CN116082454B - 一种具有骨密度调节活性的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有骨密度调节活性的多肽及其应用,属于生物活性肽领域。本发明提供了SEQ ID NO.1所示的多肽在调节骨密度、改善骨质疏松方面的新用途。该多肽能以剂量依赖的形式促进MC3T3‑E1细胞的增殖和分化,在浓度为100μg/mL干预72h后,MC3T3‑E1细胞活力提高了19%,碱性磷酸酶活性提高10%。同时,在体内小鼠模型中,持续12周的灌胃可显著增加去卵巢后骨质疏松小鼠的骨小梁数量,提高骨密度水平,具有较强的促进前成骨细胞增殖和分化的能力,在体内能显著改善骨质疏松症,可作为活性成分在骨密度调节的生物医药等领域中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有骨密度调节活性的多肽及其应用,属于生物活性肽领域。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量丢失、骨微结构改变、骨脆性增加为主要特征的全身性骨骼疾病。人口老龄化程度增加是骨质疏松发生比例逐年升高的一个关键因素。据统计,全世界有20多亿骨质疏松患者,仅在美国骨质疏松人数高达2 400万人,且其中每年约有150万名患者会发生骨折。由此带来了非常严重的经济负担,因此,骨质疏松症也成为了当今社会不容忽视的社会公众健康问题之一。临床上有多种方法来治疗骨质疏松,其中雌激素替代疗法是预防和治疗骨质疏松症的首选,但有许多研究及临床数据表明长期服用雌激素会导致肝功能受损,还会引起子宫内膜过度增生,引起子宫出血等毒副作用。此外,许多常用治疗药物均有较严重的并发症。随着科技的发展,人们越来越重视食物疗法,通过调整饮食结构同时合理摄取一些含有骨密度调节的活性成分来有效的预防骨质疏松的发生,同时也为开发一些安全高效的骨质疏松治疗药物提供辅助参考。
骨组织中的成骨细胞和破骨细胞和相互平衡是影响骨质的主要原因。一旦该平衡被打破就会引发骨的相关疾病。骨组织时刻都进行着溶解吸收和再生修复的过程,当骨组织受损时,成骨细胞就会大量增殖,并在细胞外基质中成熟、矿化,形成新的骨组织覆盖被吸收的部位。因此,成骨细胞活力的降低、凋亡的增加是引起骨质疏松的一个重要因素。成骨细胞分化增殖的过程受到激素、生长调控因子等许多因素的影响。随着年龄的增大,成骨细胞的活性降低,破骨细胞的活性相对升高,导致骨吸收大于骨形成,最终导致骨质疏松的发生。因此,适当提高成骨细胞的活力,促进骨稳态受损时成骨细胞增殖及分化的进程,缓减骨吸收和骨形成之间的平衡对于骨质疏松的预防有一定的意义。
研究表明,许多生物活性肽可以以完整肽段形式直接通过小肠粘膜吸收,发挥较强的营养价值,在疾病的预防或治疗中发挥越来越大的作用。胶原蛋白肽可刺激关节软骨形成II型胶原蛋白等主要蛋白的表达。此外,南极磷虾肽、罗非鱼胶原蛋白多肽、狭鳕鱼皮胶原多肽以及许多植物蛋白来源的多肽均被报道有较好的调节骨密度活性,但由于技术的限制以及工艺成本高等因素,限制了其进行工业化生产和利用。鳕鱼(Gadus morhua)作为一种高经济价值的食用鱼,前期研究表明鳕鱼酶解物具有较强的骨密度调节活性,能有效缓减去卵巢小鼠骨质疏松症的发生,但其中主要的活性多肽开发还有很长的路要走。因此以鳕鱼肽为原料,鉴定并开发主要的活性多肽对于骨质疏松药品的开发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有骨密度调节活性的多肽,可应用于功能食品开发与生物制药等领域,调节骨密度或预防骨质疏松。本发明以MC3T3-E1细胞的增殖及分化以及去卵巢小鼠的骨密度变化情况来评价多肽潜在的骨密度调节活性。
本发明提供了一种具有骨密度调节活性的多肽,其氨基酸序列为Gly-Glu-Thr-Asn-Pro-Ala-Asp-Ser-Lys-Pro-Gly-Ser-Ile-Arg(GETNPADSKPGSIR,P-GM-2),分子量为1428Da。
本发明还提供了所述多肽在制备缓解和/或治疗骨质疏松的药物中的应用。
在一种实施方式中,所述缓解和/或治疗骨质疏松包括:
(a)恢复因骨质疏松导致的骨密度降低;
(b)恢复因骨质疏松导致的骨量减少;
(c)恢复因骨质疏松导致的骨小梁数量减少。
在一种实施方式中,所述药物还含有药学上可接受的载体。
在一种实施方式中,所述药学上可接受的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述多肽的作用剂量≥20mg/kg。
本发明还提供了所述多肽在制备有助于改善骨密度的保健品中的应用。
本发明还提供了所述多肽的制备方法,包括如下步骤:将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,然后以这个氨基酸的氨基作为起点,与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键;不断重复这一过程,即可以得到目标多肽产物;合成反应完成后,去除保护基,将肽链与树脂分离,即可获得目标产物。
在一种实施方式中,所述方法还包括纯化,脱盐,冻干后,获得多肽的冻干粉末。
本发明还提供一种具有骨密度调节活性的食品或药物,含有SEQ ID NO.1所示的多肽。
在一种实施方式中,所述食品或药物中所述多肽的纯度≥98%。
有益效果:
本发明首次合成的骨密度调节活性肽Gly-Glu-Thr-Asn-Pro-Ala-Asp-Ser-Lys-Pro-Gly-Ser-Ile-Arg(SEQ ID NO.1所示),经检测具有良好的促进MC3T3-E1细胞增殖和分化活性,在浓度为100μg/mL干预72h后,MC3T3-E1细胞活力提高了19%,碱性磷酸酶活性提高10%。同时,在体内小鼠模型中,持续12周的灌胃可显著增加去卵巢后骨质疏松小鼠的骨小梁数量,提高骨密度水平(其中骨小梁数量由模型组的0.51 1/mm提升至0.78 1/mm,骨密度由0.43mg/cm3提升至0.46mg/cm3),可应用于具有骨密度调节的药品开发中;
2、本发明的骨密度调节活性肽水溶性良好、无色无味,可用于制备食品、保健品或药品,为骨密度的改善,骨质疏松症的改善或预防提供了新的可能。
附图说明
图1是利用高效液相色谱法测定的骨密度调节活性肽的结果图谱;
图2是固相法合成多肽液相-质谱联用鉴定结果图;
图3是所述鳕鱼活性肽(P-GM-2)在干预24h、48h和72h后对MC3T3-E1细胞的增殖情况影响图(*代表与空白对照组相比有显著性差异,p<0.05);
图4是所述鳕鱼活性肽(P-GM-2)对MC3T3-E1细胞的中碱性磷酸酶(ALP)活性影响图(*代表与空白对照组相比有显著性差异,p<0.05);
图5是所述鳕鱼活性肽(P-GM-2)对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶染色拍摄结果图(碱性磷酸酶活性部位呈蓝紫色);
图6是小鼠骨小梁三维重构图(空白组:Sham;去卵巢组:OVX;阳性药物特立帕肽组:OVX+TPTD;多肽样品组:OVX+P-GM-2);
图7是各组骨小梁数量结果图(空白组:Sham;去卵巢组:OVX;阳性药物特立帕肽组:OVX+TPTD;多肽样品组:OVX+P-GM-2;*代表有显著性差异,p<0.05);
图8是各组骨密度结果图(空白组:Sham;去卵巢组:OVX;阳性药物特立帕肽组:OVX+TPTD;多肽样品组:OVX+P-GM-2;*代表有显著性差异,p<0.05)。
具体实施方式
本发明下面结合细胞实验数据结果对本发明进行阐述,实施例中使用的试剂,如无特殊说明,均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂,实施例中方法如无特殊说明,均为常规实验方法。
下述实施例中所涉及的MC3T3-E1专用完全培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司;碱性磷酸酶活性测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司;碱性磷酸酶活染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;实验小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司;特立帕肽购自上海麦克林生化科技有限公司。
实施例1:具有促进MC3T3-E1细胞增殖活性多肽的制备
具有促进骨密度调节活性的多肽,其来源于鳕鱼酶解物,氨基酸序列为Gly-Glu-Thr-Asn-Pro-Ala-Asp-Ser-Lys-Pro-Gly-Ser-Ile-Arg(GETNPADSKPGSIR,简写为P-GM-2),采用固相合成获得,具体步骤如下:
a.称取n当量树脂放入反应器,加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时,然后抽掉DCM,加入序列中第一个氨基酸2n当量,加2n当量的DIEA,适量的DMF,DCM,DIEA(二异丙基乙胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM,氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇,反应半小时,抽掉反应液,用DMF、MEOH洗净;
b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量),2n当量HBTU(1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA,N2鼓泡反应半小时,洗掉液体,茚三酮检测,然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净,加入适量的脱帽液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基,洗净,茚三酮检测;
c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰;
d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下,倒入烧瓶中,然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95%TFA,2%乙二硫醇,2%三异丙基硅烷,1%水),震荡,滤掉树脂;
e.得到滤液,然后向滤液中加入大量乙醚,析出粗产物,然后离心,清洗即可得到序列的粗产物,再经过纯化,脱盐,冻干后获得白色粉末,其中多肽含量≥98%。采用液相和液相-质谱鉴定固相法合成多肽,结果如图1和图2所示。
实施例2:多肽的安全性评价
利用实验动物进行多肽的药物安全性评价,经单次口服及持续3个月的连续灌胃多肽样品,观察了实验动物生长情况及活动能力等行为学等指标,检测了包括饮食量、饮水量、体重变化、器官指数、以及死亡率等指标,经验证,实施例1制备的多肽未对实验对象带来明显的不良反应,具备一定的药用安全性。
实施例3:多肽的体外促进MC3T3-E1细胞增殖活性检测
取实施例1制备的多肽,进行体外促MC3T3-E1细胞增殖活性检测,通过测定多肽对MC3T3-E1细胞增殖和分化情况的影响来评价活性多肽的骨密度调节活性。
1、MC3T3-E1细胞的培养及促增殖活性的测定
(1)将MC3T3-E1细胞接种在完全培养基中,在37℃、5%的CO2和95%空气的潮湿环境中培养;
(2)采用MTT法测多肽对MC3T3-E1细胞增殖情况的影响。将培养后的MC3T3-E1细胞以5×103个/孔接板于96孔板中,培养24h后,吸走培养基,样品组分别加入不同浓度(1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)的多肽,空白组更换培养基,继续培养24h。培养完成后,每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT试剂,继续培养4h。培养结束后,除去培养基,加入150μL的DMSO,在暗处充分震荡10min后,在490nm下测定吸光值。
根据公式:细胞活力(%)=样品组/空白组×100%,计算细胞增殖比率。
如图3所示,多肽干预后,MC3T3-E1细胞的增殖率明显增加,与空白组相比有显著性差异(p<0.05),且呈现一定的剂量依赖性。在100μg/mL浓度下干预48h时,细胞活力提升比例达到最大值,增殖比例与空白对照组相比提高了25%。而当培养时间达到72h时,细胞活力为119%,与空白对照组相比有显著性差异(p<0.05)。
2、MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性的测定
将培养好的MC3T3-E1细胞以1×105个/孔接板于6孔板中,培养24h后,每孔加入不同浓度的多肽(1,10,100μg/mL),继续培养72h,收集培养基,根据碱性磷酸酶活性测定试剂盒的方法测定ALP活性。
如图4所示,在用不同浓度的多肽干预MC3T3-E1细胞72h后,MC3T3-E1细胞早期成骨分化的表型标志物ALP的活性显著增强,与空白组相比有一定的统计学差异(p<0.05),且呈现一定的剂量依赖性,其中100μg/mL浓度干预下ALP活性提高了10%。同时,碱性磷酸酶活性变化情况进一步用染色的方法来进行验证。
3、MC3T3-E1细胞中碱性磷酸酶(ALP)染色
将培养好的MC3T3-E1细胞以1×105个/孔接板于6孔板中,培养24h后,更换分化诱导培养基,同时在样品组中每孔加入不同浓度的多肽(1,10,100μg/mL),继续培养7天(每2天更换一次培养基)。待培养结束后,使用碱性磷酸酶染色液进行染色。
如图5所示,碱性磷酸酶活性随着多肽浓度的升高而增大(呈蓝紫色染色比例升高),说明经多肽可以促进前成骨细胞(MC3T3-E1)向成骨相比分化。
实施例4:多肽对去卵巢小鼠骨密度调节活性的研究
取实施例1制备的多肽,对去卵巢的骨质疏松小鼠模型进行持续12周的多肽灌胃,通过测定小鼠股骨微观结构、骨小梁数量及骨密度大小等指标的变化情况来评价多肽在体内的骨密度调节活性。
1、去卵巢骨质疏松小鼠模型的建立
购买10周龄的雌性C57BL/6小鼠,饲养在光照/黑暗周期为12小时,温度保持在22±2℃,相对湿度保持在55±5%的SPF级动物室。小鼠自由饮食饮水适应一周后,进行小鼠卵巢摘除手术。具体操作如下:将小鼠用氨基甲酸乙酯麻醉后,侧身固定,将取腿部向上一指距离上方约1cm高度进行脱毛备皮,然后使用消毒后的手术剪刀在中间区域开口,先剪开外皮,再剪开腹腔膜,创口约2-3mm。从开口处用镊子深入腹腔取出脂肪下的输卵管,在输卵管的远端找到卵巢,并将将输卵管用缝合线进行结扎,之后用手术剪摘除卵巢(左右均需摘除)。空白组除去同于卵巢大小的脂肪,作为假手术组。最后缝合伤口,伤口消毒处理。小鼠恢复一周后,除了假手术组外,其他小鼠均被随机分为3组,具体设计如下:
空白组:Sham,持续灌胃生理盐水(n=8);
模型组:OVX,持续灌胃生理盐水(n=8);
阳性药物组:OVX+TPTD,每两天颈部注射一次特立帕肽(40μg/kg,n=8);
多肽样品组:OVX+P-GM-2,持续灌胃P-GM-2肽(20mg/kg/天,n=8)。
持续进行12周的灌胃后,使用氨基甲酸乙酯进行麻醉处死,取小鼠股骨进行进一步分析评价。
2、小鼠股骨Micro-CT断层扫描分析
取下小鼠股骨组织后,使用Micro-CT扫描系统(SKYSCAN1272,Bruker,Germany)对其进行扫描。扫描仪操作参数如下:X射线电压,50kV;过滤片为0.5毫米铝,旋转角度为360°,间隔0.2°,每间隔扫描两次。将仪器的扫描股骨小梁部分通过NRecon软件进行三维重建,采用CTAn软件将所有小梁骨转换为3D模型,并计算出各组小鼠骨小梁数量及其骨密度大小。
3、实验结果
利用去卵巢手术建立小鼠由于雌激素缺乏导致的骨质疏松模型,经12周的灌胃多肽,通过测定小鼠骨小梁数量及骨密度变化等情况来评价多肽的抗骨质疏松活性。小鼠股骨组织的3D重构结果如图6所示,从图中可看出与空白组相比模型组中小鼠的骨量显著减少,而灌胃多肽后的小鼠骨量明显增加。进一步对骨质进行量化分析结果如图7和8所示,与正常组(0.921/mm)比较,模型组中去卵巢小鼠的骨小梁数量明显减少至0.51 1/mm,骨密度也从正常的0.49mg/cm3降低至0.43mg/cm3(p<0.05),而与模型组相比,连续给予多肽(P-GM-2,20mg/kg/天)12周后,去卵巢小鼠的骨小梁数量显著增加至0.78 1/mm,骨密度也明显提高至0.46mg/cm3(p<0.05)。该活性效果与阳性药物特立帕肽相当。作为食源活性多肽,其在开发预防骨质疏松特别是由于雌激素缺乏导致的骨密度降低的药品方面有潜在的应用价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.多肽在制备缓解和/或治疗骨质疏松的药物中的应用,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述缓解和/或治疗骨质疏松包括:
(a)恢复因骨质疏松导致的骨密度降低;
(b)恢复因骨质疏松导致的骨量减少;
(c)恢复因骨质疏松导致的骨小梁数量减少。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述药物还含有药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的药物,其特征在于,所述药学上可接受的载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的药物,其特征在于,所述药物中的所述多肽的纯度≥98%。
6.根据权利要求4所述的药物,其特征在于,所述药物中的所述多肽的纯度≥98%。
7.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽在制备有助于改善骨密度的保健品中的应用。
8.一种具有骨密度调节活性的食品,其特征在于,含有SEQ ID NO.1所示的多肽。
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CN202211104433.2A CN116082454B (zh) | 2022-09-09 | 一种具有骨密度调节活性的多肽及其应用 |
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Non-Patent Citations (1)
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An in vitro and in silico study on the antioxidant and cell culture-based study on the chemoprotective activities of fish muscle protein hydrolysates obtained from European seabass and gilthead seabream;Can Altınelataman等;《Food Chemistry》;20180803;第724-732页 * |
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