JP4820444B2 - Method for localizing target molecule on plate and mass spectrometry using the same - Google Patents
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Description
本発明は、プレート上での測定対象分子の局在化方法に関する。より詳細には、本発明は、プレート上で生体試料から測定対象物のみを選択的に局在化することができる方法に関する。本発明は、このような方法を用い、測定対象分子の高いシグナル強度が得られる質量分析法に関する。 The present invention relates to a method for localizing a molecule to be measured on a plate. More specifically, the present invention relates to a method capable of selectively localizing only a measurement object from a biological sample on a plate. The present invention relates to a mass spectrometry method that uses such a method to obtain a high signal intensity of a molecule to be measured.
近年、生体高分子であるタンパク質および／または糖鎖の高感度な質量分析法の開発が盛んに行なわれており、当該分析法が生化学および医学の分野に急速に普及しつつある。このような質量分析法は、例えば、生体分子の発現およびその機能に関する解析、ならびにバイオマーカー探索等に用いられる。 In recent years, high-sensitivity mass spectrometry methods for proteins and / or sugar chains, which are biopolymers, have been actively developed, and the analysis methods are rapidly spreading in the fields of biochemistry and medicine. Such mass spectrometry is used, for example, for analysis of biomolecule expression and its function, biomarker search, and the like.
生体高分子が含有される生体試料中には、測定対象分子の他に多数の夾雑分子が混在する。このため、微量の測定対象分子を含む生体試料を高度に精製した場合には、測定対象分子の質量分析感度が検出感度未満になるおそれがあり、ひいては質量分析において当該分子を見逃すおそれもある。また、夾雑分子が測定対象分子に比して高いイオン化効率を有する場合には、測定対象分子の検出は困難である。 In a biological sample containing a biopolymer, many contaminating molecules are mixed in addition to the molecule to be measured. For this reason, when a biological sample containing a very small amount of a molecule to be measured is highly purified, the mass analysis sensitivity of the molecule to be measured may be less than the detection sensitivity, and thus the molecule may be missed in mass spectrometry. In addition, when a contaminating molecule has a higher ionization efficiency than the measurement target molecule, it is difficult to detect the measurement target molecule.
このような事情を考慮して、質量分析の前段階としての生体試料のイオン化に関する技術として、例えば以下のようなものが開示されている。 Considering such circumstances, for example, the following is disclosed as a technique related to ionization of a biological sample as a previous stage of mass spectrometry.
非特許文献１には、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を用いて、チップ表面に官能基および／または抗体分子などを固定し、生体試料中の特定分子のみを捕捉、洗浄してレーザー照射によりイオン化を行なう技術が開示されている。 Non-Patent Document 1 discloses that surface-enhanced laser desorption / ionization (SELDI) is used to immobilize functional groups and / or antibody molecules on the chip surface, capture only specific molecules in a biological sample, wash them, and perform laser irradiation. Discloses a technique for performing ionization.
特許文献１には、例えば細胞培地またはこのような培地の精製フラクションにおける生体成分の表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量スペクトルプロフィルを作成することを含む、ターゲット分子の精製を監視する技術が開示されている。 Patent Document 1 discloses a technique for monitoring the purification of a target molecule, including, for example, creating a surface enhanced laser desorption ionization (SELDI) mass spectral profile of biological components in a cell culture medium or a purification fraction of such medium. Has been.
非特許文献１および特許文献１に示す各技術に開示されている、プレート上の生体試料に対して所定の洗浄により測定対象分子のみを残留させる手法（ＳＥＬＤＩ）を、質量分析に先立って採用する場合には、生体試料を洗浄する際に、測定対象分子の一部が洗い流される。このため、測定対象分子が微量である場合および／または結合が弱い場合は、プレート上での測定対象分子の残量が極めて少なくなり、質量分析に際して、その分析感度が所望の検出感度を遥かに下回るおそれがある。 Prior to mass spectrometry, a technique (SELDI) disclosed in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 that leaves only a molecule to be measured by a predetermined washing with respect to a biological sample on a plate is adopted. In some cases, some of the molecules to be measured are washed away when the biological sample is washed. For this reason, when the amount of the molecule to be measured is very small and / or the binding is weak, the amount of the molecule to be measured on the plate is extremely small, and the analysis sensitivity is much higher than the desired detection sensitivity in mass spectrometry. May fall below.
また、ＳＥＬＤＩを採用した後の質量分析は、測定対象分子が既知の場合には有効であるが、測定対象分子が未知の場合には当該分子がプレートから完全に除去されるおそれがあり有効でない。 In addition, mass spectrometry after adopting SELDI is effective when the molecule to be measured is known, but is not effective when the molecule to be measured is unknown, because the molecule may be completely removed from the plate. .
さらに、ＳＥＬＤＩを採用した後の質量分析では、所定のチップを選択し所定の洗浄を行うことによって、含量が最大の、もしくは結合が最強の特定の種類のみの測定対象分子に限定してしまう可能性があるが、実際の質量分析の現場においては、ＳＥＬＤＩ測定１回分に使用する生体試料の量で、複数の測定対象分子を同時に分析することが望ましい場合もある。 Furthermore, in mass spectrometry after adopting SELDI, by selecting a predetermined chip and performing a predetermined washing, it is possible to limit to a specific type of measurement target molecule having the maximum content or the strongest binding. However, in actual mass spectrometry, it may be desirable to simultaneously analyze a plurality of molecules to be measured with the amount of biological sample used for one SELDI measurement.
本発明の目的は、（ａ）測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができ、（ｂ）未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、（ｃ）複数の種類の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる、プレート上での測定対象分子の局在化方法を提供することにある。また、本発明の目的は、このような方法を用い、測定対象分子の高いシグナル強度が得られる質量分析法を提供することにある。 The object of the present invention is to (a) ensure a sufficient remaining amount on the plate without washing away the measurement target molecule, (b) can be used for mass spectrometry of unknown measurement target molecules, and (c) multiple Another object of the present invention is to provide a method for localizing a molecule to be measured on a plate, which can be used when mass-analyzing the molecules to be measured simultaneously. Another object of the present invention is to provide a mass spectrometry method that can obtain a high signal intensity of a molecule to be measured using such a method.
本発明は、（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む、プレート上での測定対象分子を局在化する方法に関する。ここで、プレート上に載置する生体試料には、少なくとも１種の測定対象分子が必ず含まれるものである。換言すれば、当該生体試料が夾雑分子のみからなる場合は除かれる。 The present invention includes (A) a step of preparing a plate to which at least one compound for localizing a molecule to be measured is bound, and (B) a biological sample containing at least one molecule to be measured on the plate. And (C) dropping and drying a solution containing a matrix on the biological sample and localizing the molecule to be measured on the plate, the molecule to be measured on the plate Relates to a method for localizing. Here, the biological sample placed on the plate always contains at least one kind of measurement target molecule. In other words, the case where the biological sample is composed of only contaminating molecules is excluded.
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、上記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことが望ましい。これらのうち、上記アリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基とすることができる。また、上記アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基とすることができる。 In such a method for localizing a molecule to be measured on a plate, the compound preferably contains an aryl group, a dihydroxyboryl group, an alkyl group, an amino group, or a hydroxyl group. Among these, the aryl group can be a phenyl group, a thienyl group, a pyrrolyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a pyrenyl group, a quinolyl group, an indolyl group, an acrylidinyl group, or a benzothiazolyl group. The alkyl group may be a C4 to C18 alkyl group.
当該局在化方法は、プレート上で単一の測定対象分子を局在化することができることは勿論、プレート上で複数の測定対象分子を局在化することもできる。即ち、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、上記工程（Ａ）において、上記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、上記工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化させることができる。 The localization method can localize a single molecule to be measured on the plate, and can also localize a plurality of molecules to be measured on the plate. That is, when the biological sample contains at least two kinds of molecules to be measured, different compounds are bound to at least two regions of the plate in the step (A), and at least two regions in the step (C). It is possible to localize different molecules to be measured.
当該局在化方法は、測定対象分子の局在化のみならず、夾雑分子の局在化も併せて行うことができる。即ち、上記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含む場合に、上記工程（Ａ）において、上記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、上記工程（Ｃ）において、上記プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化させることができる。 The localization method can perform not only localization of a molecule to be measured but also localization of a contaminating molecule. That is, when the biological sample further contains at least one kind of contaminant molecule, in the step (A), a different compound is bound to at least two regions of the plate, and in the step (C), The molecule to be measured can be localized in one region and the contaminating molecule can be localized in another region.
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の間に、（Ｂ’）上記生体試料を誘導体化する工程をさらに含ませることが望ましい。 In such a method for localizing a molecule to be measured on a plate, it is desirable to further include (B ′) a step of derivatizing the biological sample between steps (B) and (C). .
なお、上記測定対象分子は、例えば、糖鎖（遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質など）とすることができる。 The measurement target molecule can be, for example, a sugar chain (free sugar chain, glycopeptide, glycoprotein, etc.).
本発明は、測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）上記のいずれかの方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
The present invention is a method for mass spectrometry of a molecule to be measured,
(1) a step of localizing a molecule to be measured in a biological sample on a plate by any one of the above methods, and (2) a molecule to be measured localized in the step (1) above, It includes a mass spectrometry method including a step of performing MS n measurement, wherein n is an integer of 1 or more.
本発明は、（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、上記第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程と、（Ｂ１）上記第１プレートおよび上記第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、（Ｂ２）上記第１プレートおよび上記第２プレートを分離する工程と、（Ｃ）上記第１プレートおよび上記第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、上記第１プレートおよび前記第２プレートの少なくとも一方上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む、プレート上での測定対象分子の局在化方法に関する。ここで、プレート上に載置する生体試料には、少なくとも１種の測定対象分子が必ず含まれるものである。換言すれば、当該生体試料が夾雑分子のみからなる場合は除かれる。 The present invention includes (A1) binding a first compound that localizes the molecule to be measured on the first plate, and (A2) localizing the molecule to be measured on the second plate. A step of binding a second compound different from the compound, and (B1) sandwiching a biological sample containing at least one molecule to be measured between the first plate and the second plate, and drying (B1) B2) separating the first plate and the second plate; and (C) dropping and drying a solution containing a matrix on the first plate and the second plate, so that the first plate and the second plate are separated. And a method of localizing the molecule to be measured on the plate, comprising the step of localizing the molecule to be measured on at least one of the plates. Here, the biological sample placed on the plate always contains at least one kind of measurement target molecule. In other words, the case where the biological sample is composed of only contaminating molecules is excluded.
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、上記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことが望ましい。これらのうち、上記アリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基とすることができる。また、上記アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基とすることができる。 In such a method for localizing a molecule to be measured on a plate, the compound preferably contains an aryl group, a dihydroxyboryl group, an alkyl group, an amino group, or a hydroxyl group. Among these, the aryl group can be a phenyl group, a thienyl group, a pyrrolyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a pyrenyl group, a quinolyl group, an indolyl group, an acrylidinyl group, or a benzothiazolyl group. The alkyl group may be a C4 to C18 alkyl group.
当該局在化方法は、２枚のプレート上で異なる測定対象分子を局在化することができる。即ち、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、上記工程（Ｃ）において、第１プレートの測定対象分子とは異なる測定対象分子を上記第２プレートで局在化させることができる。 The localization method can localize different measurement target molecules on two plates. That is, when the biological sample includes at least two kinds of molecules to be measured, in the step (C), a molecule to be measured different from the molecule to be measured on the first plate can be localized on the second plate. it can.
当該局在化方法は、２枚のプレートの各々において異なる測定対象分子を局在化することができるのみならず、２枚のプレートの各々において測定対象分子と夾雑分子の局在化を行うことができる。即ち、上記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含む場合に、上記工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を上記第２プレートで局在化させることができる。 The localization method not only can localize different measurement target molecules in each of the two plates, but also localizes the measurement target molecules and the contaminant molecules in each of the two plates. Can do. That is, when the biological sample further contains at least one kind of contaminating molecule, in the step (C), at least one kind of contaminating molecule can be localized on the second plate.
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法においては、工程（Ｂ２）および工程（Ｃ）の間に、（Ｂ’）上記生体試料を誘導体化する工程をさらに含ませることが望ましい。 In such a method for localizing a molecule to be measured on a plate, it is desirable to further include (B ′) a step of derivatizing the biological sample between steps (B2) and (C). .
なお、上記測定対象分子は、例えば、糖鎖（遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質など）とすることができる。 The measurement target molecule can be, for example, a sugar chain (free sugar chain, glycopeptide, glycoprotein, etc.).
測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）上記のいずれかの方法により、上記第１プレート上の生体試料中の測定対象分子、および上記第２プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
A method for mass spectrometry of a molecule to be measured,
(1) Localizing at least one of the measurement target molecule in the biological sample on the first plate and the measurement target molecule in the biological sample on the second plate by any one of the methods described above, and (2) Mass spectrometry including a step of performing MS n measurement on the measurement target molecule localized in the step (1), wherein n is an integer of 1 or more.
本発明のプレート上での測定対象分子の局在化方法は、生体試料を載置するプレートに予め所定の表面処理（所定の化合物の結合）を施すことで、測定対象分子とプレートとの親和性を他の夾雑分子とプレートとの親和性よりも高めることができる。このため、プレート上で測定対象分子を含む生体試料を単に乾燥するだけで、プレート上に測定対象分子を選択的に十分に残留させることができる。 In the localization method of a molecule to be measured on the plate of the present invention, the affinity between the molecule to be measured and the plate is obtained by performing a predetermined surface treatment (binding of a predetermined compound) in advance on the plate on which the biological sample is placed. The affinity can be increased more than the affinity between other contaminant molecules and the plate. For this reason, the measurement target molecule can be selectively and sufficiently left on the plate simply by drying the biological sample containing the measurement target molecule on the plate.
また、本発明の局在化方法は、ＳＥＬＤＩのように測定対象分子を洗い流すことなく、プレート上で乾燥する技法を採用するため、当然に未知の測定対象分子もプレート上に残留する。このため、当該方法は、質量分析を行う対象分子がたとえ未知であっても、適用することができる。 In addition, since the localization method of the present invention employs a technique of drying on the plate without washing away the molecule to be measured like SELDI, naturally the unknown molecule to be measured remains on the plate. For this reason, this method can be applied even if the target molecule to be subjected to mass spectrometry is unknown.
さらに、本発明の局在化方法は、ＳＥＬＤＩのように測定対象分子を洗い流さないため、乾燥した生体試料中に複数の測定対象分子を残留させることができる。このため、当該方法は、質量分析を行う測定対象分子がたとえ複数であっても、適用することができる。 Furthermore, since the localization method of the present invention does not wash away the measurement target molecule unlike SELDI, a plurality of measurement target molecules can remain in the dried biological sample. For this reason, this method can be applied even if there are a plurality of molecules to be measured.
加えて、以上のような効果を奏する本発明の局在化方法を用いた質量分析によれば、測定対象分子の十分なシグナル強度を得ることができるとともに、未知の測定対象分子に対処でき、しかも複数の測定対象分子を同時に分析することができる。 In addition, according to the mass spectrometry using the localization method of the present invention that exhibits the effects as described above, it is possible to obtain a sufficient signal intensity of the molecule to be measured, and to deal with an unknown molecule to be measured, In addition, a plurality of molecules to be measured can be analyzed simultaneously.
以下に、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらの範囲に限定されるものではなく、当業者の通常の創作能力の範囲で適宜変更することができる。 Embodiments of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these ranges, and can be appropriately changed within the range of ordinary creation ability of those skilled in the art.
＜プレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ１）＞
本発明のプレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）は、（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、（Ｂ）上記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、（Ｃ）上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む方法である。ここで、測定対象分子とは、当該局在化方法を実施した後に行なう質量分析法において測定対象とする分子を意味する。
<Localization method of target molecule on plate (type 1)>
The method (type 1) for localizing a molecule to be measured on the plate of the present invention comprises (A) preparing a plate to which at least one compound that localizes the molecule to be measured is bound; B) A step of placing a biological sample containing at least one molecule to be measured on the plate; and (C) dropping and drying a solution containing a matrix on the biological sample, and then measuring the measurement target on the plate. And localizing the molecule. Here, the molecule to be measured means a molecule to be measured in mass spectrometry performed after performing the localization method.
[プレートを用意する工程]
（プレート）
プレートは、生体試料中の測定対象分子および夾雑分子の少なくとも一方を捕捉することが可能な官能基が結合されているものであれば特に限定されず、金属プレート、非金属膜のいずれとすることもできる。また、プレートはその表面を平面状、凹凸状等、いかなる形状とすることもでき、さらに多孔性とすることもできる。さらに、プレートには所定の官能基が直接結合されていなくてもよく、例えば、プレートと当該官能基との間のスペーサ部分またはポリマーが介在していてもよい。
[Process for preparing plates]
(plate)
The plate is not particularly limited as long as it has a functional group capable of capturing at least one of a molecule to be measured and a contaminating molecule in a biological sample, and is either a metal plate or a non-metal film. You can also. Moreover, the surface of the plate can have any shape such as a flat shape or an uneven shape, and can also be made porous. Furthermore, a predetermined functional group may not be directly bonded to the plate, for example, a spacer portion or a polymer between the plate and the functional group may be interposed.
プレート上で測定対象分子を捕捉する例（タイプ１−１）としては、アリール基を結合させたプレート、ジヒドロキシボリル基を結合させたプレート、アミノ基を結合させたプレート、またはヒドロキシ基を結合させたプレートを使用する例が挙げられる。これらのプレートは、測定対象分子との親和性が他の夾雑分子との親和性より高くなるようなプレートの一例である。特に、測定対象分子にピレン標識化を施す場合は、アリール基を結合させたプレートを使用することが、標識された測定対象分子とプレートとの高い親和性が実現され、局在化が良好に達成される点で好ましい。また、測定対象分子に糖鎖が含まれる場合は、ジヒドロキシボリル基を結合させたプレート、アミノ基を結合させたプレート、ヒドロキシ基を結合させたプレートなどを使用することが、糖鎖を含む測定対象分子とプレートとの高い親和性が実現され、局在化が良好に達成される点で好ましい。 Examples of capturing a molecule to be measured on a plate (type 1-1) include a plate to which an aryl group is bonded, a plate to which a dihydroxyboryl group is bonded, a plate to which an amino group is bonded, or a plate to which a hydroxy group is bonded. An example of using a different plate is given. These plates are an example of a plate that has higher affinity for the molecule to be measured than affinity for other contaminant molecules. In particular, when pyrene labeling is performed on a measurement target molecule, it is possible to achieve a high affinity between the labeled measurement target molecule and the plate by using a plate to which an aryl group is bonded, and to achieve good localization. It is preferable at the point achieved. In addition, if the molecule to be measured contains a sugar chain, it is possible to use a plate with a dihydroxyboryl group, a plate with an amino group, a plate with a hydroxy group, etc. This is preferable in that a high affinity between the target molecule and the plate is realized, and the localization is satisfactorily achieved.
これに対し、プレートの一部に、夾雑分子と親和性のある官能基（たとえばＣ４、Ｃ８、Ｃ１８など）を結合させることにより、プレート上で任意選択的に誘導体化された夾雑分子を捕捉し、プレート上で測定対象分子と夾雑分子とを分離して、測定対象分子の局在化を図ることもできる（タイプ１−２）。 In contrast, a functional group having an affinity for a contaminating molecule (for example, C4, C8, C18, etc.) is bound to a part of the plate, thereby capturing the optionally derivatized contaminating molecule on the plate. In addition, the molecule to be measured and the contaminating molecule can be separated on the plate to localize the molecule to be measured (type 1-2).
さらに、上記タイプ１，２の組み合わせとして、プレート上に測定対象分子と夾雑分子との双方を別々に捕捉し、プレート上で測定対象分子と夾雑分子とを分離して、測定対象分子の局在化を図ることもできる（タイプ１−３）。このような場合には、例えば、測定対象分子の誘導体化と夾雑分子の誘導体化に応じた所定の官能基を適宜選択して、各誘導体化分子と親和性のある当該官能基をプレートの別の領域に結合し、各分子の局在化領域を分離することができる。
Furthermore, as a combination of the
なお、上記タイプ１−１〜１−３のいずれにおいても、プレート上で、複数種類の測定対象分子および／または複数種類の夾雑分子を捕捉し、所定の複数の測定対象分子の局在化を図ることもできる。このような場合には、所定の測定対象分子および／または夾雑分子に応じた異なる誘導体化を行うとともに、各分子と親和性のあるそれぞれの官能基をプレートに別々の結合し、それぞれ局在する領域を分離してもよい。あるいは、それぞれに親和性のある官能基を結合したプレートを用いて順番に挟んで、それぞれのプレートに分子ごとに捕捉して分離することもできる。 In any of the types 1-1 to 1-3, a plurality of types of molecules to be measured and / or a plurality of types of contaminant molecules are captured on the plate, and a predetermined plurality of molecules to be measured are localized. You can also plan. In such a case, different derivatization is performed according to a predetermined molecule to be measured and / or a contaminating molecule, and each functional group having an affinity for each molecule is separately bound to the plate and localized. The regions may be separated. Alternatively, the plates can be sandwiched in order using plates having functional groups that have affinity for each, and each molecule can be captured and separated on each plate.
（プレートの作成方法）
以下に、このようなタイプ１−１〜１−３のプレートの一例として、アリール基を結合させたプレートの作成方法を説明する。
(Plate creation method)
Below, the preparation method of the plate which combined the aryl group as an example of such a plate of types 1-1 to 1-3 is demonstrated.
アリール基を結合させたプレートの作成方法は特に限定されないが、例えば以下のように作成することができる。即ち、プレートへのアリール基導入は、例えば、Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法（Ｈａｒｖａｒｄ大ＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓらＬａｎｇｍｕｉｒ・Ｖｏｌ．１０．１４９８−１５１１（１９９４）に従って行うことができる。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、この板材をベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液に所定時間浸して風乾する。次いで、この板材を別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプする。板材に存在する化合物のメルカプト基が、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合を生じ、自己組織化単分子膜（ＳＡＭｓ）を形成する。最後に、Ａｕ基板をエタノールで洗浄、乾燥し、フェニル基を結合させたプレートを得ることができる。Ａｕ基板へのアリール基の塗布態様は、上記スタンプに限られず、スピンコート、ロールコート、スクリーン印刷等の各種塗布方法を採用することもできる。 The method for producing the plate to which the aryl group is bonded is not particularly limited, but for example, it can be produced as follows. That is, the aryl group can be introduced into the plate according to, for example, the Micro Contact Contact Printing method (Harvard Whitesides et al. Langmuir Vol. 10.1498-1511 (1994). Specifically, it is made of polydimethylsiloxane. Then, the plate is dipped in an ethanol diluted solution of benzyl mercaptan [α-toluenethiol] for a predetermined time and air-dried, and then this plate is stamped on a separately prepared Au substrate for 3 seconds. Mercapto groups react with the gold surface to form Au-S bonds to form self-assembled monolayers (SAMs) Finally, the Au substrate was washed with ethanol and dried to bond the phenyl groups. Plates can be obtained: Aryl group applied to Au substrate It can not limited to the above stamp, spin coating, roll coating, also possible to employ various coating methods such as screen printing.
ここで使用する基板の金属材料としては、チオールが吸着可能な金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、またはこれらの合金が使用可能である。これらの中でも、大気中で表面酸化が進行しない、安定に作製可能な金が実用上好ましい。 As the metal material of the substrate used here, gold, silver, platinum, palladium, rhodium, ruthenium, or an alloy thereof capable of adsorbing thiol can be used. Among these, gold that can be stably produced and that does not undergo surface oxidation in the atmosphere is preferred in practice.
なお、アリール基をプレートの全面に均一に結合させる場合には、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを準備することが、アリール基がＡｕ基板の端まで均一に導入されるという理由により肝要である。 When the aryl group is uniformly bonded to the entire surface of the plate, it is important to prepare a plate larger than the Au substrate because the aryl group is uniformly introduced to the end of the Au substrate. It is.
このようなプレートへのアリール基の導入においては、アリール基をプレートの全面に均一に結合させることはもちろん、不均一に結合させることもできる。例えば、プレート上にアリール基をドット状に結合させ、またはアリール基をドーナツ状に結合させることができる。 In the introduction of the aryl group into such a plate, the aryl group can be bonded nonuniformly as well as uniformly bonded to the entire surface of the plate. For example, an aryl group can be bonded on the plate in a dot shape, or an aryl group can be bonded in a donut shape.
本発明におけるアリール基は、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基などの単環式の基であってもよいし、またはナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、ベンゾチアゾリル基などの縮合多環式の基であってもよい。また、一種類のアリール基のみでなく、複数種類のアリール基をプレートに導入することもできる。このような場合には、例えば、複数のアリール基を混合して導入してもよいし、アリール基の種類によってプレート上でのその導入領域を分けて偏在させてもよい。なお、アリール基には、ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＮＨ2、ＮＯ2、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ3、ＣＮなどの官能基が結合していてもよい。 The aryl group in the present invention may be a monocyclic group such as phenyl group, thienyl group, pyrrolyl group, pyridyl group, or naphthyl group, anthryl group, pyrenyl group, quinolyl group, indolyl group, acrylidinyl group. Or a condensed polycyclic group such as a benzothiazolyl group. Moreover, not only one type of aryl group but also a plurality of types of aryl groups can be introduced into the plate. In such a case, for example, a plurality of aryl groups may be mixed and introduced, or the introduction region on the plate may be divided and unevenly distributed depending on the type of the aryl group. Note that a functional group such as COOH, SO 3 H, NH 2 , NO 2 , OH, COOCH 3 , and CN may be bonded to the aryl group.
さらに、アリール基と、他の化合物、例えばボロン酸とを混合して同一のプレートに存在させることもでき、これらを別領域に分けて導入してもよい。 Furthermore, an aryl group and another compound such as boronic acid can be mixed and exist on the same plate, and these may be introduced separately in different regions.
プレートに導入する官能基は、アルキル基（例えばＣ４、Ｃ８、Ｃ１８など）であってもよい。さらに、これらのアルキル基にＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＮＨ2、ＮＯ2、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ3、ＣＮなどの官能基が結合していてもよい。 The functional group introduced into the plate may be an alkyl group (for example, C4, C8, C18, etc.). Furthermore, functional groups such as COOH, SO 3 H, NH 2 , NO 2 , OH, COOCH 3 , and CN may be bonded to these alkyl groups.
さらに、同一分子に２個以上の単一官能基または複数の官能基が結合したものを導入してもよい。 Further, a compound in which two or more single functional groups or a plurality of functional groups are bonded to the same molecule may be introduced.
[測定対象分子を含む生体試料を載置する工程]
（測定対象分子）
「測定対象分子」とは、糖、糖鎖、タンパク質、核酸、複合糖質（糖タンパク質、糖脂質など）などであって、天然から調製する他、化学的または酵素学的に調製するものを含む。なお、本発明における用語「タンパク質」はペプチドを含み、本発明における用語「糖タンパク質」は糖ペプチドを含む。タンパク質は糖鎖、リン酸などを含めて修飾がなされていてもよい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものまたは生体に含まれる分子を模倣して作製されたものを含む。
[Process for placing biological sample containing target molecule]
(Measuring molecule)
“Moleculars to be measured” refers to sugars, sugar chains, proteins, nucleic acids, complex carbohydrates (glycoproteins, glycolipids, etc.) that are prepared from nature or chemically or enzymatically prepared. Including. The term “protein” in the present invention includes a peptide, and the term “glycoprotein” in the present invention includes a glycopeptide. Proteins may be modified including sugar chains, phosphates and the like. Moreover, what has the partial structure of the molecule | numerator contained in the biological body, or the thing produced by imitating the molecule | numerator contained in the biological body is included.
測定対象分子は、そのまま利用してもよいが、一部誘導体化することで、プレート上における各点での、誘導体化した測定対象物質と標識化していない測定対象物質との分布を比較した局在化確認により、質量分析を可能とすることができる。誘導体化はプレートに載置する前におこなってもよいし、プレートに測定対象分子を載置して乾燥した後に行ってもよい。また、誘導体化は標識化合物を用いた標識化であってもよい。以下、誘導体化について詳述する。 The molecules to be measured may be used as they are, but by partially derivatizing them, the distribution of the derivatized and non-labeled substances to be measured at each point on the plate is compared. Mass confirmation can be made possible by confirmation of localization. Derivatization may be performed before placing on the plate, or may be performed after placing the molecule to be measured on the plate and drying. The derivatization may be labeling using a labeling compound. Hereinafter, derivatization will be described in detail.
糖、糖鎖、または複合糖質から化学的あるいは酵素学的に遊離して得た糖鎖（以下糖鎖とする）は、還元末端にある糖のアルデヒド基と、アミノ基あるいはヒドラジド基（−ＣＯＮＨＮＨ2）などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物とを縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を与える。縮合反応は、通常、メタノールまたはＤＭＳＯなどの有機溶媒中で、触媒としての酢酸などの存在下または非存在下において、糖鎖と標識化合物とを加温して行う。その後、ＮａＣＮＢＨ3、ＮａＢＨ4などの還元剤を加えて、加温または室温で還元反応を行う。あるいはまた、縮合反応溶液中に始めから還元剤を共存させる場合もある。還元末端の糖のアルデヒド基とＰＢＨとを縮合させることにより標識する方法では、［Ｍ＋Ｎａ］+あるいは［Ｍ−Ｈ］-などの親イオンの安定性が低く感度が劣っている。このため、還元反応をさらに行うことで親イオンを多く生成することができる。 A sugar chain (hereinafter referred to as a sugar chain) obtained by chemical or enzymatic release from a sugar, sugar chain, or complex carbohydrate is an aldehyde group of a sugar at the reducing end, an amino group or a hydrazide group (- A labeled compound which is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having CONHNH 2 ) or the like is subjected to a condensation reaction to form a labeled intermediate, and then the labeled intermediate is reduced to give a reduction-labeled molecule. The condensation reaction is usually performed in an organic solvent such as methanol or DMSO by heating the sugar chain and the labeled compound in the presence or absence of acetic acid as a catalyst. Thereafter, a reducing agent such as NaCNBH 3 or NaBH 4 is added, and the reduction reaction is performed at warming or room temperature. Alternatively, a reducing agent may coexist from the beginning in the condensation reaction solution. In the method of labeling by condensing the aldehyde group of the sugar at the reducing end and PBH, the stability of the parent ion such as [M + Na] + or [MH] − is low and the sensitivity is poor. For this reason, many parent ions can be produced | generated by performing a reductive reaction further.
また、糖、糖鎖または複合糖質の中でもシアル酸を含むものについては、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用いて、シアル酸のカルボキシ基と、標識化合物のアミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などとを反応させることによって標識できる。この反応は、例えば、水溶性カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド存在下で行う。 For sugars, sugar chains or complex carbohydrates containing sialic acid, a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group, a hydrazide group, a diazomethyl group or the like is used as a labeling compound, and the carboxy group of sialic acid It can be labeled by reacting with an amino group, hydrazide group, diazomethyl group, etc. of the labeling compound. This reaction is performed, for example, in the presence of water-soluble carbodiimide and N-hydroxysulfosuccinimide.
さらに、シアル酸を含む糖、糖鎖、または複合糖質は、シアル酸のＣ7-9位のみを選択的に過ヨウ素酸酸化してアルデヒド基を生じさせることができる。シアル酸のＣ7-9位の選択的酸化は、５ｍＭのＮａＩＯ4水溶液中で０℃、１０〜２０分間にわたり反応させることによって実施することができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の選択的酸化により生じたアルデヒド基と、標識化合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を得ることができる。 Furthermore, sugars, sugar chains, or complex carbohydrates containing sialic acid can selectively oxidize only the C 7-9 position of sialic acid to generate an aldehyde group. Selective oxidation of the C 7-9 position of sialic acid can be carried out by reacting in 5 mM NaIO 4 aqueous solution at 0 ° C. for 10-20 minutes. Using a labeled compound that is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group or hydrazide group, the aldehyde group produced by the selective oxidation and the amino group or hydrazide group of the labeled compound are subjected to a condensation reaction as described above. By forming a labeled intermediate and then reducing the labeled intermediate, a reduction-labeled molecule can be obtained.
あるいは、多くの糖、糖鎖、または複合糖質は、非還元末端にガラクトースを含む。その非還元末端のガラクトースを特異的にガラクトースオキシダーゼによってＣ6位を酸化しアルデヒド基を生じさせることができる。酵素反応は、たとえば、中性の緩衝液中で、室温、２時間で行うことができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の酵素的酸化により生じたアルデヒド基と、標識化合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させて標識化中間体を形成し、次いで該標識化中間体を還元することによって還元標識された分子を得ることができる。 Alternatively, many sugars, sugar chains, or glycoconjugates contain galactose at the non-reducing end. The non-reducing terminal galactose can be specifically oxidized at the C 6 position with galactose oxidase to generate an aldehyde group. The enzyme reaction can be performed, for example, in a neutral buffer solution at room temperature for 2 hours. Using a labeled compound which is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group or a hydrazide group, the aldehyde group generated by the above enzymatic oxidation and the amino group or hydrazide group of the labeled compound are subjected to a condensation reaction as described above. By forming a labeled intermediate and then reducing the labeled intermediate, a reduction-labeled molecule can be obtained.
ガラクトースに標識を行うこれらの方法を、糖タンパク質（糖ペプチドを含む）分子上のシアル酸、ガラクトースなどに適用することが可能である。その場合、糖タンパク質分子を標識できるので、該分子のイオン化効率が高くなる。 These methods of labeling galactose can be applied to sialic acid, galactose, etc. on glycoprotein (including glycopeptide) molecules. In that case, since the glycoprotein molecule can be labeled, the ionization efficiency of the molecule is increased.
タンパク質（ペプチドを含む）および糖タンパク質（糖ペプチドを含む）は、その中に含まれるカルボキシ基、アミノ基、またはＳＨ基を用いて標識することができる。カルボキシ基を用いて標識する場合には、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のカルボキシ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。一方、アミノ基を用いて標識する場合には、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のアミノ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。さらに、タンパク質または糖タンパク質に含まれるシステイン残基のＳＨ基を用いて標識する場合には、ヨード基（−Ｉ）などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のＳＨ基とを反応させることによって標識された分子を得ることができる。 Proteins (including peptides) and glycoproteins (including glycopeptides) can be labeled with a carboxy group, amino group, or SH group contained therein. When labeling with a carboxy group, a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group, a hydrazide group, a diazomethyl group, etc. is used as a labeling compound, and these groups react with a carboxy group in a protein or glycoprotein. To obtain a labeled molecule. On the other hand, when labeling with an amino group, a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having a succinimidyl ester group, a sulfonyl chloride group or the like is used as a labeling compound, and these groups are combined with an amino group in a protein or glycoprotein. To give a labeled molecule. Furthermore, when labeling using the SH group of a cysteine residue contained in a protein or glycoprotein, a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an iodo group (-I) or the like is used as a labeling compound, Labeled molecules can be obtained by reacting with SH groups in proteins or glycoproteins.
標識化合物は、芳香族化合物であっても、縮合多環炭化水素誘導体であってもよい。「芳香族化合物」とは、芳香族環部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、該芳香族環部分と反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物を含む。ここで、芳香族環部分は、ベンゼン環、チオフェン環、ピロール環、ピリジン環などの単環式芳香族環、またはナフタレン環、アントラセン環、ピレン環、キノリン環、インドール環、アクリジン環、ベンゾチアゾール環などの縮合芳香族環であってもよい。「縮合多環炭化水素誘導体」とは、ナフタレン、アントラセン、ピレンなどの縮合多環炭化水素部分と、分析対象の分子と結合することが可能である反応性官能基と、該縮合多環炭化水素と該反応性官能基とを連結するスぺーサ部分とを有する化合物をいう。 The labeling compound may be an aromatic compound or a condensed polycyclic hydrocarbon derivative. “Aromatic compound” means an aromatic ring part, a reactive functional group capable of binding to a molecule to be analyzed, and a spacer part that connects the aromatic ring part and the reactive functional group. The compound which has. Here, the aromatic ring moiety is a monocyclic aromatic ring such as a benzene ring, thiophene ring, pyrrole ring, pyridine ring, or naphthalene ring, anthracene ring, pyrene ring, quinoline ring, indole ring, acridine ring, benzothiazole. It may be a condensed aromatic ring such as a ring. “Condensed polycyclic hydrocarbon derivative” means a condensed polycyclic hydrocarbon moiety such as naphthalene, anthracene, pyrene, a reactive functional group capable of binding to a molecule to be analyzed, and the condensed polycyclic hydrocarbon And a spacer moiety that links the reactive functional group.
本発明で用いる標識化合物は、好ましくはピレン誘導体化合物である。「ピレン誘導体化合物」とは、ピレン環と、分析対象の分子に結合することが可能である反応性官能基と、該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。具体的には、１−ピレニルジアゾメタン(1-pyrenyldiazomethane)、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１−ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１−ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１−ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１−ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１−ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesulfonyl chloride）１−ピレニルジアゾメタンなどが挙げられる。これらの中でも、１−ピレニルジアゾメタンを用いることが、反応性が高い点で好ましい。 The labeling compound used in the present invention is preferably a pyrene derivative compound. The “pyrene derivative compound” is a compound having a pyrene ring, a reactive functional group capable of binding to a molecule to be analyzed, and a spacer portion that connects the pyrene ring and the reactive functional group. Say. Specifically, 1-pyrenyldiazomethane, 1-pyrenebutanoic acid, hydrazide, 1-pyreneacetic acid, hydrazide, 1-pyrenepropionic acid hydrazide (1-pyrenepropionic acid, hydrazide), 1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenebutanoic acid Succinimidyl ester (1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester), N- (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid succinimidyl ester (N- (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid, succinimidyl ester), N- (1-pyrene) iodo Acetamide (N- (1-pyrene) iodoacetamide), N- (1-pyrene) iodomaleimide (N- (1-pyrene) maleimide), N- (1-pyrene) Lenmethyl) iodoacetamide (N- (1-pyrenemethyl) iodoacetamide), 1-pyrenemethyl iodoacetate, aminopyrene, 1-pyrenemethylamine, 1-pyrenepropylamine (3- (1-pyrenyl) propylamine), 1-pyrenebutylamine (4- (1-pyrenyl) butylamine), 1-pyrenesulfonyl chloride 1-pyrenyldiazomethane and the like. Among these, it is preferable to use 1-pyrenyldiazomethane in terms of high reactivity.
また、誘導体化の例として、芳香族基を含まない、アルキル化を行ってもよい。 Further, as an example of derivatization, alkylation that does not include an aromatic group may be performed.
（生体試料の載置方法）
生体試料の載置工程では、誘導体化後の測定分子または誘導体化しない測定分子を、適当な溶媒に溶解し、ピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。乾燥は、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。必要に応じて、引き続き誘導体化反応を行なう。
(Biological sample placement method)
In the biological sample mounting step, the derivatized measurement molecule or the non-derivatized measurement molecule is dissolved in an appropriate solvent and dropped onto the plate with a dropping device such as a pipette or an automatic spotter. Drying may be left at room temperature or warmed if the molecule does not change. If necessary, a derivatization reaction is subsequently performed.
[プレート上で測定対象分子を局在化する工程]
（マトリックス）
事後的な質量分析におけるマトリックスの役割は、照射されたレーザーの光エネルギーを吸収しマトリックス自身がイオン化を起こして測定対象分子との間でプロトンまたは電子などを受け渡すというものである。マトリックスは、その種類によって固有の光エネルギー吸収帯があるので、照射するレーザーによって使用するマトリックスも異なる。また、マトリックスは、光エネルギーの吸収以外にも、測定対象分子を分子レベルで均一に分散させる分散剤としての役割も有する。このため、測定する分子の違い（タンパク質、核酸、糖類、脂質など）によってマトリックスを適宜選択することが重要である。
[Step of localizing target molecule on the plate]
(matrix)
The role of the matrix in the subsequent mass spectrometry is to absorb the light energy of the irradiated laser and cause the matrix itself to ionize and transfer protons or electrons to and from the molecule to be measured. Since the matrix has an inherent light energy absorption band depending on its type, the matrix used differs depending on the laser to be irradiated. In addition to the absorption of light energy, the matrix also has a role as a dispersing agent for uniformly dispersing the molecule to be measured at the molecular level. For this reason, it is important to select a matrix appropriately according to the difference in the molecule to be measured (protein, nucleic acid, saccharide, lipid, etc.).
このようなマトリックスとしては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）、ｎｏｒｈａｒｍａｎ、６−ａｚａ−２−ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｎｅ（６−ＡＴＴ）、２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ等を使用することができる。高い局在化を達成するためには、マトリックス濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、マトリックス濃度は、測定試料によって選択する必要がある。マトリックス濃度は、例えば０．１〜２０ ｍｇ／ｍｌとすることが特に好ましく、２〜１０ｍｇ／ｍｌとすることが、結晶形を制御できる点で極めて好ましい。 Examples of such a matrix include α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), sinapinic acid (SA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA), norharman, 6-aza-2-thiothymine ( 6-ATT), 2,4,6-trihydroxyacetophenone, etc. can be used. In order to achieve high localization, it is preferable to appropriately select the matrix concentration. Specifically, the matrix concentration needs to be selected depending on the measurement sample. The matrix concentration is particularly preferably from 0.1 to 20 mg / ml, for example, and particularly preferably from 2 to 10 mg / ml, since the crystal form can be controlled.
（溶媒）
マトリックスを溶解する溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリル等、およびこれらと水との混液を使用することができる。特に、アセトニトリルと水との混液を使用することが、試料およびマトリックスとよく混和し、その後の局在化を実現する点で好ましい。高い局在化を達成するためには、溶媒濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、溶媒濃度は、測定試料によって選択する必要がある。溶媒濃度、例えば、アセトニトリル濃度は、０〜１００％とすることが好ましく、特に、４０〜９０％とすることが、乾燥時間および／または乾燥過程を制御できる点で特に好ましい。
(solvent)
As the solvent for dissolving the matrix, acetone, methanol, ethanol, acetonitrile and the like, and a mixture of these with water can be used. In particular, the use of a mixed solution of acetonitrile and water is preferable in that it can be well mixed with the sample and the matrix to realize the subsequent localization. In order to achieve high localization, it is preferable to select a solvent concentration as appropriate. Specifically, the solvent concentration needs to be selected depending on the measurement sample. The solvent concentration, for example, acetonitrile concentration is preferably 0 to 100%, and particularly preferably 40 to 90%, from the viewpoint that the drying time and / or the drying process can be controlled.
（測定対象分子の局在化方法）
マトリックスと溶媒との混合は、特に限定するものではなく、公知のいかなる技術を使用することもできる。例えば、ＤＨＢＡ（高純度マトリックス試薬、島津ジーエルシー製）５ｍｇを、４０％のアセトニトリルを含有する水０．５ｍｌに溶解し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ溶液を用時調製する。この際、必要に応じて遠心分離した上清を用いる。
プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程では、まず、測定試料を載置した部位を覆うようにマトリックス溶液をピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。この段階で、測定対象分子が再溶解してマトリックスとの混合溶液となる。
(Localization method of target molecule)
Mixing of the matrix and the solvent is not particularly limited, and any known technique can be used. For example, 5 mg of DHBA (high purity matrix reagent, Shimadzu GL) is dissolved in 0.5 ml of water containing 40% acetonitrile, and a final concentration of 10 mg / ml solution is prepared at the time of use. At this time, the centrifuged supernatant is used if necessary.
In the step of localizing the molecule to be measured on the plate, first, the matrix solution is dropped onto the plate with a dropping device such as a pipette or an automatic spotter so as to cover the site where the measurement sample is placed. At this stage, the molecule to be measured is redissolved to form a mixed solution with the matrix.
次に、混合溶液を乾燥することで、測定対象分子が再移動して局在化を実現する。具体的には、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。当該乾燥は、測定分子によるが、局在化が十分に起こる時間で行う。乾燥時間は、２分〜２４時間とすることが好ましい。さらに、分析時間の短縮、試料および結晶形態などを変化させない観点から、５分〜３０分とすることがさらに好ましい。 Next, by drying the mixed solution, the measurement target molecule is re-migrated to realize localization. Specifically, even if it is allowed to stand at room temperature, it may be heated if the molecule does not change. The drying is performed at a time when localization sufficiently occurs, depending on the measurement molecule. The drying time is preferably 2 minutes to 24 hours. Furthermore, from the viewpoint of shortening the analysis time and not changing the sample and crystal form, it is more preferable that the time is 5 minutes to 30 minutes.
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ１）によれば、上記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、工程（Ａ）において、プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化することができる。また、生体試料が少なくとも１種の夾雑分子を含む場合に、工程（Ａ）において、プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、工程（Ｃ）において、プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することができる。 According to such a localization method (type 1) of a molecule to be measured on a plate, when the biological sample includes at least two kinds of molecules to be measured, in step (A), at least two of the plates In the step (C), different compounds to be measured can be localized in at least two regions by binding different compounds to the regions. Further, when the biological sample contains at least one kind of contaminating molecule, in step (A), different compounds are bound to at least two regions of the plate, and in step (C), molecules to be measured are detected in one region of the plate. In other areas, contaminating molecules can be localized.
＜プレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ２）＞
[プレートを用意する工程]
タイプ２において、プレートを用意する工程には、（Ａ１）第１プレート上に測定対象分子を局在化する第１の化合物を結合する工程と、（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程とが含まれる。
<Localization method of molecule to be measured on plate (type 2)>
[Process for preparing plates]
In
本工程において用いるプレートの種類については、上記したタイプ１と同様である。ただし、第１プレートと第２プレートとでは、異なる化合物を結合させる。これにより、後述するように、異なるプレートで異種の測定対象分子を局在化させることができる。 The type of plate used in this step is the same as type 1 described above. However, different compounds are bound to the first plate and the second plate. Thereby, as will be described later, different kinds of molecules to be measured can be localized on different plates.
[測定対象分子を含む生体試料を載置する工程]
タイプ２において、測定対象分子を含む生体試料を載置する工程には、（Ｂ１）第１プレートおよび第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、（Ｂ２）第１プレートおよび第２プレートを分離する工程とが含まれる。
[Process for placing biological sample containing target molecule]
In
本工程において用いる測定対象分子の種類については、上記したタイプ１と同様である。第１プレートと第２プレートとにより測定対象分子を含む生体試料を挟む際には、重しなどを置いてよく密着させることが、局在化を高効率で行うことができる点で好ましい。また、生体試料の乾燥の際には、適当な時間をかけて乾燥し、さらに完全に乾燥することが、局在化を高効率に達成できる点で好ましい。例えば、室温〜４５℃で、３０分〜２４時間かけて乾燥することが好ましい。 The kind of molecule to be measured used in this step is the same as that of Type 1 described above. When a biological sample containing a molecule to be measured is sandwiched between the first plate and the second plate, it is preferable to place a weight or the like so that the biological sample is placed in close contact with each other because the localization can be performed with high efficiency. In addition, when the biological sample is dried, it is preferable that the biological sample is dried over an appropriate time and further completely dried from the viewpoint that localization can be achieved with high efficiency. For example, it is preferable to dry at room temperature to 45 ° C. for 30 minutes to 24 hours.
[プレート上で測定対象分子を局在化する工程]
タイプ２において、プレート上で測定対象分子を局在化する工程は、（Ｃ）第１プレートおよび第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、プレート上で測定対象分子を局在化する工程である。
[Step of localizing target molecule on the plate]
In
本工程において用いるマトリックス、および溶媒の種類については、上記したタイプ１と同様である。 About the matrix used in this process, and the kind of solvent, it is the same as that of the above-mentioned type 1.
このようなプレート上での測定対象分子の局在化方法（タイプ２）によれば、生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含む場合に、工程（Ｃ）において、第１プレートの測定対象分子とは異なる測定対象分子を第２プレートで局在化することができる。また、生体試料が少なくとも１種の夾雑分子を含む場合に、工程（Ｃ）において、少なくとも１種の夾雑分子を第２プレートで局在化することができる。 According to such a localization method (type 2) of a molecule to be measured on the plate, when the biological sample includes at least two kinds of molecules to be measured, in step (C), the measurement target of the first plate A molecule to be measured different from the molecule can be localized on the second plate. Further, when the biological sample contains at least one kind of contaminating molecule, in the step (C), at least one kind of contaminating molecule can be localized on the second plate.
＜質量分析法（タイプ１）＞
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
（１）プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）により、プレート上で測定対象分子を局在化する工程、および
（２）上記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む方法である。
<Mass Spectrometry (Type 1)>
The method for mass spectrometry of the molecule to be measured of the present invention is as follows.
(1) a method of localizing a molecule to be measured on the plate by a method (type 1) for localizing the molecule to be measured on the plate, and (2) localized in the above step (1) The method includes the step of performing MS n measurement on a molecule to be measured, wherein n is an integer of 1 or more.
（工程（１））
工程１は、上記したプレート上での測定対象分子の局在化方法を行なう工程である。当該工程は、上述したとおりである。
(Process (1))
Step 1 is a step of performing the above-described localization method of the molecule to be measured on the plate. This process is as described above.
（工程（２））
工程２は、工程１で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程である。
(Process (2))
「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、レーザー脱離（ＬＤ）法、高速電子衝撃（ＦＡＢ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学（ＡＰＣＩ）法などのイオン化方法によって分子を含む試料をイオン化し、次いで、飛行時間法（タイムオブフライト法、ＴＯＦ法）、二重収束法、四重極集束法などを用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する方法である。 “Mass spectrometry” means matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, laser desorption (LD) method, fast electron impact (FAB) method, electrospray ionization (ESI) method, atmospheric pressure chemistry (APCI) method Samples containing molecules are ionized by ionization methods such as time-of-flight method (TOF method), double-focusing method, quadrupole focusing method, etc. It is a method of separating and detecting according to the ratio (m / z).
本発明においてイオン化法は限定されないが、好ましくは、ＬＤ法、ＦＡＢ法、またはＭＡＬＤＩ法であり、より好ましくは、ＭＡＬＤＩ法である。 In the present invention, the ionization method is not limited, but is preferably the LD method, FAB method, or MALDI method, and more preferably the MALDI method.
ＭＡＬＤＩ法においては、メチル化または縮合多環炭化水素が分子に結合していることで、イオン化効率が高くなる。 In the MALDI method, the ionization efficiency is increased because the methylated or condensed polycyclic hydrocarbon is bonded to the molecule.
糖、糖鎖、タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子は、分子量および組成が同一の構造異性体が存在するので、縮合多環炭化水素誘導体による標識化後、プリカーサーイオンの生成を高めて、ＭＳn（ｎ＞１）解析を行い、異性体に特異的なイオンを生成して構造情報を得ることができる。糖ペプチドまたは糖タンパク質の糖鎖部分に標識した分子をＭＳn（ｎ＞１）解析する場合、標識を含むプロダクトイオンを選択することによって、分子中の糖鎖結合位置を決定することができる。 Since molecules such as sugars, sugar chains, proteins, sugar-modified proteins, nucleic acids, glycolipids, etc. have structural isomers having the same molecular weight and composition, precursor ions are labeled after labeling with condensed polycyclic hydrocarbon derivatives. The structure information can be obtained by performing MS n (n> 1) analysis and generating ions specific to the isomer. When MS n (n> 1) analysis is performed on a molecule labeled on a sugar chain part of a glycopeptide or glycoprotein, a sugar chain binding position in the molecule can be determined by selecting a product ion containing the label.
当該タイプ１の質量分析方法においては、当該技術分野で通常用いられるいかなる方法を用いることもできる。 In the type 1 mass spectrometry method, any method usually used in the technical field can be used.
＜質量分析法（タイプ２）＞
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
（１）プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ２）により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含む方法である。
<Mass Spectrometry (Type 2)>
The method for mass spectrometry of the molecule to be measured of the present invention is as follows.
(1) Localizing the molecule to be measured in the biological sample on the plate by a method (type 2) for localizing the molecule to be measured on the plate; This is a method including the step of performing MS n measurement on the activated molecule to be measured, wherein n is an integer of 1 or more.
（工程（１））、（工程（２））、および用語「質量分析法」等については、上記の、プレート上での測定対象分子を局在化する方法（タイプ１）と同様である。 (Step (1)), (Step (2)), the term “mass spectrometry” and the like are the same as the above-described method (type 1) for localizing a molecule to be measured on a plate.
当該タイプ２の質量分析方法においても、当該技術分野で通常用いられるいかなる方法を用いることもできる。
In the
以下に、本発明の効果を実施例に基づいて実証する。 Below, the effect of this invention is demonstrated based on an Example.
（実施例１）
１−１．フェニルプレートの作成
Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法に従って、プレートへのフェニル基導入を行なった。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、ベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥してフェニルプレートを得た。本例では、プレートにフェニル基を全面コートしたため、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを使用した。
Example 1
1-1. Preparation of Phenyl Plate A phenyl group was introduced into the plate according to the Micro / Contact / Printing method. Specifically, a plate material made of polydimethylsiloxane was prepared, and dipped in an ethanol diluted solution (2 mM) of benzyl mercaptan [α-toluenethiol] for 10 minutes and air-dried. Next, stamping was performed for 3 seconds on a separately prepared Au substrate. Thereafter, the substrate was washed with ethanol and dried to obtain a phenyl plate. In this example, since the phenyl group was entirely coated on the plate, a plate larger than the Au substrate was used as the plate material.
１−２．測定対象分子の局在化および質量分析
上記のように事前に作成したプレート上に、糖鎖１(５００ｆｍｏｌ)を載置し、乾燥させた。その上に、１−ピレニルジアゾメタン５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、２５分にわたって４０℃に加熱して乾燥させることにより、一部ピレン標識化された標識糖鎖１を得た。マトリックスとしてＤＨＢＡ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液、４０％アセトニトリル）０．５μＬを、試料を覆うように滴下し室温で乾燥して、図１に示す標識糖鎖含有測定試料１を調製した。
1-2. Localization and Mass Spectrometry of Measurement Object Molecule Sugar chain 1 (500 fmol) was placed on the plate prepared in advance as described above and dried. On top of that, 0.25 μL of DMSO solution containing 500 pmol of 1-pyrenyldiazomethane was added dropwise and heated to 40 ° C. for 25 minutes to dry, thereby obtaining labeled sugar chain 1 partially labeled with pyrene. As a matrix, 0.5 μL of DHBA (10 mg / ml solution, 40% acetonitrile) was added dropwise so as to cover the sample and dried at room temperature to prepare a labeled sugar chain-containing measurement sample 1 shown in FIG.
得られた測定試料１を、Ｘ×Ｙ＝２１×２１の合計４４１の領域に分割し、質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、島津製作所）のラスタースキャンによって各領域のネガティブイオンを測定した。ラスタースキャンによって得られた各領域の測定ファイルの情報を測定位置座標（ｘ、ｙ）、ｍ／ｚおよびシグナル強度を含むテキストに変換した。当該テキスト変換したデータに基づいて、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）の分布および未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２０７７）の分布を、公開ソフトＧｒａｐｈ−Ｒを用いて二次元に表示した。 The obtained measurement sample 1 was divided into a total of 441 regions of X × Y = 21 × 21, and negative ions in each region were measured by a raster scan of a mass spectrometer (AXIMA-QIT, Shimadzu Corporation). The information of the measurement file of each region obtained by the raster scan was converted into text including measurement position coordinates (x, y), m / z, and signal intensity. Based on the text-converted data, the distribution of deprotonated ions derived from labeled sugar chain 1 (m / z = 2582) and the distribution of deprotonated ions derived from unlabeled sugar chain 1 (m / z = 2077) are disclosed. Displayed two-dimensionally using Soft Graph-R.
図２に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示し、図３に、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示す。また、図４に、図２，３中の点Ａにおける質量スペクトルを示す。また、図５に、図２，３中の点Ｂにおける質量スペクトルを示す。図４および５の縦軸は最大値が同一になるように示してある。 FIG. 2 shows the signal intensity of the deprotonated ion derived from the labeled sugar chain 1, and FIG. 3 shows the signal intensity of the deprotonated ion derived from the unlabeled sugar chain 1. FIG. 4 shows a mass spectrum at point A in FIGS. FIG. 5 shows a mass spectrum at a point B in FIGS. 4 and 5 are shown such that the maximum values are the same.
図２，３によれば、標識糖鎖イオンと未標識糖鎖イオンとの生成する領域が異なること、換言すれば標識糖鎖の局在化が実現できていることが判明した。また、図４，５によれば、図２，３の結果から所定の領域、即ち、図２，３の各点の中で図２の点の方が、色が濃い領域（例えば、点Ａ）を選択した場合にのみ、所望のイオン（標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン）の他のイオンと比較した高いシグナル強度が選択的に得られることが判明した。 2 and 3, it was found that the regions where the labeled sugar chain ion and the unlabeled sugar chain ion are generated are different, in other words, the localization of the labeled sugar chain can be realized. Also, according to FIGS. 4 and 5, from the results of FIGS. 2 and 3, a predetermined region, that is, a region in which the point of FIG. 2 is darker among the points of FIGS. Only when () was selected, it was found that a high signal intensity compared with other ions of the desired ion (labeled sugar chain 1-derived deprotonated ion) was selectively obtained.
以上の効果は、プレートに所定の加工を施してアリール基（フェニル基）を結合させたプレートを使用したことによって奏されたものであり、これにより、本願の効果が実証された。 The above effect was achieved by using a plate in which the plate was subjected to predetermined processing and bonded with an aryl group (phenyl group), thereby demonstrating the effect of the present application.
（比較例１）
フェニルプレートの代わりに一般に汎用されているステンレスプレートを用いて、実施例１と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。
(Comparative Example 1)
Scanning was performed in the same manner as in Example 1 using a generally used stainless steel plate instead of the phenyl plate. The results are shown below.
図６に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示し、図７に、未標識糖鎖１由来脱プロトン化イオンのシグナル強度を示す。また、図８に、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルのみを示す。 FIG. 6 shows the signal intensity of the deprotonated ion derived from the labeled sugar chain 1, and FIG. 7 shows the signal intensity of the deprotonated ion derived from the unlabeled sugar chain 1. FIG. 8 shows only the mass spectrum at point C in FIGS.
図６，７によれば、標識糖鎖イオンと未標識糖鎖イオンとの生成する領域が同一であること、換言すれば標識糖鎖の局在化が実現できていないことが判明した。また、図８では、図６，７中の点Ｃにおける質量スペクトルのみを表示したが、図６，７中の各点の色の濃さに差異がないことからすれば、どの点をとっても、図８の結果が得られることが予想される。 According to FIGS. 6 and 7, it was found that the regions where the labeled sugar chain ion and the unlabeled sugar chain ion are generated are the same, in other words, the localization of the labeled sugar chain has not been realized. In FIG. 8, only the mass spectrum at the point C in FIGS. 6 and 7 is displayed. However, since there is no difference in the color intensity of each point in FIGS. It is expected that the result of FIG. 8 will be obtained.
以上は、プレートに所定の加工を施さず従来のステンレスプレートを使用したことによって得られた結果であることが判る。 The above is a result obtained by using a conventional stainless steel plate without performing predetermined processing on the plate.
（実施例２）
市販の糖タンパク質前立腺特異抗原を電気泳動後、リジルエンドプロテアーゼＣでゲル内消化し、ペプチドＮグリコシダーゼＦ消化を行ない、さらにＣ１８チップ素通り画分を得た。この画分を試料として実施例１で作成したフェニルプレートに載置し、以下実施例１と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。
(Example 2)
A commercially available glycoprotein prostate specific antigen was electrophoresed and then digested in the gel with lysyl endoprotease C, digested with peptide N glycosidase F, and a C18 chip flow-through fraction was obtained. This fraction was placed as a sample on the phenyl plate prepared in Example 1, and scanning was performed in the same manner as in Example 1 below. The results are shown below.
図９に、ペプチドイオン（ｍ／ｚ＝１０７５）のシグナル強度を示し、図１０に、標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン（ｍ／ｚ＝２５８２）のシグナル強度を示す。また、図１１に、図９，１０中の点Ｄにおける質量スペクトルを示す。また、図１２に、図９，１０中の点Ｅにおける質量スペクトルを示す。図１１および１２の縦軸は最大値が同一になるように示してある。 FIG. 9 shows the signal intensity of peptide ions (m / z = 1075), and FIG. 10 shows the signal intensity of labeled sugar chain 1-derived deprotonated ions (m / z = 2582). FIG. 11 shows a mass spectrum at a point D in FIGS. FIG. 12 shows a mass spectrum at point E in FIGS. 11 and 12 are shown such that the maximum values are the same.
図９，１０によれば、ペプチドイオンと標識糖鎖イオンとの生成する領域が異なること、換言すればペプチドイオンと標識糖鎖との局在化が実現できていることが判明した。また、図１１，１２によれば、図９，１０の結果から所定の領域、即ち、図９，１０の各点の中で図１０の点の方が、色が濃い領域（例えば、点Ｅ）を選択した場合にのみ、所望のイオン（標識糖鎖１由来脱プロトン化イオン）の他のイオンと比較した高いシグナル強度が選択的に得られることが判明した。 9 and 10, it was found that the regions where peptide ions and labeled sugar chain ions are generated are different, in other words, localization of peptide ions and labeled sugar chains can be realized. Further, according to FIGS. 11 and 12, a predetermined region based on the results of FIGS. 9 and 10, that is, a region with a darker color (for example, a point E in the point of FIG. 10 among the points of FIGS. 9 and 10). Only when () was selected, it was found that a high signal intensity compared with other ions of the desired ion (labeled sugar chain 1-derived deprotonated ion) was selectively obtained.
以上の効果は、プレートに所定の加工を施して芳香族化合物を結合させたプレートを使用したことによって奏されたものであり、これにより、本願の効果が実証された。 The above effect was achieved by using a plate in which the plate was subjected to predetermined processing and bonded with an aromatic compound, thereby demonstrating the effect of the present application.
さらに、従来、測定試料中にペプチドが糖鎖とともに混在していると、ペプチドがイオン化し易いため、質量分析において糖鎖イオンはほとんど検出できなかった。しかしながら、実施例２では、ペプチドが糖鎖とともに混在していても、微小領域での局在化による両物質の分離が実現され、生体試料由来の微量糖鎖でも質量分析により同定が可能であることが予想される。 Furthermore, conventionally, when a peptide is mixed with a sugar chain in a measurement sample, since the peptide is easily ionized, sugar chain ions were hardly detected in mass spectrometry. However, in Example 2, separation of both substances by localization in a microregion is realized even if a peptide is mixed with a sugar chain, and even a trace sugar chain derived from a biological sample can be identified by mass spectrometry. It is expected that.
（実施例３）
実施例３は、フェニルプレートを用いて糖ペプチドおよびペプチドの局在化を行った例である。まず、ＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドの精製は、以下のようにして行った。即ち、０．６ｍＬチューブにＰＳＡ−ＡＣＴ０．５μｇを含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液９５μＬと、１０Ｕ／μＬサーモライシン水溶液の５μLとを加えて混合溶液を撹拌し、５６．５℃で一晩インキュベーションした。この混合溶液を遠心エバポレーターで乾燥して乾燥物を得、当該乾燥物に、０．８%トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を１５０μＬ加え、ヒートブロックを用い、８０℃で４０秒反応させてアシアロ化を行ったサンプルを得た。
(Example 3)
Example 3 is an example in which a glycopeptide and a peptide are localized using a phenyl plate. First, purification of the PSA-ACT-derived glycopeptide was performed as follows. That is, 95 μL of a 50 mM ammonium bicarbonate aqueous solution containing 0.5 μg of PSA-ACT and 5 μL of a 10 U / μL thermolysin aqueous solution were added to a 0.6 mL tube, and the mixed solution was stirred and incubated at 56.5 ° C. overnight. This mixed solution is dried with a centrifugal evaporator to obtain a dried product, and 150 μL of 0.8% trifluoroacetic acid (TFA) is added to the dried product, and the mixture is reacted at 80 ° C. for 40 seconds using a heat block. Obtained samples were obtained.
次いで、当該サンプルに、Ｈ2Ｏを加えて繰り返し乾燥させた。具体的には、当該サンプルに、Ｈ2Ｏ２０μＬ、エタノール２０μＬ、ブタノール８０μＬの順で加えてよく撹拌し、洗浄・平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲル浮遊液（１：１）を１０μＬ加えてよく撹拌した後、１時間振盪した。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂゲルの洗浄・平衡化は、５０％エタノールで３回洗浄し、ブタノール／エタノール／水（４：１：１）の混合溶液で３回行った。振盪後、遠心して上清を捨て、これを繰り返して洗浄した。５０％エタノール１００μＬを加えて３０秒振盪し、遠心後上清を回収し、遠心エバポレーターで乾燥した。 Next, H 2 O was added to the sample and dried repeatedly. Specifically, 20 μL of H 2 O, 20 μL of ethanol, and 80 μL of butanol were added in this order and stirred well, and 10 μL of washed and equilibrated Sepharose CL-4B gel suspension (1: 1) was added and stirred well. Thereafter, it was shaken for 1 hour. The Sepharose CL-4B gel was washed and equilibrated three times with 50% ethanol and three times with a mixed solution of butanol / ethanol / water (4: 1: 1). After shaking, the supernatant was discarded by centrifugation, and this was repeated for washing. 100 μL of 50% ethanol was added and shaken for 30 seconds. After centrifugation, the supernatant was collected and dried with a centrifugal evaporator.
最後に、フェニルプレートを用いた局在化およびＭＳ測定を、実施例１と同様に行った。即ち、６０％アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍＬＤＨＢＡの１μＬを滴下し、風乾させてＡＸＩＭＡ−ＱＩＴで測定を行った結果、ネガティブイオンＭＳスペクトルを図１３，１４に示す。なお、図１３は、ピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図１４は、ピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。 Finally, localization and MS measurement using a phenyl plate were performed in the same manner as in Example 1. That is, 1 μL of 10 mg / mL DHBA dissolved in 60% acetonitrile was dropped, air-dried, and measured by AXIMA-QIT. As a result, negative ion MS spectra are shown in FIGS. 13 shows the result of MS measurement without pyrene labeling, and FIG. 14 shows the result of MS measurement with pyrene labeling.
図１３，１４によれば、ピレン標識を行わなかった場合には、ペプチドのシグナルａのみが検出された。これに対し、ピレン標識を行った場合には、糖ペプチドのシグナルｂ，ｃ，ｄが特異的に検出されることが明らかになった。ポジティブイオンＭＳスペクトルにおいても同様の結果が得られた。 According to FIGS. 13 and 14, only peptide signal a was detected when pyrene labeling was not performed. In contrast, when pyrene labeling was performed, it was revealed that the signals b, c, and d of the glycopeptide were specifically detected. Similar results were obtained in the positive ion MS spectrum.
さらに、測定試料の特定の領域のＭＳスペクトルの例を図１５に示す。図１３，１４に示した、全測定点の平均スペクトルに比較して、糖ペプチドのみのシグナル強度が相対的に高くなる測定点が明らかに存在する、すなわち局在化していることが示された。 Furthermore, FIG. 15 shows an example of the MS spectrum of a specific region of the measurement sample. Compared with the average spectrum of all measurement points shown in FIGS. 13 and 14, it was shown that there are clearly measurement points where the signal intensity of only the glycopeptide is relatively high, that is, localized. .
（実施例４）
実施例４は、Ｃ１８プレートとフェニルプレートとの間に、糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った例である。まず、Ｃ１８プレートおよびフェニルプレートの作製は、以下のようにして行った。即ち、フェニルプレートは実施例１と同様に作成した。なお、測定試料溶液を保持させるために、直径３ｍｍの穴の空いたＰＤＭＳ(ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ)樹脂製のシート（厚さ１００μm、外形はフェニルプレートと略同形状）を作製し、貼り付けた。貼り付けは、ＰＤＭＳシートの自己吸着により、接着剤等は用いていない。Ｃ１８プレートについてもフェニルプレートと同様に作製した。ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、[１−オクタデカンチオール]のエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備したＡｕ基板に３秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。本例では、プレートにＣ１８を全面コートしたため、上記板材として、Ａｕ基板よりも大きなものを使用した。
糖ペプチドの調製は実施例３と同様に行った。
Example 4
Example 4 is an example in which localization was performed by sandwiching a glycopeptide and a peptide between a C18 plate and a phenyl plate. First, the C18 plate and the phenyl plate were produced as follows. That is, the phenyl plate was prepared in the same manner as in Example 1. In order to hold the measurement sample solution, a sheet made of PDMS (polydimethylsiloxane) with a hole having a diameter of 3 mm (thickness: 100 μm, outer shape is substantially the same as that of the phenyl plate) was prepared and attached. Adhesion is not used because of the self-adsorption of the PDMS sheet. A C18 plate was prepared in the same manner as the phenyl plate. A plate material made of polydimethylsiloxane was prepared and immersed in an ethanol dilution (2 mM) of [1-octadecanethiol] for 10 minutes and air-dried. Next, stamping was performed for 3 seconds on a separately prepared Au substrate. Thereafter, the substrate was washed with ethanol and dried. In this example, since C18 was coated on the entire surface of the plate, a material larger than the Au substrate was used as the plate material.
The glycopeptide was prepared in the same manner as in Example 3.
さらに、Ｃ１８プレートおよびフェニルプレートを用いた局在化およびＭＳ測定は以下のようにして行った。即ち、乾燥したＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドに５%アセトニトリルを１２．５μＬ加えて溶解した。ペプチドとして、４ｐｍｏｌ／μＬの副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）断片（Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18-39 human, Sigma）を５%含むアセトニトリル溶液をＰＳＡ−ＡＣＴ由来糖ペプチドと等量混合し、測定試料とした。穴の空いたＰＤＭＳシートを貼り付けたフェニルプレートに試料溶液０．５μＬを滴下し、Ｃ１８プレートを上にかぶせ、重しを載せて密着させた。この密着体を、ヒートブロックの上に乗せ、この状態のまま４０℃で２．５時間放置し、溶媒を蒸発させた。フェニルプレートとＣ１８プレートを剥がした後、ＰＤＭＳシートをはがし、ピレン標識化のために、１−ピレニルジアゾメタン（ＰＤＡＭ）５００ｐｍｏｌの０．２５μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を滴下して、４０℃で放置し反応させた。乾燥させた後一晩真空デシケーター中でさらに乾燥した。 Further, localization and MS measurement using C18 plate and phenyl plate were performed as follows. That is, 12.5 μL of 5% acetonitrile was added to the dried PSA-ACT-derived glycopeptide and dissolved. As a peptide, an acetonitrile solution containing 5% of 4 pmol / μL adrenocorticotropic hormone (ACTH) fragment (Adrenocorticotropic Hormone Fragment 18-39 human, Sigma) was mixed with PSA-ACT-derived glycopeptide in an equal amount to prepare a measurement sample. A sample solution of 0.5 μL was dropped onto a phenyl plate to which a PDMS sheet with a hole was attached, and a C18 plate was placed on top, and a weight was placed on the plate to bring it into close contact. The adhesion body was placed on a heat block and left in this state at 40 ° C. for 2.5 hours to evaporate the solvent. After peeling off the phenyl plate and the C18 plate, the PDMS sheet was peeled off, and a 0.25 μL dimethyl sulfoxide (DMSO) solution of 500 pmol of 1-pyrenyldiazomethane (PDAM) was dropped for pyrene labeling and left at 40 ° C. And reacted. After drying, it was further dried in a vacuum desiccator overnight.
この乾燥物に、６０％アセトニトリルに溶解した１０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）を１μＬ滴下し、風乾させてＡＸＩＭＡ−ＱＩＴで測定を行った結果、ネガティブイオンＭＳスペクトルを図１６，１７(フェニルプレートに関し)および１８，１９（Ｃ１８プレートに関し）に示す。なお、図１６，１８にはピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図１７，１９にはピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。
To this dried product, 1 μL of 10 mg /
図１６〜１９によれば、いずれのプレートにおいても、ピレン標識を行わなかった場合には、ペプチドのシグナルａのみが検出された。なお、図１６によれば、ペプチドのシグナルが実施例３（図１３）の１／２に低下していることが判る。 According to FIGS. 16-19, only the peptide signal a was detected in any plate, when pyrene labeling was not performed. In addition, according to FIG. 16, it turns out that the signal of a peptide has fallen to 1/2 of Example 3 (FIG. 13).
これに対し、ピレン標識を行った場合には、Ｃ１８プレートには糖ペプチドのシグナルｂ，ｃ，ｄが検出されないが、フェニルプレートには特異的に検出されることが判る。なお、ポジティブイオンＭＳスペクトルにおいても同様の結果が得られた。 On the other hand, when pyrene labeling is performed, it is understood that the signals b, c and d of the glycopeptide are not detected on the C18 plate, but are specifically detected on the phenyl plate. Similar results were obtained in the positive ion MS spectrum.
これら（実施例３と４）の結果から、実施例４では、フェニルプレート上の測定試料中の夾雑分子であるペプチドは、その上に重ねたＣ１８プレートに捕捉され、シグナル強度が低下したが、糖ペプチドはフェニルプレートに留まり局在化されてシグナルが低下しないことが判る。さらに、実施例４では、実施例３と比較してシグナル／ノイズ比が向上していることが示された。すなわち、実施例４は実施例３と比較してより効果的な局在化が実現されているといえる。なお、この効果は、同一プレート上にＣ１８結合部分およびフェニル基結合部分を配したものにおいても得られると考えられる。 From these results (Examples 3 and 4), in Example 4, the peptide, which is a contaminant molecule in the measurement sample on the phenyl plate, was captured by the C18 plate superimposed thereon, and the signal intensity decreased. It can be seen that the glycopeptide remains on the phenyl plate and is localized and does not reduce the signal. Further, in Example 4, it was shown that the signal / noise ratio was improved as compared with Example 3. That is, it can be said that Example 4 achieves more effective localization than Example 3. In addition, it is thought that this effect is acquired also in what arranged the C18 bond part and the phenyl group bond part on the same plate.
（実施例５）
アミノプレートに糖ペプチドおよびペプチドを載せて、または、Ｃ８プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った。これらの例では、プレートの種類以外は実施例３および４と同様な操作を行った。実施例５において、Ｃ８プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチド等を挟んで局在化し、その後、これらのプレートを分離した後のアミノプレートに関する結果を、図２０，２１に示す。これに対し、実施例５において、アミノプレートに糖ペプチド等を載せて局在化し、その後、当該アミノプレートに関する結果を図２２，２３に示す。これらの図において、図２０、２２は、ピレン標識を行わずにＭＳ測定した結果を示し、図２１、２３は、ピレン標識を行ってＭＳ測定した結果を示す。
(Example 5)
The localization was performed by mounting the glycopeptide and peptide on the amino plate or sandwiching the glycopeptide and peptide between the C8 plate and amino plate. In these examples, the same operation as in Examples 3 and 4 was performed except for the type of plate. In Example 5, the results relating to the amino plate after localization, with the glycopeptide sandwiched between the C8 plate and the amino plate, and then separating these plates are shown in FIGS. In contrast, in Example 5, a glycopeptide or the like was placed on the amino plate for localization, and then the results relating to the amino plate are shown in FIGS. In these figures, FIGS. 20 and 22 show the results of MS measurement without pyrene labeling, and FIGS. 21 and 23 show the results of MS measurement with pyrene labeling.
ピレン標識を行わないで測定した結果（図２０、２２）によれば、夾雑ペプチドのみが観測された。一方、ピレン標識を行って測定した結果（図２１、２３）によれば、Ｃ８を重ねずに局在化させたアミノプレートの場合（図２３）と比較して、Ｃ８プレートを重ねた場合（図２１）は、実施例４の場合と同等に、糖ペプチドのシグナル強度が優れた結果を示すことが判る。以上により、Ｃ８プレートとアミノプレートとを使用した場合にも、糖ペプチドとアミノプレートとの親和性が高く、夾雑ペプチド共存下であっても糖ペプチドのシグナルが観察されることが判明した。 According to the results of measurement without pyrene labeling (FIGS. 20 and 22), only contaminating peptides were observed. On the other hand, according to the results of measurement using pyrene labeling (FIGS. 21 and 23), when the C8 plate was overlapped (FIG. 23), compared to the case of the amino plate localized without overlapping C8 (FIG. 23) FIG. 21) shows that the signal intensity of the glycopeptide is excellent as in Example 4. As described above, it was found that even when the C8 plate and the amino plate were used, the affinity between the glycopeptide and the amino plate was high, and the signal of the glycopeptide was observed even in the presence of the contaminating peptide.
本発明のプレート上での測定対象分子の局在化方法は、測定対象分子を洗い流すことなくプレート上でその十分な残量を確保することができるとともに、未知の測定対象分子の質量分析に使用でき、しかも複数の測定対象分子を同時に質量分析する場合にも使用できる。このため、当該方法は、生化学および医学等の分野で今後益々頻繁に使用されることが予想される、種々の分子の質量分析法に好適に適用することができる点で有望である。 The localization method of the molecule to be measured on the plate of the present invention can secure a sufficient remaining amount on the plate without washing the molecule to be measured, and can be used for mass analysis of unknown molecules to be measured. In addition, it can also be used when a plurality of molecules to be measured are subjected to mass spectrometry simultaneously. Therefore, the method is promising in that it can be suitably applied to mass spectrometry of various molecules, which are expected to be used more frequently in the fields of biochemistry and medicine.
上述のように本発明の一つ態様としては以下のものを挙げることができる。
１．（Ａ）測定対象分子を局在化する少なくとも１種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、
（Ｂ）前記プレート上に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、
（Ｃ）前記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、前記プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子を局在化する方法。
２．前記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、１に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
３．前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
４．前記アルキル基が、Ｃ４〜Ｃ１８のアルキル基であることを特徴とする、２に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
５．前記生体試料が少なくとも２種の測定対象分子を含み、前記工程（Ａ）において、前記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程（Ｃ）において、少なくとも２つの領域で異なる測定対象分子を局在化することを特徴とする、１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
６．前記生体試料が少なくとも１種の夾雑分子をさらに含み、前記工程（Ａ）において、前記プレートの少なくとも２つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程（Ｃ）において、前記プレートの１つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することを特徴とする、１〜４のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
７．工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ’）前記生体試料を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、１〜６のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
８． 測定対象分子の質量分析方法であって、
（１）請求項１〜７のいずれかに記載の方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
As described above, one aspect of the present invention includes the following.
1. (A) preparing a plate to which at least one compound that localizes the molecule to be measured is bound;
(B) placing a biological sample containing at least one type of molecule to be measured on the plate;
(C) dropping and drying a solution containing a matrix on the biological sample to localize the molecule to be measured on the plate;
A method for localizing a molecule to be measured on a plate, comprising:
2. 2. The method for localizing a molecule to be measured on a plate according to 1, wherein the compound contains an aryl group, a dihydroxyboryl group, an alkyl group, an amino group, or a hydroxyl group.
3. 2. The aryl group is a phenyl group, a thienyl group, a pyrrolyl group, a pyridyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a pyrenyl group, a quinolyl group, an indolyl group, an acrylidinyl group, or a benzothiazolyl group. A method for localizing a molecule to be measured on a plate.
4). 3. The method for localizing a molecule to be measured on a plate according to 2, wherein the alkyl group is a C4-C18 alkyl group.
5). The biological sample contains at least two kinds of molecules to be measured, and in the step (A), different compounds are bound to at least two regions of the plate, and in the step (C), different measurement subjects are used in at least two regions. 5. The method for localizing a molecule to be measured on a plate according to any one of 1 to 4, wherein the molecule is localized.
6). The biological sample further includes at least one contaminant molecule, and in the step (A), different compounds are bound to at least two regions of the plate, and in the step (C), measurement is performed in one region of the plate. 5. The method for localizing a measurement target molecule on a plate according to any one of 1 to 4, wherein the target molecule is localized in another region.
7). Between step (B) and step (C),
(B ′) The method for localizing a molecule to be measured on a plate according to any one of 1 to 6, further comprising a step of derivatizing the biological sample.
8). A method for mass spectrometry of a molecule to be measured,
(1) a step of localizing a molecule to be measured in a biological sample on a plate by the method according to any one of claims 1 to 7, and (2) a measurement localized in the step (1) A mass spectrometry method comprising a step of performing MS n measurement on a target molecule, wherein n is an integer of 1 or more.
Claims (7)
（Ａ２）第２プレート上に測定対象分子を局在化する、前記第１化合物とは異なる第２の化合物を結合する工程と、
（Ｂ１）前記第１プレートおよび前記第２プレートの間に、少なくとも１種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、
（Ｂ２）前記第１プレートおよび前記第２プレートを分離する工程と、
（Ｃ）前記第１プレートおよび前記第２プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、前記第１プレートおよび前記第２プレートの少なくとも一方上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子の局在化方法。(A1) binding a first compound that localizes the molecule to be measured on the first plate;
(A2) binding a second compound different from the first compound, which localizes the molecule to be measured on the second plate;
(B1) sandwiching and drying a biological sample containing at least one molecule to be measured between the first plate and the second plate;
(B2) separating the first plate and the second plate;
(C) dropping a solution containing a matrix on the first plate and the second plate and drying to localize the molecule to be measured on at least one of the first plate and the second plate; ,
A method for localizing a molecule to be measured on a plate, comprising:
（Ｂ’）前記第１プレート上の前記生体試料、および前記第２プレート上の前記生体試料の少なくとも一方を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。Between step (B2) and step (C),
(B ′) The method further comprises a step of derivatizing at least one of the biological sample on the first plate and the biological sample on the second plate. A method for localizing a molecule to be measured on the plate.
（１）請求項１〜６のいずれかに記載の方法により、前記第１プレート上の生体試料中の測定対象分子、および前記第２プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
（２）前記工程（１）で局在化された測定対象分子に対して、ＭＳn測定を行なう工程であって、ｎは１以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。A method for mass spectrometry of a molecule to be measured,
(1) By the method according to any one of claims 1 to 6, at least one of a molecule to be measured in the biological sample on the first plate and a molecule to be measured in the biological sample on the second plate is localized. And (2) a step of performing MS n measurement on the measurement target molecule localized in the step (1), wherein n is an integer of 1 or more. Characteristic mass spectrometry.
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