CN117903293A

CN117903293A - 一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白及其制备方法和用途

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Publication number: CN117903293A
Application number: CN202410309842.9A
Authority: CN
Inventors: 竹林贵史; 覃兴炯; 周勃宇; 李雨帆; 李可心
Original assignee: Rufenghuang Regenerative Technology Development Chengdu Co ltd
Current assignee: Rufenghuang Regenerative Technology Development Chengdu Co ltd
Priority date: 2024-03-19
Filing date: 2024-03-19
Publication date: 2024-04-19

Abstract

本发明属于医疗、化妆品原料技术领域，具体涉及一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白及其制备方法和用途。本发明的三螺旋胶原蛋白结构式如式I所示：式I：H₂N‑(X‑Y‑Z)_n‑COOH；其中，X‑Y‑Z是由三种不同氨基酸残基构成的肽链；X、Y、Z分别独立选自脯氨酸残基、羟脯氨酸残基或甘氨酸残基。其重均分子量分布为5.0×10⁴~3.0×10⁸。本发明的胶原蛋白具有三重螺旋结构，热稳定性良好，具有更好抗皱紧致功效和注射填充效果，能够更好的应用于化妆品、医疗器械等领域，应用前景良好。

Description

一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医疗、化妆品原料技术领域，具体涉及一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白是人体含量最高的功能性蛋白，具有稳定的三螺旋网状结构，有着非常重要的生理功能。其主要存在于皮肤、骨骼、韧带等组织中，维持了各组织和器官的稳定和正常机能。近年来，随着科学技术的进步，人工胶原蛋白被应用于化妆品、医疗整形、医用材料等众多领域。

在美妆领域中，胶原蛋白被广泛应用于护肤品和化妆品，以改善皮肤的水分保持能力、弹性和光泽度等。许多功能性护肤品、面膜、精华液、洗面奶等都添加了胶原蛋白。胶原蛋白可补充皮肤所需的养分，改善皮肤细胞生存环境，促进皮肤组织的新陈代谢，从而达到延缓衰老、滋养皮肤的功效。目前市面上的大部分胶原蛋白保养品，多是制备出高含量的胶原蛋白原料，利用科技手段让其小分子化，更易于皮肤吸收。在医疗整形行业及医用材料领域中，胶原蛋白也有着广泛的应用。比如在面部填充、抗衰老整形、皮肤修复等方面，胶原蛋白被作为一种重要的生物填充材料。此外，还可以用于临床治疗皮肤烧伤、创伤等病理改变，改善皮肤状况。在组织工程中，胶原蛋白作为一种生物可降解材料，可以用来制造各种组织工程支架，用于支持细胞生长和组织修复。同时，由于其良好的生物相容性和生物降解性，也可以用于制备医用缝合线、皮肤移植等医用器械。仿生材料作为再生医学的核心组成部分，极大地丰富了疾病治疗的手段。胶原蛋白占据了人体蛋白质总量30%以上，可通过胶原蛋白来开发人工皮肤、人工骨、人工角膜、人工肌腱及韧带、人工软骨等类器官及组织，且相关开发均取得了不同程度的成功制备及研究成果。因胶原蛋白在细胞粘附性、增殖性、生物相容性、生物吸收性等方面具有优势，并且是具有充分的力学强度的生物材料，特别是在利用与细胞和组织直接接触的医用材料治疗中是最好的选择。还可以作为细胞材料，或者作为细胞治疗药物、细胞组织片等大量制备的关键技术，今后市场规模有望大幅扩大。与此同时，胶原蛋白在高龄者组织及器官再生与修复方面也希望展开更多研究及有更多的实际应用成果与案例。因此，通过产业与医院融合研究仿生生物材料临床价值和应用场景,为此推动仿生生物材料产业高质量发展，具备现实临床价值和创新的产业价值。

目前人工胶原蛋白主要分为从牛、猪、鸡、鱼等动物组织中提取的动物源胶原蛋白，以及通过生物发酵、纯化和基因编辑等方法制得的重组胶原蛋白。然而，人工胶原蛋白的生产存在一些技术问题。首先，从动物体内提取胶原蛋白，可能会引起免疫风险，如以疯牛病为首的病毒和疾病的传播。其次，由于动物源胶原蛋白的氨基酸序列与人胶原蛋白的序列存在一定差异，因此无法保证具有足够的生物活性、稳定性和安全性。重组胶原蛋白虽然能保证更完整的氨基酸序列，然而其过程繁琐且成本高昂，并且无法确定是否具有完整的三螺旋结构,其生物活性存疑。

而化学合成制备的类胶原蛋白目前还未有重大突破。首先，虽然模仿人胶原蛋白氨基酸序列的多肽合成已经可以理论实现，然而如何正确地折叠这些蛋白质分子，使其形成具有活性的三螺旋结构，是一个关键技术难点。另外，如何制备出具有优异热稳定性三螺旋结构的胶原蛋白也是目前面临的重大挑战之一。

现有技术中，对于类胶原蛋白的多肽分子可采用多肽合成仪进行合成。多肽合成仪是一种专门设计用于在体外合成多肽链的自动化实验室设备。它基于固相多肽合成（Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS）技术，通过精确控制反应条件和步骤，能够高效地构建从几个氨基酸到数百个氨基酸组成的多肽链。然而，实验研究表明，利用多肽合成仪制备得到的多肽分子难以形成三重螺旋结构，且即使形成了三重螺旋结构，其也存在热稳定性不足的问题。而胶原蛋白用于制成化妆品或医疗器械时，会存在一定的耐受环境温度或进行高温消毒的需求。不稳定的三重螺旋结构难以在较高温度下维持，这对于上述多肽在化妆品或医疗器械中的应用造成了一定的困难。

因此，开发一种具有更好的热稳定性的胶原蛋白替代品是本领域亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明提供一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白及其制备方法和用途。

一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白，其结构式如式I所示：

式I：H₂N-(X-Y-Z)_n-COOH；

其中，X-Y-Z是由三种不同氨基酸残基构成的肽链；所述三螺旋胶原蛋白的重均分子量分布为5.0×10⁴~3.0×10⁸

X、Y、Z选自如下组合中的一种：

X为甘氨酸残基，Y为羟脯氨酸残基，Z为脯氨酸残基；

X为羟脯氨酸残基，Y为脯氨酸残基，Z为甘氨酸残基；

X为脯氨酸残基，Y为羟脯氨酸残基，Z为甘氨酸残基；

X为脯氨酸残基，Y为甘氨酸残基，Z为羟脯氨酸残基。

优选的，所述n 的取值满足1.05×10⁶≧n≧175。

优选的，所述三螺旋胶原蛋白是采用结构式为H₂N-X-Y-Z –COOH的三肽作为原料，通过液相反应进行缩合后得到的。

本发明还提供上述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，将结构式为H₂N-X-Y-Z –COOH的三肽和缩合助剂以磷酸盐缓冲液作为溶剂，配制成三肽溶液；将脱水缩合剂以磷酸盐缓冲液作为溶剂，配制成脱水缩合剂溶液；

其中，所述磷酸盐缓冲液采用如下重量份的原料进行配制：

氯化钾0.18~0.22份、

磷酸二氢钠 1.0~1.2份、

磷酸二氢钾 0.18~0.22份、

水995~1005份；

所述三肽溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液495~505体积份、

三肽49.5~50.5重量份、

缩合助剂4.9~5.1重量份；

所述脱水缩合剂溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液495~505体积份、

脱水缩合剂156~160重量份；

步骤2，将所述脱水缩合剂溶液添加至所述三肽溶液中，进行缩聚反应；所述缩聚反应中三肽、缩合助剂和脱水缩合剂的投料重量比为49.5~50.5:4.9~5.1:156~160；所述缩聚反应的温度为小于等于20℃，所述缩聚反应的时间为20~26小时；

步骤3，分离纯化，即得。

优选的，步骤1中，所述缩合助剂选自1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑中的至少一种；

所述脱水缩合剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-戊二酰亚胺或1,3-二环己基碳二亚胺中的至少一种；

所述磷酸盐缓冲液采用如下重量份的原料进行配制：

氯化钾0.2份、

磷酸二氢钠 1.15份、

磷酸二氢钾 0.2份、

水 1000份；

所述三肽溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液 500体积份、

三肽 50重量份、

缩合助剂 5重量份；

所述脱水缩合剂溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液 500体积份、

脱水缩合剂 158重量份。

优选的，步骤2中，所述脱水缩合剂溶液和三肽溶液中，三肽、缩合助剂和脱水缩合剂的投料重量比为50:5:158；

所述缩聚反应的时间为24小时。

优选的，步骤3中，所述分离纯化的具体步骤为：用均质机循环研磨，通过50000分子量截留膜过滤，得到含有所述三螺旋胶原蛋白的溶液。

本发明还提供上述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白在制备化妆品、药物、美容整形材料或医疗器械中的用途。

优选的，所述化妆品为功能性护肤品；

所述医疗器械为用于皮肤、骨骼、韧带的填充材料或工程支架。

优选的，所述功能性护肤品为面膜、精华液或洗面奶。

本发明还提供一种化妆品，它是以上述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白作为活性成分，加入辅料后制成的。

优选的，所述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的浓度为0.0005 wt%-0.05wt %。

优选的，所述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的浓度为0.005 wt%。

本发明提供的“三螺旋胶原蛋白”是指具有三肽重复单元和三重螺旋结构的蛋白质，它是以三肽重复单元作为重复结构的具有不同聚合度的蛋白质的混合物。所述“三重螺旋结构”是天然胶原蛋白所具有的基本结构，为三股多肽链相互缠绕形成的三螺旋结构，检测蛋白质或聚合物是否具有类似于天然胶原蛋白的三重螺旋结构的方法是利用圆二色光谱检测聚合物在220-230nm是否具有正峰。所述“体积份”和“重量份”的比例关系按照如下方式确定：

1体积份:1重量份=1ml:1g。

本发明提供了一种新的具有热稳定性的胶原蛋白，它是一种液相合成的多肽链，该多肽链以三个氨基酸为一个单元进行缩聚而得到。现有胶原蛋白产品在超过40℃的温度下会凝胶化，无法保持三重螺旋结构。在化妆品中（除冷藏使用的化妆品外），不能用作原料。此外，如果用作医疗器械，也无法进行加热灭菌（60℃以上）或消毒（高压灭菌锅）。本发明提供的胶原聚合物（多肽链）能够在常温和高温（40-60℃）的条件下保持三重螺旋结构，热稳定性优于现有的同类合成胶原产品，使得其能够更好的在化妆品或医疗器械中的应用。此外，本发明提供的胶原蛋白聚合物具有胶原蛋白聚合物具有更好的注射填充效果，能够促进成纤维细胞的CollagenⅠ基因和CollagenⅢ基因表达提升，具有抗皱紧致功效，且浓度为0.005 wt %时具有最佳的效果。

因此，本发明的胶原蛋白聚合物具有很好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实验例1中胶原蛋白在20-60℃进行热处理后的圆二色光谱图；

图2为实验例1中商品化的多肽在20-60℃进行热处理后的圆二色光谱图；

图3为实验例1中胶原蛋白的分子量测试结果图；

图4为实验例2中CollagenⅠ基因相对表达量的实验结果图；

图5为实验例2中CollagenⅢ基因相对表达量的实验结果图；

图6为实验例3中小鼠给药区域示意图；

图7为实验例3中给药1周后的成像结果图，其中，A为注射0.5 wt.%胶原蛋白的实验组，B为注射0.6 wt.%的低浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组，C为注射3wt.%的高浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组，D为注射PBS的对照组；

图8为实验例3中给药3周后的成像结果图，其中，A为注射0.5 wt.%胶原蛋白的实验组，B为注射0.6 wt.%的低浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组，C为注射3wt.%的高浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组，D为注射PBS的对照组。

具体实施方式

以下实施例和实验例中所用的试剂和原料，未特别说明的均为市售品。

实施例1具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白

本实施例提供具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白，它是一种具有三重螺旋结构的蛋白质，其结构式如下：

H₂N-(X-Y-Z)_n-COOH

式中的X、Y和Z由以下氨基酸残基构成：

X：脯氨酸（以下简称P）、

Y：羟脯氨酸（以下简称O）、

Z：甘氨酸（以下简称G）；

n≧4，由于本实施例的三螺旋胶原蛋白是具有不同聚合度的分子的混合物，因此n的取值有多种可能，可根据分子量的表征估计其范围。

上述三螺旋胶原蛋白的制备方法如下：

1、磷酸缓冲液的配制

将高纯水1000ml中加入氯化钾（KCl）0.2g、磷酸二氢钠（Na₂HPO₄）1.15g、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.2g，搅拌后制备磷酸缓冲液（Buffer-PB，以下简称PB液）。

2、三肽溶液的配制

将PB液500ml中加入三肽P-O-G（由Uniqs Inc.制造）50g和縮合助剂1-羟基苯并三唑（HOBt）5g，搅拌后制备三肽溶液（以下简称POG液）。

3、脱水缩合剂溶液的配制

将PB液500ml中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-戊二酰亚胺（EDC）158g，搅拌后制备脱水缩合剂溶液（以下简称EDC液）。

4、缩聚反应

将制备好的POG液倒入2L分液漏斗中，在恒温槽中冷却至2℃，然后逐渐添加已冷却至2℃的EDC液（POG液和EDC液用量体积比为1：1），控制反应温度保持在20℃以下，进行24小时的缩聚反应。将反应液转移到10L容器中，用均质机循环研磨，并通过50000分子量截留膜（旭化成AHP-1013D）用旋转泵过滤，得到含有目标产品三螺旋胶原蛋白的水溶液。

实施例2具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白

本实施例的三螺旋胶原蛋白及其制备方法与实施例1相同，区别在于：

X为甘氨酸残基（G），Y为羟脯氨酸残基（O），Z为脯氨酸残基（P），制备原料中采用的三肽对应替换为G-O-P。

实施例3具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白

当X为羟脯氨酸残基（O），Y为脯氨酸残基（P），Z为甘氨酸残基（G），制备原料中采用的三肽对应替换为O- P -G。

实施例4具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白

当X为脯氨酸残基（P），Y为甘氨酸残基（G），Z为羟脯氨酸残基（O），制备原料中采用的三肽对应替换为P-G-O。

实施例5 用于抗皱紧致的保湿水乳

本实施例提供一种保湿水乳，其组成包括：

实施例1制备的三螺旋胶原蛋白0.005 wt%、

甘油10wt%、

聚乙二醇15wt%、

透明质酸5wt%、

其余为水。

下面通过实验对本发明的技术方案做进一步说明。

实验例1 产品的表征

一、实验方法

本实验例对实施例1制备的三螺旋胶原蛋白进行表征，包括：

1、圆二色光谱表征

选择商品化的多肽作为对照品，其分子式为H₂N-(P-O-G)₁₀-COOH（购自安徽省国平药业有限公司）。该对照品的氨基酸序列与实施例1制备的样品相似，其与实施例1制备的样品的主要区别在于其采用的是多肽合成仪进行制备。

将实施例1的三螺旋胶原蛋白或商品化的多肽对照品制备为0.25mg/ml浓度的水溶液，并在20℃、40℃、60℃下进行1小时的热处理，对每个溶液取5ml，在圆二色光谱仪上进行分析。确认各样品是否存在三重螺旋结构胶原蛋白特有的正峰。

2、分子量表征

使用光散射法进行测定。使用Wyatt多角度光散射检测器DAWN HELEOS II和Wyatt差示折射率检测器Optilab T-rEX，柱子采用Shodex SB-806M。

二、实验结果

1、圆二色光谱表征

三螺旋胶原蛋白表征结果如图1所示，从图中可以看到，在20℃、40℃、60℃处理后，三组样品均能够检测到220-230nm范围内的正峰，且峰高度几乎没有变化，表明三螺旋胶原蛋白能够在20℃-60℃温度范围内保持稳定。这表明本发明提供的三螺旋胶原蛋白能够在20℃-60℃温度范围内形成稳定的三重螺旋结构。

商品化的多肽对照品的表征结果如图2所示，从图中可以看到，在20℃、40℃、60℃处理后，220-230nm范围内也能够检测到一定的正峰，这表明商品化的多肽也能够形成三重螺旋结构。然而，随着温度的升高，220-230nm范围内正峰高度降低，这表明该商品化的多肽分子形成的三重螺旋结构在热处理条件下容易消失，其三重螺旋结构的热稳定性不佳。

本实验结果表明，对于多肽而言，是否能够形成稳定的三重螺旋结构与其制备方法有关，而本发明提供通过液相合成方法制备得到的三螺旋胶原蛋白能够满足形成稳定的三重螺旋结构的要求。

2、分子量表征

如图3所示，结果显示，实施例1制备的三螺旋胶原蛋白的重均分子量Mw为5.0×10⁴~3.0×10⁸(g/mol)。

实验例2促进成纤维细胞-抗皱紧致相关基因表达效果的检测

一、测试目的

皮肤的衰老可以分为内在因素引起的内源性衰老和继发于外在因素导致的外源性衰老；其中氧化是皮肤衰老的最大威胁，主要由环境压力因素，如紫外线辐照、环境污染、烟雾、生活压力等造成，其中紫外线辐射是最主要的因素。当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，引起衰老相关基因表达，诱发炎症级联反应并降低弹性蛋白和胶原蛋白的表达量导致皮肤出现松弛、皱纹等光老化现象。光老化主要发生真皮层。

本测试以成纤维细胞为测试系统，针对CollagenⅠ、CollagenⅢ的基因表达变化情况，评价待测样品是否具有抗皱紧致功效。

二、实验方法

1、主要试剂

低糖DMEM 培养液(索莱宝)、胎牛血清(Gibco)、PBS (VivaCell)、胰蛋白酶(Gibco)、细胞裂解液（诺唯赞）。

2、主要设备

CO₂培养箱(Thermo，160i)、生物安全柜(苏净安泰，BSC-1604ⅡA2)、倒置显微镜(徕卡，DMi8)、QPCR 仪(罗氏)、落地半身紫外线治疗仪（希格玛高，SS-03AB）。

3、测试方法

测试分组具体设置如下：

设置空白对照（BC）、阴性对照（NC）、阳性对照（PC）和三个样品组（0.0005%、0.005%、0.05%）。其中，空白对照不进行给药和辐射处理；阴性对照仅进行9 J/cm²UVA照射；阳性对照组给药后进行9 J/cm²UVA照射，药物为100 μg/mL维生素C和7 μg/mL维生素E；三个样品组（0.0005%、0.005%、0.05%）给药后分别进行9 J/cm²UVA照射，药物分别为浓度0.0005 wt%、0.005wt%、0.05wt%的三螺旋胶原蛋白（按照实施例1的方法制备得到）。

具体操作步骤如下：

1) 细胞接种：将人成纤维细胞按8×10⁴/孔接种细胞至24 孔板，培养箱（37℃、5%CO²）中孵育过夜，培养基为DMEM培养液。

2) 给药：待24 孔板中细胞铺板率达到40%~60%时进行给药。空白对照组、阴性对照组每孔加入1 mL的细胞培养液（DMEM培养基）；阳性对照组每孔加入1 mL 含有100 μg/mL维生素C 和7 μg/mL 维生素E 的培养液（DMEM培养基）；三个样品组每孔加入1 mL 含有相应浓度三螺旋胶原蛋白的培养液（DMEM培养基）。

3) 辐射：给药完成24 h 后，阴性对照组、阳性对照组及样品组接受总剂量为9 J/cm2 的UVA 辐射，与此同时，空白对照组放置于相同的环境（UVA 辐射剂量为0 J/cm2）。

4) 收集细胞：孵育培养24 h 后，培养结束后，每孔加入0.5 mL 裂解液，室温放置5 min，使其充分裂解，转移至1.5 mL RNase-free Eppendorf 管中，按照操作规程提取RNA。

5) 反转录：按照RNA 反转录试剂盒产品说明书，合成cDNA。

6) 对CollagenⅠ、CollagenⅢ进行qRT-PCR 检测。

三、实验结果

CollagenⅠ基因含量检测结果如表1和图4所示：

表1 CollagenⅠ基因相对表达数据汇总表

备注：用t-test 方法进行统计分析时，NC 组与BC 组相比，显著性以#表示，p-value＜0.05 表示为#，p-value＜0.01 表示为##。样品组、PC 组与NC 组相比，显著性以*表示，p-value＜0.05 表示为*，p-value＜0.01 表示为**。

结果显示，与BC 组相比，NC 组成纤维细胞接受总剂量为9 J/cm²的UVA 辐射后，CollagenⅠ基因表达量显著下降(p＜0.01)，说明辐照刺激有效。

与NC 组相比，PC组的维生素C和维生素E 可以显著提高CollagenⅠ基因表达量(p＜0.01)，表明本次阳性对照检测有效。

与NC 组相比，样品在给药浓度为0.0005 wt%、0.005 wt %和0.05wt%时，成纤维细胞的CollagenⅠ基因表达量显著提升（p<0.05）。特别的，给药浓度为0.005 wt %时，成纤维细胞的CollagenⅠ基因表达量提升效果最佳，且提升效果显著优于PC组。

CollagenⅢ基因含量检测结果如表2和图5所示：

表2 CollagenⅢ基因相对表达数据汇总表

结果显示，与BC组相比，NC 组成纤维细胞接受总剂量为9 J/cm²的UVA 辐射后，CollagenⅢ基因表达量显著下降(p＜0.01)，说明辐照刺激有效。

与NC 组相比，PC 组的维生素C 和维生素E 可以显著提高弹性蛋白基因表达量(p＜0.01)，表明本次阳性对照检测有效。

与NC 组相比，样品在给药浓度为0.0005 wt%、0.005 wt %和0.05wt %时，成纤维细胞的CollagenⅢ基因表达量显著提升（p<0.05）。特别的，给药浓度为0.005 wt %时，成纤维细胞的CollagenⅢ基因表达量提升效果最佳，且提升效果与PC组相当。

以上实验结果表明，本发明的三螺旋胶原蛋白（特别是在给药浓度为0.005 wt %时）能够促进成纤维细胞的CollagenⅠ基因和CollagenⅢ基因表达提升，具有抗皱紧致功效。

实验例3 注射效果验证

一、实验目的

在医美领域，注射胶原蛋白类产品，可以起到皮肤填充与紧致、轮廓塑形、保湿与修复、促进伤口愈合和改善肤质等功效。双光子成像技术可以通过二次谐波（SHG）成像，对活体动物（小鼠）的胶原蛋白及肌纤维在不经过染色的情况下进行成像观察，因此可以通过双光子成像观察胶原蛋白类产品在注射至动物皮下后，在动物体内的存在情况，从而考察胶原蛋白类产品的注射效果。

二、实验方法

如图6所示，在小鼠背部皮肤给药区域设置，每只小鼠背部4个注射区域。按照是否注射胶原蛋白，将6周龄雄性BALB/c小鼠分为注射0.5 wt.%三螺旋胶原蛋白（按照实施例1的方法制备）的实验组，0.6 wt.%的低浓度重组人源化III型胶原蛋白（欧俪芳，c36）的实验组，3wt.%的高浓度重组人源化III型胶原蛋白（欧俪芳，c200）的实验组，和注射PBS的对照组。给药方式为水光针注射，每个注射区域（1*1cm）给药0.2ml，注射层次为真皮浅层和真皮深层，每组12只小鼠，分别在注射后的1周、3周予以双光子成像。

三、实验结果

注射后1周、3周的成像结果分别如图7、图8所示，从图中可以看到，注射后1周，可以在实验组中观察到胶原蛋白的累积，且0.5 wt.%三螺旋胶原蛋白实验组的胶原蛋白量不仅显著高于0.6 wt.%的低浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组，而且还显著高于3wt.%的高浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组。注射后3周，可以观察到各实验组的胶原蛋白进一步累积，表明注射胶原蛋白可促进小鼠自身胶原蛋白的再生。同时，与注射后1周的实验数据相似，0.5wt.%三螺旋胶原蛋白实验组的胶原蛋白量不仅显著高于0.6 wt.%的低浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组，而且还显著高于3%的高浓度重组人源化III型胶原蛋白的实验组。

以上实验结果表明，本发明的三螺旋胶原蛋白相比于现有技术中的重组胶原蛋白能够更有效地促进自身胶原蛋白的再生，因而具有更好的注射效果。

通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白，其具有与天然胶原蛋白相同的三重螺旋结构，能够促进成纤维细胞的CollagenⅠ基因和CollagenⅢ基因表达提升，具有抗皱紧致功效，具有更好的注射填充效果，且能够在20℃-60℃温度范围内保持三重螺旋结构，热稳定性良好，能够更好的应用于化妆品、医疗器械等领域，应用前景良好。

Claims

1.一种具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白，其特征在于，其结构式如式I所示：

式I：H₂N-(X-Y-Z)_n-COOH；

其中，X-Y-Z是由三种不同氨基酸残基构成的肽链；所述三螺旋胶原蛋白的重均分子量分布为5.0×10⁴~3.0×10⁸；

X、Y、Z选自如下组合中的一种：

X为甘氨酸残基，Y为羟脯氨酸残基，Z为脯氨酸残基；

X为羟脯氨酸残基，Y为脯氨酸残基，Z为甘氨酸残基；

X为脯氨酸残基，Y为羟脯氨酸残基，Z为甘氨酸残基；

X为脯氨酸残基，Y为甘氨酸残基，Z为羟脯氨酸残基。

2.按照权利要求1所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白，其特征在于：所述n 的取值满足1.05×10⁶≧n≧175。

3.按照权利要求1所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白，其特征在于：所述三螺旋胶原蛋白是采用结构式为H₂N-X-Y-Z –COOH的三肽作为原料，通过液相反应进行缩合后得到的。

4.权利要求1-3任一项所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，所述磷酸盐缓冲液采用如下重量份的原料进行配制：

氯化钾0.18~0.22份、

磷酸二氢钠 1.0~1.2份、

磷酸二氢钾 0.18~0.22份、

水995~1005份；

所述三肽溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液495~505体积份、

三肽49.5~50.5重量份、

缩合助剂4.9~5.1重量份；

所述脱水缩合剂溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液495~505体积份、

脱水缩合剂156~160重量份；

步骤3，分离纯化，即得。

5.按照权利要求4所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述缩合助剂选自1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑中的至少一种；

所述磷酸盐缓冲液采用如下重量份的原料进行配制：

氯化钾0.2份、

磷酸二氢钠 1.15份、

磷酸二氢钾 0.2份、

水 1000份；

所述三肽溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液 500体积份、

三肽 50重量份、

缩合助剂 5重量份；

所述脱水缩合剂溶液采用如下配比的原料进行配制：

磷酸盐缓冲液 500体积份、

脱水缩合剂 158重量份。

6.按照权利要求4所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述脱水缩合剂溶液和三肽溶液中，三肽、缩合助剂和脱水缩合剂的投料重量比为50:5:158；

所述缩聚反应的时间为24小时。

7.按照权利要求4所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述分离纯化的具体步骤为：用均质机循环研磨，通过50000分子量截留膜过滤，得到含有所述三螺旋胶原蛋白的溶液。

8.权利要求1-3任一项所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白在制备化妆品、药物、美容整形材料或医疗器械中的用途。

9.按照权利要求8所述的用途，其特征在于：所述化妆品为功能性护肤品；

10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于：所述功能性护肤品为面膜、精华液或洗面奶。

11.一种化妆品，其特征在于，它是以权利要求1-3任一项所述的具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白作为活性成分，加入辅料后制成的。

12.按照权利要求11所述的化妆品，其特征在于：所述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的浓度为0.0005 wt%-0.05wt %。

13.按照权利要求12所述的化妆品，其特征在于：所述具有热稳定性和促进自身胶原生成的三螺旋胶原蛋白的浓度为0.005 wt%。