RU2351932C2 - Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии - Google Patents
Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2351932C2 RU2351932C2 RU2006129865/15A RU2006129865A RU2351932C2 RU 2351932 C2 RU2351932 C2 RU 2351932C2 RU 2006129865/15 A RU2006129865/15 A RU 2006129865/15A RU 2006129865 A RU2006129865 A RU 2006129865A RU 2351932 C2 RU2351932 C2 RU 2351932C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- macromolecules
- molecules
- immobilized
- complexes
- mass
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицинской диагностике. Предложен способ регистрации специфических макромолекул в биологической пробе с использованием комбинации двух методов: сканирующей зондовой микроскопии и масс-спектрометрии, что позволяет проводить регистрацию макромолекул в растворе аналита методом атомно-силовой микроскопии и одновременно идентифицировать выловленные молекулы с помощью методов масс-спектрометрии. Способ позволяет с чувствительностью до 10-19 М идентифицировать макромолекулы при проведении протеомных, вирусологических, диагностических исследований. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.
Description
Изобретение относится к протеомике и медицинской диагностике и касается применения методов зондовой микроскопии и масс-спектрометрии для регистрации и идентификации макромолекул при протеомных исследованиях, диагностике, в вирусологии и т.д.
В качестве прототипа может быть использован стандартный SELDI метод, который позволяет аффинно биоспецифически вылавливать макромолекулы из раствора на поверхность биочипа с иммобилизованными молекулами, после чего проводить измерение масс выловленных макромолекул с помощью масс-спектрометра с источником ионизации MALDI (Lewczuk P., Esselmann H., Groemer T.W., Bibi M., Maler J.M., Steinacker P., Otto M., Kornhuber J., Wiltfang, J., Biol. Psychiatry. 2004, 55, 524-530.; Landuyt В., Jaap Jansen J., Wildiers H., Goethals L., Boeck G.D., et al., J. Separation Science, 2003, 26, 619-623). Применение термина "вылавливают" (на английском языке "Fishing"), используемого в международных научных изданиях, в данном контексте означает захват молекулой, иммобилизованной на поверхности чипа, макромолекулы-партнера из раствора и концентрированно захваченных макромолекул на поверхности биочипа (см. review: Nelson R.W. and Krone J.R. J. of Molecular recognition 1999, 12, 77-93. Natsume Т., Nakayama H., Isobe T. Trends in Biotechnology 2001, 19, S28-S33).
Недостатком этого метода является отсутствие возможности визуализации комплексов, а именно нет информации о структуре комплексов.
Существует метод зондовой сканирующей микроскопии как частный случай атомно-силовой микроскопии (АСМ) для регистрации и визуализации структуры макромолекулярных комплексов в аналите, при котором биочип с иммобилизованными молекулами инкубируется в растворе аналита, при этом производится аффинное биоспецифическое вылавливание макромолекул из раствора, концентрирование их на поверхности биочипа, перешивание выловленных комплексов молекула/макромолекула, при этом концентрационная чувствительность которого достигает чрезвычайно высокого уровня - 10-19 М (заявка № 2004119864 от 30 июня 2004). Недостаток использования этого метода - нет достоверной идентификации выловленных комплексов из-за мешающего влияния артефактов от загрязненности образца.
Преодоление этих недостатков может быть достигнуто применением сопряжения двух методов сканирующей зондовой микроскопии и масс-спектрометрии, позволяющее проводить регистрацию макромолекул в растворе аналита с высокой чувствительностью до 10-19 М, характерной для метода атомно-силовой микроскопии, и одновременно идентифицировать выловленные молекулы с помощью методов масс-спектрометрии. Он заключается в том, что ансамбль аффинных иммобилизованных молекул на поверхности биочипа инкубируется в растворе макромолекул, которые за счет аффинного биоспецифического связывания с иммобилизованными молекулами вылавливаются из этого раствора, отмываются от неспецифически сорбированных молекул, после чего полученные комплексы иммобилизованных белков с выловленными макромолекулами регистрируются с помощью сканирующего зондового микроскопа.
Идентификация выловленных комплексов производится методом масс-спектрометрии in situ с использованием лазерной ионизации с десорбцией из матрицы (MALDI) или методом электроспрейной ионизации (ESI). В последнем случае комплексы смываются с биочипа и производится прямой масс-спектрометрический анализ методом электроспрейной ионизации. Метод пригоден как для анализа белков, так и для анализа олигонуклеотидов. Если белок имеет массу более 30 кДа, то может производиться протеолиз как in situ на биочипе, так и в смытом аналите в случае анализа ESI. В обоих случаях анализируются пептиды - продукты протеолиза.
Для повышения чувствительности комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических, химических методов с радиоизотопной меткой.
В качестве примера реализации поставленной задачи был создан АСМ биочип, состоящий из ансамбля иммобилизованных молекул, расположенных на подложке биочипа к сканирующему атомно-силовому микроскопу для идентификации макромолекул с использованием сканирующей зондовой микроскопии и сопряжен с масс-спектрометром.
В качестве иммобилизованных на поверхности биочипа молекул, как пример, использовались антитела (анти-HCVcore) к HCVcore антигену (HCVcoreAg) вируса гепатита С, ковалентно иммобилизованные на поверхности модифицированной положке слюды с неровностью рельефа порядка 1 нм.
В качестве биоспецифического партнера антител к HCVcore антигену использовался раствор аналита с находящимися в нем макромолекулами HCVcore антигенов. Эти макромолекулы HCVcore антигенов специфически связывались и за счет этого вылавливались из раствора аналита, образуя биоспецифические комплексы anti-HCVcore/HCVcore на поверхности биочипа. Затем осуществлялась отмывка биочипа от неспецифически сорбировавшихся молекул на поверхности биочипа, после чего, проводилось обнаружение и визуализация белков и их комплексов на поверхности биочипа с помощью атомно-силовой микроскопии и затем проводился масс-спектрометрический анализ белков, оставшихся на подложке.
На фиг.1 приведено АСМ-изображение участка поверхности биочипов с иммобилизованными антителами к HCVcore и биочипов с анти-HCVcore/HCVcore комплексами, которые образовывались на поверхности биочипа с иммобилизованными анти-HCVcore при инкубации его в растворе аналита, содержащего HCV антигены при концентрации 10-9 М.
На фиг.1,А приведено изображение изолированных антител к HCVcore антигену на подложке биочипа. Высоты антител имеют распределение по высоте с размерами 1,5-2 нм. На биочипе с иммобилизованными анти-HCVcore, инкубированном в растворе аналита, содержащего HCVcore (фиг.1,В), кроме антител наблюдаются комплексы антиген/антитело, с размером 2,5-5 нм, превышающим размеры изолированных антител.
Для повышения чувствительности комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических, химических методов с радиоизотопной меткой. На фиг.2 приведено АСМ-изображение части поверхности биочипов с активированными фотолинкерами, иммобилизованными антителами к HCVcore, и биочипов с анти-HCVcore/HCVcore комплексами, которые образовывались на поверхности биочипа с иммобилизованными анти-HCVcore при его инкубации в растворе аналита, содержащего HCV антигены при концентрации 10-14 М и последующей ковалентной фотосшивкой между анти-HCVcore с HCVcore антигенами посредством проведения фотореакции. На фиг.2,А приведено изображение изолированных активированных антител к HCVcore антигену на подложке биочипа. Высоты антител имеют распределение по высоте с размерами 1,5-3 нм. На биочипе с иммобилизованными анти-HCVcore, инкубированном в растворе аналита, содержащего HCVcoreAg (фиг.2,В), кроме антител наблюдаются комплексы антиген/антитело с размером 3,5-7 нм, превышающим размеры изолированных антител. Из сравнения фиг.2, В и фиг.1, В видно, что использование ковалентной сшивки между HCVcoreAg и анти-HCVcore позволяет зафиксировать примерно такое же количество белковых комплексов, что и в случае, когда не применяется ковалентная сшивка между белками при гораздо меньшей концентрации HCVcoreAg в аналите (на 5 порядков). То есть фиксация белков в комплексе на поверхности биочипа за счет ковалентной сшивки между белками в комплексе при вылавливании белков позволяет повысить чувствительность регистрации макромолекул в растворе аналита. Расчеты показывают, что чувствительность может быть повышена до 10-19 М.
На фиг.3 приведены масс-спектры, полученные методом MALDI с поверхности AFM-биочипа, с изолированными антителами (фиг.3,С), биочипа с комплексами антитген/антитело (фиг.3,D) и контрольные масс-спектры от антител в растворе (фиг.3,А) и от HCVcoreAg в растворе (фиг.3,В).
Как видно из фиг.3,А, масс-спектр анти-HCVcore в растворе имеет характерные сигналы с массами в диапазоне М=147 kDa, соответствующими массам целых молекул анти-HCVcore, и фрагментов легкой и тяжелой цепей этих антитела с сигналами в области М=24 kDa, 32 kDa и М=47 kDa соответственно. Масс-спектр HCVcore антигена в растворе имеет характерные сигналы с массами в диапазоне М=25 kDa, соответствующими массам целых молекул антигена. Масс-спектр иммобилизованных на поверхности биочипа изолированных анти-HCVcore (фиг.3,С) имеет характерные сигналы, соответствующие массам фрагментов легкой и тяжелой цепей этих антител с сигналами в области М=24 kDa, 32 kDa и М=47 kDa соответственно. Масс-спектр объектов на поверхности биочипа с иммобилизованными анти-HCVcore, которые были инкубированы в растворе аналита, содержащего HCV антигены (фиг.3,D), видно изменение паттерна масс-спектра по сравнению с паттерном масс-спектра изолированных анти-HCVcore (фиг.3,С), что связано со вкладом в полный масс-спектр сигналов от HCVcoreAg. Так, кроме сигналов, соответствующих массам фрагментов легкой и тяжелой цепей антител, появляются сигналы с массами М=52 kDa и 77 kDa, соответствующие комплексам фрагментов, включающих легкую цепь антител с антигенами HCVcore, а также существенное увеличение сигнала в области 25 kDa, соответствующей вкладу от целого антигена HCVcore. Таким образом, сопряжение системы на основе сканирующей атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии позволяет регистрировать HCVcore антиген с помощью биочипа к атомно-силовому микроскопу в растворе и идентифицировать эти антигены с помощью масс-спектрометрического анализа. Если белок имеет массу более 30 кДа, то может производиться протеолиз как in situ на биочипе, так и в смытом аналите в случае анализа методом ESI, как описано в обзоре [Williams С., Addona T.A. TIBTECH, 2000, v.18, February, 45-48]. В обоих случаях анализируются пептиды - продукты протеолиза.
Для повышения чувствительности комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических, химических методов с радиоизотопной меткой.
В качестве методов ионизации при масс-спектрометрометрическом анализе могут быть использованы LD, MALDI, SELDI, SALDI, ESI, SIMS, FAB (fast atom bombardment). В случае использования последних двух методов поверхность отмытого биочипа может покрываться тонким слоем золота, получаемого методом напыления в вакууме.
В качестве масс-анализаторов могут быть использованы TOF, Q, Q-TOF, FTICR, ion TRAP, ORBITRAP.
Claims (3)
1. Способ регистрации и идентификации макромолекул в растворе аналита при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии, при котором ансамбль аффинных иммобилизованных молекул на поверхности биочипа инкубируют в растворе макромолекул, которые за счет аффинного биоспецифического связывания с иммобилизованными молекулами вылавливаются из этого раствора, отмывают от неспецифически сорбированных молекул, после чего полученные комплексы иммобилизованных белков с выловленными макромолекулами регистрируют с помощью сканирующего зондового микросокопа, а идентификацию выловленных комплексов производят методом масс-спектрометрии in situ с использованием лазерной десорбции LD, а также MALDI, SELDI, SALDI, SIMS, FAB или методом ESI, при этом комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических или химических методов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сканирующего зондового микроскопа используют атомно-силовой микроскоп, или сканирующий туннельный микроскоп, или оптический ближнепольный микроскоп в одноканальном или многоканальном исполнении.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве молекул, иммобилизованных на поверхности чипа, могут быть антитела, антигены, аптамеры, фотоаптамеры, олигонуклеотиды или их фрагменты как в виде отдельного чипа, так и любые комбинации этих молекул в виде поля.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006129865/15A RU2351932C2 (ru) | 2006-08-18 | 2006-08-18 | Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006129865/15A RU2351932C2 (ru) | 2006-08-18 | 2006-08-18 | Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006129865A RU2006129865A (ru) | 2008-02-27 |
| RU2351932C2 true RU2351932C2 (ru) | 2009-04-10 |
Family
ID=39278502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006129865/15A RU2351932C2 (ru) | 2006-08-18 | 2006-08-18 | Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2351932C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2759906C1 (ru) * | 2021-03-16 | 2021-11-18 | Елена Александровна Прокопьева | Метод диагностики вирусов и вирусных инфекций |
-
2006
- 2006-08-18 RU RU2006129865/15A patent/RU2351932C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NIEMEYER CM. Semi-synthetic DNA-protein conjugates: novel tools in analytics and nanobiotechnology. Biochem Soc Trans. 2004 Feb; 32 (Pt 1): 51-3. Lewczuk P at al, Amyloid beta peptides in cerebrospinal fluid as profiled with surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: evidence of novel biomarkers in Alzheimer′s disease. Biol Psychiatry. 2004; 55 (5): 524-30. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2759906C1 (ru) * | 2021-03-16 | 2021-11-18 | Елена Александровна Прокопьева | Метод диагностики вирусов и вирусных инфекций |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006129865A (ru) | 2008-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5442720B2 (ja) | 質量分析 | |
| JP4906725B2 (ja) | 試料提示器具 | |
| JP4587954B2 (ja) | タンパク質相互作用相違マッピング | |
| JP3930563B2 (ja) | 表面プラズモン共鳴質量分析法 | |
| JP6537605B2 (ja) | モノクローナル抗体の定量方法 | |
| US20160282361A1 (en) | Mass spectrometric assays for peptides | |
| US20020055125A1 (en) | Microarrays for performing proteomic analyses | |
| US7202472B2 (en) | Mass spectrometric analysis using nanoparticles | |
| Xu et al. | On‐plate enrichment of glycopeptides by using boronic acid functionalized gold‐coated Si wafer | |
| CN109932410A (zh) | 一种基于纸质靶片的质谱检测方法 | |
| US8455202B2 (en) | Affinity selector based recognition and quantification system and method for multiple analytes in a single analysis | |
| WO2011112188A1 (en) | Method for recognition and quantification of multiple analytes in a single analysis | |
| CA2682543A1 (en) | Immunoassays and characterization of biomolecular interactions using self- assembled monolayers | |
| JP2006521567A (ja) | 質量分析法を用いる、タンパク質および／または他の分子の測定 | |
| RU2351932C2 (ru) | Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии | |
| JP6008462B2 (ja) | Ｓｐｒ−ｍｓ連結法のための官能化バイオチップ | |
| CN110291037A (zh) | 用于确定对象中的感染水平的组合物和方法 | |
| JP5369172B2 (ja) | 新たな質量分析信号の増幅技術 | |
| US20040142487A1 (en) | Methods and compositions for mass spectrometry analysis | |
| JP4820444B2 (ja) | プレート上での測定対象分子の局在化方法、およびこれを用いた質量分析法 | |
| Chen et al. | Targeted protein quantitation and profiling using PVDF affinity probe and MALDI‐TOF MS | |
| KR101345674B1 (ko) | Ｏｎ ｃｈｉｐ 질량분석을 위한 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩 | |
| Johnson et al. | Affinity capture mass spectrometry of biomarker proteins using peptide ligands from biopanning | |
| US20160139141A1 (en) | Imaging mass cytometry using molecular tagging | |
| Bonnel et al. | Label‐Free Biosensor Affinity Analysis Coupled to Mass Spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180819 |