JP6685587B2 - Ionization aid for mass spectrometry and mass spectrometry method using the same - Google Patents
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Description
本発明は、試料に含まれる物質をイオン化して検出し定量的に分析する質量分析技術に用いるイオン化支援剤及びこれを使用した質量分析方法に関する。 The present invention relates to an ionization assisting agent used in a mass spectrometric technique in which a substance contained in a sample is ionized, detected, and quantitatively analyzed, and a mass spectrometric method using the same.
質量分析技術は、試料に含まれる原子や分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定することで、試料に含まれる物質の種類や性質を調べる分析方法であり、近年、有機化学や生化学の分野において、試料に含まれる様々な成分の分析に用いられている。 Mass spectrometry technology is an analysis method for examining the type and properties of substances contained in a sample by measuring the mass-to-charge ratio (m / z) of atoms and molecules contained in the sample. In recent years, organic chemistry and biochemistry Is used for analysis of various components contained in a sample.
質量分析技術としては、装置に導入された試料に対してイオンビームやレーザーを照射し、試料に含まれる物質をイオン化して脱離し、脱離された物質を検出して質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定する手法が開発されており、例えば、イオン化支援剤を用いない２次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ；Secondary Ion Mass Spectrometry）、イオン化支援剤を用いるマトリクス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ；Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）が挙げられる。ＳＩＭＳ法は、ビーム状のイオンを照射してイオン化するためイオン化支援剤が不要となるが、イオン化可能な質量数に上限があることから、高分子物質の分析には不向きである。これに対して、ＭＡＬＤＩ法は、タンパク質といった高分子物質をイオン化して分析することが可能なことから、食品や生体の試料分析に用いられている。 As a mass spectrometric technique, a sample introduced into an apparatus is irradiated with an ion beam or a laser to ionize and desorb a substance contained in the sample, and the desorbed substance is detected to detect a mass-to-charge ratio (m / m). z) has been developed, for example, secondary ion mass spectrometry (SIMS) without using an ionization assisting agent, matrix-assisted laser desorption / ionization using an ionization assisting agent (MALDI). Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization). The SIMS method does not require an ionization support agent because it is ionized by irradiating beam-shaped ions, but since it has an upper limit of the mass number that can be ionized, it is not suitable for the analysis of polymer substances. On the other hand, the MALDI method is used for sample analysis of foods and living bodies because it is possible to ionize and analyze high molecular substances such as proteins.
ＭＡＬＤＩ法では、高分子物質を対象とした質量分析が可能となっているが、有機マトリクスをイオン化支援剤として用いるため、質量電荷比が５００以下の領域では、イオン化した有機マトリクスが検出されるようになり、低分子物質の検出が困難であった。また、ＭＡＬＤＩ法では、試料に分析対象となる種々の物質が含まれていた場合には、使用するマトリクスが物質選択的なイオン化を行うことが難しく、すべての物質がイオン化されてしまうといった課題がある。 In the MALDI method, mass spectrometry of a high molecular substance can be performed. However, since the organic matrix is used as the ionization support agent, the ionized organic matrix is detected in the region where the mass-to-charge ratio is 500 or less. It was difficult to detect low molecular weight substances. Further, in the MALDI method, when various substances to be analyzed are contained in the sample, it is difficult for the matrix to be used to perform the substance-selective ionization, and there is a problem that all the substances are ionized. is there.
こうしたマトリクスのイオン化によるノイズを防止するため、ナノ微粒子支援レーザー脱離／イオン化法（Ｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ；Nano-Particle Assisted Laser Desorption/Ionization）が提案されている。Ｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法では、標的物質のイオン化を支援するナノ微粒子（ＮＰ）自身はイオン化することがないため、試料のみがイオン化されて測定することができ、ノイズの少ない測定結果を得ることが可能となる。 In order to prevent such noise due to ionization of the matrix, a nano-particle assisted laser desorption / ionization (Nano-PALDI) method has been proposed. In the Nano-PALDI method, the nanoparticles (NPs) themselves, which support the ionization of the target substance, do not ionize, so only the sample can be ionized and measured, and it is possible to obtain measurement results with less noise. Become.
Ｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法については、例えば、特許文献１では、酸化鉄からなるコアを有した第１機能性ナノ微粒子の第１懸濁液及び酸化マンガンからなるコアを有した第２機能性ナノ微粒子の第２懸濁液を混合させ、微粒子には、コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェル及びシェルの表面に共有結合的に導入された官能基を有する配糖体群質量分析用イオン化支援剤が記載されている。また、特許文献２では、Ｆｅ2Ｏ3を含む酸化鉄からなるコアを有する機能性ナノ微粒子及びクエン酸塩水溶液を含み、ナノ微粒子は、コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェル及びシェルの表面に共有結合的に導入された官能基を有する核酸検出用のイオン化支援キットが記載されている。 Regarding the Nano-PALDI method, for example, in Patent Document 1, a first suspension of first functional nanoparticles having a core made of iron oxide and a second suspension of second functional nanoparticles having a core made of manganese oxide are disclosed. The second suspension is mixed, and in the fine particles, a glycoside group mass spectrometry ionization aid having a shell composed of an amorphous silica network covering the core and a functional group covalently introduced to the surface of the shell is described. Has been done. Further, in Patent Document 2, functional nanoparticles containing a core made of iron oxide containing Fe 2 O 3 and an aqueous citrate solution are contained, and the nanoparticles are provided on a shell made of an amorphous silica network covering the core and on the surface of the shell. An ionization assistance kit for detecting nucleic acids having covalently introduced functional groups is described.
上述したＮａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法では、低分子物質に対して他の手法とほぼ同程度の検出下限が実現できるものの検出上限が質量電荷比で５，０００程度であり、ＭＡＬＤＩ法に比べてかなり低くなっている。そのため、ノイズは少なくなるものの高分子物質の検出が困難で検出範囲が不十分といった課題がある。 In the above-mentioned Nano-PALDI method, although the detection lower limit that is almost the same as other methods can be realized for low molecular weight substances, the detection upper limit is about 5,000 in terms of mass-to-charge ratio, which is considerably lower than that of the MALDI method. ing. Therefore, although the noise is reduced, there is a problem that the detection of the polymer substance is difficult and the detection range is insufficient.
そこで、本発明は、質量分析の際のノイズを少なくするとともに検出範囲を拡げることができる質量分析用イオン化支援剤及びそれを用いた質量分析方法を提供することを目的とする。 Therefore, it is an object of the present invention to provide an ionization support agent for mass spectrometry and a mass spectrometry method using the same, which can reduce noise during mass spectrometry and can widen the detection range.
本発明に係る質量分析用イオン化支援剤は、官能基が表面に付与されたシリカからなるポリマーにより被覆された鉄酸化物からなるコアを有する機能性ナノ微粒子と、光エネルギーを吸収してイオン化し試料中の分析対象物質との間でプロトン又は電子を受け渡す機能を有するマトリクス機能物質とを含み、前記機能性ナノ微粒子は、前記マトリクス機能物質が前記官能基に脱水縮合により共有結合的に修飾されている。さらに、前記機能性ナノ微粒子は、表面にアミノ基が付与されており、前記マトリクス機能物質としてシナピン酸が前記アミノ基に共有結合的に修飾されている。 The ionization support agent for mass spectrometry according to the present invention is a functional nanoparticle having a core made of iron oxide coated with a polymer made of silica having a functional group provided on the surface, and ionized by absorbing light energy. A matrix functional substance having a function of transferring a proton or an electron to and from an analysis target substance in a sample, wherein the functional nano-particles are covalently modified with the functional group by dehydration condensation. Has been done. Furthermore, the functional nanoparticle has an amino group on the surface, and sinapinic acid is covalently modified with the amino group as the matrix functional substance.
本発明に係る質量分析方法は、上記の質量分析用イオン化支援剤を試料と混合状態に設定する工程と、混合状態の前記試料及び前記質量分析用イオン化支援剤にレーザー光を照射して前記試料中の分析対象物質のイオン化を支援する工程とを含む。さらに、前記分析対象物質は、質量電荷比が１０〜３０，０００である。 The mass spectrometry method according to the present invention comprises the step of setting the above-mentioned ionization support agent for mass spectrometry in a mixed state with a sample, and irradiating the sample in the mixed state and the ionization support agent for mass spectrometry with a laser beam to obtain the sample. Supporting the ionization of the analytes therein. Further, the substance to be analyzed has a mass-to-charge ratio of 10 to 30,000.
本発明は、質量分析の際のノイズを少なくすることができるとともに１回の質量分析で低分子物質から高分子物質までの広い範囲の分析対象物質の有無を検出することができ、検出範囲を拡げることが可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can reduce noise during mass spectrometry and can detect the presence or absence of a target substance in a wide range from low molecular weight substances to high molecular weight substances in a single mass spectrometry. It can be expanded.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、本発明は以下に記載した実施の形態によって何ら限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited to the embodiments described below.
本発明に係る質量分析用イオン化支援剤は、官能基が表面に付与されたポリマーにより被覆された金属酸化物からなるコアを有する機能性ナノ微粒子と、光エネルギーを吸収してイオン化し試料中の分析対象物質との間でプロトン又は電子を受け渡す機能を有するマトリクス機能物質とを含み、機能性ナノ微粒子は、マトリクス機能物質が官能基に共有結合的に修飾されている。 The ionization aid for mass spectrometry according to the present invention is a functional nanoparticle having a core made of a metal oxide coated with a polymer having a functional group provided on the surface thereof, and ionized by absorbing light energy. The functional nanoparticle includes a matrix functional substance having a function of transferring protons or electrons to and from an analysis target substance, and the matrix functional substance is covalently modified with a functional group.
イオン化支援剤に含まれる機能性ナノ微粒子は、金属酸化物からなるコアをポリマーで被覆するとともにポリマーの表面に官能基が付与されているので、低分子物質に対してイオン化能力を向上させることができる。また、イオン化支援剤に含まれるマトリクス機能物質は、高分子物質に対してイオン化能力を向上させることができることから、質量分析する際に低分子物質から高分子物質までの広い範囲の分析対象物質の有無を検出することができるようになり、検出範囲を拡げることが可能となる。そして、機能性ナノ微粒子の表面に付与された官能基にマトリクス機能物質が共有結合的に修飾（固定化）されているため、マトリクス機能物質単独の場合に比べて自身のイオン化が抑制されるとともにマトリクス機能物質自身のイオン化によるノイズが少なくなる。その分ノイズの発生を少なくすることができ、分析対象物質の有無に関する検出精度を向上させることが可能となる。 The functional nanoparticle contained in the ionization support agent has a core made of a metal oxide coated with a polymer and a functional group is added to the surface of the polymer, so that the ionization ability of a low molecular weight substance can be improved. it can. In addition, since the matrix functional substance contained in the ionization support agent can improve the ionization ability with respect to the high molecular weight substance, it can be analyzed in a wide range of substances from low molecular weight substances to high molecular weight substances during mass spectrometry. The presence or absence can be detected, and the detection range can be expanded. The matrix functional substance is covalently modified (immobilized) on the functional groups provided on the surface of the functional nanoparticle, so that the ionization of the matrix functional substance is suppressed as compared with the case of the matrix functional substance alone. Noise due to ionization of the matrix functional material itself is reduced. As a result, the generation of noise can be reduced, and the detection accuracy regarding the presence or absence of the substance to be analyzed can be improved.
＜機能性ナノ微粒子＞
機能性ナノ微粒子は、金属酸化物からなるコアにポリマーが被覆されており、そのサイズは質量分析に使用可能なサイズに設定されていればよく、粒径が３ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは１．３ｎｍ〜３ｎｍに設定するとよい。機能性ナノ微粒子の形状は、特に限定されないが、球状に形成することが好ましい。
<Functional nanoparticles>
The functional nanoparticle has a core made of a metal oxide coated with a polymer, and the size thereof may be set to a size usable for mass spectrometry, and the particle size is preferably 3 nm or less. More preferably, it should be set to 1.3 nm to 3 nm. The shape of the functional nanoparticles is not particularly limited, but it is preferably spherical.
金属酸化物としては、遷移金属または稀土類金属の酸化物が好ましく、ニッケル、鉄又はコバルトの酸化物がより好ましい。その中でも、特に鉄の酸化物が好ましい。ポリマーとしては、例えば、ポリアリルアミン、ポリスチレン、ポリチオフェン、ポリアクリル酸、エチレングリコールグリシジルエステルとリジンの共重合体、シリカなどが挙げられるが、その中でも特にシリカが好ましい。 As the metal oxide, an oxide of a transition metal or a rare earth metal is preferable, and an oxide of nickel, iron or cobalt is more preferable. Among them, iron oxide is particularly preferable. Examples of the polymer include polyallylamine, polystyrene, polythiophene, polyacrylic acid, a copolymer of ethylene glycol glycidyl ester and lysine, and silica. Among them, silica is particularly preferable.
金属酸化物の表面をポリマーで被覆する方法としては、例えば、湿式沈殿法といった公知の方法を用いることができ、金属酸化物とポリマーの種類に応じて適宜選択すればよい。金属酸化物及びポリマーとして鉄の酸化物及びシリカを用いて湿式沈殿法により機能性ナノ微粒子を調製する場合、以下の式で示す化学式により機能性ナノ微粒子 [ｘＭ（ＯＨ）2・ｙＳｉＯ2］を得ることができる。ここで、ｘＭ（ＯＨ）2はコアを表し、ｙＳｉＯ2は表面を被覆するポリマーを表す。 As a method for coating the surface of the metal oxide with the polymer, for example, a known method such as a wet precipitation method can be used and may be appropriately selected depending on the types of the metal oxide and the polymer. When the functional nanoparticle is prepared by the wet precipitation method using iron oxide and silica as the metal oxide and the polymer, the functional nanoparticle [xM (OH) 2 · ySiO 2 ] is prepared by the chemical formula shown below. Obtainable. Here, xM (OH) 2 represents a core and ySiO 2 represents a polymer coating the surface.
式中、Ｍは遷移金属または稀土類金属を示し、この例では鉄となり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素から選択されるハロゲン元素を示す。pは２又は３、nは０から９までの整数、mは９又は０である。ｘ及びｙはともに１未満の正数であり、ｘ＞ｙ、かつ、ｘ／ｙが、１〜１００、好ましくは２〜２０の範囲から選択される。 In the formula, M represents a transition metal or a rare earth metal, iron in this example, and X represents a halogen element selected from fluorine, chlorine, bromine, and iodine. p is 2 or 3, n is an integer from 0 to 9, and m is 9 or 0. Both x and y are positive numbers less than 1, and x> y and x / y are selected from the range of 1 to 100, preferably 2 to 20.
ポリマー表面に付与される官能基は、マトリクス機能物質と共有結合可能なものであればよくその種類は特に限定されないが、例えば、水酸基、アミノ基、イソシアネート基又はメルカプト基が挙げられる。官能基をポリマー表面に付与する方法としては、例えばシランカップリング剤を介して共有結合的に導入することができる。 The functional group provided on the polymer surface is not particularly limited as long as it can be covalently bonded to the matrix functional substance, and examples thereof include a hydroxyl group, an amino group, an isocyanate group or a mercapto group. As a method for imparting a functional group to the polymer surface, for example, it can be covalently introduced via a silane coupling agent.
＜マトリクス機能物質＞
マトリクス機能物質は、光エネルギーを吸収してイオン化し試料中の分析対象物質との間でプロトン又は電子を受け渡す機能を有している物質が用いられ、具体的には、ＭＡＬＤＩ法でマトリクスとして使用される物質で、ポリマー表面に付与された官能基に共有結合的に修飾可能なものが好ましい。例えば、シナピン酸（ＳＡ）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、t3-インドールアクリル酸、ピコリン酸、アントラニル酸、ニコチン酸、3-ヒドロキシピコリン酸、3-アミノキノリン、ジスラノール、トリフルオロ酢酸銀といったＭＡＬＤＩ法においてマトリクスとして用いられている公知の物質が挙げられる。
<Matrix functional substance>
As the matrix functional substance, a substance having a function of absorbing light energy, ionizing it, and transferring protons or electrons between it and the substance to be analyzed in the sample is used. Specifically, it is used as a matrix by the MALDI method. It is preferable that the substance used be capable of covalently modifying the functional groups provided on the polymer surface. For example, sinapinic acid (SA), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), t3-indole acrylic acid, picolinic acid, anthranilic acid, nicotinic acid, 3- Known substances used as a matrix in the MALDI method such as hydroxypicolinic acid, 3-aminoquinoline, disranol, and silver trifluoroacetate can be mentioned.
機能性ナノ微粒子の表面に付与された官能基にマトリクス機能物質を導入する方法としては、脱水縮合、イオン結合、物理的吸着といった処理により導入することができる。その中でも、脱水縮合による共有結合がより好ましい。 As a method of introducing the matrix functional substance into the functional group provided on the surface of the functional nanoparticle, it is possible to introduce by a treatment such as dehydration condensation, ionic bond or physical adsorption. Among them, covalent bond by dehydration condensation is more preferable.
＜イオン化支援剤を用いた質量分析方法＞
上述したイオン化支援剤を用いた質量分析方法は、ＭＡＬＤＩ法に用いる質量分析装置を使用して行うことができる。すなわち、試料及びイオン化支援剤を混合状態に設定し、混合状態の試料及びイオン化支援剤にレーザー光を照射することでイオン化支援剤の機能性ナノ微粒子及びマトリクス機能物質がそれぞれ光エネルギーを吸収して試料中の分析対象物質との間の相互作用によりイオン化を支援する。イオン化された分析対象物質を静電力によって装置内を飛行させて電気的・磁気的な作用等により質量電荷比に応じて分離し、分離された分析対象物質をそれぞれ検出することで、質量電荷比及びそれ対応する検出シグナル強度を得る。そして、質量電荷比を横軸とし、シグナル強度を縦軸とするマススペクトルに基づいてデータ処理を行うことで、化合物固有のピークパターンから既知物質の同定や未知物質の構造決定を行う。
<Mass Spectrometry Method Using Ionization Support Agent>
The mass spectrometric method using the above-mentioned ionization support agent can be performed using a mass spectroscope used for the MALDI method. That is, by setting the sample and the ionization support agent in a mixed state and irradiating the sample and the ionization support agent in the mixed state with laser light, the functional nanoparticle and the matrix functional substance of the ionization support agent absorb light energy, respectively. The interaction with the analyte in the sample assists in ionization. The ionized analytes are flown through the device by electrostatic force and separated according to the mass-to-charge ratio by electrical / magnetic action, etc., and the separated analytes are detected respectively to obtain the mass-to-charge ratio. And the corresponding detection signal intensity. Then, by performing data processing based on a mass spectrum with the mass-to-charge ratio on the horizontal axis and the signal intensity on the vertical axis, the known substance is identified and the structure of the unknown substance is determined from the peak pattern peculiar to the compound.
分析対象物質としては、低分子物質から高分子物質までの広い範囲の物質を対象とすることができる。具体的には、質量電荷比が１０〜３０，０００の範囲を対象とすることができ、その中でも１００〜１０，０００の範囲を精度よく検出することができる。分析対象物質の種類としては、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質といった生体物質、農薬成分となる合成低分子化合物、合成高分子化合物が挙げられる。 As the substance to be analyzed, a wide range of substances from low molecular weight substances to high molecular weight substances can be targeted. Specifically, the mass-charge ratio can be targeted in the range of 10 to 30,000, and the range of 100 to 10,000 can be accurately detected. The type of the substance to be analyzed is not particularly limited, and examples thereof include biological substances such as proteins, peptides, nucleic acids, sugars and lipids, and synthetic low molecular weight compounds and synthetic high molecular weight compounds which are agricultural chemical components.
試料及びイオン化支援剤を混合状態に設定する工程では、レーザー光の照射により分析対象物質がイオン化される程度にイオン化支援剤を近接させた混合状態とすればよい。例えば、イオン化支援剤を含む溶液と試料を含む溶液とを混合したり、イオン化支援剤を試料用プレート等の担体に固定しておき、イオン化支援剤が固定化された担体上に試料を添加して混合状態に設定することができる。質量分析を行う場合のイオン化支援剤及び分析対象物質の比は特に限定されないが、好ましくは１：１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１の重量比に調製すればよい。 In the step of setting the sample and the ionization support agent in a mixed state, the ionization support agent may be brought into a mixed state in which the ionization support agent is brought close to the extent that the substance to be analyzed is ionized by the irradiation of laser light. For example, a solution containing an ionization assisting agent is mixed with a solution containing a sample, or the ionization assisting agent is immobilized on a carrier such as a sample plate, and the sample is added onto the carrier on which the ionization assisting agent is immobilized. Can be set to a mixed state. The ratio of the ionization aid and the substance to be analyzed in mass spectrometry is not particularly limited, but it may be adjusted to a weight ratio of preferably 1:10 to 10: 1, more preferably 1: 3 to 3: 1.
混合状態の試料及びイオン化支援剤にレーザー光を照射して試料中の分析対象物質のイオン化を支援する工程では、レーザー光は集光光学系等により照射径を絞り込んで５０μｍ以下の微小径で照射することが好ましく、分析対象となる試料に応じて適宜照射径を設定すればよい。照射されるレーザーとしては、窒素レーザー（波長３３７ｎｍ）、ＹＡＧレーザー（波長３５５ｎｍ）が一般的に使用されることから、マトリクス機能物質にはレーザーの波長領域に吸収帯を持つ物質が好ましい。 In the step of irradiating the mixed sample and the ionization support agent with laser light to support the ionization of the substance to be analyzed in the sample, the laser light is irradiated with a small diameter of 50 μm or less by narrowing the irradiation diameter with a condensing optical system. The irradiation diameter may be appropriately set according to the sample to be analyzed. Nitrogen laser (wavelength: 337 nm) and YAG laser (wavelength: 355 nm) are generally used as the laser to be irradiated, so that a substance having an absorption band in the wavelength region of the laser is preferable as the matrix functional substance.
機能性ナノ微粒子は、微小径のレーザー光が照射されるとレーザー光を吸収し、金属酸化物から構成されているコアと分析対象物質との間の相互作用により分析対象物質のイオン化を支援する。機能性ナノ微粒子の表面に導入されたマトリクス機能物質についても、微小径のレーザー光の照射によりレーザー光を吸収して急速に加熱されイオン化を支援するが、気化することなく分析対象物質のみを脱離して、分析対象物質にプロトン又は電子を受け渡すことで分析対象物質のイオン化を支援する。 The functional nanoparticle absorbs the laser light when irradiated with a laser beam having a small diameter, and assists the ionization of the target substance by the interaction between the core composed of the metal oxide and the target substance. . Regarding the matrix functional substance introduced on the surface of the functional nanoparticles, the laser beam is absorbed by the laser beam with a small diameter to rapidly heat it to support the ionization, but only the substance to be analyzed is removed without vaporization. The ionization of the substance to be analyzed is supported by transferring protons or electrons to the substance to be analyzed separately.
以上説明した質量分析方法によれば、機能性ナノ微粒子及びマトリクス機能物質のイオン化支援作用により低分子物質から高分子物質の広い範囲の分析対象物質を一度に検出することができる。また、マトリクス機能物質が機能性ナノ微粒子の表面に共有結合的に修飾されているため、マトリクス機能物質自身のイオン化によるノイズを少なくして分析対象物質の有無に関する検出精度を向上させることが可能となる。 According to the above-described mass spectrometric method, it is possible to detect a wide range of substances to be analyzed from low molecular weight substances to high molecular weight substances at once by the ionization assisting action of the functional nanoparticles and the matrix functional substance. Further, since the matrix functional substance is covalently modified on the surface of the functional nanoparticles, it is possible to reduce noise due to ionization of the matrix functional substance itself and improve the detection accuracy regarding the presence or absence of the substance to be analyzed. Become.
次に本発明の具体的な実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
＜機能性ナノ微粒子（ＮＰ）の調製＞
ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ（和光純薬工業株式会社製）及びγ−アミノプロピルトリエトキシシラン（γ−ＡＰＴＥＳ）（信越化学工業株式会社製）を準備し、１００ｍＭのＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏを２０ミリリットルとγ−ＡＰＴＥＳを２０ミリリットル２液混合して、室温で１時間撹拌した後、遠心分離機（株式会社日立製作所製；CF15RXII）を用いて温度４℃の状態及び１５ｋｒｐｍの回転速度で超純水を投入し上澄み液を除去する洗浄処理を３回繰り返して沈殿物を得た。洗浄処理した沈殿物は、分散媒としてN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；ＷＡＫＯ株式会社製）を用いて分散させてＮＰ分散液を調製した。
Next, specific examples of the present invention will be shown, but the present invention is not limited to these examples.
<Preparation of functional nanoparticles (NP)>
FeCl 2 .4H 2 O (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and γ-aminopropyltriethoxysilane (γ-APTES) (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) were prepared, and 100 mM FeCl 2 .4H 2 O was added. 20 ml of two liquids of γ-APTES and 20 ml of γ-APTES were mixed and stirred at room temperature for 1 hour, and then ultracentrifuged at a temperature of 4 ° C. and a rotation speed of 15 krpm using a centrifuge (manufactured by Hitachi, Ltd .; CF15RXII). A washing treatment in which water was added and the supernatant was removed was repeated 3 times to obtain a precipitate. The washed precipitate was dispersed using N, N-dimethylformamide (DMF; manufactured by WAKO Co., Ltd.) as a dispersion medium to prepare an NP dispersion liquid.
＜シナピン酸（ＳＡ）の修飾＞
ＮＰの表面を修飾するマトリクス機能物質としてシナピン酸（ナカライ株式会社製）を用いた。０．１Ｍのシナピン酸（ＳＡ）２２４ｍｇと０．２Ｍのガルボジイミダゾール（ＣＤＩ；ＷＡＫＯ株式会社製）３２２ｍｇをＤＭＦ（ＷＡＫＯ株式会社製）５ミリリットルに投入して溶解させた後、上記で得られたＮＰ分散液５ミリリットルを溶液に加えて温度３５℃で２０時間反応させた。反応処理後、遠心分離機を用いて温度４℃の状態及び１５ｋｒｐｍの回転速度でＤＭＦを投入し上澄み液を除去する洗浄処理を３回繰り返して沈殿物を得た。洗浄処理した。洗浄処理した沈殿物は、分散媒としてメタノールを用いて分散させて温度４℃で保管した。
<Modification of sinapinic acid (SA)>
Sinapic acid (manufactured by Nakarai Co., Ltd.) was used as a matrix functional substance for modifying the surface of NP. 224 mg of 0.1 M sinapinic acid (SA) and 322 mg of 0.2 M galvodiimidazole (CDI; manufactured by WAKO Co., Ltd.) were added to 5 ml of DMF (manufactured by WAKO Co., Ltd.) and dissolved, and then obtained above. 5 ml of the above NP dispersion was added to the solution and reacted at a temperature of 35 ° C. for 20 hours. After the reaction treatment, a washing process of adding DMF at a temperature of 4 ° C. and a rotation speed of 15 krpm using a centrifuge to remove a supernatant liquid was repeated three times to obtain a precipitate. It was washed. The washed precipitate was dispersed using methanol as a dispersion medium and stored at a temperature of 4 ° C.
＜イオン化支援剤（ＳＡ−ＮＰ）の特性評価＞
得られたイオン化支援剤（ＳＡ−ＮＰ）について透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；株式会社日立製作所製；H-7650）で観察した結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａは倍率×１００００倍の撮影画像であり、図１Ｂは倍率×５００００倍の撮影画像である。測定結果からＮＰのサイズは３．６ｎｍであった。
<Characteristic evaluation of ionization support agent (SA-NP)>
The results of observing the obtained ionization support agent (SA-NP) with a transmission electron microscope (TEM; manufactured by Hitachi, Ltd .; H-7650) are shown in FIGS. 1A and 1B. FIG. 1A is a photographed image of magnification × 10000 times, and FIG. 1B is a photographed image of magnification × 50000 times. From the measurement results, the size of NP was 3.6 nm.
フーリエ変換赤外分光分析装置（PerkinElmer社製；Spectrum Two）を用いて赤外線分光法によりＮＰ及びＳＡ−ＮＰを測定した結果を図２に示す。図２は、横軸に赤外線の波数をとり、縦軸に吸光度をとっており、ＮＰ及びＳＡ−ＮＰに関する赤外吸収スペクトルを示している。ＳＡ−ＮＰに関する赤外吸収スペクトルでは、Ｃ＝Ｏ結合に対応する１６５０ｃｍ-1、Ｎ−Ｈ結合に対応する１５４０ｃｍ-1及び１２４０ｃｍ-1が確認でき、ペプチド結合特有のピークが確認された。 The results of measuring NP and SA-NP by infrared spectroscopy using a Fourier transform infrared spectrophotometer (PerkinElmer; Spectrum Two) are shown in FIG. In FIG. 2, the horizontal axis represents the infrared wave number and the vertical axis represents the absorbance, showing the infrared absorption spectra for NP and SA-NP. The infrared absorption spectrum for SA-NP, C = O bonds corresponding to 1650 cm -1, confirmed 1540 cm -1 and 1240 cm -1 corresponding to the N-H bond, the peak of the peptide bond characteristic was confirmed.
また、紫外可視近赤外分光光度計（日本分光株式会社；V-630）を用いて可視・紫外分光法により、ＳＡ−ＮＰ、ＮＰ及びＳＡを測定した結果を図３に示す。図３は、横軸に波長をとり、縦軸に吸光度をとっており、ＳＡ−ＮＰ、ＮＰ及びＳＡに関する吸収スペクトルを示している。ＮＰでは波長が２００ｎｍ〜５００ｎｍでは吸収は見られないが、ＳＡでは、カルボキシ基及びベンジル基に対応する波長２２０ｎｍ及び３５０ｎｍで吸収が確認された。ＳＡ−ＮＰでは、波長３４０ｎｍで吸収が見られることから、ベンジル基の電子状態が変化したことを示しており、また波長２２０ｎｍの吸収が大きくなっていることから、カルボキシ基が消失してアミド結合が生成されたものと考えられる。以上の測定結果をみると、ＳＡのＮＰへの共有結合的な修飾が行われていることがわかる。 Further, FIG. 3 shows the results of measuring SA-NP, NP and SA by visible / ultraviolet spectroscopy using an ultraviolet-visible near-infrared spectrophotometer (JASCO Corporation, V-630). In FIG. 3, the horizontal axis represents wavelength and the vertical axis represents absorbance, showing absorption spectra for SA-NP, NP, and SA. No absorption was observed in NP at wavelengths of 200 nm to 500 nm, but in SA, absorption was confirmed at wavelengths of 220 nm and 350 nm corresponding to carboxy groups and benzyl groups. In SA-NP, absorption is observed at a wavelength of 340 nm, which indicates that the electronic state of the benzyl group has changed, and since absorption at a wavelength of 220 nm is large, the carboxy group disappears and the amide bond is lost. Is considered to have been generated. From the above measurement results, it can be seen that the SA is modified covalently with the NP.
また、吸光度測定の結果よりＮＰ表面に修飾されたＳＡ量を算出することができ、この例では、ＮＰ１ｍｇ当りＳＡは５μｇ存在している。この算出結果に基づいてＮＰ１個当たりに換算すると、１個のＮＰに６個のＳＡが修飾されている。この換算結果によれば、質量分析のターゲットプレートに滴下した場合のＳＡ密度は１５ｎｇ／ｍｍ2となる。なお、今回得られたＳＡの修飾率については、３倍に向上させることが可能である。 Further, the amount of SA modified on the NP surface can be calculated from the result of the absorbance measurement, and in this example, 5 μg of SA is present per 1 mg of NP. When converted per NP based on this calculation result, one NP is modified with 6 SAs. According to this conversion result, the SA density when dropped on the target plate for mass spectrometry is 15 ng / mm 2 . The SA modification ratio obtained this time can be improved three times.
図４は、ＳＡ−ＮＰの生成に関する構造式を示している。金属酸化物のコアの表面は、ポリマーとしてＳｉＯ2層で被覆されており、ＳｉＯ2層表面に付与された官能基であるアミノ基にシナピン酸のカルボキシ基が縮合反応により結合して、マトリクス機能物質であるシナピン酸が共有結合的に修飾したＳＡ−ＮＰが生成されるようになる。 FIG. 4 shows the structural formula for the production of SA-NP. The surface of the core of the metal oxide is covered with a SiO 2 layer as a polymer, and the carboxy group of sinapinic acid is bound to the amino group, which is a functional group provided on the surface of the SiO 2 layer, by a condensation reaction to form a matrix function. SA-NP in which the substance sinapinic acid is covalently modified is generated.
＜イオン化支援剤（ＳＡ−ＮＰ）を用いた質量分析＞
ＭＡＬＤＩ法に用いる飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（ブルカー社製；Autoflex、窒素レーザー（３３７ｎｍ）を使用）を準備し、ＳＡ−ＮＰを用いた質量分析を行った。分析対象物質となるサンプルとして、カルベンダジウム（分子量１９１）、アブシシン酸（分子量２６４）、アンジオテンシンII（分子量１０４５）、アミロイドβ（分子量４３２９）、インスリン（分子量５８０３）及びチトクロムＣ（分子量１２３６０）を用いた。また、タンパク質分解物として、インスリンをトリプシンにより分解したインスリン分解物（フラグメントペプチドGFFYTPK；分子量８５９．４）を準備した。
<Mass Spectrometry Using Ionization Support Agent (SA-NP)>
A time-of-flight (TOF) mass spectrometer (manufactured by Bruker; Autoflex, nitrogen laser (337 nm) was used) used for the MALDI method was prepared, and mass spectrometry was performed using SA-NP. As samples to be analyzed, carbendadium (molecular weight 191), abscisic acid (molecular weight 264), angiotensin II (molecular weight 1045), amyloid β (molecular weight 4329), insulin (molecular weight 5803) and cytochrome C (molecular weight 12360) are used. I was there. In addition, an insulin degradation product (fragment peptide GFFYTPK; molecular weight 859.4) obtained by degrading insulin with trypsin was prepared as a protein degradation product.
各サンプルとＳＡ−ＮＰとを混合し、サンプル濃度１０ピコモル／マイクロリットルでＳＡ−ＮＰ濃度が１ｍｇ／ミリリットルとなる分散液を調製した。調製した分散液をピペットを用いてターゲットプレートに滴下し、滴下した分散液表面に対して１０００回のレーザショットを照射し、正イオン検出モードでマススペクトルを測定した。 Each sample was mixed with SA-NP to prepare a dispersion liquid having an SA-NP concentration of 1 mg / milliliter at a sample concentration of 10 picomoles / microliter. The prepared dispersion liquid was dropped onto a target plate using a pipette, the surface of the dropped dispersion liquid was irradiated with 1000 laser shots, and a mass spectrum was measured in a positive ion detection mode.
比較のため、イオン化支援剤として、ＮＰのみのＮＰ分散液、ＳＡの飽和状態となる従来の飽和ＳＡ分散液、ＳＡ−ＮＰに用いたＳＡと同じ濃度のＳＡ分散液を準備し、上述した質量分析法と同様に各サンプルを分析した。 For comparison, as ionization aids, an NP dispersion containing only NP, a conventional saturated SA dispersion that becomes a saturated state of SA, and an SA dispersion having the same concentration as SA used for SA-NP were prepared, and the above-mentioned mass was used. Each sample was analyzed in the same manner as the analysis method.
＜質量分析結果＞
図５は、インスリンの場合の測定結果を示すマススペクトルである。横軸に質量電荷比（ｍ／ｚ）をとり、縦軸に検出シグナル強度をとっている。ＳＡ−ＮＰは、ＮＰよりも検出シグナル強度が大きく増加しているが、飽和ＳＡよりも検出シグナル強度が小さくなっている。しかしながら、ＳＡ−ＮＰは、ＳＡ−ＮＰと同密度のＳＡ（１５ｎｇ／ｍｍ2）よりも検出シグナル強度が大きくなっており、高分子物質に対するイオン化能力が向上していることがわかる。すなわち、ＳＡ−ＮＰのＳＡ部位だけがインスリンのイオン化を支援しているわけではなく、ＮＰ部位も支援に関わっていると言える。つまり、ＮＰ及びＳＡのイオン化能力の相乗効果が生じていると考えられる。
<Mass spectrometry result>
FIG. 5 is a mass spectrum showing the measurement results for insulin. The mass-charge ratio (m / z) is plotted on the horizontal axis, and the detected signal intensity is plotted on the vertical axis. The detection signal intensity of SA-NP is significantly higher than that of NP, but the detection signal intensity is lower than that of saturated SA. However, SA-NP has a detection signal intensity higher than that of SA (15 ng / mm 2 ) having the same density as SA-NP, and it can be seen that the ionization ability with respect to the polymer substance is improved. That is, it can be said that not only the SA site of SA-NP supports the ionization of insulin, but also the NP site is involved in the support. That is, it is considered that a synergistic effect of the ionization ability of NP and SA is generated.
図６は、カルベンダジウム及びアブシシン酸の場合の測定結果を示すマススペクトルである。ＳＡ−ＮＰでは、こうした低分子物質をほとんどノイズなしで検出することが可能であるが、飽和ＳＡでは、自己イオン化によるノイズが生じるため、低分子領域では検出することができない。これに対して、ＳＡ−ＮＰは、低分子物質のイオン化能力を維持しつつＳＡの自己イオン化を抑制しており、低分子物質から高分子物質に対してイオン化能力を備えていることがわかる。 FIG. 6 is a mass spectrum showing the measurement results for carbendadium and abscisic acid. With SA-NP, it is possible to detect such low-molecular substances with almost no noise, but with saturated SA, noise is generated due to self-ionization, and therefore it cannot be detected in the low-molecular region. On the other hand, SA-NP suppresses the self-ionization of SA while maintaining the ionization ability of the low molecular weight substance, and has the ionization ability from the low molecular weight substance to the high molecular weight substance.
図７は、インスリン分解物の場合の測定結果を示すマススペクトルである。インスリン分解物の場合にもＳＡ−ＮＰでは、検出シグナル強度が得られており、イオン化能力を備えているのに対し、飽和ＳＡでは十分な検出シグナル強度を得られていないのがわかる。 FIG. 7 is a mass spectrum showing a measurement result in the case of an insulin degradation product. It can be seen that, even in the case of an insulin degradation product, the detection signal intensity is obtained with SA-NP and has the ionization ability, whereas the sufficient detection signal intensity is not obtained with saturated SA.
図８は、カルベンダジウム、アブシシン酸、アンジオテンシンII、アミロイドβ、インスリン及びチトクロムＣを１回の質量分析により分析した場合の測定結果を示すマススペクトルである。低分子物質から高分子物質までの広い範囲の分析対象物質がイオン化されて検出されており、１０ｋＤａを超える高分子物質についても検出可能であることがわかる。 FIG. 8 is a mass spectrum showing the measurement results when carbendadium, abscisic acid, angiotensin II, amyloid β, insulin and cytochrome C were analyzed by mass spectrometry once. It can be seen that a wide range of substances to be analyzed from low molecular weight substances to high molecular weight substances are ionized and detected, and that high molecular weight substances exceeding 10 kDa can also be detected.
従来の質量分析方法では、分析対象物質の分子量に合わせてイオン化支援方法及び質量分析装置を選択しなければならなかったが、本発明に係るイオン化支援剤を用いることで、低分子物質から高分子物質までの多様な分析対象物質を１回の質量分析で検出することが可能となる。 In the conventional mass spectrometry method, it was necessary to select the ionization support method and the mass spectrometer according to the molecular weight of the substance to be analyzed, but by using the ionization support agent according to the present invention, from a low molecular substance to a polymer. It is possible to detect various substances to be analyzed up to the substance by one mass spectrometry.
本発明のイオン化支援剤は、農薬、植物ホルモン、ペプチド、タンパク質といった幅広い質量範囲の検出が可能であり、イメージング質量分析への応用やタンパク質などの高分子イメージングへの活用が期待される。 The ionization support agent of the present invention can detect a wide range of masses such as agricultural chemicals, plant hormones, peptides, and proteins, and is expected to be applied to imaging mass spectrometry and used for polymer imaging of proteins and the like.
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