CN118324929A

CN118324929A - 一种融合细胞外基质的重组蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN118324929A
Application number: CN202410742274.1A
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 周炜; 李增; 朱何龙; 许高涛; 吴博; 凡玉芳; 张勇
Original assignee: Interfield Chengdu Biological Products Co ltd
Current assignee: Interfield Chengdu Biological Products Co ltd
Filing date: 2024-06-11
Publication date: 2024-07-12

Abstract

本申请公开了一种融合细胞外基质的重组蛋白及其制备方法与应用，涉及重组蛋白技术领域，至少解决了现有细胞外基质相关重组蛋白无法通过人体表皮屏障被吸收进入人体的技术问题。所述融合细胞外基质的重组蛋白，所述重组蛋白的基因序列表达如SEQ ID No.1所示。本申请所述重组蛋白的促细胞增殖活性效率较高、体外促细胞粘附活性较高，且具有明显透皮吸收性能。

Description

一种融合细胞外基质的重组蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本申请涉及重组蛋白技术领域，尤其涉及一种融合细胞外基质的重组蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

目前细胞外基质相关蛋白的获得主要通过两条途径：一是从生物的组织细胞或体液中提取；二是运用基因工程技术构建表达载体，利用宿主表达重组蛋白。由于天然蛋白分子量大，全序列表达可行性低，主要是选取蛋白不同功能的结构域进行表达或组合表达，以获得具有不同功能的重组蛋白。天然提纯蛋白工艺复杂、成本高，且产品分子量大使其推广应用受到了限制。而利用基因工程技术表达外源基因已成为获取目的蛋白的高效途径之一。与此同时，细胞外基质是一个复杂的系统，内部多种成分彼此协作，构建单一重组蛋白无法达到其作用，因此对多种蛋白的功能域进行串联表达以发挥各种蛋白的各自功能。

但现有细胞外基质相关重组蛋白由于是多种蛋白组合，因此分子量较大，无法通过人体表皮屏障被吸收进入人体，导致其使用范围受到限制。

发明内容

本申请提供了一种融合细胞外基质的重组蛋白及其制备方法与应用，至少解决了现有细胞外基质相关重组蛋白无法通过人体表皮屏障被吸收进入人体的技术问题。

为解决上述技术问题，本申请实施例提供了：一种融合细胞外基质的重组蛋白，所述重组蛋白的基因序列表达如SEQ ID No.1所示。

作为本申请一些可选实施方式，所述重组蛋白的氨基酸序列表达如SEQ ID No.2所示。

作为本申请一些可选实施方式，所述重组蛋白的氨基酸序列是通过将纤连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白的功能域基因序列串联表达融合蛋白，并在融合蛋白的N端增加透皮肽TD-1后获得的。

再一方面，本申请实施例提供了，包括：一种如上所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

基于pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计获得重组蛋白的基因序列和重组蛋白的氨基酸序列；

基于所述重组蛋白的基因序列，构建pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体；

将所述pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞，获得工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA；

对所述工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA进行诱导表达后，离心收集培养上清液进行纯化处理，获得TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液。

作为本申请一些可选实施方式，基于所述重组蛋白的基因序列，构建pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体的步骤，包括：

将质粒pYES2/CT-Mfα和人工合成TD-1/FN/Col/ELA质粒分别用Not I和Xba I进行双酶切处理；

酶切处理完成后，以1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，并回收双酶切的PCR产物；

将所述回收双酶切的PCR产物与所述pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1h~5 h，获得重组质粒；其中，所述每10μl连接体系包括：目的基因5μl、载体片段3μl、T4 DNA连接酶和10×ligase buffer各1μl；

将所述重组质粒转化到E. coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，获得pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体。

作为本申请一些可选实施方式，在进行双酶切处理时，每50μl酶切体系包括：QuickCut Hind Ⅲ、QuickCut EcoR I和10×QuickCut Green Buffer各5 μl、pYES2或PCR产物35 μl；

所述酶切条件为：在37℃金属浴中酶切3 h。

作为本申请一些可选实施方式，所述将所述pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞，获得工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA的步骤，包括：

将10μl所述pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，混合均匀后转移到电击杯中进行冰浴；

5min后，将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，电击杯置于所述Bio-Rad电转化仪上进行电击，并向电击杯中加入500μl 1M山梨醇溶液，混合均匀，涂布于SC-U固体平板；

30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆的转化子；

挑取所述转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200 rpm恒温培养后，作为模板，进行PCR反应鉴定筛选阳性克隆的转化子，作为工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA。

作为本申请一些可选实施方式，所述对所述工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA进行诱导表达后，离心收集培养上清液进行纯化处理，获得TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液的步骤，包括：

挑取所述INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA单菌落，接种于20 ml SC-U选择培养基，经30 ℃、220 rpm振荡培养过夜；

将其培养结束后的菌液转接至100 ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD600nm达到0.4，诱导时间为20 h；

诱导后，离心收集培养上清液进行纯化处理，获得TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液。

作为本申请一些可选实施方式，所述诱导完成后，离心收集培养上清液进行纯化处理，获得TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液的步骤，包括：

诱导完成后，离心收集培养上清液，用0.22 μm滤膜对所述培养上清液进行过滤；

过滤后，再对所述滤液进行层析纯化处理；再使用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定；

再以含150 mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液。

再一方面，本申请实施例提供了，包括：一种如上所述融合细胞外基质的重组蛋白的应用，将所述融合细胞外基质的重组蛋白用于制备化妆品或激素类药物

与现有技术相比，本申请提供基因序列表达如SEQ ID No.1所示的重组蛋白具有活性：促细胞增殖活性检测结果显示，所述重组蛋白的工作效价为166000U/mg，校正效价为181000U/mg，即本申请所述重组蛋白的促细胞增殖活性效率较高；促细胞贴壁的作用效果试验结果显示，当所述重组蛋白的蛋白浓度为0.125mg/ml时，其工作效价为35.26U/ml，ED₅₀为3.55μg/ml，即本申请所述重组蛋白的体外促细胞粘附活性较高；透皮吸收试验结果显示，本申请所述重组蛋白具有明显透皮吸收性能。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本申请中涉及的INVSc1/pYES2/CT-MFα- rhFN-Col-ELA-IGF诱导表达的上清液的SDS-PAGE电泳图；

图2为本申请中涉及的促细胞黏附数据拟合结果图；

图3为本申请中涉及的透皮试验各组鼠皮免疫组化结果图。

本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

多细胞有机体中，细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，称作细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)。ECM主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，其在上皮或内皮细胞的基底部者为基底膜，而在细胞间黏附结构者为间质结缔组织。ECM的形成需要细胞分泌细胞外基质蛋白(ECMP)。大量研究表明，ECM可以针对生物体内的微环境的变化而产生动态响应，影响细胞的行为，并维持着生物体内各组织的稳态。最新研究发现，在创面恢复的过程中，ECM不仅起到单纯的支撑、粘附作用，对于细胞增殖分化、细胞间信号传导、代谢以及迁移活动，也有着重要作用。

胶原蛋白（Collagen，COL）是ECM中最主要的蛋白质，也是与美容护肤、组织再生关系最为紧密的成分。一方面胶原蛋白组成纤维，从而构成细胞外基质的三维结构，为细胞提供生存空间，支撑组织的生理形态；另一方面，其所构建的三维结构可以通过生物力转导从而调控细胞的黏附、增殖和分化以及免疫细胞的免疫应答等行为，从而调控组织再生。

弹性蛋白（elastin，ELA）是ECM中弹性纤维的主要成分。含有弹性蛋白的纤维可以在需要重复扩张和松弛的组织中提供弹性反冲，通常存在于皮肤、肺、韧带、肌腱和血管组织中。弹性蛋白也可以在细胞黏附、迁移中发挥重要作用，并参与细胞内的信号通路。在组织的发育过程中，弹性蛋白组装成弹性纤维，并随着组织成熟和衰老而发生变化。纤连蛋白则是一种广泛分布的多结构域糖蛋白，存在于大多数细胞外基质中。

纤连蛋白(fibronectin, FN)的多结构使其能够同时与细胞表面受体(如整合素)以及胶原蛋白、蛋白多糖和其他黏附分子结合。在皮肤上，纤连蛋白可以促进细胞粘连、增殖、分化、生长、迁移等，还可以刺激细胞分泌其他功能蛋白；在伤口愈合中，还参与到凝血、抗炎、肉芽组织产生和组织重建，起到重要作用。目前，在难愈合的严重创面上，还采用了大规模添加外源性纤连蛋白以帮助创面愈合。

除了上述基质成分，细胞外基质中还有多种其他重要成分。比如蛋白多糖、层粘连蛋白、透明质酸钠等，这些成分含量或多或少，但各自起到不可或缺的作用，并相互协作，营造最适于细胞和机体生存的环境。不同于单一的组分，细胞外基质是一个复杂的系统，由细胞工厂加工产生，内部含有多种成分，彼此协同、共同营造出最适合机体的微环境。因此，细胞外基质目前也是最佳的再生材料，能够高度还原人体正常的结构和功能，起到最理想的修护和再生功效。

酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体，其生化和遗传研究已经非常详细。酿酒酵母分泌表达系统为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

透皮短肽(Transdermal peptide 1, TD-1)由11个氨基酸组成，是第一个通过噬菌体展示技术发现的透皮增强肽。第一个被证明通过生物学特异机制克服皮肤屏障的短肽。第一个能通过经皮给药途径有效携带蛋白质药物透皮的短肽。

为了克服天然蛋白提纯免疫原性高、纯度低；天然蛋白类型多，全基因表达可行性低；现有原核表达系统存在容易形成包涵体、单一蛋白功能单一等缺陷的技术问题，本申请提供了一种酿酒酵母表达重组细胞外基质蛋白组合，将纤连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白的功能域基因序列串联表达融合蛋白，并在融合蛋白的N端增加透皮肽TD-1，从而具有快速透皮吸收的功效。

根据表达载体和宿主菌的不同，主要分为原核表达和真核表达。原核表达系统虽成本低廉，但该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷，而利用真核表达系统进行外源表达能够获得较高活性的目的蛋白。相较于大肠杆菌原核表达系统，本申请采用的酿酒酵母更加安全有效。酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体，其生化和遗传研究已经非常详细。酿酒酵母分泌表达系统为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

另一方面，重组蛋白虽然只选取功能域串联表达，但因为是多种蛋白组合，分子量依旧较大，无法通过人体表皮屏障被吸收进入人体，使用方式的局限使使用范围受到局限。针对这一情况国内外已经有很多研究，中国科学技术大学温龙平教授课题组在科技部重大科学研究计划支持下，创造性地应用体内噬菌体展示技术，发现了一种能够帮助胰岛素等生物大分子药物提高透皮效率的透皮短肽TD-1，可以有效解决蛋白质类药物难以透皮的问题。因此，本申请在将TD-1和融合蛋白有效结合，很好的解决了大分子重组蛋白透皮吸收问题。

为了便于本领域技术人员对本申请技术方案的理解，下面结合具体实施方式对本申请所述技术方案进行详细说明：

实施例1TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白工程菌的构建、鉴定及制备

1、培养基及试剂的配制

YPD完全培养基包括以下组分：酵母提取物10 g和蛋白胨(Peptone)20 g，以及加纯化水至900 ml。将上述组分混合后，在121 °C高压灭菌20 min，冷却至60 °C以下，超净台中加入无菌100 ml 10×葡萄糖，获得YPD完全培养基。若为固体培养基，则另加琼脂粉2.0%。

SC-U缺陷型培养基包括以下组分：YNB无氨基酸氮源6.7 g、0.01%氨基酸混合物I1 g和0.005%氨基酸混合物II 0.5 g，加蒸馏水至900 ml。其中，0.01%氨基酸混合物I为精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤，0.005%氨基酸混合物II为天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、撷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。在将上述组分混合均匀后，在121 °C高压灭菌20 min，冷却至60 °C以下，超净台中加入无菌100 ml20%葡萄糖，获得SC-U缺陷型培养基。若为固体培养基，则另加琼脂粉2.0%。SC-U诱导培养基包括以下组分：蛋白胨(Peptone)20 g、酵母提取物10 g和纯化水700 ml。将上述组分混合后，在121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml20%半乳糖，获得SC-U诱导培养基。若为固体培养基，则另加琼脂2.0%。

PBS缓冲液包括以下组分：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄1.44 g和KH₂PO₄0.24 g，将上述组分混合后，加纯化水进行溶解，调pH至8.0，定容至1 L。

含500 mM咪唑PBS缓冲液包括以下组分：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄1.44 g、KH₂PO₄0.24g和咪唑 34.04 g，将上述组分混合后，加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1 L。

2、目的基因序列设计

根据pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计融合蛋白（与上述重组蛋白为同一概念）的基因序列如SEQ ID No.1所示，即：

GCGGCCGCATGGCTTGTAGTAGCAGCCCGAGCAAACATTGCGGTGGTGGGGGAGGAAGTGGTGGGGGCGGATCTGGAGGTGGTGGATCTAATGCTCCCCAACCATCTCATATCTCAAAGTACATCCTTAGGTGGCGTCCAAAAAATTCCGTTGGGCGTTGGAAGGAAGCAACTATTCCTGGCCACCTAAACTCATATACCATAAAAGGGTTAAAACCGGGAGTAGTCTACGAGGGTCAACTAATTAGTATTCAGCAGTACGGCCATCAAGAGGTCACGAGGTTCGATTTTACAACAACATCAACTTCTACTCCAGGTGGGGGTGGATCAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGCGGTGGTTCTGGAAGGCCTGGAGAGAGAGGATTACCAGGCGGAGGTGGGTCTGGAGGAGGTGGGTCAGGTGGGGGCGGATCTGGTGTAGGGGTAGCTCCTCATCACCACCATCACCACTAATCTAGA。

需要说明的是，在SEQ ID No.1所示基因序列中，GCGGCCGC为NotI酶切位点，TCTAGA为XbaI酶切位点；ATG为起始密码子，TAA为终止密码子；CATCACCACCATCACCAC为6×His标签序列；

融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，即：

ACSSSPSKHCGGGGGSGGGGSGGGGSNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTPGGGGSGGGGSGGGGSGRPGERGLPGGGGSGGGGSGGGGSGVGVAPHHHHHH。在SEQ ID No.2所示氨基酸序列中，ACSSSPSKHCG为多肽TD-1氨基酸序列；NAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTP为FN多肽片段；GRPGERGLP为Ⅲ型COL多肽片段；GVGVAP为弹性多肽片段；（GGGGS）₃为连接蛋白的Linker所对应的氨基酸序列；HHHHHH为6×His标签氨基酸序列。

3、载体构建

将如SEQ ID No.1所示的融合蛋白（TD-1/FN/Col/ELA蛋白）基因序列发送通用生物公司进行人工合成，同时合成检测引物：

T7：5' TAATACGACTCACTATAGGG 3'

CYC1 Terminator：5' GTGACATAACTAATTACATGATG 3'

提取DH5α/pYES2/CT-Mfα质粒。将pYES2/CT-Mfα质粒和人工合成TD-1/FN/Col/ELA质粒分别用NotI和XbaI进行双酶切。酶切体系(50 μl)：QuickCut Hind Ⅲ、QuickCut EcoRI和10×QuickCut Green Buffer各5 μL、pYES2或PCR产物35 μL。在37℃金属浴中酶切3 h，酶切后以1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，并胶回收双酶切的PCR产物和质粒。

将双酶切回收的PCR产物（即目的基因产物）与pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1h~5 h，获得重组质粒。连接体系(10 μl)包括：目的基因5 μl、载体片段3 μl、T4 DNA 连接酶（ligase）和10×ligase buffer各1 μl。将重组质粒转化到E. coliDH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，PCR鉴定后进行测序；测序结果无误，则pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体构建成功。

需要说明的是，所述目的基因是指如SEQ ID No.1所示的重组蛋白基因序列；所述载体片段是指pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体片段。

4、pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞

将10 μl pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA质粒加到80 μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷（所述预冷是指预冷至4℃~10℃，下同）的电击杯中。冰浴5 min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500 μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆转化子。挑取单克隆转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200 rpm恒温培养后，作为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆。选取鉴定无误的转化子进行下一步试验，由此获得INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA工程菌。

5 INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA工程菌的诱导表达

挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA工程菌的单菌落接种于20 ml SC-U选择培养基，经30 ℃、220 rpm振荡培养过夜。将其转接至100 ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4，诱导时间为20 h。

诱导结束后，将INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA诱导表达的上清液经SDS-PAGE电泳，结果图如图1所示，可以看出：

INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA诱导表达的上清液在14.6kDa左右的特异性条带，而含有pYES2/CT-MFα空载质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液则无特异性条带。其中，图1中，M：Marker；1：诱导上清；2：空载质粒诱导上清。

6、TD-1/FN/Col/ELA纯化

在12000r/min条件下进行离心20min，收集培养液上清液，用0.22 μm滤膜过滤所述培养上清液。使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni²⁺螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280 nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6 ml/min。再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定。再以含150 mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液。

实施例2 TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白促细胞增殖的作用效果试验

根据《YY/T 1849-2022 重组胶原蛋白》，采用促细胞增殖对本申请制备的融合蛋白的体外生物学活性检测进行检测。

1 实验方法

1.1 实验材料

供试品：TD-1/FN/Col/ELA，实施例1制备，批号20240104。

对照品：英特菲尔生物制品有限责任公司生产的批号为20230220的长效重组Ⅲ型胶原蛋白。

标准品：EGF蛋白，效价50万U/mg，购自sigma。

细胞株：小鼠胚成纤维细胞（3T3），8代，冻存批号20221215，购自美国ATCC。

其他试剂（完全培养基HyClone/AJ30742864、PBS 、0.25%胰蛋白酶）和其他物品（96孔细胞培养板、TIP头和微量移液器）为实验室常规，试验前进行灭菌或过滤除菌处理，无菌检测合格。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞培养，传代

细胞以含10%小牛血清的培养基正常培养，当细胞生长至融合率达90%以上时，去除培养基，用PBS洗两次，然后加入0.25%的胰酶消化，当细胞皱缩变圆时，倾去胰酶，加入含10%小牛血清的培养基轻轻吹打，收集细胞并离心，计数细胞，将细胞浓度调整至适当浓度接种至1ml含1.0×10⁵~5.0×10⁵个细胞。待生长至融合率达90%以上时，进行下一次传代。

1.2.2 细胞接种

选择传代后24~36小时用于测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×10⁴~8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。

1.2.3 细胞同步化

24小时后换成维持培养液（购自HyClone），于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养24小时。

1.2.4 给药

24小时后，使用维持培养液稀释对样品进行4倍梯度系列稀释，将稀释后的样品加入至细胞中每孔100μl。同时设立空白对照组（只含维持培养液），每组2个复孔，继续培养。

1.2.5 MTT测定

给药处理后的细胞继续培养72h后，每孔加入MTT液（0.5mg/m1）20u1，5%CO₂，37℃孵育4h后弃液，加入DMSO裂解振荡，570nm测定吸光度值。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。

2 结果计算

试验结果如下表1：

表1 促细胞增殖活性检测结果

从表1结果来看，融合蛋白促细胞增殖活性与本公司已获专利的胶原蛋白活性在同等数量级，无明显差异。

实施例3：TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白促细胞贴壁的作用效果试验

1 实验原理

本实验通过促牛肾细胞（MDBK细胞）的粘附（贴壁）试验，检测TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白是否具有促粘附活性。

2 试验材料

2.1 主要仪器：超净工作台、细胞培养箱。

2.2 试剂配制

完全细胞培养液：量取胎牛血清10ml，双抗1ml，加入DMEM培养液90ml，4℃保存。

无血清培养基：量取双抗1ml，加入1640培养液99ml，4℃保存。

消化液：0.25%胰蛋白酶。

PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌。

2.3 细胞

MDBK细胞在完全细胞培养液中呈单层、贴壁生长，每4～5天传代一次，1︰2消化传代，于完全培养液中生长繁殖。

2.4 供试品：实施例1制备的TD-1/FN/Col/ELA，批号20240104。

2.5 阳性对照：英特菲尔生物制品有限责任公司生产的批号为20231003的重组纤连蛋白（rhFN）溶液。

3 试验操作

3.1 样品稀释及孵育

将TD-1/FN/Col/ELA用PBS预稀释至0.5μg/ml，预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做10个稀释度，每孔50μl不同稀释度的TD-1/FN/Col/ELA样本，设置梯度稀释的阳性对照孔以及阴性对照（加入50μl PBS作为对照），4℃过夜孵育。

3.2 促细胞粘附试验

孵育完成后弃去板中液体，每孔加入100μl 30g/L BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；取出弃去板中液体，加入MDBK细胞悬液（用无血清培养基重悬），细胞接种密度为1.0×10⁵个/ml，每孔接种100μl，温箱孵育5h。

3.3 结果观察及计算

将孵育完成的细胞板用PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果使用四参数拟合曲线得出效价。结果计算如表2-表3和图2所示：

表2 孔板内各孔五点细胞数

表3 效价统计结果

从表3的结果统计来看，TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白和本公司生产的rhFN均具有体外促细胞粘附活性。

实施例4：TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白透皮吸收试验

一试验原理

将蛋白溶液在直立式Franz扩散池中进行透皮吸收试验，扩散池置于药物透皮扩散试验仪中，于37℃恒温循环水浴中保温。对TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白和长效重组Ⅲ型胶原的体外透皮性能进行对比评价。

二试验方法

1.试验材料：

1.1 离体皮肤选择6~8周龄BALB/c小鼠制备离体皮肤。

1.2 主要试验试剂

供试品：实施例1生产的TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白，批号20240104；

生理盐水；Ⅲ型胶原蛋白单抗（购自abcam，英国）。

1.3 实验仪器：宏华ZTY智能透皮试验仪，接受池最大容量20ml，有效透皮面积1.36cm²。

2.试验步骤

2.1 离体皮肤制备

选取6~8周龄BALB/c小鼠，小鼠适应性饲养后颈椎脱臼法处死，迅速刮除腹部皮肤发毛后，剥离无毛的腹部皮肤，去除皮下脂肪，然后用生理盐水反复冲洗干净、擦干、用铝箔纸包裹置于保险盒中，-20℃冰箱保存备用（不超过1个月）。实验前隔日取出融冻（0~5℃），使用前用生理盐水反复淋洗至澄清。同时取部分皮肤使用固定液固定备检。

2.2 体外透皮试验

2.2.1 鼠皮安装

在直立式Franz扩散池中进行透皮吸收试验，扩散池置于药物透皮扩散试验仪中。将处理好的离体皮肤固定在供给池和接收池中间，角质层部分朝向供给池，真皮层面朝向接受室。调整水浴系统温度为 37℃, 搅拌速度为100 r/min , 在接受室中加入预温 37℃的生理盐水，排尽气泡。为降低干扰，在不给药的情况下，先将鼠皮内层表面与接受液接触，再将不同浓度溶液5ml注入供给室紧贴于鼠皮肤上。

2.2.2 采样

分别于试验开始后第 1、2、4、6、8、12和24 h 用注射器抽取1ml左右接受液作为样品液。同时，将接受室补满等量生理盐水溶液。最后，将收集的各时间段的样品液进行检测。

2.2.3试验分组

设置空白组（生理盐水）、供试品组、对照品组共3组，使用生理盐水将样品稀释至0.1mg/ml浓度。

3 结果检测

3.1 蛋白含量检测

将各时间点取出的接收液样品采用考马斯亮蓝法测定接受液中蛋白含量，累积渗透量（Q）计算公式如下：

其中，C_n表示第n次取样样品浓度，Ci表示第i次取样样品浓度，V表示接收池体积，Vi表示取样体积，S表示透皮面积。

3.2免疫组化切片制备及观察

将5组实验24h后的鼠皮取透皮部分（包括毛囊部位和非毛囊部位比较）进行固定，制备免疫组化切片。将制备好的免疫组化切片置于显微镜下观察各组皮肤组织中胶原蛋白存在位置。

3.3 免疫组化切片制备流程

（1）切片放入干燥箱66℃烤片20-30min。

（2）依次过3道二甲苯，每道5min。

（3）依次过3道(100%-95%-80%)乙醇，每道3min。

（4）将切片放入烧杯中，流水缓慢冲洗，洗去乙醇，直到切片干净透明。

（5）抗原高压修复：在高压锅内配制2000ml pH为6.0的柠檬酸盐修复液，电磁炉加热至沸腾，放入切片盖上锅盖，喷气后计时2min，然后停止加热，流水缓慢冲洗高压锅盖直至冷却。

（6）阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%H₂O₂中室温孵育，蒸馏水洗3次，画疏水圈，PBS-T冲洗3次。

（7）甩去切片上多余的液体，滴加一抗（Ⅲ型胶原蛋白单抗），加盖置于37℃培养箱孵育60min。取出切片，PBS-T冲洗3次。

（8）甩去切片上多余的液体，滴加二抗，加盖置于37℃培养箱孵育30min。取出切片，PBS-T冲洗3次。

（9）甩去切片上多余的液体，滴加DAB显色剂，显微镜下控制显色时间，有阳性终止显色，蒸馏水冲洗干净。

（10）苏木素衬染2-5min，水洗干净；1%盐酸酒精分化数秒，水洗干净。

（11）碳酸锂溶液蓝化30s，水洗干净。

（12）常规脱水，二甲苯透明。

（13）中性树胶封片，显微镜观察结果。棕色为阳性反应。

4实验结果

4.1 各时间段样本蛋白浓度

各时间点单位面积累积渗透量（Q）根据公式计算结果如表4所示：

表4长效重组Ⅲ型胶原蛋白各时间点样本蛋白浓度及单位面积累积渗透量Q

注：（1）样本浓度单位为μg/ml；（2）Q值单位μg/cm²

从表4结果来看，TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白具有透皮性能，长效重组Ⅲ型胶原蛋白无法透皮。

4.2 免疫组化结果

对试验24h的离体鼠皮进行免疫组化检测，结果如图3所示。结果显示：供试品组TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白透皮进入真皮层（图3A箭头处），呈现明显的棕色阳性反应；而对照品组长效重组Ⅲ型胶原蛋白则基本无蛋白渗透，阳性反应均在表皮层外，真皮层内无明显集中阳性反应，仅有皮肤本身胶原结构有散在阳性反应（图3B）；图3C的空白组也无明显集中阳性反应。

5 结论

根据试验结果可知，TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白具有明显透皮吸收效果。

可以看出，本申请利用酿酒酵母分泌表达系统，将细胞外基质最主要的3种蛋白-纤连蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白的功能域基因序列串联表达融合蛋白，通过在融合蛋白的N端增加透皮肽TD-1，有效的提高了蛋白的透皮功效，免疫组化试验证明该蛋白经皮能够作用到真皮层，同时体外试验证明本公司的融合蛋白能显著促进细胞黏附及增殖。并且由于重组蛋白属于生物蛋白，具有易分解无残留的优点，相比普通化工品类化妆品和激素类药物具有无副作用的巨大优势。

以上仅为本申请的优选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims

1.一种融合细胞外基质的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的基因序列表达如SEQID No.1所示。

2.根据权利要求1所述融合细胞外基质的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列表达如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述融合细胞外基质的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列是通过将纤连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白的功能域基因序列串联表达融合蛋白，并在融合蛋白的N端增加透皮肽TD-1后获得的。

4.一种如权利要求1-3任一项所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，其特征在于，基于所述重组蛋白的基因序列，构建pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体的步骤，包括：

将所述回收双酶切的PCR产物与所述pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1h~5 h，获得重组质粒；其中，每10μl连接的体系包括：目的基因5μl、载体片段3μl、T4 DNA连接酶和10×ligase buffer各1μl；

6.根据权利要求5所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，其特征在于，在进行双酶切处理时，每50μl酶切体系包括：QuickCut Hind Ⅲ、QuickCut EcoR I和10×QuickCutGreen Buffer各5 μl、pYES2或PCR产物35 μl；

所述酶切条件为：在37℃金属浴中酶切3 h。

7.根据权利要求4所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA载体电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞，获得工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA的步骤，包括：

30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆的转化子；

挑取所述转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200 rpm恒温培养后，作为模板，进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆的转化子，作为工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA。

8.根据权利要求4所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-TD-1/FN/Col/ELA进行诱导表达后，离心收集培养上清液进行纯化处理，获得TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液的步骤，包括：

将其培养结束后的菌液转接至100 ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4，诱导时间为20 h；

9.根据权利要求8所述融合细胞外基质的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导后，离心收集培养上清液进行纯化处理，获得TD-1/FN/Col/ELA融合蛋白原液的步骤，包括：

对过滤后的滤液进行层析纯化处理；再使用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定；

10.一种如权利要求1-3任一项所述融合细胞外基质的重组蛋白的应用，其特征在于，将所述融合细胞外基质的重组蛋白用于制备化妆品或激素类药物。