CN117756926A - 一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用 - Google Patents
一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17，其序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。并公开了其编码基因、表达载体和表达宿主菌，以及制备方法和应用。本发明的重组XⅦ型胶原蛋白Pro.C17，具有良好的生物活性，其生物性接近人体XⅦ型胶原蛋白。本发明所制备的重组XⅦ型人源化胶原蛋白Pro.C17的氨基酸序列源自天然胶原蛋白氨基酸序列，可以与其余蛋白复配成为组织工程产品、化妆品、保健品或药物的原材料。且可用原核系统来进行表达，表达体系简单，成本低，产量高。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17及其制备方法和应用，属于蛋白表达技术领域。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，其广泛分布在动物的皮肤、骨骼、肌腱、韧带和血管之中。人体中胶原蛋白含量占总蛋白的25％～30％，是一种重要的结构蛋白，起着保护机体、支撑器官的重要作用。
人XVII型胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白，其为三条相同α1(XVII)链构成的均相三聚体，单链分子量为180kDa。XVII型胶原蛋白分为胞内、跨膜、胞外三大类结构域，又可根据是否具有典型的(Gly-X-Y)n氨基酸重复序列及能否形成三螺旋区域分为16个非三螺旋区和15个三螺旋区，这些胶原域和非胶原域共同参与执行了与细胞外基质间的相互作用。人XVII型胶原蛋白是细胞中半桥粒的一种组成成分，在上皮细胞-基底膜的作用中发挥重要作用，可调控上皮细胞的黏附、分离和发育分化，对角化细胞的分化和再生有重要作用。
然而，人XVII胶原蛋白在人体及动物体内中含量极少，提取难度非常大，无法依靠传统的酸、碱、酶解法处理动物组织获得，少量的提取只能满足科研需求，无法量产，没有大量应用的可能性，同时不可避免的存在免疫原性和潜在的病毒、疫病等生物安全性隐患。由于这些阻碍，目前人类对于非纤维类胶原蛋白的结构功能认识非常有限，尤其是对于XVII型胶原蛋白知之甚少。
现在解决此类问题的主要方式则是通过基因工程等生物技术来获得重组胶原蛋白，基于人体皮肤XVII胶原蛋白的原始基因序列，优化选择其中水溶性强、生物活性高的部分进行密码子优化和拼接重组，得到了全新的重组人源化XVII型胶原蛋白序列，利用生物发酵技术实现可规模化生产，通过实验证实此胶原蛋白表达量大，水溶性好，生物活性高，其性能优于人天然胶原蛋白，在生物医用材料、美容化妆品、食品保健等领域有着广大的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17，可原核表达，水溶性好，生物活性高。
本发明采用的技术方案：
一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17，其序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6或SEQ IDNo.7所示。
上述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的编码基因。
优选的，其序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示。
上述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达载体。
根据权利要求4所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达载体，其特征在于所述载体为pET30a。
上述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达宿主菌。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌细胞BL21。
上述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的制备方法，其步骤包括：
(1)构建前述的表达载体，将其转化到表达宿主菌中；
(2)培养表达宿主菌，诱导重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17表达；
(3)纯化表达产物，得到重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17。
本发明还公开了上述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17在辅助细胞培养中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的重组XⅦ型胶原蛋白Pro.C17，具有良好的生物活性，其生物活性接近人体XⅦ型胶原蛋白。本发明所制备的重组XⅦ型人源化胶原蛋白Pro.C17的氨基酸序列源自天然胶原蛋白氨基酸序列，可以与其余蛋白复配成为组织工程产品、化妆品、保健品或药物的原材料。且可用原核系统来进行表达，表达体系简单，成本低，产量高。
附图说明
图1本发明的重组表达载体pET30a-17-1质粒图谱。
图2本发明的重组表达载体pET30a-17-2质粒图谱。
图3本发明的重组表达载体pET30a-17-3质粒图谱。
图4本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-1诱导表达SDS-PAGE胶图；泳道1是重组胶原蛋白Pro.C17-1不诱导组，泳道2是重组胶原蛋白Pro.C17-1诱导组。
图5本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-2诱导表达SDS-PAGE胶图；泳道1是重组胶原蛋白Pro.C17-2不诱导组，泳道2是重组胶原蛋白Pro.C17-2诱导组。
图6本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-3诱导表达SDS-PAGE胶图；泳道1是重组胶原蛋白Pro.C17-3不诱导组，泳道2是重组胶原蛋白Pro.C17-3诱导组，泳道3是重组胶原蛋白Pro.C17-3诱导平行组。
图7本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-1纯化后SDS-PAGE胶图。
图8本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-2纯化后SDS-PAGE胶图。
图9本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-3纯化后SDS-PAGE胶图。
图10本发明的重组胶原蛋白Pro.C17-1、Pro.C17-2、Pro.C17-3和商品化的人胶原蛋白的细胞黏附活性检测结果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：重组XⅦ型胶原蛋白Pro.C17系列质粒的制备
(1)基因设计及合成
SEQ ID No.1为XⅦ型胶原蛋白的全序列。CN 113185604 A显示，XⅦ型胶原蛋白无法进行全序列表达，因为XVII型胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋白，分为胞内、跨膜、胞外三大类结构域，极难进行全序列的表达。
本发明中，构建重组人源XⅦ型胶原蛋白的表达载体，其中重组XⅦ型胶原蛋白Pro.C17分别为Pro.C17-1、Pro.C17-2、Pro.C17-3，其对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7，对应的编码基因序列分别为SEQ ID No.8、SEQ ID No.12、SEQIDNo.13。其中Pro.C17-3系由SEQ ID No.3-5所示的氨基酸序列拼接后再重复一次而成，SEQ IDNo.3-5所示的多肽对应的编码基因序列展示在SEQ ID No.9-11中。将重组XⅦ型胶原蛋白Pro.C17对应的编码基因SEQ ID No.8、SEQ ID No.12委托北京六合华大基因科技有限公司合成，基因序列SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11可从基因序列SEQ IDNo.8中获取。
(2)重组表达载体的构建
以上述合成的基因片段为模板，PCR扩增，并将目的基因片段和pET30a表达载体骨架通过Gibson-plasmid连接方式进行连接，得到相应的质粒，
引物设计：
PCR扩增：
| 体系成分 | 成分体积 |
| 引物F | 2.5μL |
| 引物R | 2.5μL |
| 2xSuperNova PCR Mix(Dye) | 25μL |
| 委托华大基因合成的编码基因 | 1μL |
| ddH2O | To 50μL |
配制完PCR体系后，混匀并离心，PCR扩增条件为：第一阶段98℃预变性30s；第二阶段98℃变性10s，50-72℃退火30s，72℃延伸30s/kb，33个循环次数；第三阶段72℃终延伸2min。使用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收上述载体及基因片段，按照产品说明书的操作步骤进行。
Gibson连接：
| 体系成分 | 成分体积 |
| Gibson Assembly Master Mix(2X) | 5μL |
| 连接片段 | 0.2–1pmols*XμL |
| dd H2O | (5-X)μL |
| 总体系 | 10μL |
将以上成分在冰上混匀之后置于37℃热浴60min，获得的连接产物储存在冰上或者-20℃，以便后续的感受态转化。
连接产物通过热激方法转化至宿主菌E.coliDH5α中，涂布与LB培养抗性平板，37℃保温过夜，随机挑取阳性克隆，进行LB液体培养基，37℃，220rpm培养过夜，采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，构建成功的质粒pET30a-17-1、pET30a-17-2、pET30a-17-3，其图谱参见图1-3。
(3)工程菌的构建
将上述获得的重组表达质粒通过热激方式转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌，具体过程为：①取5μL的重组表达质粒于100μL的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min；②将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min；③向该混合物中加入500μL无抗性的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)，37℃，220rpm条件下培养0.5h；④取200μL该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/mL氨苄青霉素)上；⑤将平板倒置培养于37℃恒温箱中，培养约16h，待长出清晰可见的菌落，得对应的DE3-pET30a-17-1、DE3-pET30a-17-2、DE3-pET30a-17-3工程菌。
实施例2：工程菌的诱导表达
将上述平板上的单菌落置于含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养10小时，此为一级种子液，以1％的接种量接种到新的LB培养基中，37℃培养过夜，此为二级种子液，再以5％的接种量接种到新的LB培养基中，37℃培养2h，加入终浓度为0.5mMIPTG、18℃进行诱导表达，培养20小时。4000g、4℃离心20min收集菌体。
将菌体重悬在裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,500mM NaCl,pH8.5)中，加入100X蛋白酶抑制剂PMSF，然后使用360W超声仪超声30min(超声3s间隙6s)破碎细胞后，取1mL破碎液在4℃和10000g下离心10min，取80μL上清，沉淀用200μL裂解缓冲液重悬，弃120μL重悬液，上清和沉淀都加入20μL 5X蛋白上样缓冲液，混合后在沸水浴中加热10min进行SDS-PAGE，结果如图4-6所示，在诱导的情况下，构建的工程菌都有蛋白表达。
实施例3：表达产物的纯化
将实施例2所得到的破碎液进行10000g 4℃离心30分钟，收集上清液，用清水洗涤Ni亲和柱柱材，用buffer 1(25mMTris，200mM NaCl，pH8.0)平衡柱材，上样，用含有20mM咪唑的洗涤缓冲液(20mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)漂洗杂蛋白，用含有250mM咪唑的溶液(250mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)洗脱目的蛋白；用含有1M咪唑的溶液洗涤柱材，再用水洗涤柱材，最后用20％乙醇填充柱材。
纯化后的蛋白样品取80μL上清，加入20μL 5X蛋白上样缓冲液，混合后在沸水浴中加热10min进行SDS-PAGE，结果如图7-9所示，经Ni亲和柱纯化后的蛋白样品纯度很高，只有目的蛋白。
实施例4：重组XⅦ型人源化胶原蛋白的生物活性检测
胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,JBiochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：
(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括商品化的人XⅦ型胶原蛋白、本发明提供的重组XⅦ型人源化胶原蛋白Pro.C17。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
(2)向96孔板中加入100μL各浓度调整后的蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min。
(3)每孔中加入105个培养状态良好的3T3细胞，37℃孵育60min。
(4)每孔用PBS清洗4次。
(5)用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测每个孔在492nm的吸光度OD492nm。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细胞贴壁率＝(测试孔-空白孔)×100％/(阳性孔-空白孔)。
结果如图10所示，从图10可知，相比于商品化的人胶原蛋白，添加了本发明的重组人源化XⅦ型Pro.C17胶原蛋白的孔OD492nm更大，意味着该孔细胞的贴壁率越高。证明本发明的蛋白Pro.C17具有比商品化的人胶原蛋白更高的生物活性，能在更短的时间内给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。
Claims (9)
1.一种重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17，其特征在于其序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。
2.权利要求1所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示。
4.权利要求1所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达载体，其特征在于所述载体为pET30a。
6.权利要求1所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达宿主菌。
7.根据权利要求6所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的表达宿主菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌细胞BL21。
8.权利要求1所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建权利要求4所述的表达载体，将其转化到表达宿主菌中；
(2)培养表达宿主菌，诱导重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17表达；
(3)纯化表达产物，得到权利要求1所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17。
9.权利要求1所述的重组ⅩⅦ型胶原蛋白Pro.C17在辅助细胞培养中的应用。
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