌呤柱状体结构，这种结构称为DNA鸟嘌呤四联体结构(G-quadruplex,G4)(Qu etal., 2018,Anal Chem,90:12051-12058)。
人类相关研究结果表明，G4结构在肿瘤基因的端粒维持、复制、转录和翻译等多种生物学过程中发挥着重要作用(Kumetar et al.,2011,Nucleic Acids Res.39:8005-8016)，特别是，G4在肿瘤端粒中生理功能相对比较活跃。但也有研究表明，DNA G4结构不仅广泛分布于癌变细胞中，而在正常细胞中也普遍存在。人体癌细胞系的研究表明，G4位点多集中在DNA端粒区并与DNA损伤修复机制可能有一定的相关性，表明DNA G4可能参与细胞对逆境胁迫下的防御反应，甚至参与到逆境损伤修复过程，从而推动了G4位点作为癌症治疗药物的靶标位点的应用转化研究。从而表明，G4是真核生物基因组中具有行使一定生物学功能的一种DNA高级结构，而不仅仅是冗余的基因组DNA序列。
目前，用于鉴定人类细胞系G4结构的ChIP(Chromatin immunoprecipitation)反应的抗体主要有BG4,D1等抗体(Giulia Biffi,2013,Nature Chemistry,5:182–186).最近，Giulia等人在人基因组中BG4蛋白末端连接FLAG标签，通过基因工程的方式制备出一种含有FLAG 标签的BG4重组蛋白，经研究发现，该重组蛋白对基因组DNA中的G4结构具有特异识别作用，最终将BG4-ChIP-seq方法成功应用于人体多种不同细胞系的全基因组的G4位点的鉴定(Hansel-Hertsch,et al.,2018,Nat Protoc,13:551-564)，从而为体外研究DNA G4结构提供了一种切实可行的方法。另外，现有的报道显示，基于DNA G4保守性核心序列(motif) 的DNA-G4-seq方法可适用于多物种全基因组G4结构鉴定，并且该方法首次运用于在植物拟南芥，但该方法是否同样适用于其他植物，特别是作物，还有待于进一步验证。不过迄今为止，基于ChIP-seq方法在全基因组水平鉴定植物G4位点的方法未见报道。
与本方法最接近的是G4 ChIP-seq。该方法目前主要在人类基因组成功应用。它与一般的ChIP反应体系大致相同(Hansel-Hertsch,et al.,2018,Nat Protoc,13:551-564)。首先需要对人细胞系进行交联处理，之后提取人体细胞系细胞核，用超声波Buffer重悬后对细胞核内染色质进行片段化处理，染色质破碎成为100-500bp的片段，然后将片段化的染色质与BG4 重组蛋白进行免疫沉淀应用，通过Anti-FLAG-Beads将含有G4结构的染色质DNA片段捕获并沉淀下来，再将G4富集的DNA从Beads上洗脱下来，用DNA纯化剂盒将经过解交联，回收经Proteinase K处理的ChIPed-DNA，通过建库测序以及生物信息学分析，最终在全基因组水平鉴定G4位点。人体细胞系应用BG4重组蛋白的BG4-ChIP-seq反应体系主要流程见附图1((Hansel-Hertsch,et al.,2018,Nat Protoc,13:551-564))。该方法主要在体内染色质水平进行G4位点鉴定，但在植物材料中是否适用还有待于进一步验证。
我们发展了一种基于人BG4重组蛋白的G4 DNA-IP(immunoprecipitation)-seq方法 (BG4-DNA-IP-seq)，并将该方法成功应用于在全基因组水平鉴定水稻，小麦和玉米的G4位点。该方法主要步骤包括：植物材料交联，提取和纯化细胞核，细胞核经超声波将染色质片段化成为100-500bp的片段，提取片段化染色质DNA并与BG4重组蛋白进行孵育，利用Anti-FLAG和Protein G Beads捕获BG4特异结合的含有G4结构的DNA片段，经洗脱，解交联，Proteinase K处理和酚仿抽提和酒精沉淀等步骤，最终获得G4富集的IPed-DNA，通过建库测序和生物信息学分析，从而在全基因组水平鉴定G4位点。主要技术流程见附图 2。
总之，该方法的发展和应用将有利于植物全基因组G4的生物学功能研究以及在农作物分子育种上的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用BG4重组蛋白在全基因组水平鉴定植物基因组DNA鸟嘌呤四联体(G4)位点的新方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNA G4位点的方法(BG4-DNA-IP-seq)，该方法主要包括如下步骤：
(1)交联固定植物材料；
(2)提取并纯化植物材料的细胞核；
(3)对细胞核内染色质进行片段化处理(利用超声波破碎仪片段化染色质)，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测超声波片段化效果，选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应，回收DNA片段；
(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer(GCB Buffer)中进行变复性反应(即变性及复性反应)；
(5)将IP Buffer加入到变复性产物中，继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物；
(6)用Protein G Beads回收过夜反应后由BG4重组蛋白与DNA形成的IP反应复合物；
(7)从Beads上洗脱IPed DNA，并用醇沉法回收DNA片段；
(8)用qPCR方法检测DNA G4的富集程度；
(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序，经生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。
作为一种优选技术方案，步骤(1)中交联固定植物材料的过程为：将植物材料剪碎(大小约1～2cm)后浸泡于交联固定液中，在真空条件下进行交联反应；再向交联固定液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理使多余的交联剂失活，最后得到交联固定的植物材料；用灭菌水多次清洗交联固定的植物材料，吸干表面的水分，将交联固定的植物材料用锡铂纸包裹后放置于液氮中进行速冻处理，最后将速冻材料取出于-80℃保存待用。
进一步优选的，步骤(1)中交联固定植物材料的详细过程为：将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下4℃交联8～15分钟；再向交联固定液中加入甘氨酸溶液后，在4℃条件下真空处理2～7分钟，倒掉交联固定液，无菌水洗材料三次，吸水纸吸干残留无菌水，用锡纸包裹并液氮速冻后保存在-80℃冰箱。
所述的交联固定液包括：50mM HEPES(试剂pH＝7.5)、1mM EDTA(试剂pH＝ 8.0)、0.1M NaCl、1mM PMSF和终浓度为1％(v/v)的甲醛；所述甘氨酸溶液的终浓度为 125mM。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中提取并纯化植物材料细胞核的过程为：将交联后的植物材料用液氮研磨成粉末后，往粉末中加入等体积核提取缓冲液，搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、弃去上清，再加入细胞核清洗液重悬细胞核离心弃上清液从而纯化细胞核，重复细胞核清洗直到细胞核颜色变成白色或淡黄色，用RSB缓冲液再次重悬细胞核，离心后弃尽上清，保留沉淀得到纯化的细胞核。
所述核提取缓冲液H1B的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mM spermine、40％(v/v)Glycerol、0.1％(v/v)Mercaptoethanol；所述细胞核清洗液H1BW的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mM spermine、40％(v/v)Glycerol、0.1％(v/v)Mercaptoethanol、0.5％(v/v)Triton X-100；
所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl(试剂pH＝7.4)、10mM NaCl、3mM MgCl2。
作为一种优选技术方案，步骤(3)中对细胞核内染色质进行片段化处理的过程为：将纯化后的细胞核充分重悬于200μl Lysis缓冲液中，用非接触式超声波破碎仪处理细胞核悬浮液3～15个循环(将经过4℃预冷的超声波破碎仪的参数设置为High能量，30s开启，30 s停止为一个循环)，取1/20体积的混合液经快速解交联法提取DNA，检测片段化程度，如果经过片段化处理的DNA均匀的分布在100～500bp，用lysis buffer将片段化混合液配置成400μl体系，再向混合液中加入解交联试剂，于65℃水浴反应过夜进行解交联反应；第二天向反应液中加入RNase A，于37℃水浴中孵育，然后再加入Proteinase K，于55℃水浴中孵育；用等体积的酚仿(1:1)抽提离心后保留上清液并加入20μg Glycogen，1/10体积的 3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置1h后，离心回收 DNA，DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，再用EB(10mM Tris-HCl pH＝8.0)溶解。
进一步优选的，所述裂解缓冲液的配方为50mM Tris-HCl、10mM EDTA及终浓度为1％的SDS(w/v，g/100ml)(原始SDS溶液的质量百分比为20％，用该原始SDS溶液配置裂解缓冲液)。
进一步优选的，所述解交联试剂的配方为：终浓度为0.2M的NaCl，解交联反应条件为 65℃反应过夜。其中所涉及的所有的细胞核提取配方见表1。
作为一种优选技术方案，步骤(4)中变复性的详细方法为：将步骤(3)回收的经过片段化处理的基因组DNA(即DNA片段)，取出5μg，在变复性Buffer中煮沸3～8min，之后停止加热，做好保温工作，放置过夜使溶液温度慢慢降至室温。
进一步优选的，所述变复性Buffer的配方为：150mM KCl,40％PEG200(w/v， g/100ml，原始PEG200溶液浓度为1.128g/ml，采用该原始PEG200溶液配置变复性Buffer),10mM Tris-HCl,pH＝7.5。
作为一种优选技术方案，步骤(5)中IP反应的详细步骤为，制备2x IP Bμffer，并按照比例加入到经过过夜处理的DNA片段中，终浓度为1x IP反应液，在加入BG4重组蛋白前，取1/10体积的IP反应混合液作为Input。保存Input后，向IP反应复合液中加入BG4 重组蛋白，在混匀仪上于4℃，10rpm反应7h后，向反应体系中加入等量的Anti-FLAG抗体过夜反应。
进一步优选的，所述的相关IP Buffer配方为：50mM HEPES,150mM KCl,1mMMgCl2,130nM CaCl2,1％BSA(w/v，g/100ml),40％PEG200(w/v，g/100ml，原始PEG200溶液浓度为1.128g/ml),10mM Complete mini,pH＝7.5。
作为一种优选技术方案，步骤(6)中用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物的过程为：重悬保存在冰箱中的Protein G Beads，按照40μl每个反应分装Beads到新的离心管中。用4℃预冷的1xIP Buffer重悬Beads，静置1min后用磁板回收Beads，弃去上清；重复三次，最后一次尽量去除上清，将反应过夜IP反应混合液加入到Beads中，在混匀仪上4℃，10rpm反应5h；用磁板收集Beads，弃去IP反应液。
作为一种优选技术方案，步骤(7)中洗脱并回收IPed DNA的详细步骤为：用1ml经过4度预冷的Washing Buffer重悬Beads，静止1min后用磁板收集Beads并弃去上清液，重复此步骤三次；最后一次尽量除去上清；用200μl Elution Buffer在65℃水浴条件下，将结合在Beads上的BG4-DNA复合物洗脱，每次反应10min，洗脱两次，合并两次上清于一个新的离心管中，此时取出保存在冰箱中的Input，与洗脱的DNA一并加入Proteinase K，在55℃条件下消化1h，反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)抽提后，12,000rpm，4℃离心 10min，取上清于一个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC，20μg Glycogen， 2.5倍体积经预冷的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃冰箱中放置1h后，12,000rpm，4℃离心15min；用75％乙醇洗沉淀两次，室温晾干后，用17μl EB溶解DNA。
进一步优选的，所述的Washing Buffer配方为：10mM Tris-HCl,150mM KCl,1％(v/v) Tween20。
进一步优选的，所述的Elution Buffer配方为：0.1M NaHCO3,1％SDS(w/v，g/100ml，质量百分比，原始SDS溶液的质量百分比为20％)。
作为一种优选技术方案，步骤(8)的详细操作方法为：选定一个G4位点以及一个非G4位点分别设计引物，所扩增片段大小为100-150bp。取1μl Input DNA，2μl IPed-DNA，作为模板，分别稀释三倍后，分别用正负引物做qPCR，用2(ΔΔCt)的方法计算富集倍数，选取正负引物倍数比大于5的反应进行下一步实验。
作为一种优选技术方案，步骤(9)的详细操作方法为：步骤(8)中回收DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序的详细方法为：将步骤(8)符合要求的IP DNA用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-600bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序平台进行2x150 PE测序。
表1.核提取缓冲液的配方
Figure BDA0002861937740000051
Figure BDA0002861937740000061
注：所使用的SDS为质量百分比，原始SDS溶液为质量百分比为20％的SDS溶液
Lysis：裂解缓冲液；H1B：细胞核提取缓冲液；H1BW：细胞核清洗缓冲液；RNase A：核糖核酸酶A；Proteinase K：蛋白酶K；Glycogen：糖原；Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷； pH:酸碱度；KCl：氯化钾；CaCl2：氯化钙；MgCl2：氯化镁；HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；EDTA：乙二胺四乙酸；PMSF：苯甲基磺酰氟；Spermidine；亚精胺；spermine：精胺；Glycerol:甘油；Mercaptoethanol：巯基乙醇；Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚；mM：毫摩尔；M:摩尔；测序；bp：碱基对。
本发明所述方法最优选技术方案的详细步骤为：
(1)植物材料交联
选取2-5g需要供试的实验材料(水稻、小麦、玉米或拟南芥)，剪成碎片(大小约 1～2cm)浸泡于交联固定液中，在真空条件于4℃交联10分钟。
向交联固定液中加入2M的甘氨酸溶液使其终浓度为125mM，在4℃条件下真空处理5分钟。
弃去所有交联固定液，用灭菌的蒸馏水冲洗三次，将所有叶片置于吸水纸上，于空气中干燥10分钟，待所有叶片表面水分吸干后，将交联后的叶片用锡铂纸包裹后，于液氮中速冻10分钟，将叶片取出放置于-80℃冰箱中保存待用。
(2)提取并纯化植物材料的细胞核：将交联后的叶片用液氮研磨成粉末，取10ml的粉末用于提取细胞核。往粉末中加入等体积核提取缓冲液(H1B)，搅拌成匀浆后将离心管平放于冰上100rpm摇晃6分钟。
将匀浆过滤于一个新的50ml离心管中，4℃，3,000rpm升降速为8离心12分钟。弃去上清，加入5ml H1B Washing Buffer，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用H1B Washing Buffer冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同一个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀三至五次，3,000rpm升降速为8离心12分钟，重复该步骤三次，直到细胞核颜色为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。
用5ml的RSB缓冲液重新悬细胞核，3,000rpm升降速为8离心12分钟，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。用400μl RSB buffer重悬细胞核，并转移到1.5ml离心管中；4℃， 3,000rpm升降速为8离心12分钟，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。
(3)向纯化后的实验材料的细胞核中加入200μl lysis buffer重悬细胞核，在经过预冷的非接触式超声波破碎仪器中高能破碎7～13个循环。
从中取出10μl混合液经快速解交联法提DNA检测破碎状况：先将取出的混合液用lysis buffer配制到50μl体系，100℃快速解交联10min，之后用Proteinase K在55℃下处理 10min，用等体积的酚仿(1:1)抽提一次，保留上清液并加入20μg Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱放置1h沉淀DNA，离心后DNA沉淀用70％酒精清洗后，于空气中干燥5分钟，用20μl EB溶解DNA。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测超声波片段化效果。
选取片段化效果在100～500bp均匀分布的反应，将反应体系用lysis buffer配置成400 μl体系，加入16μl 5M NaCl(终浓度为0.2M)混合均匀后，65℃反应过夜解交联。
次日，向反应体系中加入3μl RNaseA,37℃反应1h；加入7μl Proteinase K混合均匀后，55℃反应2h；反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)混合均匀后，12,000rpm，4℃离心10min，取上清于一个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC，20μg Glycogen，2.5倍体积经预冷的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃冰箱中放置1h后， 12,000rpm，4℃，离心15min；用75％乙醇洗沉淀两次，干燥后，用20μl EB溶解DNA并测量浓度。
(4)取5μg DNA溶解于100μl变复性Buffer中煮沸5min后停止加热，做好保温工作，放置过夜使溶液温度慢慢降至室温。
(5)次日，用新配置的2xIP Buffer，并按照比例加入到经过过夜处理的DNA片段中，配置成1xIP反应液，并在加入BG4重组蛋白前，取1/10体积的反应复合液作为 Input。保存Input后，向IP反应复合物中加入适量BG4重组蛋白，4℃，10rpm反应7h 后，向反应体系中加入等量的Anti-FLAG抗体反应过夜。
(6)重悬保存在冰箱中的Protein G Beads，并按照40μl每个反应分装Beads到新的离心管中。用1ml经过预冷的1xIP Buffer重悬Beads，静置1min后用磁板回收Beads，弃去上清，重复三次；最后一次尽量去除上清，将过夜反应IP反应混合液加入到Beads中， 4℃，10rpm反应5h；用磁板收集Beads，弃去IP反应液。
(7)用1ml经过预冷的Washing Buffer重悬Beads，静止一分钟后用磁板收集Beads并弃去上清液，重复此步骤三次；最后一次尽量除去上清；用200μl Elution Buffer在65℃水浴条件下，洗脱结合在Beads上的BG4-DNA复合物，每次反应10min，洗脱两次，取上清于一个新的离心管中，此时取出保存在冰箱中的Input，与洗脱的DNA一并加入Proteinase K，在55℃条件下消化1h，反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)抽提后， 12,000rpm，4℃离心10min，取上清于一个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC，20μg Glycogen，2.5倍体积经预冷的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃冰箱中放置1h 后，12,000rpm，4℃，离心15min；用75％乙醇洗沉淀两次，干燥后，用17μl EB溶解 DNA。溶解后的DNA放置在-20℃冰箱中保存或直接进行下一步实验。
(8)通过生物信息学推测并选定一个G4位点以及一个非G4位点分别设计引物，所扩增片段大小为100-150bp。取1μl Input DNA，2μl IPed-DNA，作为模板，分别稀释三倍后，分别用正负引物做qPCR，用2(ΔΔCt)的方法计算富集倍数，选取正负引物倍数比大于5 的反应进行下一步实验。
(9)IPed-DNA片段构建Illumina测序文库并进行测序的过程为：将步骤(8)中经过检测符合要求的IP反应的DNA片段取出7μl用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-600bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序平台进行2x150 PE测序。
本发明所述的室温为25±5℃。
本方法与现有的G4-ChIP-Seq的主要区别在于，是通过体外提取全基因组DNA进行实验，不会受到植物材料生理状态的影响，并且有益于在植物基因组中大规模的对G4潜在位点进行鉴定。
与现有的方法相比，本发明具有以下优点：
(1)整个方法流程简单，与G4-ChIP-seq方法一个周期需要约2-3天相似，耗时较短，一个周期大约需要3天。(2)有明确的检测标准，实验结果在同一个或不同的操作者间易重复。(3)适合应用于多种植物物种。(4)可直接用于鉴定全基因组G4位点。(5)本发明可在不同实验室广泛应用和推广。
附图说明
图1.G4-ChIP-seq主要步骤流程图
图2.BG4-DNA-IP-seq方法主要步骤流程图。
图3.超声波破碎水稻基因组DNA的琼脂糖电泳检测图。
图4.Illumina测序文库的胶图。
图5.水稻G4位点的可视化图。
图6.水稻G4位点的可视化图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例1：
(1)植物材料交联：
选取2-5g需要供试的实验材料(小麦、玉米、水稻或拟南芥叶片)，剪成1-2cm大小的碎片浸泡于终浓度为1％甲醛(v/v)的交联固定液中，在真空条件于4℃交联10分钟。
向交联固定液中加入2M的甘氨酸溶液使其终浓度为125mM，在4℃条件下真空处理5分钟。
弃去所有交联固定液，用灭菌的蒸馏水冲洗三次，将所有叶片置于吸水纸上，于空气中干燥10分钟，待所有叶片表面水份吸干后，将交联后的叶片用锡铂纸包裹后于液氮中速冻 10分钟，将叶片取出放置于-80℃冰箱中保存待用。
(2)提取纯化植物材料的细胞核：
将固定交联后的叶片用液氮研磨成粉末，取10ml的粉末提取细胞核。往粉末中加入等体积核提取缓冲液(H1B)，搅拌成匀浆后离心管平放于冰上100rpm摇晃6分钟。
将匀浆过滤于一个新的50ml离心管中，4℃，3,000rpm升降速为8离心12分钟。弃去上清，加入2ml H1B Washing Buffer(HIBW))，用毛笔头轻轻重悬细胞核，并用3ml HIBW冲洗毛笔头上残留的细胞核，收集于同一个离心管中，然后上下轻轻颠倒混匀三至五次，3,000rpm升降速为8离心12分钟，重复该步骤三次，直到细胞核颜色为白色或淡黄色，尽可能弃去上清，沉淀为纯化的细胞核。
接下来用5ml的RSB缓冲液重新悬细胞核，4℃，3,000rpm升降速为8离心12分钟，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。用400μl的RSB缓冲液重新悬浮细胞核，并将细胞核转移到一个新的1.5ml离心管中；4℃，3,000rpm升降速为8离心12分钟，弃尽上清，保留沉淀(细胞核)。
(3)细胞核的超声波破碎处理及相应DNA的回收：
将纯化后的实验材料的细胞核重新悬浮于200μl Lysis Buffer中，将样品放置于经4℃预冷的非接触式超声波破碎仪支架上(超声波破碎仪的参数设置为High能量，30s开启，30s 停止为一个循环)，高能量处理7～13个循环，取10μl混合物经快速解交联法提取DNA，用琼脂糖凝胶检测破碎状况，选取DNA均匀分布在100-500bp间的反应，用lysisibuffer配置成400μl体系，加入16μl 5M NaCl(终浓度为0.2M)混合均匀后，65℃保温反应过夜解交联。
次日，向反应体系中加入3μl RNaseA,37℃反应1h；加入7μl Proteinase K混合均匀后，55℃反应2h；反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)混合均匀后，12,000rpm，4℃离心10min，保留上清液于一个新的1.5ml离心管中，并加入20μg Glycogen，1/10体积的3M 醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱放置1h，离心回收 DNA，DNA沉淀用75％酒精清洗后，于空气中干燥5分钟，用20μl EB溶解DNA。立即进行下步反应或者将DNA放置在-20℃冰箱中保存待用。
(4)BG4-DNA-IP反应
取5μg DNA溶解于100μl变复性Buffer中煮沸5min后停止加热，做好保温工作，使溶液过夜慢慢降至室温。
(5)配置好2xIP Buffer，并按照比例加入到经过过夜处理的DNA片段中，配置成1xIP反应液，最终反应体积为625μl；在加入BG4重组蛋白前，取1/10体积的反应复合液作为Input。保存Inpμt后，向IP反应物中加入适量BG4重组蛋白，于4℃，10rpm反应7h 后，向反应体系中加入等量的Anti-FLAG antibody反应过夜。
(6)次日重悬保存在冰箱中的Protein G Beads，并按照40μl每个反应分装Beads到新的离心管中。用1ml经过4℃预冷的1xIP Buffer重悬Beads，静置1min后用磁板回收Beads，弃去上清，重复三次；最后一次尽量去除上清，将过夜反应IP反应混合液加入到Beads中，4℃，10rpm反应5h；用磁板收集Beads，弃去IP反应液。
(7)BG4-IPed DNA洗脱与回收
用1ml经过预冷的Washing Buffer重悬Beads，静止一分钟后用磁板收集Beads并弃去上清液，重复此步骤三次；最后一次尽量除去上清；用200μl Elution Buffer在65℃水浴条件下，将结合在Beads上的抗体DNA复合物洗脱，每次反应10min，洗脱两次，取上清于一个新的离心管中。
取出保存在冰箱中的Input，与洗脱的DNA一并加入3μl Proteinase K，在55℃条件下，反应1h，反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)抽提后，12,000rpm，4℃离心10min，取上清于一个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC，20μg Glycogen，2.5倍体积经预冷的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃冰箱中放置1h后，12,000rpm，4℃，离心15 min，回收DNA，用75％乙醇洗沉淀两次，室温晾干后，用17μl EB溶解DNA。溶解后的 DNA放置在-20℃冰箱中保存或直接进行下一步实验。
(8)qPCR检测G4富集程度
选定一个G4位点以及一个非G4位点分别设计引物，所扩增片段大小为100-150bp。取1μl Input DNA，2μl IPed-DNA，作为模板，分别稀释三倍后，分别用正负引物做qPCR，用2(ΔΔCt)的方法计算富集倍数，选取正负引物倍数比大于5的反应进行下一步实验。所使用的正引物序列为：F：CCACTGTGCCCCGCTT，R：GGGTCAGGTGGCGTTTAT；负引物序列为：F：GGACGCATAGGAAGAACAGG，R：GGACGCATAGGAAGAACAGG)。
(9)IPed-DNA片段构建Illumina测序文库
将经过检测符合要求的ChIP反应的DNA片段取出7μl用于构建Illumina测序文库，具体实验方案按照试剂盒给出的实验方案操作。分离纯化分布在200-600bp DNA文库片段用于Illumina NovaSeq测序平台进行2x150 PE测序
实验结果显示：
(1)本实验所建立的BG4-DNA-IP-seq体系流程如图2所示
(2)在提取的细胞核经过超声波处理后，DNA片段均匀分布在100～500bp范围内，如图3所示。
(3)取适量的DNA用于构建Illumina测序文库，并纯化200-600bp大小片段，回收测序，文库构建检测如图4所示
(4)通过生物信息学分析，G4位点的可视化效果图如图5，图6所示。
九、相关技术术语的名词解释
交联固定液：用于固定染色质上蛋白质和DNA的一种缓冲溶液。
核提取缓冲液(HIB)：用于提取细胞核的缓冲溶液。
核清洗液(H1BW)：用于纯化细胞核。
RNaseA：一种降解RNA的核糖核酸酶。
Proteinase K：蛋白酶K，主要降解蛋白质。
DNA G4：基因组DNA上鸟嘌呤通过氢键形成的四螺旋结构
Illumina测序文库：基于第二代DNA测序技术而建立的DNA文库。
PCR：又称多聚酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。
qPCR：实时荧光定量核酸扩增检测系统
IP,immunoprecipitation:免疫沉淀。

Claims (10)

1.一种利用BG4重组蛋白鉴定植物基因组DNA G4位点的方法，其特征在于，该方法主要包括如下步骤：
(1)交联固定植物材料；
(2)提取并纯化植物材料的细胞核；
(3)对细胞核内染色质进行片段化处理，选取片段化程度符合要求的样品进行解交联反应，回收DNA片段；
(4)将回收的DNA片段在变复性Buffer中进行变复性反应；
(5)将IP Buffer加入到变复性产物中，继而加入BG4重组蛋白反应后再加入Anti-FLAG抗体过夜反应得到IP反应复合物；
(6)用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物；
(7)从Beads上洗脱IPed DNA，并用醇沉法回收DNA片段；
(8)用qPCR方法检测DNA G4富集程度；
(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序，经过生物信息学分析实现在全基因组水平鉴定G4位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中交联固定植物材料的过程为：将植物材料剪碎后浸泡于交联固定液中，在真空条件下进行交联反应；再向交联固定液中加入甘氨酸溶液并进行真空处理使多余的交联剂失活，最后得到交联固定的植物材料；将交联固定的植物材料清洗后吸干表面的水分，用锡铂纸包裹并于液氮中速冻后于-80℃保存待用；
所述的交联固定液包括：50mM HEPES、1mM EDTA、0.1M NaCl、1mM PMSF和终浓度为1％的甲醛；所述甘氨酸溶液的终浓度为125mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中提取并纯化植物材料细胞核的过程为：将交联后的植物材料用液氮研磨成粉末后，往粉末中加入核提取缓冲液，搅拌成匀浆后于冰上放置；然后过滤、离心、并且弃上清，再加入细胞核清洗液重悬细胞核，再次离心，弃上清液对细胞核进行纯化，重复细胞核清洗过程直到细胞核颜色为白色或淡黄色，用RSB缓冲液重悬细胞核，离心后弃尽上清，保留沉淀，即得到纯化的细胞核；
所述核提取缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mMspermine、40％Glycerol、0.1％Mercaptoethanol；
所述细胞核清洗液的配方为：20mM Tris-HCl、50mM EDTA、5mM Spermidine、0.15mMspermine、40％Glycerol、0.1％Mercaptoethanol、0.5％Triton X-100；
所述RSB缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中对细胞核内染色质进行片段化处理和解交联反应的过程为：将纯化后的细胞核充分重悬于裂解缓冲液中，用非接触式超声波破碎仪处理细胞核悬浮液3～15个循环，检测片段化程度，如果经过片段化处理的DNA均匀的分布在100～500bp，则加入解交联试剂进行解交联反应；然后向反应液中加入RNaseA，于37℃水浴中孵育后，再加入Proteinase K，于55℃水浴中孵育；用等体积的酚仿(1:1)抽提离心后保留上清液并加入Glycogen，1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积冰冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置1h后，离心回收DNA，DNA沉淀用75％酒精清洗干燥后，用EB溶解；
所述裂解缓冲液的配方为50mM Tris-HCl、10mM EDTA、1％SDS；
所述解交联试剂：终浓度为0.2M的NaCl。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述变复性反应的方法为：将步骤(3)回收的DNA片段在变复性Buffer中煮沸3～8min，之后停止加热，做好保温工作，放置过夜使溶液温度慢慢降至室温；
所述的变复性Buffer的配方为：150mM KCl,40％PEG200,10mM Tris-HCl,pH＝7.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中IP反应的详细步骤为：制备2xIP Bμffer，并按照比例加入到步骤(4)制备的变复性产物中，配制终浓度为1x IP反应液，在加入BG4重组蛋白前，取1/10体积的IP反应混合液作为Input，保存Input后，向IP反应复合液中加入BG4重组蛋白，于4℃，10rpm反应7h后，向反应体系中加入等量的Anti-FLAG抗体过夜反应；
所述的IP Buffer配方为：50mM HEPES,150mM KCl,1mM MgCl2,130nM CaCl2,1％BSA,40％PEG200,10mM Complete mini,pH＝7.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中用Protein G Beads回收过夜反应形成的IP反应复合物的过程为：重悬保存在冰箱中的Protein G Beads，按照40μl每个反应分装Beads到新的离心管中；用4℃预冷的1xIP Buffer重悬Beads，静置1min后用磁板回收Beads，弃去上清；重复三次，最后一次尽量去除上清，将反应过夜IP反应混合液加入到Beads中，在混匀仪上4℃，10rpm反应5h；用磁板收集Beads，弃去IP反应液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中洗脱并回收IPed DNA的过程为：用Washing Buffer重悬Beads，静止1min后用磁板收集Beads并弃去上清液，重复此步骤三次；最后一次尽量除去上清；用Elution Buffe将结合在Beads上的BG4-DNA复合物洗脱，洗脱条件是65℃水浴10min，洗脱两次，合并两次上清于一个新的离心管中，此时取出保存在冰箱中的Input，与洗脱的DNA一并加入Proteinase K，在55℃条件下消化1h，反应完成后，用等体积的酚仿(1:1)抽提，醇沉法回收DNA片段；
所述的Washing Buffer配方为：10mM Tris-HCl,150mM KCl,1％Tween20；
所述的Elution Buffer配方为：0.1M NaHCO3,1％SDS。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)的具体过程为，选定一个G4位点以及一个非G4位点分别设计引物，所扩增片段大小为100-150bp；从步骤(7)中所获得的DNA片段中取1μl Input以及2μl IPed-DNA，作为模板，分别稀释三倍后，分别用正负引物做qPCR，用2(ΔΔCt)的方法计算富集倍数，选取正负引物倍数比大于5的反应进行下一步实验。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(9)将经过富集程度检测的IP DNA进行建库和Illumina测序的过程为：将步骤(8)符合要求的IP DNA用于构建Illumina测序文库，分离纯化200-600bp DNA片段用于Illumina NovaSeq测序平台进行2x150 PE测序。
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