WO2020153502A1 - 未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのリフレクトロンモードｍａｌｄｉ－ｔｏｆおよびｔｏｆ／ｔｏｆ質量分析のためのアニリン誘導体またはアミノオキシ基含有芳香族誘導体／ｄｈｂ／アルカリ金属マトリックス組成物 - Google Patents

未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのリフレクトロンモードｍａｌｄｉ－ｔｏｆおよびｔｏｆ／ｔｏｆ質量分析のためのアニリン誘導体またはアミノオキシ基含有芳香族誘導体／ｄｈｂ／アルカリ金属マトリックス組成物 Download PDF

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dhb
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matrix
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洋 比能
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国立大学法人北海道大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode

Definitions

  • the present invention provides a method for MALDI-TOFMS analysis with high accuracy and sensitivity without any modification of acidic sugar chains such as sialylated glycoconjugates, and a matrix system suitable for such a method.
  • Sialylated glycoconjugates play a biologically important role in nature.
  • a sialylated glycoconjugate in which N-acetylneuraminic acid (NeuAc), which is a type of sialic acid, is attached to the sugar chain is a lipid bilayer membrane on the cell surface using the lipid or protein to which the sugar chain is attached as an anchor.
  • N-acetylneuraminic acid which is a type of sialic acid
  • sialic acid residue is unstable in MALDI-MS, in-source degradation (ISD) or post-source degradation (PSD) is avoided in the analysis of sialic acid-containing sugar chains and glycoconjugates. Therefore, it is necessary to modify the carboxyl group of sialic acid.
  • MALDI-TOFMS Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry
  • DVB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • Fragmentation of sialic acid in both ISD and PSD produces pseudo-molecular ions, making it difficult to determine the original structure and content of glycans in the analyte.
  • a system in which ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) is used as a solid matrix and 3-aminoquinoline is added as an arylamine-type basic substance (3AQ/CHCA) forms a uniform ILM.
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • 3AQ/CHCA 3-aminoquinoline
  • MALDI target plates Such homogeneous ILM systems often improve both ionization efficiency and analyte signal reproducibility compared to conventional solid matrices, but the liquid spots form large heterogeneous crystals on the target plate. Like the easy DHB, it tends to broaden the peak shape of the ion signal.
  • aniline and its N-methyl derivatives form microcrystals or ionic liquids with DHB and unmodified hydrocarbons can be ionized for detection by MALDI-TOFMS.
  • Snovida S. I.; Chen, V. C.; Perreault, H., Use of a 2,5-dihydroxybenzoic acid/aniline MALDI matrix for improved detection and on-target Derivatization of glycans: A preliminaryChemical report. , 78(24), 8561-8.
  • Snovida S. I.; Rak-Banville, J.
  • ⁇ Sialic acid-containing compounds are known to accompany elimination of sialic acid under any conditions for structural analysis.
  • the above-mentioned non-patent documents include a report example of successful low resolution mass spectrometry without cleavage of sialic acid in the linear mode, but for suppressing the cleavage of unmodified sialic acid in the high resolution analysis using the reflectron mode. Not successful.
  • Non-Patent Document 2 (1) The crystallinity of DHB is changed by adding about 0.3 equivalent of aniline or N,N-dimethylaniline to DHB, and the sensitivity is increased by forming microcrystals. (2) When a free sugar chain is analyzed, the free sugar can be identified by combining it with an N,N-dimethylaniline additive because aniline forms a Schiff base with the reducing end of the sugar chain; and ( 3) It has been reported that the sialylated sugar chain can be measured without modification in a linear mode called post-source decomposition, which is not affected by an ion cleavage reaction after ionization.
  • Non-Patent Document 6 a liquid matrix is produced by mixing DHB and an aniline derivative in equal amounts so that the final concentration is 0.1 M; and, among aniline derivatives, N-methylaniline or N-ethylaniline is DHB. It has been reported that the use of a mixture of an equal amount of the above as a liquid matrix provides a sensitivity enhancement effect of about 100 times in MALDI-TOFMS analysis of neutral sugar chains with respect to a solid matrix of DHB alone. However, in this document, it is assumed that the mixture used is a liquid ionic matrix (ILM), the measurement target is only neutral sugar chains, and acidic sugar chains such as sialic acid that are easily released are handled. Absent.
  • ILM liquid ionic matrix
  • the pKa of sialic acid and DHB is about 2.5 to 3.0, and it is expected that the addition of DHB will facilitate protonation of the carboxylic acid site of sialic acid.
  • Anilines have a pKa of their proton adduct, which is a conjugate acid, of about 4.0 to 5.0, and by forming a salt with DHB or sialic acid, they exert a buffering ability to stabilize the pH of the solution near that pKa. There is expected.
  • the present invention in the MALDI-TOFMS analysis, suppressing the cleavage of the acidic sugar chain without pretreatment such as modification of the acidic sugar chain such as sialylated sugar chain, and a method for increasing the measurement sensitivity and ,
  • the development of a matrix system suitable for such a method is an issue.
  • sialic acid cleavage is involved in the structural analysis of sialic acid-containing compounds under any conditions, we searched for a matrix that can minimize the cleavage of sialic acid in the reflectron mode, which is necessary for high-resolution measurement.
  • the matrix composition in which the alkali metal ion is added to the /DHB matrix system most efficiently inhibits the cleavage of sialic acid, and further, the laser intensity is adjusted in TOF/TOF analysis to adjust the internal structure of the sugar chain and complex sugars. It has been found that mass analysis of the aglycone site of the peptide and the like can be performed.
  • the present invention comprises the following aspects. 1) Solid matrix system and its composition that realizes highly sensitive analysis of sialylated sugar chains and glycoconjugates in MALDI-TOFMS analysis; 2) MALDI-TOF mass spectrometry of sialylated sugar chains and glycoconjugates using the solid matrix system according to the invention; 3) MALDI-TOF/TOF mass spectrometry of sialylated glycans and glycoconjugates using the solid matrix system according to the invention; and 4) exploiting the laser power-dependent fragmentation tendency in the above MALDI-TOF/TOFMS analysis. Simulated MS/MS/MS analysis technology
  • Embodiment 1 of the present invention a composition in which an aromatic basic molecule having a conjugate acid of pKa 4.0 to 5.0 and a monovalent metal ion are added to 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) as a solid matrix. Is adopted as the solid matrix system.
  • the target concentration position can be controlled by using a target plate that can be expected to have a concentration effect, and high-sensitivity automatic analysis of a small amount of sample is enabled. Further, in order to sufficiently obtain the effects of the present invention, it is essential that the matrix system and the measurement target form a cloudy solid. According to the present invention, the property of the matrix is different from the conventional DHB and becomes a microcrystalline or amorphous solid, and the measurement target is uniformly distributed in the target area, so that the measurement reproducibility is improved. That is, a matrix having an ionic liquid property or a matrix having a property of forming a relatively large crystal is not a target of the present invention.
  • a fragment ion with a high fragmentation rate is selected by the TOF gate, and the cleavage information after passing through the gate is used in the reflect mode in the second stage TOF.
  • a method for realizing pseudo MS/MS/MS analysis by detecting and acquiring internal structure information of a sugar chain and a glycoconjugate to be analyzed.
  • sialylated sugar chains can be analyzed with high accuracy in reflectron mode without any modification.
  • FIG. 6 is a diagram showing attribution to each peak.
  • TOF MS spectrum Reflection mode MALDI- of negative mode measurement using a known Na ion-added NMA/DHB liquid matrix composition 18 (a) or the matrix composition 19 (b) of the present invention for SGP-10.
  • FIG. 3 is a photograph of the morphology of control Matrix Composition 3 or Matrix Composition 20 containing DHBNa alone, with SGP-10 as the analyte.
  • LIFT-TOF/TOF MS spectrum (a) measured at various laser outputs using the matrix composition 9 of the present invention in which SGP is an analysis target, spectra measured at a laser output of 40% and attribution to each peak (B) and spectrum measured at a laser output of 70% and attribution to each peak (c).
  • a solid matrix system and its composition that achieves sensitive analysis of sialylated glycoconjugates and glycopeptides in MALDI-TOFMS analysis.
  • the solid matrix system of the present invention comprises 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and a conjugate acid as a solid matrix in order to realize highly sensitive analysis of sialylated glycoconjugates and glycopeptides in MALDI-TOFMS analysis.
  • DLB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • conjugate acid as a solid matrix in order to realize highly sensitive analysis of sialylated glycoconjugates and glycopeptides in MALDI-TOFMS analysis.
  • aniline derivative selected from the group consisting of aromatic basic molecules having pKa 4.0 to 5.0 (aniline, N-methylaniline (NMA) and N,N-dimethylaniline (DMA) (hereinafter, including aniline, And an aminooxy group-containing aromatic derivative such as O-benzyloxyamine (BOA)), and lithium ion, sodium ion, potassium ion, rubidium ion, and cesium ion. And a alkali metal ion.
  • the aromatic basic molecule described above when mixed with DHB to suppress the crystallization of DHB to form a uniform matrix layer, to reduce the background noise of the MALDI-TOFMS spectrum, the aromatic basic molecule described above. To use.
  • the amount of the aromatic basic molecule added is preferably 10 mol% or more with respect to DHB, more preferably an equimolar amount or more (100 mol% or more) with respect to DHB. ..
  • the excessive addition of the aromatic basic molecule does not affect the effect of the present invention, but in the volatilization process of the excess aromatic basic molecule, if a large excess of the aromatic basic molecule exists, Since the concentration process until the formation of a matrix solid is delayed, it is desirable to keep the amount of aromatic basic molecule added to DHB in a small excess (preferably 150 mol% or less, more preferably 120 mol% or less). ..
  • the above alkali metal ion is used because it is stable under laser irradiation, has low corrosiveness, and easily vaporizes as a counter ion when added to the matrix.
  • salts of lithium, sodium, potassium, rubidium and cesium such as carbonic acid, hydrogen carbonate, hydrochloric acid and acetic acid are preferably used as the source of the above-mentioned alkali metal ions.
  • the amount of the alkali metal ion added is 1 to 50 mol %, preferably 5 to 25 mol %, more preferably 10 to 20 mol% based on DHB.
  • an alkali metal ion is added, fragmentation of sialic acid occurs, and a plurality of sialic acid fragmen peaks are generated together with a large number of metal ion addition peaks.
  • the amount of alkali metal ion added is 5 mol%, the fragment peak decreases, and when the amount added is 10 mol% or more, the cleavage of sialic acid is almost suppressed and no further suppression effect is exerted. This is because if it exceeds, the peak intensity starts to decrease.
  • MALDI-TOF mass spectrometry of unmodified sialylated glycoconjugates and glycopeptides uses the solid matrix system according to the invention. More specifically, the aqueous mixture of the solid matrix composition prepared by adding a source of an alkali metal ion such as, but not limited to, sodium hydrogencarbonate to a mixture containing a small excess of an aromatic basic molecule with respect to DHB. The solution is spotted onto the target plate and dried to form a microcrystalline or amorphous matrix layer. An aqueous solution to be analyzed is deposited on the matrix layer and dried to prepare a measurement sample to be analyzed.
  • a source of an alkali metal ion such as, but not limited to, sodium hydrogencarbonate
  • a plate having a liquid-repellent coating having one or more hydrophilic patches (anchors) on its surface is useful (for example, AnchorChip TM (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)).
  • AnchorChip TM Bruker Daltonics, Bremen, Germany
  • “Liquid repellency” means low wettability not only with water but also with alcohol, acetonitrile, and most organic solvents including acetone.
  • MALDI-TOF MS is performed on the obtained measurement sample using a MALDI-TOF mass spectrometer (for example, Ultraflex III MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics GmbH; Bremen, Germany)).
  • MALDI-TOF mass spectrometer for example, Ultraflex III MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics GmbH; Bremen, Germany)
  • the method of the present invention is particularly useful for measurement using the reflectron mode, which enables more accurate analysis.
  • MALDI-TOF/TOF mass spectrometry of unmodified sialylated glycoconjugates and glycopeptides is provided.
  • the MALDI-TOF/TOF mass spectrometry method according to the invention uses a solid matrix system according to the invention. LIFT-TOF/TOF analysis is performed by selecting the parent ion to be analyzed by the timed ion gate and without further ion acceleration in the LIFT cell.
  • a pseudo MS/MS/MS analysis technique utilizing the laser output-dependent fragmentation tendency of unmodified sialylated glycoconjugates and glycopeptides.
  • the pseudo MS/MS/MS analysis technique according to the present invention utilizes the MALDI-TOF/TOF mass spectrometry method according to the present invention. Fragment ions at specific m/z positions generated by multiple fragmentation by LIFT-TOF/TOFMS with high laser power are used as pseudo parent ions, and the fast fragmentation process is regarded as ISD based on the velocity difference at each fragmentation position. , T 3 -sequence analysis is performed as a pseudo MS 3 method, considering the slow fragmentation process as PSD.
  • the compounds used to prepare the matrix composition are shown in Figure 2.
  • a conventional solid matrix 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) were used.
  • As basic substances of arylamine type aniline, aniline derivatives N-methylaniline (NMA) and N,N-dimethylaniline (DMA), aminooxy group-containing aromatic derivatives O-benzyloxyamine, and amino
  • Sodium hydrogen carbonate was used as a source of monovalent metal ions.
  • sialyl glycopeptide (SGP) derived from egg yolk and SGP (SGP-10) in the form of disialyl decasaccharide derived from SGP were used as analysis targets.
  • the peptide that binds to SGP is represented by KVANKT (SEQ ID NO: 1), and the sugar chains are N-acetylneuraminic acid (NeuAc), galactose (galactose), N-acetylglucosamine (GlcNAc), and mannose (mannose). Configured ( Figure 3).
  • Sialyl glycopeptide (SGP), disialyl decasaccharide form of SGP (SGP-10), 2-aminopyridine (2AP), 3-aminopyridine (3AP), and 3-aminoquinoline (3AQ) are available from Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. ( Purchased from Tokyo, Japan).
  • 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB), ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), N-methylaniline (NMA) and N,N-dimethylaniline (DMA) are available from Sigma-Aldrich Corp. (St ., Louis, MO, USA).
  • Acetonitrile, aniline, trifluoroacetic acid (TFA), and sodium hydrogen carbonate were purchased from Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan).
  • O-benzyloxyamine (BOA) was purchased from Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Japan).
  • ⁇ Experiment 1> in the present invention, 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and an aniline derivative selected from the group consisting of aniline, N-methylaniline (NMA) and N,N-dimethylaniline (DMA) (hereinafter , And also collectively referred to as “aniline derivative” including aniline) and an alkali metal ion selected from the group consisting of lithium ion, sodium ion, potassium ion, rubidium ion and cesium ion.
  • DMB 2,5-dihydroxybenzoic acid
  • aniline derivative selected from the group consisting of aniline, N-methylaniline (NMA) and N,N-dimethylaniline (DMA)
  • aniline derivative including aniline
  • alkali metal ion selected from the group consisting of lithium ion, sodium ion, potassium ion, rubidium ion and cesium ion.
  • a matrix composition was prepared to investigate the effects of basic substances and sodium salts on the matrix. Choosing DHB as the solid matrix and a mixture of DHB and its sodium salt in a molar ratio of 9:1 and aniline, NMA, DMA, 2-aminopyridine, 3-aminopyridine, and 3AQ as the basic substances, Prepared as a 1.2:1 molar ratio of basic/DHB mixture. 3AQ/CHCA was also tested as a control. Dilute 0.5 M DHB in CH 3 CN/H 2 O (90:10, v/v) 10 times with TFA/CH 3 CN/H 2 O (0.1:50:50, v/v/v). A conventional matrix composition 1 was prepared.
  • 0.5 M DHB in CH 3 CN/H 2 O (90:10, v/v) was diluted 10 times with CH 3 CN/H 2 O (50:50, v/v) to obtain a control matrix composition. 2 was prepared. Add 0.5 M DHB (100 ⁇ L) in CH 3 CN/H 2 O (90:10, v/v) and 0.1 M sodium hydrogen carbonate (50 ⁇ L) in water to CH 3 CN/H 2 O (50:50, V/v) was added to 1.0 mL to prepare a control Na-added matrix composition 3.
  • 0.5 M DHB (100 ⁇ L) in CH 3 CN/H 2 O (90:10, v/v) 1.0 M aniline solution in CH 3 CN (60 ⁇ L) and 0.1 M sodium bicarbonate in water (50 ⁇ L) CH 3 CN/H 2 O (50:50, v/v) was added to 1 mL to prepare Na-added matrix composition 5.
  • CH 3 CN / H 2 O 90:10, v / v) 1.0 in 0.5 M DHB in (100 [mu] L) and of CH 3 CN in M N, N-dimethylaniline solution (60 ⁇ L)
  • CH 3 CN / H 2 Matrix composition 8 was prepared by increasing the volume to 1 mL with O 2 (50:50, v/v).
  • CH 3 CN/ A comparative matrix composition 16 was prepared by increasing the volume to 1 mL with H 2 O (50:50, v/v).
  • a comparative Na-containing matrix composition 17 was prepared by increasing the volume to 1 mL with 2 O (50:50, v/v).
  • SGP obtained as an egg yolk extract and a decasaccharide fragment (SGP-10) obtained by digesting the endoglycosidase were selected.
  • SGP-10 a decasaccharide fragment obtained by digesting the endoglycosidase
  • Matrix Composition 1 in which 0.1% TFA was added to DHB had a small signal-to-noise (S/N) ratio, and many fragment peaks were present.
  • DHB only matrix composition 2 had a low S/N ratio and many fragment peaks were present.
  • the detection limit of the matrix composition 3 was 5 pmol/spot.
  • aniline derivative aniline, NMA or DMA
  • the matrix compositions 10, 12, and 14 in which the aminopyridine derivatives (2AP, 3AQ, and 3AP) were added to DHB did not improve the S/N ratio, and no signal or weak signal was obtained.
  • Matrix compositions 11 and 13 with Na added to each composition showed no improvement in peak pattern.
  • the matrix composition 15 to which 3AQ was added the peak pattern was simplified, but a wider peak shape and higher baseline noise were generated.
  • the matrix composition 16 in which 3AQ was added to CHCA had the detection limit reduced to 1/1000 (5 fmol/spot) as compared with the matrix composition 3 in which CHCA was not added (ie, the signal). Sensitivity improved 1000 times). However, it gave a broader peak shape, higher baseline noise, and the fragmentation of sialic acid reduced the signal S/N ratio.
  • the matrix composition 17 to which Na was added to the composition had no signal.
  • the proton is desorbed from the carboxyl group, the Na + ion is ionically bonded to stabilize the structure, and fragmentation is suppressed.
  • aniline derivatives tested as additives to DHB aniline and NMA tended to give higher analyte ion peak S/N signal ratios than DMA.
  • aniline As reported in Non-Patent Document 2, the difference between aniline and NMA is the potential for aniline to selectively form an imine at the reducing end of SGP-10 to distinguish a reduced oligosaccharide from a glycoconjugate. It can be an intelligent tool. In contrast to aniline, NMA produced a simpler product ion peak pattern for sialyl oligosaccharides in the presence of adducts.
  • the sensitivity and simplified peak pattern in the low to mid femtomolar range for sialylation analytes using the aniline derivative/DHB/Na matrix system show the structure of sialylated glycans and glycoconjugates without any modification process. It may provide a potential choice for analysis.
  • FIG. 26 shows spectra of SMA measured in an NMA/DHB mixture having a molar ratio of 1.2:1 with various amounts of Na ions added to DHB.
  • a fragment peak of N-acetylneuraminic acid (NeuAc) residue is conspicuous, but when the amount of Na ion added is about 5 mol% relative to DHB, noise is reduced.
  • the amount of Na ion added was increased to 10 mol %, the fragment peak disappeared without noise, and almost only the parent peak was detected.
  • the peak pattern did not change even if the amount added was increased.
  • the Na ion addition amount reached 25 mol %, the peak intensity began to decrease, and the effect of an excessive amount of Na ion was observed.
  • the number of Na ions in the product ion peak did not change even when the amount of Na ions added exceeded 10 mol %. Therefore, in the present invention, it is suitable to add 5 to 25 mol% of alkali metal ion to 100 mol% of DHB, and more suitable to add 10 to 20 mol% thereof.
  • NMA/DHB mixture with a molar ratio of 1.2:1 was added to DHB.
  • a positive mode spectrum is shown in FIG. 27 and a negative mode spectrum is shown in FIG. 28 using SGP-10 as an analysis target using a matrix system to which 10 mol% of alkali metal ions are added. As shown in FIG.
  • alkali metal means any alkali metal of Li, Na, K, Rb, and Cs.
  • FIG. 29 shows the spectrum measured in the positive mode
  • FIG. 30 shows the spectrum measured in the negative mode, with SGP as the analysis target.
  • a molecular ion (C 112 H 186 N 15 Li 4 O 70 + , Exact Mass) corresponding to [M-3H+4alkali metal] + was obtained in any of the alkali metal ion-added matrix systems.
  • the solid matrix composition of the present invention containing an aniline derivative/DHB can analyze both SGP-10 having only sugar chains and SGP having both sugar chains and peptide chains. Even for the target, almost single product ion peak was given, which enabled high-accuracy mass spectrometry.
  • Non-Patent Document 6 reports that an equivalent mixture of an aniline derivative and DHB forms a liquid matrix by using a high-concentration matrix solution having a final concentration of 0.1M.
  • a dense matrix composition 18 was prepared by adding 0.1M sodium hydrogencarbonate in an amount equal to 1/10 of DHB to an equal mixture of 0.1M final concentration of DHB and NMA solution.
  • AnchorChip TM anchor chip target plate (Concentrated diameter 400 ⁇ m) (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) 0.5 ⁇ L was added and air-dried for about 30 minutes.
  • ionic liquids in the high vacuum mass spectrometer were Droplets were formed that maintained their properties (Figure 34a). It has been found that this liquid matrix can be analyzed as a liquid matrix by maintaining the properties of the liquid matrix even in a high vacuum in an environment in which a constant thickness can be maintained by its own surface tension.
  • the matrix composition 19 has the same composition and properties as the matrix composition 9.
  • the MALDI-TOF mass spectrometry method using the known liquid matrix containing the aniline derivative/DHB mixture and the MALDI-TOF mass spectrometry method using the solid matrix containing the aniline derivative/DHB mixture according to the present invention have the analytical characteristics. Was found to be very different.
  • the solid matrix containing the aniline derivative (arylamino type basic substance) according to the present invention was found to be useful for MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the inventor sought additional matrix components and found that aryloxyamino type basic substances such as O-benzylhydroxyamine (BOA) were also useful for MALDI-TOF mass spectrometry.
  • O-benzylhydroxyamine (BOA) is an aromatic base having a conjugate acid with a pKa that is almost the same as that of the aniline derivative (pKa:4.6 for aniline, pKa:4.3 for BOA). It was expected that the effect of adding ions would be obtained.
  • a matrix composition was prepared to investigate the effects of basic substances and sodium salts on the matrix.
  • DHB as a solid matrix and a mixture of DHB and its sodium salt in a molar ratio of 9:1 and O-benzyloxyamine (BOA) as a basic substance
  • BOA O-benzyloxyamine
  • a basic substance in a molar ratio of 1.2:1 Prepared as a /DHB mixture.
  • CH 3 CN/H 2 O 90:10, v/v
  • CH 3 CN with 1.0 M O-benzyloxyamine solution 60 ⁇ L
  • a matrix composition 20 was prepared by increasing the volume to 1 mL with O 2 (50:50, v/v).
  • a matrix composition 5 containing aniline/DHBNa, a matrix composition 20 containing BOA/DHBNa, or a matrix composition 7 containing NMA/DHBNa was used for analysis of SGP-10 or SGP, respectively.
  • the MALDI-TOF MS spectrum is shown.
  • the matrix composition of the present invention by properly using the matrix composition of the present invention, the sensitivity of the sugar chain peak to be analyzed is improved, the effect of suppressing the elimination of sialic acid is suppressed, and the sugar chain at the reducing end of the sugar chain is distinguished from the glycoside. Is possible. Furthermore, by properly using the three types of compositions shown in FIG. 40, three types of (a) sugar chain + matrix composition adduct, (b) matrix composition adduct only, (c) sugar chain only It becomes possible to obtain a peak pattern. For example, by comparing the peaks obtained using two matrix compositions (7 and 20) with BOA or NMA as additives, it is possible to distinguish free sugar chains. Further, although the peak pattern is complicated, it is expected that when the matrix composition 5 is used, the free sugar chain can be discriminated by a single measurement by extracting the molecular weight change corresponding to the addition of aniline. ..
  • the BOA addition reaction to a free sugar chain obtained by using the matrix composition 20 is used for the analysis of the free sugar chain and its sequence analysis by TOF/TOF analysis. ..
  • the BOA addition step and the analysis step using MALDI-TOFMS have been independent so far, and the matrix corresponding to the matrix composition 3 having low ionization efficiency is used in the MALDI-TOFMS analysis.
  • this BOA addition step and the MALDI-TOFMS analysis step can be integrated, so that the analysis step can be omitted and, as shown in the present invention, a significantly high Automatic multi-sample analysis is possible by sensitivity analysis and homogenization of matrix crystal field.
  • ISD In-source decomposition
  • PSD Post-source decomposition
  • ISD In-source decomposition
  • ISD is the internal energy of the ion itself in the drift space after ionization. It is a decomposition phenomenon caused by excitation due to collision with the residual gas. Cleavage of the analyte due to ISD or PSD occurs at multiple points in the molecule, resulting in various fragment ions. Since the internal energy of the ions depends on the laser output applied, it is known that the degree of increase in the amount of fragments produced differs depending on the cleavage of the laser output.
  • LIFT-TOF/TOF analysis was performed to accurately analyze the above events. LIFT-TOF/TOF without further ion acceleration in the LIFT cell (parent mode) to focus the PSD process on the main product ion peaks of SGP-10 (2087 Da) and SGP (2953 Da)
  • the parent ion was selected in the mode timed ion gate.
  • the parent ion peaks of both SGP-10 and SGP were metastable, with the parent ion peaks maintained at 40% laser power.
  • cross-ring cleavage of GlcNAc residues at the reducing end occurred preferentially over removal of sialic acid residues at the non-reducing end.
  • the formation of PSD product ions was promoted with increasing laser power and showed a complex peak pattern at 70% laser power.
  • cross-ring cleavage 0,2 A 6 -type fragment ions (m/z 1985) and 2,4 A 6 -type fragment ions (m/z 1926) are low lasers as the main PSD product ions.
  • the output (40%) was observed, and the cleavage of sialic acid to form Y 5 -type fragment ions (m/z 1773) was observed above 60% laser power.
  • the peak intensity of the major product ion (m/z 1613) resulting from double fragmentation consisting of Y 5 -type cleavage of the sialic acid residue and 2,4 A 6 -type cross-ring cleavage of the reducing end GlcNAc residue is It increased as the laser power increased from 40% to 70%.
  • protons with cross-ring cleavage 0,2 X 0 -type fragment ion (m/z 743) and cross-ring cleavage 0,2 A 7 -type fragment ion (m/z 2189) at the reducing terminal GlcNAc residue Peptide ion was observed from the low laser power (50%) as the main PSD product ion. At the higher laser power (70%), additional fragment ions were observed.
  • the peak intensity of the major product ion (m/z 1816) resulting from double fragmentation consisting of Y-type cleavage of the sialic acid residue and 2,4 A 7 -type cross-ring cleavage of the reducing terminal GlcNAc residue is determined by the laser intensity. It increased as the power increased from 40% to 70%.
  • the structural analysis of a sialylated glycoconjugate is performed by forming a layer of the solid matrix composition of the present invention containing an aniline derivative/DHB/alkali metal on a target plate in LIFT-TOF/TOF mass spectrometry, Ions observed at low powers by depositing analytes on top and irradiating the target with lasers at multiple different laser powers (eg, 40% to 70% of maximum power) to acquire multiple mass spectra.
  • the peak intensity as a reference, the cleavage site can be estimated based on the change in the relative intensity with the increase of the laser output, and the characteristic ion peak showing the internal structure can be identified.
  • the fast fragmentation process can be regarded as ISD, and the slow fragmentation process can be regarded as PSD to perform T 3 -sequence analysis as a pseudo MS 3 method. ..
  • the first-stage gate in TOF/TOF analysis was performed. The molecular weight was set and anti-laser output analysis was performed.
  • FIG. 44a shows the T 3 -sequencing spectrum of SGP-10 from the pseudo-parent ion at m/z 1613 Da selected by the LIFT-TOF/TOFMS parent mode with 70% laser power.
  • the pseudo-MS 3 spectrum of SGP-10 showed the correct sequence of the monosialylated octasaccharide with a glycerol moiety obtained by 2,4 A 6 -type cross-ring cleavage.
  • FIG. 44b shows the T 3 -sequencing spectrum of SGP derived from the pseudo-parent ion at m/z 1816 Da selected by the LIFT-TOF/TOFMS parent mode with 70% laser power.
  • the pseudo-MS 3 spectrum of SGP also showed the correct sequence of the monosialylated nonasaccharide with a glycerol moiety.
  • the matrix composition of the present invention is an aniline derivative/DHB matrix to which an alkali metal ion is added, and this matrix composition becomes a microcrystalline or amorphous uniform solid on a target plate for MALDI-TOF.
  • the main advantage is the high sensitivity and reproducibility of automated analysis of large numbers of analytes using prespotted target plates.
  • the matrix composition to which the alkali metal ion is added is used, in the reflectron mode MALDI-TOF mass spectrometry, the positive mode measurement and the negative mode measurement are performed, and the detailed structural analysis of the unmodified sialylated glycoconjugate is performed. Became possible.
  • the laser output dependent in the source or post-source decay patterns to be analyzed, pseudo MS 3 Strategies for detailed sequencing studies of analyte are possible.

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Abstract

本発明は、MALDI-TOFMS分析において、シアリル化糖鎖等の酸性糖鎖を一切修飾することなく酸性糖鎖の開裂を抑制し、かつ、測定感度を増大させる方法および、そのような方法に適したマトリックス系の開発を課題とする。本発明は、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）と、アニリンもしくはアニリンのN-アルキル誘導体またはアミノオキシ基含有芳香族誘導体と、アルカリ金属イオンと、を含有する固体マトリックス組成物を用いることによって、上記課題を解決した。

Description

未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのリフレクトロンモードＭＡＬＤＩ－ＴＯＦおよびＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析のためのアニリン誘導体またはアミノオキシ基含有芳香族誘導体／ＤＨＢ／アルカリ金属マトリックス組成物
　本発明は、シアリル化複合糖質等の酸性糖鎖を一切修飾することなく、高い精度および感度でMALDI-TOFMS分析する方法および、そのような方法に適したマトリックス系を提供する。
　シアリル化複合糖質は、自然界において生物学的に重要な役割を果たす。例えば、シアル酸の一種であるN-アセチルノイラミン酸（NeuAc）が糖鎖に結合したシアリル化複合糖質は、糖鎖が結合している脂質やタンパク質をアンカーとして細胞表面の脂質二重膜上に提示される。このとき正常な細胞表面に提示される糖鎖と、異常細胞（例えば、がん細胞）の表面に提示される糖鎖と、が異なることが知られている（図１）。すなわち、細胞表面に提示されるシアリル化複合糖質は、疾病、感染、免疫機構のバイオマーカーである。したがって、精度の高い、シアリル化複合糖質の解析方法の開発は、非常に重要なテーマであり、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（MALDI-MS）を用いた解析が行われている。しかしながら、MALDI-MSにおいて、シアル酸残基は不安定であるため、シアル酸を含有する糖鎖及び複合糖質の解析には、インソース分解（ISD）またはポストソース分解（PSD）を回避するために、シアル酸のカルボキシル基の修飾が必要である。
　マトリックス支援レーザー脱離／イオン化-飛行時間型質量分析法（MALDI-TOFMS）は、生体分子の高感度、高分解能分析のための迅速で強力な方法である。炭水化物および複合糖質は、一般に2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）を固体マトリックスとして使用するMALDI-TOFMSの分析対象である。しかし、シアル酸やウロン酸に代表される酸性糖残基を含むオリゴ糖をイオン化する場合、カルボキシル基の負電荷はイオン化効率をかなり低下させ、そして多数の付加イオンピークを有する複雑なピークパターンを形成する。ISDおよびPSDの双方でシアル酸がフラグメント化されると、擬似分子イオンが生成され、分析対象中のグリカンの元の構造および含有量を特定することが困難になる。
　これらの課題を解決するために、シアル酸のカルボン酸残基を修飾して負電荷を中和し、シアル酸のグリコシド結合を安定化することが報告されている。この修飾戦略は、特に固相捕捉などの分離方法を用いる質量分析法を利用したグライコミクス型の研究には有効である。
　しかしながら、分析プロセス（例えば、酵素反応モニタリング）の簡素化とスピードアップのために、修飾プロセスなしの直接分析の要求がある。この意味で、2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノンおよびイオン液体マトリックス（ILM）などの代替マトリックス系がリニアモードでの酸性グリカンのイオン化効率および直接モニタリングを向上させることが報告されているが、これらの方法は、PSDのため、リフレクトロンモードでの高分解能分析には適していない。
　近年、様々なアリールアミン型の塩基性物質が、MALDIターゲットプレート上の分析対象と共にイオン液体および均質な結晶形を形成し、分析対象グリカンの感度と再現性を改善する、マトリックス中の添加剤として報告されている（非特許文献１～７）。
　例えば、固体マトリックスとしてα-シアノ－4－ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）を用い、アリールアミン型の塩基性物質として3-アミノキノリンを添加した系（3AQ/CHCA）は、均一ILMを形成して、MALDIターゲットプレート上に高感度のアミノキノリン標識グリカンを提供することが知られている。このような均一ILM系は、しばしば、通常の固体マトリックスと比較してイオン化効率と分析対象のシグナル再現性の両方を改善するが、液体スポットは、ターゲットプレート上で不均一な大きな結晶を形成し易いDHBと同様に、イオンシグナルのピーク形状を広げる傾向がある。また、アニリンおよびそのN-メチル誘導体は、DHBと微結晶またはイオン性液体を形成し、未修飾炭化水素はMALDI-TOFMSによる検出のためにイオン化することができることが知られている。
特許第5147815号明細書 特許第5467815号明細書 特許第5368725号明細書 特許第5682767号明細書 特許第4566604号明細書 特許第5289707号明細書 特許第5485449号明細書 特許第5301705号明細書 特許第5301706号明細書 特許第5301708号明細書
Snovida, S. I.; Chen, V. C.; Perreault, H., Use of a 2,5-dihydroxybenzoic acid/aniline MALDI matrix for improved detection and on-target Derivatization of glycans: A preliminary report. Anal Chem 2006, 78 (24), 8561-8. Snovida, S. I.; Rak-Banville, J. M.; Perreault, H., On the use of DHB/aniline and DHB/N,N-dimethylaniline matrices for improved detection of carbohydrates: automated identification of oligosaccharides and quantitative analysis of sialylated glycans by MALDI-TOF mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 2008, 19 (8), 1138-46. Kaneshiro, K.; Fukuyama, Y.; Iwamoto, S.; Sekiya, S.; Tanaka, K., Highly sensitive MALDI analyses of glycans by a new aminoquinoline-labeling method using 3-aminoquinoline/alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid liquid matrix. Anal Chem 2011, 83 (10), 3663-7. Watanabe, M.; Terasawa, K.; Kaneshiro, K.; Uchimura, H.; Yamamoto, R.; Fukuyama, Y.; Shimizu, K.; Sato, T. A.; Tanaka, K., Improvement of mass spectrometry analysis of glycoproteins by MALDI-MS using 3-aminoquinoline/alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid. Anal Bioanal Chem 2013, 405 (12), 4289-93. Fukuyama, Y.; Funakoshi, N.; Takeyama, K.; Hioki, Y.; Nishikaze, T.; Kaneshiro, K.; Kawabata, S.; Iwamoto, S.; Tanaka, K., 3-Aminoquinoline/p-coumaric acid as a MALDI matrix for glycopeptides, carbohydrates, and phosphopeptides. Anal Chem 2014, 86 (4), 1937-42. Zhao, X. Y.; Shen, S. S.; Wu, D. T.; Cai, P. F.; Pan, Y. J., Novel ionic liquid matrices for qualitative and quantitative detection of carbohydrates by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta 2017, 985, 114-120. Fukuyama, Y.; Nakaya, S.; Yamazaki, Y.; Tanaka, K., Ionic liquid matrixes optimized for MALDI-MS of sulfated/sialylated/neutral oligosaccharides and glycopeptides. Anal Chem 2008, 80 (6), 2171-9. Shin-Ichiro Nishimura, Kenichi Niikura, Masaki Kurogochi, Takahiko Matsushita, Masataka Fumoto, Hiroshi Hinou, Ryousuke Kamitani, Hiroaki Nakagawa, Kisaburo Deguchi, Nobuaki Miura, Kenji Monde, Hirosato Kondo "High-throughput protein glycomics: Combined use of chemoselective glycoblotting and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry" Angewante Chemie-International Edition, 44, 91-96, 2005. Hideyuki Shimamoka, Hiromitsu Kuramoto, Jun-ichi Furukawa, Yoshiaki Miura, Masaki Kurogochi, Yoko Kita, Hiroshi Hinou, Yasuro Shinohara, and Shin-Ichiro Nishimura* "One-pot solid phase glycoblotting and probing by trans-oximization for high-throughput glycomics and glycoproteomics" Chemistry-A Europian Journal, 13, 1664-1673, 2007. Yoshiaki Miura, Kentaro Kato, Yasuhiro Takegawa, Masaki Kurogouchi, Jun-ichi Furukawa, Yasuro Shinohara, Noriko Nagahori, Maho Amano, Hiroshi Hinou, Shin-Ichiro Nishimura* "Glycoblotting-assisted O-glycomics: Ammonium carbamate allows for highly efficient O-glycan release from glycoproteins" Analytical Chemistry, 82, 10021-10029, 2010.
　シアル酸含有化合物は、いかなる条件で構造解析を行っても、シアル酸の脱離を伴うことが知られている。上記した非特許文献は、リニアモードではシアル酸の開裂を伴わない低分解能質量分析に成功した報告例を含むが、リフレクトロンモードを使用する高分解能解析において未修飾シアル酸の開裂の抑制には成功していない。
　例えば、非特許文献２では、（１）DHBにアニリンまたはN,N-ジメチルアニリンを0.3等量程度添加することにより、DHBの結晶性が変化し、微結晶を形成することにより感度が増大すること；（２）遊離糖鎖を分析対象とする場合、アニリンが糖鎖の還元末端とシッフ塩基を形成することからN,N-ジメチルアニリン添加物と組み合わせることにより遊離糖を識別できること；および（３）ポストソース分解と呼ばれるイオン化後のイオン開裂反応の影響を受けないリニアモードにおいてはシアリル化糖鎖を無修飾で測定できること、が報告されている。しかし、この文献には、付加イオンの制御については記載されず、シアリル化糖鎖は高分解能解析に必要なリフレクトロンモードで解析すると、未修飾シアル酸含有シグナルが消失し、測定できなかったことが記載されている。
　また、非特許文献６では、終濃度0.1MとなるようにDHBとアニリン誘導体を等量混合することにより液体マトリックスが生じること；および、アニリン誘導体のうちN-メチルアニリンまたはN-エチルアニリンをDHBと等量混合したものを液体マトリックスとして使用すれば、DHB単体の固体マトリックスに対し中性糖鎖のMALDI-TOFMS分析において100倍程度の感度増大効果が得られること、が報告されている。しかし、この文献では、使用している混合物は液体イオンマトリックス(ILM)であり、測定対象が中性糖鎖のみであって、シアル酸等の脱離しやすい酸性糖鎖を取り扱うことは想定されていない。
　このように、本願の出願時には、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）などの酸性マトリックスに、塩基性物質を添加すること、または、ナトリウム塩を添加することが試みられていたが、シアル酸等の脱離しやすい酸性糖鎖を分析対象とするMALDI-TOFMS分析の測定感度を向上させ、特に、より精度の高いリフレクトロンモードにおいて、保護基などの修飾をすることなく、シアリル化糖鎖等の酸性糖鎖を解析する方法については一切検討されていない。
　さらに、シアル酸およびDHBのpKaは2.5～3.0程度であり、DHBを添加するとシアル酸のカルボン酸部位がプロトン化されやすくなることが予想される。アニリン類はその共役酸であるプロトン付加物のpKaが4.0～5.0程度であり、DHBやシアル酸と塩を形成することによりその溶液のpHをそのpKa付近に安定化させる緩衝能を発揮することが期待される。
　この、アニリン類が緩衝能を示すpH4～5付近では先述の遊離糖鎖と1級アミンのシッフ塩基形成の至適酸性度として知られており、非特許文献２に示された通り、分析対象である遊離糖と配糖化していない遊離糖鎖の還元末端部位と呼ばれるアルデヒドまたはケトン性官能基とイミンおよびオキシム誘導体とアミン類が脱水縮合しイミンを形成することから、このイミン形成反応が糖鎖還元末端の有無を検出する指標となる。
　一方、水存在下ではイミン形成は熱力学的に不利であり、イミン体の生成比率は少なくその再現性も低い。これに対し、同じ機構で生成するオキシムはアミノ基に隣接する酸素原子の隣接効果により、水中でも安定した脱水縮合型生成物を形成することが知られている。このオキシム形成反応は一般的にケミカルライゲーションと呼ばれ、タンパク質や塩などが存在する夾雑系で選択的に共有結合を形成する方法として利用されている。
　近年、糖鎖の還元末端とO置換型ヒドロキシルアミンとの組み合わせによるオキシム形成反応が糖鎖のラベル化および捕捉反応として報告されている。特に、糖鎖構造解析においてはヒドロキシアミン型のラベル化反応を鍵としたプロセスが報告されている。（特許文献１～１０、非特許文献８～１０）。
　よって、本発明は、MALDI-TOFMS分析において、シアリル化糖鎖等の酸性糖鎖の修飾操作などの前処理をすることなく酸性糖鎖の開裂を抑制し、かつ、測定感度を増大させる方法および、そのような方法に適したマトリックス系の開発を課題とする。
　シアル酸含有化合物の構造解析においていかなる条件においてもシアル酸の開裂を伴うため、高分解能測定に必要なリフレクトロンモードにおいてシアル酸の開裂を最小限に抑えることができるマトリックスを探索したところ、アニリン誘導体/DHBマトリックス系にアルカリ金属イオンを添加したマトリックス組成物が最も効率的にシアル酸の開裂を抑制し、さらに、TOF/TOF分析においてレーザー強度を調整することにより糖鎖の内部構造および複合糖質におけるペプチド等のアグリコン部位の質量解析が可能となることを見出した。
　さらに、上述のマトリックス系の比率を変化させることなくアニリン誘導体を、共役酸が類似のpKaを有する芳香族性塩基であるベンジルヒドロキシルアミンに置き換えたところ、配糖体である糖ペプチドにおいては上述のマトリックスと同様のイオン化効率が得られると共に、還元糖の分析においてはオキシム型の付加物を安定して形成することを見出した。
　すなわち、本発明は以下の態様よりなる。
　１）MALDI-TOFMS分析においてシアリル化糖鎖及び複合糖質の高感度解析を実現する固体マトリックス系とその組成；
　２）本発明による固体マトリックス系を使用する、シアリル化糖鎖および複合糖質のMALDI-TOF質量分析法；
　３）本発明による固体マトリックス系を使用する、シアリル化糖鎖および複合糖質のMALDI-TOF/TOF質量分析法；および
　４）上記MALDI-TOF/TOFMS分析においてレーザー出力依存的フラグメント化傾向を活用した疑似MS/MS/MS解析技術
　本発明の態様１においては、固体マトリックスとして2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）に、共役酸がpKa4.0～5.0を示す芳香族性塩基性分子および１価の金属イオンを添加した組成物を固体マトリックス系として採用する。
　本発明の態様２においては、濃縮効果を期待できるターゲットプレートを使用することによりサンプル濃縮位置を制御して、微量検体の高感度自動分析を可能とする。また、本発明の効果を十分に得るためには、マトリックス系と測定対象が白濁固体を形成することが必須である。本発明によれば、マトリックスの性状が従来のDHBと異なり、微結晶またはアモルファス状固体となってターゲットエリアに測定対象が均一に分布するため、測定再現性が向上する。すなわち、イオン性液体性状のマトリックスや、比較的大きな結晶を形成する性状のマトリックスは本発明の対象とはならない。
　本発明の態様３においては、TOF/TOF解析を行うことにより、糖鎖内部構造と共に複合糖質のペプチド部位など、断片情報を解析することが可能になる。
　本発明の態様４においては、断片化速度が部位によって異なることを利用し、断片化速度の速いフラグメントイオンをTOFゲートで選択し、さらにゲート通過後の開裂情報をリフレクトモードで2段階目のTOF検出することにより疑似MS/MS/MS解析を実現し、分析対象の糖鎖及び複合糖質の内部構造情報を取得する方法を提供する。
　本発明の固体マトリックス系を用いるMALDI-TOFMS分析によれば、リフレクトロンモードで、いかなる修飾もすることなくシアリル化糖鎖を高い精度で分析することができる。
正常細胞および異常細胞の表面上に結合するシアリル化糖鎖の概略図。 マトリックス組成物の調製に用いる化合物を示す概略図。 分析対象のシアリルグリコペプチド（SGP）の化学構造ならびに、SGPおよびSGP-10の模式図。 Naイオンを添加したマトリックス組成物のモルフォロジーの写真。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物１を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物２または３を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物４または５を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物６または７を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物８または９を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物１０または１１を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物１２または１３を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物１４または１５を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、マトリックス組成物１６または１７を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物１を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物２または３を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物４または５を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物６または７を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物８または９を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物１０または１１を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物１２または１３を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物１４または１５を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物１６または１７を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物１（ａ）、マトリックス組成物６（ｂ）、マトリックス組成物３（ｃ）、マトリックス組成物７（ｄ）を用いたリフレクトロンモードMALDI-TOF MSスペクトルと、各ピークへの帰属を示す図。 SGPを分析対象とする、マトリックス組成物６（ａ）またはマトリックス組成物７（ｂ）を用いたリフレクトロンモードMALDI-TOF MSスペクトル。 Naイオン添加量の異なるNMA/DHBマトリックス組成物のモルフォロジーを示す写真。 SGPを分析対象とする、Naイオン添加量の異なるNMA/DHBマトリックス組成物を用いたリフレクトロンモードMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、種々のアルカリ金属イオン添加NMA/DHBマトリックス組成物を用いた、ポジティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、種々のアルカリ金属イオン添加NMA/DHBマトリックス組成物を用いた、ネガティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、種々のアルカリ金属イオン添加NMA/DHBマトリックス組成物を用いた、ポジティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、種々のアルカリ金属イオン添加NMA/DHBマトリックス組成物を用いた、ネガティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 NMA添加量の異なるNaイオン添加DHBマトリックス組成物のモルフォロジーを示す写真。 SGPを分析対象とする、種々のNMA添加量のNaイオン添加DHBマトリックス組成物を用いた、ポジティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、種々のNMA添加量のNaイオン添加DHBマトリックス組成物を用いた、ネガティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 公知のNaイオン添加NMA/DHB液体マトリックス組成物１８（ａ）または本発明のマトリックス組成物１９（ｂ）のモルフォロジーを示す写真。 SGP-10を分析対象とする、公知のNaイオン添加NMA/DHB液体マトリックス組成物１８（ａ）または本発明のマトリックス組成物１９（ｂ）を用いた、ポジティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、公知のNaイオン添加NMA/DHB液体マトリックス組成物１８（ａ）または本発明のマトリックス組成物１９（ｂ）を用いた、ネガティブモード測定のリフレクトロンモードのMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、DHBNaのみを含む対照のマトリックス組成物３またはマトリックス組成物２０のモルフォロジーの写真。 SGP-10を分析対象とする、BOAを含まずDHBNaのみを含むマトリックス組成物３（ａ）またはBOA/DHBNaを含むマトリックス組成物２０（ｂ）を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物２０またはアニリン/BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物５を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、アニリン/DHBNaを含むマトリックス組成物５、BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物２０またはNMA/BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物７を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGPを分析対象とする、アニリン/DHBNaを含むマトリックス組成物５、BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物２０またはNMA/BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物７を用いたMALDI-TOF MSスペクトル。 SGP-10を分析対象とする、本発明のマトリックス組成物９を用いて種々のレーザー出力にて測定したLIFT-TOF/TOF MSスペクトル（ａ）、レーザー出力４０％で測定したスペクトルと各ピークへの帰属（ｂ）およびレーザー出力７０％で測定したスペクトルと各ピークへの帰属（ｃ）。 SGPを分析対象とする、本発明のマトリックス組成物９を用いて種々のレーザー出力にて測定したLIFT-TOF/TOF MSスペクトル（ａ）、レーザー出力４０％で測定したスペクトルと各ピークへの帰属（ｂ）およびレーザー出力７０％で測定したスペクトルと各ピークへの帰属（ｃ）。 70%のレーザー出力のLIFT-TOF/TOFMS親モードによって選択された、m/z 1613Daでの擬似親イオンに由来するSGP-10のT3-配列決定スペクトル（ａ）およびm/z 1816Daでの擬似親イオンに由来するSGPのT3-配列決定スペクトル（ｂ）。
　本発明の第１の態様において、MALDI-TOFMS分析においてシアリル化複合糖質および糖ペプチドの高感度解析を実現する固体マトリックス系とその組成が提供される。
　本発明の固体マトリックス系は、MALDI-TOFMS分析においてシアリル化複合糖質および糖ペプチドの高感度解析を実現するために、固体マトリックスとして、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）と、共役酸がpKa4.0～5.0を示す芳香族性塩基性分子（アニリン、N-メチルアニリン（NMA）およびN,N-ジメチルアニリン（DMA）よりなる群から選択されるアニリン誘導体（以下、アニリンも含み、総括的に「アニリン誘導体」と呼ぶ）またはO-ベンジルオキシアミン（BOA）などのアミノオキシ基含有芳香族誘導体）と、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンよりなる群から選択されるアルカリ金属イオンと、を含有するマトリックス組成物である。
　前記組成物において、DHBと混合したときにDHBの結晶化を抑制して均一なマトリックス層を形成し、MALDI-TOFMSスペクトルのバックグラウンドノイズを低減することから、上記の芳香族性塩基性分子を用いる。
　前記組成物において、芳香族性塩基性分子の添加量は、DHBに対して10モル%以上添加することが好ましく、DHBに対して等モル量以上（100モル％以上）添加することがより好ましい。本発明において、芳香族性塩基性分子の過剰添加は本発明の効果に影響を及ぼさないが、過剰芳香族性塩基性分子の揮発過程において、大過剰の芳香族性塩基性分子が存在すると、マトリックス固体形成までの濃縮工程を遅延させることから、芳香族性塩基性分子の添加量はDHBに対して小過剰（好ましくは150モル％以下、より好ましくは120モル％以下）に留めることが望ましい。
　前記組成物において、レーザー照射下で安定であり、腐食性が低く、かつ、マトリックスに添加した際に対イオンとして気化しやすいことから、上記のアルカリ金属イオンを用いる。限定されないが、上記のアルカリ金属イオンの源として、炭酸、炭酸水素、塩酸、酢酸などのリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムの塩が好適に用いられる。
　前記組成物において、アルカリ金属イオンの添加量は、DHBに対して1～50モル％であり、5～25モル％が好ましく、10～20モル％がより好ましい。本発明において、アルカリ金属イオンを添加しなければ、シアル酸のフラグメント化が起こり、多数の金属イオン付加ピークと共に、複数のシアル酸フラグメンピークが発生する。アルカリ金属イオンの添加量が5モル％になるとフラグメントピークが減少し、添加量が10モル％以上では、シアル酸の開裂がほぼ抑制され、それ以上の抑制効果は発揮されず、25モル％を超えると、ピーク強度が低下し始めるからである。
　本発明の第２の態様において、未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのMALDI-TOF質量分析法が提供される。
　本発明によるMALDI-TOF質量分析法は、本発明による固体マトリックス系を使用する。より詳しくは、DHBに対して小過剰量の芳香族性塩基性分子を添加した混合物に、限定されないが、炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ金属イオン源を添加して調製された固体マトリックス組成物の水性溶液を、ターゲットプレート上にスポットし、乾燥させて、微結晶またはアモルファス状のマトリックス層を形成する。マトリックス層上に、分析対象の水溶液を堆積し乾燥して分析対象の測定サンプルを作成する。
　本発明において、表面上に１以上の親水性パッチ（アンカー）を有する撥液性被膜が形成されたプレートが有用である（例えば、AnchorChipTM (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)）。「撥液性」とは、水のみならず、アルコール、アセトニトリル、さらにはアセトンを包含するほとんどの有機溶媒に対しても濡れ性が低いことをいう。
　得られた測定サンプルをMALDI-TOF 質量分析装置（例えば、Ultraflex III MALDI-TOF/TOF質量分析装置 (Bruker Daltonics GmbH; Bremen, Germany)）を用いて、MALDI-TOFMSを行う。本発明の方法は、特に、より高精度な分析が可能なリフレクトロンモードを用いる測定に有用である。
　本発明の第３の態様において、未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのMALDI-TOF/TOF 質量分析法が提供される。
　本発明によるMALDI-TOF/TOF質量分析法は、本発明による固体マトリックス系を使用する。時限イオンゲートにより分析対象の親イオンを選択し、LIFTセル中でさらなるイオン加速を行わず、LIFT-TOF/TOF解析を行う。
　本発明の第４の態様において、未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのレーザー出力依存的フラグメント化傾向を活用した疑似MS/MS/MS解析技術が提供される。
　本発明による疑似MS/MS/MS解析技術は、本発明によるMALDI-TOF/TOF質量分析法を利用する。
　高レーザー出力のLIFT-TOF/TOFMSによる多重フラグメント化で生じた特定のm/z位のフラグメントイオンを擬似親イオンとし、各フラグメント化位置での速度差に基づき、高速フラグメント化プロセスをISDとみなし、低速フラグメント化プロセスをPSDとみなして擬似MS3法としてT3-配列解析を行う。
　マトリックス組成物を調製するために用いた化合物を図２に示す。従来の固体マトリックスとして、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、α-シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）を用いた。アリールアミン型の塩基性物質として、アニリン、アニリン誘導体であるN-メチルアニリン（NMA）およびN,N-ジメチルアニリン（DMA）、アミノオキシ基含有芳香族誘導体であるO-ベンジルオキシアミン、ならびにアミノピリジン誘導体である2-アミノピリジン（2AP）、3-アミノキノリン（3AQ）、および3-アミノピリジン（3AP）を用いた。１価金属イオン源として、炭酸水素ナトリウムを用いた。
　また、分析対象として、卵黄由来のシアリルグリコペプチド（SGP）および、SGP由来のジシアリル十糖類形態のSGP（SGP-10）を用いた。SGPに結合するペプチドはKVANKT（配列番号：１）で示され、糖鎖は、N-アセチルノイラミン酸（NeuAc）、ガラクトース（galactose）、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、およびマンノース（mannose）から構成される（図３）。
　シアリルグリコペプチド（SGP）、ジシアリル十糖類形態のSGP（SGP-10）、2-アミノピリジン（2AP）、3-アミノピリジン（3AP）、および3-アミノキノリン（3AQ）は東京化成工業株式会社（Tokyo, Japan）から購入した。2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、α-シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）、N-メチルアニリン（NMA）、N,N-ジメチルアニリン（DMA）はSigma-Aldrich Corp.（St. Louis, MO, USA）から購入した。アセトニトリル、アニリン、トリフルオロ酢酸（TFA）、および炭酸水素ナトリウムは、和光純薬（Osaka, Japan）から購入した。O-ベンジルオキシアミン（BOA）は、和光純薬（Osaka, Japan）から購入した。
＜実験１＞
　本発明において、固体マトリックスとして、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）と、アニリン、N-メチルアニリン（NMA）およびN,N-ジメチルアニリン（DMA）よりなる群から選択されるアニリン誘導体（以下、アニリンも包含して、総括的に「アニリン誘導体」と呼ぶ）と、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンよりなる群から選択されるアルカリ金属イオンと、を含有するマトリックス組成物が、リフレクトロンモードMALDI-TOFMSおよびMALDI-TOF/TOFMS配列決定法を用いる未修飾シアリル化オリゴ糖および糖ペプチドの生成物イオンの解析に非常に有用であることを明らかにした。
［マトリックス組成物の調製］
　最初に、マトリックスに対する塩基性物質およびナトリウム塩の影響を調べるためのマトリックス組成物を調製した。
　固体マトリックスとしてDHBおよび9:1のモル比のDHBとそのナトリウム塩の混合物を選択し、塩基性物質としてアニリン、NMA、DMA、2-アミノピリジン、3-アミノピリジン、および3AQを選択して、1.2:1のモル比の塩基性物質/DHB混合物として調製した。3AQ/CHCAも対照として試験した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHBをTFA/CH3CN/H2O (0.1:50:50, v/v/v)で１０倍希釈して、従来のマトリックス組成物１を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHBをCH3CN/H2O (50:50, v/v)で１０倍希釈して、対照のマトリックス組成物２を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)および水中の0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1.0 mLに増量して、対照のNa添加マトリックス組成物３を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 Mアニリン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物４を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)、CH3CN中1.0 Mアニリン溶液(60 μL)および水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、Na添加マトリックス組成物５を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 M N-メチルアニリン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物６を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)、CH3CN中1.0 M N-メチルアニリン溶液(60 μL)および水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、Na添加マトリックス組成物７を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 M N,N-ジメチルアニリン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物８を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)、CH3CN中1.0 M N,N-ジメチルアニリン溶液(60 μL)および水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、Na添加マトリックス組成物９を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 M 2-アミノピリジン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物１０を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)、CH3CN中1.0 M 2-アミノピリジン溶液(60 μL)および水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、Na添加マトリックス組成物１１を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 M 3-アミノピリジン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物１２を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)、CH3CN中1.0 M 3-アミノピリジン溶液(60 μL)および水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、Na添加マトリックス組成物１３を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 M 3-アミノキノリン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物１４を調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)、CH3CN中1.0 M 3-アミノキノリン溶液(60 μL)および水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (50 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、Na添加マトリックス組成物１５を調製した。
　CH3CN/H2O (50:50, v/v)中の50 mM CHCA (200 μL)、水中の0.1 M炭酸水素ナトリウム (10 μL)および3-AQ (13 mg)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、比較対象のマトリックス組成物１６を調製した。
　CH3CN/H2O (50:50, v/v)中の0.1 M CHCA (100 μL)、水中0.1 M炭酸水素ナトリウム (10 μL)および3-AQ (13 mg)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、比較対象のNa添加マトリックス組成物１７を調製した。
［分析対象溶液およびプレスポットMALDIターゲットプレートの調製］
　SGPおよびSGP-10をmilli-Q水で希釈して、分析対象の10, 1, 0.1, 0.01 pmol/μL溶液を調製した。
　上記で調製した各マトリックス組成物の溶液（0.25μL）をMTP AnchorChipTM 400/384 TF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)上にスポットし、周囲温度にて30分間乾燥して、プレスポットMALDIターゲットプレートを調製した。
　プレスポットMALDIターゲットプレート上に、分析対象溶液 (0.5 μL)を堆積させ、周囲温度で乾燥させた。
［マトリックス組成物のモルフォロジーの観察］
　60 mmのエクステンションチューブ付きの顕微鏡対物レンズUPlanFLN 4× (Olympus, Tokyo, Japan)を備えた工業用カメラDMK 33UX264 (Imaging Source; Bremen, Germany)を用いて、ターゲットプレート上にスポットされたマトリックス組成物のモルフォロジーを撮影し、SharpCap Softwareを用いて記録した。
　Naイオンを添加したマトリックス組成物２、４、６、８、１０、１２、１４および１６のモルフォロジーを記録した顕微鏡写真を図４に示す。
　MALDIターゲットプレート上のマトリックス層のモルフォロジーは、分析対象の感受性の結果および生成物イオンの再現性に密接に関係する。
　塩基性物質が無添加の場合、DHBは、AnchorChipTMのスポットの中心に収束する前に、大きな針状結晶となり、不均一なマトリックス層を形成した。
　DHBにアニリン、NMA、DMA、および3AQを添加した場合、マトリックス組成物はAnchorChipTMの中心スポットに、微結晶またはアモルファス状の均一なマトリックス層を形成した。
　DHBに2APを添加した場合、マトリックス組成物は、中心スポットに集中する前に細い針状結晶となり、不均一なマトリックス層を形成した。
　DHBに3APを添加した場合およびCHCAに3AQを添加した場合、マトリックス組成物は、中心スポットにILMを生じた。
　10%ナトリウムの有無はいずれのマトリックス組成物のモルフォロジーにも影響を及ぼさなかった。また、マトリックス組成物のモルフォロジーは、プレスポットマトリックス上への分析対象の添加後および乾燥後に変化しなかった。モルフォロジー観察結果を表１にまとめた。
［MALDI-MS分析］
　最大出力30 mWの200 Hz スマートビーム Nd:YAG UV レーザー (355 nm)を備えたUltraflex III MALDI-TOF/TOF質量分析装置 (Bruker Daltonics GmbH; Bremen, Germany)をリフレクトロンモードで使用した。ターゲットプレート上のスポット位置はオートティーチング機能を使用して較正した。すべてのサンプルの質量スペクトルは、200 Hzのレーザー周波数でのシューティングポジションパターンのランダムウォークモードで500回のレーザーショットで、リフレクトロンモードにつきm/z 700～5000の範囲で取得した。較正用の外部標準としてBrukerペプチド較正標準IIを使用した。上記以外、サンプルポジションとレーザー出力は、FlexControl 3.5ソフトウェアを使用して用意されたデフォルト設定を採用した。
　分析対象として、卵黄抽出物として得られるSGPとそのエンドグリコシダーゼ消化により得られた十糖フラグメント（SGP-10）を選択した。ここでの分析システムの簡便さのメリットを最大限にし、将来の自動化のために、AnchorChipTM MALDIターゲットプレート上にプレスポットして形成したマトリックス層の上に分析対象の水溶液をスポットし、ランダムウォークエリアを使用して分析し、人為的な、DHBマクロ結晶の「スイートスポット」選択の影響を最小限にした。
　ランダムウォークレーザー照射で500ショットを使用して得られた各マトリックス系での各スポット上の5 pmolのSGP-10 (1,200～2,400 Da)またはSGP (2,000～3,200 Da)に対するリフレクトロンモードのMALDI-TOFスペクトルを、それぞれ、図５～１３（SGP-10）および図１４～２２（SGP）に示し、検出限界を表１にまとめた。
　分析対象がSGPおよびSGP-10のいずれの場合も、同じ結果が得られた。
　従来のマトリックス系として、DHBに0.1%TFAを添加したマトリックス組成物１は、信号対ノイズ（S/N）比が小さく、多くのフラグメントピークが存在した。
　対照のマトリックス系として、DHBのみのマトリックス組成物２は、S/N比が小さく、多くのフラグメントピークが存在した。
　その組成物に対してNa添加したマトリックス組成物３も同様であった。マトリックス組成物３の検出限界は5 pmol／スポットであった。
　DHBにアニリン誘導体（アニリン、NMAまたはDMA）を添加したマトリックス組成物４、６および８は、S/N比が上昇したが、多くのフラグメントピークが存在した。アニリン誘導体を添加しないDHBのみのマトリックス組成２と比較しても、シアル酸のフラグメント化および付加金属イオンの変動によりピークパターンがより複雑化した。
　それぞれの組成物に対してNaイオン添加したマトリックス組成物５、７および９は、上昇したS/N比を維持しつつ、フラグメントピークが減少した。Naイオン添加前は、Naイオン付加ピーク、プロトン付加ピークおよびカリウムイオン付加ピークと共に、複数のシアル酸フラグメントピークが複雑に組み合わさったスペクトルが得られるため解析が困難であるが、Naイオン添加により、付加イオンが均一化されてピークパターンが単純化されたと考えられる。
　また、検出限界が、無添加のマトリックス組成物３に対して100分の１（50 fmol/スポット）まで低下した（すなわち、シグナル感度が１００倍向上した）。
　DHBにアミノピリジン誘導体（2AP、3AQ、および3AP）を添加したマトリックス組成物１０、１２、１４は、S/N比の改善がなく、無信号か弱い信号しか得られなかった。
　それぞれの組成物に対してNa添加したマトリックス組成物１１および１３は、ピークパターンの改善を示さなかった。一方、3AQを添加したマトリックス組成物１５は、ピークパターンが単純化されたがより広いピーク形状、より高いベースラインノイズが生じた。
　比較対象のマトリックス系として、CHCAに3AQを添加したマトリックス組成物１６は、検出限界が、無添加のマトリックス組成物３に対して1000分の１（5 fmol/スポット）まで低下した（すなわち、シグナル感度が１０００倍向上した）。しかしながら、より広いピーク形状、より高いベースラインノイズを与え、シアル酸のフラグメント化がシグナルのS/N比を低下させた。
　その組成物に対してNa添加したマトリックス組成物１７は、無信号となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［考察］
　SGPを分析対象として、マトリックスDHBの従来のマトリックス組成物１と、DHBに、それぞれ、NMA、NaまたはNMA/Naが添加された、マトリックス組成物６、３、７の各マトリックス系を用いるリフレクトロンモードのMALDI-TOFスペクトルの各ピークについて帰属した（図２３ａ～ｄ）。図２３ａ～ｄで示すスペクトルは、それぞれ、図１４、１５および１７で示すスペクトルと同一である。
　いずれのスペクトルからも、SGPから３つのプロトンが脱離し、４つのNa+イオンが結合したピーク[(M-3H+4Na)+ = 2953]が観察された。従来のマトリックス組成物１、マトリックスDHBにNMAのみを添加したマトリックス組成物６およびNaイオンのみを添加したマトリックス組成物３では、様々なフラグメントピークが生じ、シアル酸が開裂していることが分かる（図２３ａ～ｃ）。また、DHBにNMAのみを添加したマトリックス組成物６（図２４ａ）と比較すると、DHBにNMAおよびNaイオンを両方とも添加したマトリックス組成物７（図２４ｂ）は、ほぼ親ピークのみの単純なピークパターンを示していることが分かる。このことから、例えば、N-アセチルノイラミン酸（NeuAc）残基に着目すると、DHBにNMAおよびNaイオンの双方を添加しない場合、下式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
で示されるように、カルボキシル基のプロトン転移を起因とするフラグメント化が起こり、種々の構造が存在することになるが、DHBにNMAおよびNaの双方を添加することによって、下式（２）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で示すように、カルボキシル基からプロトンが脱離し、Na+イオンがイオン結合して構造が安定になり、フラグメント化が抑制されると考えられる。
　上記の結果から以下のことが明らかとなった。
　DHBマトリックスにアニリン、NMAまたはDMAを添加すると、分析対象イオンピークの感度が大幅に向上する（50 fmol/スポット）。アニリン誘導体/DHBに10モル％のナトリウムイオンを添加することで、分析対象化合物のシグナルパターンの単純化がもたらされた。ナトリウムイオンの添加は、アニリン誘導体/DHBマトリックス系のシグナル感度に影響を及ぼさず、イオン化プロセスの間のシアル酸残基の損失およびリフレクトロンモードMALDI-TOF分析に必要な飛行時間を最小限に抑えて、親ピーク中のナトリウムイオンの数は、分子内のカルボキシル基の数と分析対象の１つの付加イオンの合計と同一となり、SGP [(M-3H+4Na)+ = 2953]およびSGP-10 [(M-2H+3Na)+ = 2087]につき、それぞれ、ほぼ単一の生成物イオンピークを与えたことは注目に値する。
　DHBへの添加剤として試験されたアニリン誘導体の中で、アニリンおよびNMAは、DMAよりも高い分析対象イオンピークのS/Nシグナル比を与える傾向があった。アニリンとNMAとの違いは、非特許文献２で報告されているように、アニリンがSGP-10の還元末端で選択的にイミンを形成して還元オリゴ糖を複合糖質から識別するための潜在的ツールとなり得ることである。アニリンと対照的に、NMAは、付加物の存在下でのシアリルオリゴ糖のより単純な生成物イオンピークパターンを生じた。
　すなわち、アニリン誘導体/DHB/Naマトリックス系を用いたシアル化分析対象の中低度フェムトモル範囲の感度および単純化されたピークパターンは、いかなる修飾プロセスもなしに、シアル化グリカンおよび複合糖質の構造分析のための可能性のある選択を提供し得る。
＜実験２＞
　NMA/DHB/アルカリ金属マトリックス系を用いて、各マトリックス系のモルフォロジー、シグナル感度、および主要分子イオンピークに対する添加金属イオンの付加パターンについて調べた。
（１）DHBに対するアルカリ金属イオン添加の影響
［マトリックス組成物のモルフォロジーの観察］
　実験１と同様に、ターゲットプレート上にスポットされたマトリックス組成物のモルフォロジーを記録した。
　図２５に示すように、AnchorChipTMターゲットプレート上のNMA/DHBマトリックス組成物のモルフォロジーは、1.2:1のモル比のNMA/DHB混合物に、DHBに対して0～50モル％の範囲のNaイオンを添加しても変化しなかった。
［MALDI-MS分析］
　実験１と同様に、SGPを分析対象として、リフレクトロンモードMALDI-TOFMSを行った。1.2:1のモル比のNMA/DHB混合物に、DHBに対して種々のNaイオンの添加量で、SGPを分析対象として測定したスペクトルを図２６に示す。
　Naイオン無添加の場合、例えば、N-アセチルノイラミン酸（NeuAc）残基のフラグメントピークが目立っているが、Naイオンの添加量がDHBに対して5モル％程度になると、ノイズが低減されてきた。さらにNaイオンの添加量を増量して、10モル％になると、ノイズもなく、フラグメントピークが消滅して、ほぼ親ピークのみが検出されている。それ以上、添加量を増やしても、ピークパターンは変化しなかった。ここには示していないが、Naイオン添加量が25モル％になると、ピーク強度が低下し始め、過剰量のNaイオンの影響が観察された。また、生成物イオンピーク中のNaイオンの数は、Naイオン添加量が10モル％を超えても変化しなかった。
　よって、本発明においては、100モル％のDHBに対してアルカリ金属イオンは5～２５モル％添加することが適切であり、10～20モル％添加することがより適切である。
　次に、Naイオン以外のアルカリ金属イオン（Li+, K+, Rb+, Cs+）についても添加効果を確認するために、1.2:1のモル比のNMA/DHB混合物に、DHBに対して10モル％のアルカリ金属イオンを添加したマトリックス系を用いて、SGP-10を分析対象として、ポジティブモード測定したスペクトルを図２７に示し、ネガティブモード測定したスペクトルを図２８に示す。
　図２７に示した通り、リフレクターポジティブモードではいずれのアルカリ金属イオン添加系においても[M-2H+3alkali metal]+に相当する分子イオン(C76H123N5Li3O57 +, Exact Mass: 2038.7354; C76H123N5Na3O57 +, Exact Mass: 2086.6567; C76H123N5K3O57 +, Exact Mass: 2134.5786; C76H123N5Rb3O57 +, Exact Mass: 2272.4228; C76H123N5Cs3O57 +, Exact Mass: 2416.4038)が観測された。ただし、2Da異なる同位体を豊富に有するルビジウム(85Rbが約72%, 87Rbが約28%)添加系のみ最小質量数の安定同位体のみで構成される分子イオン強度は検出限界以下であった。また、図２８に示した通り、リフレクターネガティブモードではいずれのアルカリ金属イオン添加マトリックス系においても[M-2H+1alkali metal]-に相当する分子イオン(C76H123N5LiO57 -, Exact Mass: 2024.7045; C76H123N5NaO57 -, Exact Mass: 2040.6783; C76H123N5KO57 -, Exact Mass: 2056.6522; C76H123N5RbO57 -, Exact Mass: 2102.6003; C76H123N5CsO57 -, Exact Mass: 2150.5940)が観測された。
　ここで、「alkali metal」は、Li, Na, K, Rb, Csのいずれかのアルカリ金属を意味する。
　また、同様に、SGPを分析対象として、ポジティブモード測定したスペクトルを図２９に示し、ネガティブモード測定したスペクトルを図３０に示す。
　図２９に示した通り、リフレクターポジティブモードではいずれのアルカリ金属イオン添加マトリックス系においても[M-3H+4alkali metal]+に相当する分子イオン(C112H186N15Li4O70 +, Exact Mass: 2889.2091; C112H186N15Na4O70 +, Exact Mass: 2953.1041; C112H186N15K4O70 +, Exact Mass: 3016.9999; C112H186N15Rb4O70 +, Exact Mass: 3200.7922; C112H186N15Cs4O70 +, Exact Mass: 3392.7668)が観測された。ただし、2Da異なる同位体を豊富に有するルビジウム(85Rbが約72%, 87Rbが約28%)添加系のみ最小質量数の安定同位体のみで構成される分子イオン強度は検出限界以下であった。また、図３０に示した通り、リフレクターネガティブモードではいずれのアルカリ金属イオン添加マトリックス系においても[M-3H+2alkali metal]-に相当する分子イオン(C112H186N15Li2O70 -, Exact Mass: 2875.1781; C112H186N15Na2O70 -, Exact Mass: 2907.1257; C112H186N15K2O70 -, Exact Mass: 2939.0736; C112H186N15Rb2O70 -, Exact Mass: 3030.9697; C112H186N15Cs2O70 -, Exact Mass: 3126.9570)が観測された。
　ここで、「alkali metal」は、Li, Na, K, Rb, Csのいずれかのアルカリ金属を意味する。
　添加するアルカリ金属イオンの種類によらず、アニリン誘導体/DHBを含有する、本発明の固体マトリックス組成物は、糖鎖のみのSGP-10および糖鎖とペプチド鎖の双方を有するSGPのいずれの分析対象に対しても、ほぼ単一の生成物イオンピークを与え、高い精度の質量分析を可能にした。
（２）DHBに対するアニリン誘導体添加の影響
［マトリックス組成物のモルフォロジーの観察］
　実験１と同様に、ターゲットプレート上にスポットされたマトリックス組成物のモルフォロジーを記録した。
　図３１に示すように、AnchorChipTMターゲットプレート上のDHBNaマトリックス組成物のモルフォロジーは、1:0.1のモル比のDHB/Naイオン混合物に、DHBに対して10～50モル％（0.1, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 2.0, 3.0, 5.0等量）の範囲のNMAを添加しても変化しなかった。
［MALDI-TOF質量分析法］
　実験１と同様に、SGPを分析対象として、リフレクトロンモードMALDI-TOFMSを行った。1:0.1の比のDHB/Naイオン（DHBに対して10モル％のNaイオン添加）混合物に、DHBに対して種々のNHBの添加量で、SGPを分析対象として、ポジティブモード測定したスペクトルを図３２に示し、ネガティブモード測定したスペクトルを図３３に示す。
　ポジティブモード測定およびネガティブモード測定に共通して、NHBの添加量がDHBに対して０．９モル等量までは、信号強度が低くてS/N比が小さく、複数のフラグメントピークが存在していた。NHBの添加量がDHBに対して１モル等量以上になると、S/N比が大きくなり、フラグメントピークが消失した。ポジティブモード測定で[M-3H+4Na]+が主イオンピークとして、ネガティブモード測定で[M-3H+2Na]-が主イオンピークとして観察された。
　さらに、NHBの添加量を増量しても、それ以上のシグナル感度増大効果およびノイズ抑制効果は観測されず、過剰のアニリン誘導体の影響により、マトリックスを固化させるのに長時間要することから、本発明の効果を最大にするには、アニリン誘導体の添加量はDHBに対して小過剰であることがよいことが分かった。
　したがって、本発明のマトリックス組成物はポジティブモードおよびネガティブモードのいずれでも高感度・高分解能測定に使用できることが実証された。
＜実験３＞
　本発明でこれまで実証したマトリックスはいずれも微結晶またはアモルファス状の固体マトリックスとして使用している。一方、非特許文献６では終濃度0.1Mとなるような高濃度マトリックス溶液を使用することによりアニリン誘導体とDHBの等量混合物が液体マトリックスを形成することを報告している。
　そこで、終濃度0.1MのDHBとNMA溶液との等量混合液にDHBの10分の1量の0.1M炭酸水素ナトリウムを添加した濃厚なマトリックス組成物１８を作成し、AnchorChipTM アンカーチップターゲットプレート（濃縮径400μm）(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)に0.5μL添加し、約30分間自然乾燥したところ、3AQ/CHCAや２AP/DHBと同様に高真空状態の質量分析計内でもイオン性液体の性状を維持する液滴が形成された（図３４ａ）。この液体マトリックスは自身の表面張力により一定の厚みを維持できる環境では、高真空中でも液体マトリックスの性状を維持し、液体マトリックスとして解析できることが判明した。
　この液体マトリックスからDHB濃度を5分の1とし、DHBに対しNMAを1.2等量、炭酸水素ナトリウムを0.1等量添加して調製したマトリックス組成物１９の液滴0.5μLを同じターゲットプレート上で自然濃縮したところ、アンカーチップの濃縮ゾーンの形状と一致した薄膜型固体が形成された（図３４ｂ）。マトリックス組成物１９は、マトリックス組成物９と同一の組成および性状である。
　これらの性状の異なる２種類のマトリックス系をそれぞれ用い、実験１と同様に、SGP-10を分析対象としてリフレクトロンモードMALDI-TOFMS分析を行い、ポジティブ測定したスペクトルを図３５に示す。その結果、液体マトリックス（図３５ａ）よりも固体マトリックス（図３５ｂ）の方が、低レーザー強度条件でイオン化し、分析対象のSGP-10由来ピーク強度も明確に向上することが確認された。
　同様に、ネガティブ測定したスペクトルを図３６に示す。その結果、液体マトリックスからはいずれのレーザー強度においても明確な親イオンピークおよびフラグメントイオンピークいずれも確認されなかった（図３６ａ）。一方、固体マトリックスからは[M-2H+Na]-に相当するイオン (C76H123N5NaO57 -, Exact Mass: 2040.6783)が高感度で検出され、レーザー強度依存的にフラグメントイオンの形成が確認された（図３６ｂ）。
　以上の結果より、アニリン誘導体/DHB混合物を含む公知の液体マトリックスを用いるMALDI-TOF質量分析法と、本発明によるアニリン誘導体/DHB混合物を含む固体マトリックスを用いるMALDI-TOF質量分析法はその解析特性が大きく異なることが分かった。
＜実験４＞
　上記のように、本発明によるアニリン誘導体（アリールアミノ型塩基性物質）を含む固体マトリックスは、MALDI-TOF質量分析法に有用であることが分かった。
　本発明者は、さらなるマトリックス成分を探求し、O-ベンジルヒドロキシアミン（BOA）のようなアリールオキシアミノ型塩基性物質もMALDI-TOF質量分析法に有用であることを見出した。
　本発明者は、O-ベンジルヒドロキシアミン（BOA）は、アニリン誘導体とほぼ同じpKaの共役酸を有する芳香族塩基であるため（アニリンのpKa:4.6, BOAのpKa:4.3）、類似したアルカリ金属イオンの添加効果が得られると期待した。
　最初に、マトリックスに対する塩基性物質およびナトリウム塩の影響を調べるためのマトリックス組成物を調製した。
　固体マトリックスとしてDHBおよび9:1のモル比のDHBとそのナトリウム塩の混合物を選択し、塩基性物質としてO-ベンジルオキシアミン (BOA)を選択して、1.2:1のモル比の塩基性物質/DHB混合物として調製した。
　CH3CN/H2O (90:10, v/v)中の0.5 M DHB (100 μL)およびCH3CN中の1.0 M O-ベンジルオキシアミン溶液 (60 μL)をCH3CN/H2O (50:50, v/v)で1 mLに増量して、マトリックス組成物２０を調製した。
［マトリックス組成物のモルフォロジーの観察］
　実験１と同様に、ターゲットプレート上にスポットされたマトリックス組成物２０のモルフォロジーを記録した。比較のため、DHBのみを含むマトリックス組成物３のモルフォロジーも記録した。
　図３７に示すように、AnchorChipTMターゲットプレート上の1.2:1のモル比のBOA/DHB混合物に、DHBに対して１０モル％のNaイオンを添加した場合、撥水場で集積可能な微結晶ないしアモルファスが形成された。
［MALDI-MS分析］
　実験１と同様に、SGP-10を分析対象として、リフレクトロンモードMALDI-TOFMSを行った。1.2:1のモル比のBOA/DHB混合物に、DHBに対して10モル％のNaイオン添加量（1:0.1の比のDHB/Naイオン）で、SGP-10を分析対象として測定したスペクトルを図３８および３９に示す。比較のため、図３８には、BOAを含まないDHBのみのマトリックス組成物３を用いたスペクトルを併記し、図３９には、アニリンを含むマトリックス組成物５を用いたスペクトルを併記する。
　BOAを含むマトリックス組成物２０は、DHBのみの従来のマトリックス組成物３よりも感度が向上したスペクトルパターンが得られた。また、アニリンを含むマトリックス組成物５と比較して、よりシンプルなスペクトルパターンが得られた。
　図４０および４１に、それぞれ、SGP-10またはSGPを分析対象として、アニリン/DHBNaを含むマトリックス組成物５、BOA/DHBNaを含むマトリックス組成物２０またはNMA/DHBNaを含むマトリックス組成物７を用いたMALDI-TOF MSスペクトルを示す。
　還元末端が遊離のSGP-10ではアニリンを含有するマトリックス組成物５を使用した場合はSGP-10 [(M-2H+3Na)+ = 2087]に加え、アニリン付加物[(M+aniline-H2O-2H+3Na)+ = 2162]のピークが観察された。マトリックス組成物７を使用した場合はSGP-10 [(M-2H+3Na)+ = 2087]のピークが選択的に観察された。これに対し、BOAを含有するマトリックス組成物２０を使用した場合はBOA付加物[(M+BOA-H2O-2H+3Na)+ = 2192]のピークが選択的に観察された。
　一方、糖ペプチド型配糖体であるSGPではいずれのマトリックス組成物を用いた場合でもSGP [(M-3H+4Na)+ = 2953]を示すほぼ単一のピークが観察された。
　したがって、本発明のマトリックス組成物を使い分けることにより分析対象となる糖鎖ピーク感度の向上、シアル酸の脱離の抑制効果に加え、糖鎖還元末端が遊離な糖鎖と配糖体との識別が可能となる。さらに、図４０に示した3種の組成物を使い分けることにより、(a) 糖鎖＋マトリックス組成物付加体、(b) マトリックス組成物付加体のみ、(c) 糖鎖のみ、の3種のピークパターンを得ることが可能となる。例えば、添加物にBOAまたはNMAを用いた2種のマトリックス組成物（７および２０）を使用して得られたピークを比較することにより、遊離糖鎖を識別することが可能となる。また、ピークパターンが複雑化するが、マトリックス組成物５を使用した場合、アニリン付加に相当する分子量変化を抽出することによる遊離糖鎖の識別が一回の測定で可能となることが期待される。
　また、非特許文献１０で報告されているように、マトリックス組成物２０を用いて得られる遊離糖鎖に対するBOA付加反応は遊離糖鎖の分析およびそのTOF/TOF解析による配列解析に使用されている。しかし、これまでそのBOA付加工程とMALDI-TOFMSを用いた分析の工程は独立しており、MALDI-TOFMS解析ではイオン化効率の低いマトリックス組成物３に相当するマトリックスが使用されている。本発明のマトリックス組成物２０を使用することにより、このBOA付加工程とMALDI-TOFMS解析工程が統合可能となることから、その分析工程が省略されると共に、本発明で示した通り、大幅な高感度解析およびマトリックス結晶場の均一化による自動多検体解析が可能となる。
＜実験５＞
　通常、MALDI-TOF質量分析ではレーザー強度の増大に伴い、生成した分子イオンの内部結合が開裂したフラグメントイオンが生じる。それは、CHCAよりも分解されにくく、ソフトなイオン化が可能である「クールな」DHBマトリックスを用いても、インソース分解（ISD）および／またはポストソース分解 (PSD)と呼ばれる骨格フラグメント化をもたらす。
　インソース分解 (ISD)とは、イオン化室で、イオン化と同時または直後に分析対象が開裂する分解現象であり、ポストソース分解 (PSD)とは、イオン化後に、ドリフト空間で、イオン自体の内部エネルギーや残留ガスとの衝突などによる励起による分解現象である。
　ISDやPSDに起因する分析対象の開裂は分子内の複数の箇所で起こるため、様々なフラグメントイオンが生じる。イオンの内部エネルギーは照射したレーザー出力に依存するため、レーザー出力の増大に対して、開裂箇所毎に、フラグメントの生成量の増加度合いが異なることが知られている。したがって、同一分析対象について複数のレーザー出力にて測定を行うと、得られる質量スペクトルが変化する。複数の質量スペクトルのうち、低出力から高出力まで共通して観察されるピークを基準として、他のスペクトルの相対強度比を解析すれば、分析対象の構造解析が可能となる。
　そこで、NMA/DHB/Naマトリックス組成物９を用いるLIFT-TOF/TOF MSモードにおいて、レーザー出力を増加させて、シアリル化分析対象の分解パターンを評価した。
　SGP-10およびSGPは両方ともリフレクトロンモードでレーザー出力に依存するフラグメント化パターンを示した。両分析対象は準安定生成物イオンを形成して低レーザー出力（40％）でインタクトな親イオンピークを示した。レーザー出力の増加（50-70％）とともに親イオンのフラグメント化が促進され、高いレーザー出力（70%）では、多数のフラグメントピークを示した。
　SGPとSGP-10との比較により、ペプチド部分のより高いイオン化効率のため、シアル酸残基のフラグメント化が抑制されていることが分かる。しかしながら、レーザー出力が高くなるにしたがい、SGP-10よりもSGPで、より複雑なフラグメント化パターンおよびより高いベースラインノイズが生じた。このことは、グリコペプチドの場合、ペプチド部分がシアロシド結合のフラグメント化を抑制するが、その一方で、シアロシド結合以外の部位での多重フラグメント化が発生することを示唆している。
　上記の事象を正確に解析するため、LIFT-TOF/TOF解析を行った。SGP-10 (2087 Da)およびSGP (2953 Da)の主要生成物イオンピークのPSDプロセスに焦点を合わせるために、LIFTセル中でさらなるイオン加速を行わずに（親モード）、LIFT-TOF/TOFモードの時限イオンゲートにおいて親イオンを選択した。
　図４２ａ，ｂおよび図４３ａ，ｂに示されるように、SGP-10およびSGPの両方の親イオンピークは準安定であり、40%のレーザー出力にて、親イオンピークが維持された。驚くべきことに、還元末端でのGlcNAc残基の交差環開裂は、非還元末端でのシアル酸残基の除去よりも優先的に起こった。
　図４２ａ，ｃおよび図４３ａ，ｃに示されるように、PSD生成物イオンの形成は、レーザー出力の増加と共に促進され、70%のレーザー出力にて、複雑なピークパターンを示した。
　要するに、SGP-10およびSGPにおいては還元末端のGlcNAc残基が優先的に内部開裂し、続いてシアル酸が脱離していることが確認された。アグリコン部位を有さないSGP-10も同様の開裂パターンを示した。特に、SGP-10では遊離の還元末端GlcNAc残基の内部開裂ピーク（1925 Da）がより顕著に観察された。糖ペプチドであるSGPにおいてはレーザー強度の増大に伴い、ペプチド部位と還元末端のGlcNAc残基の一部が結合した断片（744 Da）およびその相補的な糖鎖断片（2189 Da）が生じた。さらに、この糖鎖断片から片方のシアル酸残基が脱離すると共に、還元末端のGlcNAc残基の断片化が進行したピーク（1816 Da）の生成が確認され、レーザー出力の増大に伴いこのピーク強度の上昇が確認された。
　このようなレーザー出力依存性のインソース分解またはポストソース分解の存在は、本発明の固体マトリクス組成物を用いて、TOF/TOF解析により糖鎖構造およびアグリコン構造双方が解析可能であることを示している。
　SGP-10では、交差環開裂0,2A6-型フラグメントイオン(m/z 1985)および2,4A6-型フラグメントイオン(m/z 1926)が、主要なPSD生成物イオンとして低いレーザー出力（40%）から観察され、そしてY5-型フラグメントイオンを形成するシアル酸の開裂(m/z 1773)は、60%以上のレーザー出力で観察された。シアル酸残基のY5-型開裂および還元末端GlcNAc残基の2,4A6-型交差環開裂からなる二重フラグメント化から生じる主要生成物イオン (m/z 1613)のピーク強度は、レーザー出力が40%から70%に増大するにしたがって増大した。
　SGPでは、還元末端GlcNAc残基での交差環開裂0,2X0-型フラグメントイオン (m/z 743)および交差環開裂0,2A7-型フラグメントイオン (m/z 2189)を有するプロトン化ペプチドイオンが、主要なPSD生成物イオンとして低いレーザー出力（50%）から観察された。より高いレーザー出力(70%)では、さらなるフラグメントイオンが観察された。シアル酸残基のY-型開裂および還元末端GlcNAc残基の2,4A7-型交差環開裂からなる二重フラグメント化から生じる主要生成物イオン(m/z 1816)のピーク強度は、レーザー出力が40%から70%に増大するにしたがって増大した。
　本発明によれば、レーザー出力依存性のインソース分解またはポストソース分解を利用して、シアリル化複合糖質の構造解析が可能となった。
　例えば、シアリル化複合糖質の構造解析は、LIFT-TOF/TOF質量分析において、アニリン誘導体/DHB/アルカリ金属を含有する本発明の固体マトリックス組成物の層をターゲットプレート上に形成し、マトリックス層上に分析対象を堆積し、複数の異なるレーザー出力（例えば、最大出力の４０％～７０％）にてレーザーを分析対象に照射して複数の質量スペクトルを取得し、低出力時に観察されるイオンピーク強度を基準として、レーザー出力の増大に伴う相対強度の変化に基づき開裂箇所を推定し、内部構造を示す特徴的イオンピークの同定を行うことができる。
＜実験６＞
　多重フラグメント化の存在および各フラグメント化位置での速度差に基づき、高速フラグメント化プロセスをISDとみなし、低速フラグメント化プロセスをPSDとみなして擬似MS3法としてT3-配列解析を行うことができる。
　実験５において観察された、SGP-10およびSGPのそれぞれに特徴的なレーザー出力依存性のフラグメントピーク（それぞれ、m/z 1613およびm/z 1816）に、TOF/TOF解析における１段階目のゲート分子量を設定し、抗レーザー出力解析を実施した。
　図４４ａは、70%のレーザー出力のLIFT-TOF/TOFMS親モードによって選択されたm/z 1613Daでの擬似親イオンに由来するSGP-10のT3-配列決定スペクトルを示す。SGP-10の擬似MS3スペクトルは、2,4A6-型の交差環開裂により得られたグリセロール部分を有するモノシアル酸化八糖の正しい配列を示した。
　図４４ｂは、70%のレーザー出力のLIFT-TOF/TOFMS親モードによって選択されたm/z 1816Daでの擬似親イオンに由来するSGPのT3-配列決定スペクトルを示す。SGPの擬似MS3スペクトルも、グリセロール部分を有するモノシアリル化九糖の正しい配列を示した。
　本発明によれば、レーザー出力依存性擬似MS3戦略によって、いかなる修飾もなしに、シアリル化複合糖質の詳細な配列決定が達成された。
　本発明のマトリックス組成物はアルカリ金属イオンが添加されたアニリン誘導体/DHBマトリックスであり、このマトリックス組成物は、MALDI-TOF用のターゲットプレート上で、微結晶またはアモルファス状の均一固体となるので、
プレスポットされたターゲットプレートを使って多数の分析対象を、高感度で再現性よく自動分析するのに主たる利点がある。
　また、アルカリ金属イオンが添加されたマトリックス組成物を用いるので、リフレクトロンモードMALDI-TOF質量分析において、ポジティブモード測定およびネガティブモード測定を行って、未修飾のシアリル化複合糖質の詳細な構造解析が可能となった。
　さらには、分析対象のレーザー出力依存性のインソースまたはポストソース分解パターンは、分析対象の詳細な配列決定研究のための擬似MS3戦略も可能である。

Claims (7)

  1. 　2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）と、共役酸がpKa4～5を示す芳香族性塩基性分子と、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンよりなる群から選択されるアルカリ金属イオンと、を含有する固体マトリックス組成物。
  2. 　アルカリ金属イオンの添加量が、DHBに対して1～50モル％である、請求項１に記載の固体マトリックス組成物。
  3. 　塩基性分子の添加量が、DHBに対して10～150モル％である、請求項１または２に記載の固体マトリックス組成物。
  4. 　塩基性分子が、アニリン、N-メチルアニリン（NMA）、N,N-ジメチルアニリン（DMA）およびO-ベンジルヒドロキシアミン（ＢＯＡ）よりなる群から選択される、請求項１～３いずれかに記載の固体マトリックス組成物。
  5. 　シアリル化糖鎖および複合糖質のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化-飛行時間型質量分析法であって、
    　請求項１～４いずれかに記載の固体マトリックス組成物を用いる、質量分析法。
  6. 　リフレクトロンモードで測定する、請求項５に記載の質量分析法。
  7. 　MALDI-TOF/TOFMS分析においてレーザー出力依存的フラグメント化傾向を活用し、疑似MS/MS/MS解析する、請求項５に記載の質量分析法。
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Harvey Identification of cleaved oligosaccharides by matrix-assisted laser desorption/ionization

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