CN112898398B - 一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白及其应用 - Google Patents

一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种家蚕卵胶蛋白的氨基酸截短蛋白，该卵胶蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，卵胶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将SEQ ID NO.1所示序列连接到蛋白表达载体上，并在酵母细胞内诱导表达，分离得到粗提的卵胶蛋白，过镍柱纯化，然后经转谷酰胺酶催化交联得到具有较高粘性的重组卵胶蛋白，通过剪切拉伸强度测试发现其粘性达到2.2MPa，强于家蚕丝胶的粘性(1.2MPa)，甚至强于商业胶水PVP胶(1.2MPa)、PVA胶(1.4～1.8MPa)和UHU胶(1.8MPa)的粘性，本方法生产的家蚕卵胶蛋白可用于制备具有良好的胶黏强度的生物胶水。

Description

一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白，还涉及该家蚕卵胶蛋白的截短蛋白的制备方法及家蚕卵胶蛋白的截短蛋白作为生物胶水的应用。
背景技术
昆虫能分泌具有粘性的胶蛋白，用于各种生物功能，如作茧、锚定卵和捕获猎物。其中蚕丝中丝胶蛋白的研究尤为深入。家蚕丝胶蛋白包裹在蚕丝纤维的外层，用于将丝纤维粘连为茧形，并使茧附着于周围的物体如蔟架等，家蚕的丝胶蛋白富含丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸等成分。除了丝胶蛋白外，昆虫还会分泌卵胶蛋白。卵胶蛋白是由雌性成虫的粘液腺合成并分泌的，用于将卵锚定于寄主植物。Li等人(2008)调查发现昆虫的卵胶蛋白分子量普遍较大，富含甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。Amomsak等人(1992)通过蛋白质电泳发现家蚕的卵胶蛋白分子量分别为240kDa和190kDa，Yoshida K等(1997)指出其粘合强度(拉伸剪切强度)为11.8kgf/cm2。Nakamura K等(1997)研究发现家蚕卵胶蛋白的化学成分为Glu(16.8％)、Gly(13.9％)和Asp(11.3％)。
近年来仿生材料学的研究方兴未艾，近日，美国加州大学圣芭芭拉分校赫伯威特教授团队，从贻贝、沙塔蠕虫等海洋生物分泌的胶黏蛋白中获得灵感，发明了一种可在水下进行快速粘接的新型胶水。然而，目前尚未发现有家蚕卵胶蛋白作为仿生胶水的相关研究和应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白，本发明的目的之二在于提供该家蚕卵胶蛋白的截短蛋白的制备方法，本发明的目的之三在于提供该家蚕卵胶蛋白的截短蛋白及其交联产物作为生物胶水的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白，编码所述家蚕卵胶蛋白截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，编码所述家蚕卵胶蛋白截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.包含编码家蚕卵胶蛋白截短蛋白核酸序列的重组载体。
优选的，所述重组载体由SEQ ID NO.1所示序列通过EcoR I、Not I酶切位点连接到pPICZα-A蛋白表达载体上构建而得。
3.包含上述重组载体的转化体。
优选的，所述转化体宿主菌为毕赤酵母X33。
4.家蚕卵胶蛋白截短蛋白的制备方法，所述的家蚕卵胶蛋白的截短蛋白是由包含SEQ ID NO.1所示序列的重组载体在转化体中诱导表达后，经过分离纯化而得。
5.家蚕卵胶蛋白的截短片段的交联蛋白，所述交联蛋白由上述截短蛋白经催化交联制得。
优选的，催化交联所用的试剂为转谷酰胺酶；催化交联的时间大于10分钟。
6.上述家蚕卵胶蛋白的截短蛋白或上述交联蛋白在作为生物胶水中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明通过毕赤酵母表达了重组的家蚕卵胶蛋白的部分序列(1500bp核酸序列，编码500个氨基酸)，发现通过转谷酰胺酶催化交联能够使其粘性明显提高，通过剪切拉伸强度测试发现其粘性达到2.2MPa，强于Kludkiewicz B等(2009)研究报道的家蚕丝胶的粘性(1.2MPa)，甚至强于Liang C等(2015)、Wang G等(2013)研究报道的商业胶水PVP胶(1.2MPa)、PVA胶(1.4-1.8MPa)和UHU胶(1.8MPa)的粘性。本方法生产的家蚕卵胶蛋白是一种具有很好的胶黏强度的生物胶水，由于其本质是天然来源的蛋白质，因此具有安全无毒、可降解等众多优点，可用于医药领域，如皮肤组织和骨骼粘合，也可作为外伤喷涂剂，用于烧伤、烫伤、手术后的皮肤、粘膜修复等。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为毕赤酵母表达的家蚕卵胶蛋白的纯化图(M：蛋白分子量标准；U：未纯化的蛋白；W1-W2：漂洗的蛋白；E1-E6：洗脱的蛋白)；
图2为毕赤酵母表达的家蚕卵胶蛋白的交联效果图(EGP：卵胶蛋白；TG：豚鼠转谷酰胺酶；Min：分钟；“+”表示有；“-”表示没有)；
图3为毕赤酵母表达的家蚕卵胶蛋白的粘性测定(a，粘性测定的方法图示；b，粘性测定的stress-strain曲线，EGP：卵胶蛋白，TG：转谷酰胺酶；c，用转谷酰胺酶催化卵胶蛋白交联前后的粘性强度的比较。实验重复了10次，****表示p value值小于0.0001)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、构建真核表达载体
1.1目的片段合成
真核表达的片段是根据家蚕卵胶蛋白BmEGP基因序列，选择其序列重复区的前1500bp序列(SEQ ID NO.1)，在5’端加上EcoR I、3’端加上Not I酶切位点，由于序列高度重复，普通扩增极易出现碱基突变以及扩增提前终止的情况，因此选择将整段序列交于擎科生物进行序列合成，合成片段连接到pUC57载体上保存。SEQ ID NO.1对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
1.2目的片段EcoR I、Not I双酶切
酶切体系如下：Cut Smart 5μL，EcoR I 1μL，Not I 1μL，pUC57-BmEGP质粒20μL，ddH2O23μL；酶切反应条件为：混匀离心在37℃金属浴中水浴处理2h，水浴完成后用1.2％的核酸胶进行电泳检测并回收目的片段。
1.3 pPICZa-A载体EcoR I、Not I双酶切
酶切体系如下：Cut Smart 5μL，EcoR I 1μL，Not I 1μL，pPICZα-A质粒20μL，ddH2O 23μL；酶切反应条件为：混匀离心在37℃金属浴中水浴处理2h，水浴完成后用1.2％的核酸胶进行电泳检测并回收载体骨架。
1.4目的片段与载体骨架连接
取回收目的片段1μL进行电泳检测，目的条带大小一致且单一则可用，测定浓度和纯度，将目的片段与pPICZa-A载体连接，连接体系为：回收的目的片段7μL，pPICZa-A载体1μL，T4 DNA polymerase 1μL，T4 DNA polymerase buffer 1μL。连接反应条件为：轻柔混合后离心，16℃连接过夜。
1.5转化
Trans1-T1感受态细胞从-80℃冰箱取出，插在于冰上融化；将连接好的产物加入到50μLTrans1-T1感受态细胞中，用移液枪轻轻吹吸混匀后在冰上静置35min；在42℃预热好的金属浴上热激90s，接着在冰上放置2-3min；在超净工作台中加入300-400μL无抗LB液体培养基，置于37℃摇床220rpm培养30-40min；取70μL菌液均匀涂布于LB固体培养基(Ampicillin)平板上，放于37℃培养箱正置30min后倒置培养过夜。
1.6阳性克隆筛选与检测
超净工作台内操作，选取较大的单菌落，加入到450μL LB(Ampicillin，Zeocin)液体培养基中，37℃220rpm条件下摇床培养4-6h，取少量菌液进行PCR检测，体系如下(15μL体系)：10×buffer 2μL，引物-F 0.4μL，引物-R 0.4μL，菌液2μL，dNTP 1.6μL，rTaq 0.2μL，ddH2O 8.4μL。
PCR程序如下：Step1：94℃预变性5min；Step2：94℃变性40s；Step3：58℃退火30s；Step4：72℃延伸50s；Step5：72℃延伸8min；Step6：12℃，∞。
反应共进行30个循环，结束后用1.2％琼脂糖凝胶进行核酸电泳检测，选取条大小正确的菌株，吸取100μL送至上海生工进行测序，剩余菌液4℃保存备用。
1.7重组质粒提取
将测序正确的大肠杆菌接入5mL LB液体培养基(Ampicillin，Zeocin)中，37℃条件下过夜培养，10000rpm常温离心5-6min，弃掉上清；沉淀中加入质粒提取试剂盒中的RB溶液300μL进行重悬；加入300μL LB溶液，轻轻翻转4-8次，待菌体充分裂解，形成蓝色透亮溶液；加入350μL NB溶液，温和地翻转4-6次，室温静置4-5min，12000rpm室温离心10min；将上清加入到DNA结合吸附柱中，12000rpm室温离心50s，弃流出液；向吸附柱中加入750μL含有乙醇的Washing Buffer，12000rpm室温离心2min，弃流出液，重复一次；12000rpm室温离心2min，彻底去掉DNA结合柱的液体；将DNA结合柱转移到一新的1.5mL离心管中，向结合柱中心加入30-40μL 65℃预热的无菌ddH2O，12000rpm室温离心2min，洗下DNA；测量质粒浓度，放置于-30℃保存备用。
1.8 pPICZα-A重组载体线性化
对10μg超纯重组质粒进行线性化处理，体系如下：Cut Smart 25μL，BamH I 6μL，pPICZα-A重组质粒10μg，ddH2O补足至200μL。混匀离心后放置于37℃酶切2-4小时左右，酶切是否完全取2-4μL酶切产物进行电泳检测。检测到酶切完全后，根据北京全式金公司的EasyPure PCR Purification Kit使用说明书进行清洁回收。清洁回收后再液氮速冻后放入冷冻干燥机进行浓缩线性化处理，直至质粒至10μL的体积，-20℃保存备用。
实施例2、毕赤酵母感受态制备及转化
2.1酵母感受态制备
X33感受态细胞复苏：取10μL保存菌(X33)，接入10mL YPD液体培养基中，用100mL的锥形瓶在温度为28℃～30℃的恒温培养箱中200rpm过夜培养；用移液枪头蘸取少量过夜培养的菌液，在YPD(Kan+)上划线，28℃生长至菌落明显即可见(大约24-72h)；挑取单菌落，接种于5mL YPD液体培养液中，于50mL锥形瓶250rpm 28℃～30℃过夜培养；平板可保存数月，液体可保存数周(4℃保存)。
取100μL过夜的X33接入100mL YPD(Kan+)液体培养液中，在1L锥形瓶250rpm 28℃-30℃过夜至OD值1.3-1.5(约16-18h)；1500g 4℃离心5min，弃上清，加入100mL无菌水(冰上预冷)清洗，重悬菌液；1500g 4℃离心5min，弃上清，加入50mL无菌水(冰上预冷)清洗，重悬菌液；1500g 4℃离心5min，弃上清，加入4mL1M无菌山梨醇(冰上预冷)清洗，重悬菌液，转移菌液至1.5mL或2mL离心管中；1500g 4℃离心5min，弃上清，加入200μL1M无菌山梨醇(冰上预冷)清洗，重悬菌液，大约可获得300μL的电转感受态。将感受态至于冰上，当天使用，也可分装成80μL，-80℃保存，但电转效率会有明显下降；
2.2酵母电转化
将总体积10μL线性化重组质粒加入到80μL制备好的X33酵母感受态细胞中，用移液枪轻轻混匀后转到提前预冷的0.2cm电转杯；将电转杯放置在冰上冰浴5min；设置参数进行电转，参数设置为：0.2cm电转杯为：1.5Kv，25uF，200Ω，4-10ms(设置8ms)；将冰上提前预冷的1M无菌山梨醇溶液立即加入到电转杯中，轻轻混匀后转移到新的1.5mL离心管中；放置在室温静置1-2h后加入1-2mL YPD培养液，放入200rpm摇床中，28℃-30℃培养1h；离心去掉一部分上清，将菌液混匀后在含100μg/mL zeocin的YPD平板上，涂布约100μL，在28℃恒培养箱中培养2-4d，每日观察平板生长情况直至长成单菌落；在平板中挑取10-15个生长态势较好的单菌落转移100μg/mL zeocin的YPD平板上筛选高拷贝。
2.3酵母重组子鉴定
将高抗性YPD平板上筛选到的生长直径较大的菌斑，挑入YPD液体培养基中，在50mL锥形瓶(注意需要透气)中以250rpm、28℃恒温摇床中培养过夜；取2mL菌液，以基因组为模板进行PCR检测，或使用直接快速检测方法进行相应的检查；取2mL过夜培养的菌液进行3000g离心5min，弃上清；加入约400μL PBS PH 7.4(具体视沉淀而定)并对沉淀进行重悬；3000g离心5min，弃上清，加入约80μL TE buffer(视沉淀数量而定)并对沉淀进行重悬；在金属水浴锅中沸水浴10min并将其转移到-80℃冷冻30min(液氮速冻)后立即转移到沸水浴10min，以裂解细胞；裂解细胞后进行1500g离心5min，弃沉淀，取2-4μL上清作为模板进行相应检测，PCR反应体系共50μL，反应体系组成如下：10×Buffer I 5μL，上清4μL，dNTP 5μL，Primer F/R各1μL，HiFi高保真酶1μL，ddH2O 33μL。取10μL检测，其余可以选择测序。选取测序正确的阳性酵母重组子做后续实验。
实施例3、真核重组蛋白少量表达检测与大量表达
3.1小量表达检测
将25mL BMGY放于于250mL锥形瓶中，并将检测正确的重组菌接种于其中，置于28℃，250rpm，培养至OD值＝2～6(大概需要20～25h，OD＝5最好)；培养结束后于1500g离心10min，弃上清，向沉淀中加入BMMY将酵母细胞重悬，并稀释到OD＝1.0，转移到1L锥形瓶中培养，在28℃，250rpm条件下进行诱导表达；每隔24h在超净工作台中加入100％甲醇至培养基中，使其最终浓度为0.5％-1％，直至96h；定时取样，每隔0h、24h、48h、72h、96h进行取样培养基1mL，在4℃下8000-14000rpm离心15min，将上清与沉淀分别进行收集，直接检测或液氮速冻放置-80℃保存备用；将TCA(三氯乙酸)加入到上清中使其终浓度为10％-20％(2mL可加400μL100％TCA或者800μL50％TCA)，在冰上静置20-60min或者过夜，加的量视蛋白体积而定；13000rpm离心5min，4℃，弃上清；加入600μL丙酮对沉淀进行洗涤，在12000rpm条件下，离心20min(4℃)，弃上清(也可以200μL分3次洗涤)；晾干沉淀，65-95℃5-10min，或于室温自然晾干；加入重悬buffer对晾干的的沉淀进行重悬(加入20Um Tris8.08M尿素可复溶沉淀)，体积视沉淀而定；最后进行取样，制样，进行SDS-PAGE及WB检测是否表达。
3.2真核重组蛋白大量表达
将检测正确的重组菌接种于250mL BMGY(Kan+)，按照小量检测时的培养条件，培养至OD值＝2～6；在超净工作台中将菌液转移到50mL无菌离心管中，在3000rpm离心5min条件下，去掉上清，用BMMY将沉淀进行重悬转移至1L BMMY(Kan+)中，在28℃220rpm摇床中进行培养；每隔一天加入100％甲醇进行蛋白诱导表达；诱导完成后将菌液进行8000rpm室温离心20-30min，收集上清至干净的容器中；将抽滤过后的上清蛋白溶液进行高压细胞破碎；将破碎完成后的蛋白溶液于12000rpm 4℃离心20min，收集上清，用0.45μm滤膜抽滤。
实施例4、重组蛋白纯化
4.1重组蛋白镍柱亲和层析
镍柱清洗：用10mL 1M的咪唑加入到镍柱中，正常流速流出，Milli Q水进行冲洗，接着用10mL 6M盐酸胍加入到镍柱中，缓慢流出，接着用大量Milli Q水冲洗镍柱填料2-3次；补镍：柱子清洗完成后在镍柱中加入2-3mL NiCl2溶液，用移液枪吹散混匀填料，静置过夜；镍柱平衡：补镍后的镍柱用Milli Q水冲洗3个柱体积，接着加入3个柱体积的蛋白缓冲液对镍柱进行平衡；上样：在4℃环境中蛋白样品过滤后轻轻加入到镍柱填料中，将流速调节为3～5s/滴使蛋白能够与填充分结合并收集流穿液；洗脱：蛋白与镍柱结合后用不同浓度咪唑的缓冲液进行洗脱，浓度分别为0mM 200mL、20mM 200mL、50mM 10mL、100mM 10mL、200mM 10mL、300mM 10mL、400mM 10mL，每个浓度收集40μL到离心管中。
检测：使用电泳进行检测，点样顺序分别使蛋白原液、流穿液、0mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM；镍柱重生：用10mL 1M的咪唑加入到镍柱中，正常流速流出，Milli Q水进行冲洗，接着用10mL 6M盐酸胍加入到镍柱中，缓慢流出，接着用大量Milli Q水冲洗镍柱填料2-3次；镍柱保存：镍柱清洗干净后，向镍柱中加入20％乙醇溶液室温保存。
4.2重组蛋白脱盐
在10mL离心管架上PD-10脱盐柱，首先用Milli-Q水3-5个柱体积清洗柱子，并将其流干；平衡柱子，用3个柱体积的蛋白缓冲液滴干；加入2.5mL左右纯化后的蛋白溶液快速滴干；加入3.5mL蛋白缓冲液(合适pH值)，收集洗脱下的蛋白溶液；接着重复步骤2，接着上样；清洗脱盐柱用Milli-Q水，脱盐柱用3个柱体积的20％乙醇清洗并保存在20％乙醇中。
利用毕赤酵母真核表达系统，表达获得了含有500个氨基酸的截短重组家蚕卵胶蛋白，然后用镍柱亲和层析进行纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，通过酵母表达的家蚕卵胶蛋白EGP约为100kDa，纯度非常高(图1)。由于含有500个氨基酸的截短的家蚕卵胶蛋白EGP的预测分子量为50kDa，因此我们推断表达获得的蛋白以二聚体形式存在。
实施例5、家蚕卵胶蛋白的酶催化交联
将商品化的豚鼠转谷酰胺酶与家蚕卵胶蛋白按照2％(w/v)的量一起孵育，进行不同时间的催化交联，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行交联程度的检测(图2)，发现交联前的卵胶蛋白分子量为100kDa左右，交联10到30分钟后的卵胶蛋白分子量为200kDa，交联90-270分钟后，形成了分子量更大的蛋白。
实施例6、黏性力学性能的测定
制作搭接剪切模具：将牛皮纸裁剪成长为40mm，宽为3mm，作为测定黏性的基质。
测试样品制备：将真核表达的重组卵胶蛋白使用超滤浓缩管浓缩到40mg/mL以上，向每管中加入2％(w/v)的转谷酰胺酶，接着加入50mM的CaCl2溶液，将溶液吹吸混匀，放置于37℃恒温金属浴当中进行孵育12h；
模具粘合：待完成蛋白交联反应后，将交联前后的蛋白均匀得涂在3mm*3mm面积区域与另一模具进行粘合，放置于室温进行自然风干；
测试：使用万能测试仪进行搭剪切粘合测试，拉伸速率为120mm/min；每个样品重复10次，保证实验的真实性；数据分析：使用Origin软件进行数据处理。
单搭接剪切强度试验用于测量卵胶蛋白的粘合强度，粘性测定的装置如图3，a所示。结果发现家蚕卵胶蛋白的粘接强度为0.814±0.218MPa(图3，b)，与豚鼠的转谷氨酰胺酶孵育后，家蚕卵胶蛋白的粘附强度显著增强，达到2.218±0.343MPa(图3，b和3，c)，表明交联显著增强了家蚕卵胶蛋白的粘附能力。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120>一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 家蚕(Bombyx mori Linaeus)
<400> 1
ggtggaaatc aagaaggtgg aaatcaacaa ggtggaaatc aacagggtgg aaatgaacaa 60
gggggaaatc aaccaggtgg aaaacaacaa ggtggaaatg aacaaggtgg aaatgaacaa 120
gggggaagtc aacaaggtgg aaatcaacca ggtggaaaac aacaaggggg aagtcaacaa 180
ggtggaaatc aacaaggtgg aaatcaacca ggtggaaaac aacaaggtgg aaatgaacaa 240
gggggaagtc aacaaggtgg aaatcaacaa ggtggaaatg aacaaggggg aaatcaacaa 300
ggtggaaatg aacaaggggg aaatcaacaa ggtggaaatg aacaaggtgg aaatcaacaa 360
ggtggaaatg aacaaggggg aaatcaacaa ggtggaaatg aacaaggggg aaatcaacaa 420
ggtggaaatc aaccaggtgg aaaacaacaa ggtggagatg aacaaggggg aaatcaacaa 480
ggtgggaaac aacaaggtgg agatgaacaa ggtggaagtc aacaaggtgg aaatcaacca 540
ggtgggaaac aacaaggtgg aaatggacaa ggtggaaata aaccaggtgg aaaacaacaa 600
ggtggagatg aacaaggtgg aaatcaacaa ggtggaaata aacaaggggg aaatgaacaa 660
gggcgaaatc aaccaggtgg aaaacaacaa ggtggagatg aacaaggggg aaatcaacaa 720
ggtggaaata aacaaggggg aaatgaacaa ggtggaaatg aacaaggtgg aaataaacaa 780
gggggaaatg aacaaggggg aaatcaacaa ggtggaaatc aaccaggtgg gaaacaacaa 840
ggtggaaatg aacaaggtgg aaataaacca ggtggaaaac aacaaggtgg agatgaacaa 900
ggtggaaatc aacaaggtgg aaatgaacaa gggggaaatc aacaaggtgg aaatcaacca 960
ggtgggaaac aacaaggtgg aaatgaacaa ggtggaaata aaccaggtgg aaaacaacaa 1020
ggtggagatg aacaaggtgg aaatcaacaa ggtggaaata aacaaggggg aaatgaacaa 1080
gggggaagtc aacaaggtgg aaatcaacaa ggtgggaaac aacaaggggg aaatcaacaa 1140
ggtggaagtc aacaaggtgg aaatcaacaa ggtggaaata aacaaggggg aaatgaacaa 1200
gggggaaatc aacaaggtgg aaatcaacca ggtgggaaac aacaaggtgg aaatggacaa 1260
ggtggaaata aaccaggtgg aaaacaacaa ggtggagatg aacaaggtgg aaatgaacaa 1320
ggtggaaata aacaaggggg aaatgaacaa gggggaaatc aacaaggtgg aaatcaacca 1380
ggtgggaaac aacaaggtgg aaatgaacaa ggtggaaata aaccaggtgg aaaacaacaa 1440
ggtggagatg aacaaggtgg aaatcaacaa ggtggaaatg aacaaggggg aaatcaacaa 1500
<210> 2
<211> 500
<212> PRT
<213>家蚕(Bombyx mori Linaeus)
<400> 2
Gly Gly Asn Gln Glu Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Gln Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly
20 25 30
Asn Glu Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Ser Gln Gln Gly Gly Asn
35 40 45
Gln Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Ser Gln Gln Gly Gly Asn Gln
50 55 60
Gln Gly Gly Asn Gln Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gln Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly
85 90 95
Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly
100 105 110
Asn Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn
115 120 125
Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln
145 150 155 160
Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Ser Gln Gln Gly
165 170 175
Gly Asn Gln Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asn Gly Gln Gly Gly
180 185 190
Asn Lys Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Asn
195 200 205
Gln Gln Gly Gly Asn Lys Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Arg Asn Gln
210 215 220
Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln
225 230 235 240
Gly Gly Asn Lys Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly
245 250 255
Gly Asn Lys Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly
260 265 270
Asn Gln Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn
275 280 285
Lys Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Asn Gln
290 295 300
Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Gln Pro
305 310 315 320
Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Lys Pro Gly
325 330 335
Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly
340 345 350
Asn Lys Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Ser Gln Gln Gly Gly Asn
355 360 365
Gln Gln Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Ser Gln
370 375 380
Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Lys Gln Gly Gly Asn Glu Gln
385 390 395 400
Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Gln Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly
405 410 415
Gly Asn Gly Gln Gly Gly Asn Lys Pro Gly Gly Lys Gln Gln Gly Gly
420 425 430
Asp Glu Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Lys Gln Gly Gly Asn
435 440 445
Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Gln Pro Gly Gly Lys Gln
450 455 460
Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly Gly Asn Lys Pro Gly Gly Lys Gln Gln
465 470 475 480
Gly Gly Asp Glu Gln Gly Gly Asn Gln Gln Gly Gly Asn Glu Gln Gly
485 490 495
Gly Asn Gln Gln
500

Claims (9)

1.一种家蚕卵胶蛋白的截短蛋白，其特征在于：所述家蚕卵胶蛋白截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.包含权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体由SEQ ID NO.1所示序列通过EcoR Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点连接到pPICZα-A蛋白表达载体上构建而得。
5.包含权利要求3所述重组载体的转化体。
6.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于：所述转化体宿主菌为毕赤酵母X33。
7.权利要求1所述的家蚕卵胶蛋白截短蛋白的制备方法，其特征在于：所述家蚕卵胶蛋白的截短蛋白是由包含SEQ ID NO.1所示序列的重组载体在转化体中诱导表达后，经过分离纯化而得。
8.家蚕卵胶蛋白的截短蛋白的交联蛋白，其特征在于：所述交联蛋白由权利要求1所述的截短蛋白经催化交联制得，所述催化交联所用的试剂为转谷酰胺酶，所述催化交联的时间大于10分钟。
9.权利要求1所述家蚕卵胶蛋白的截短蛋白或权利要求8所述交联蛋白在制备生物胶水中的应用，其特征在于：权利要求1所述家蚕卵胶蛋白的截短蛋白经催化交联制得交联蛋白，所述催化交联所用的试剂为转谷酰胺酶，所述催化交联的时间大于10分钟。
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