CN103228677A - 用于储存和分析生物材料的纤维素基材、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过使生物样品与纤维素基材接触而储存来自所述生物样品的遗传材料或分析物的方法和制品，所述纤维素基材包含式I的结构单元：
Figure 201180059086X100004DEST_PATH_IMAGE002
(I)其中X和Y独立地为N-O-L-A或O，条件为当Y为O时，则X为N-O-L-A，而当X为O时，则Y为N-O-L-A；L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且A=COOH、SO3H或其组合。本发明还涉及包含式I的结构单元的纤维素基材及其制造方法。

Description

用于储存和分析生物材料的纤维素基材、组合物和方法
背景
已经证明FTA?纸(GE Healthcare, Whatman Inc., Piscataway, NJ)是从多种生物样品中收集、运输、储存和归档遗传材料例如DNA的可靠工具。已经发展并广泛使用简单的程序来纯化并扩增储存在FTA上的样品。也已经使用FTA分子程序发展了新的程序，例如药物代谢和包括毒物动力学(TK)研究的药物动力学(DMPK)分析。在许多情况下，分析可在含有固定的DNA样品的纸上直接进行。在其它情况下，可首先自纸洗脱(elude) DNA，由此DNA释放到溶液(FTA Elute?)中。洗脱可使用能够溶解DNA的溶液经由各种洗涤循环发生且也可包括对该过程施用热、真空或离心。
虽然当前的FTA纸提供吸引人的性质，例如所关注组分的稳定化和能够降低安全准则的抗菌特征，但是如应用于DMPK和TK型研究，当前的FTA纸的一个缺点是在该纸上有可浸出组分，其可干扰药物和代谢物或其它分析物的下游分析。
为了扩展FTA纸技术的用途，需要保存在纸上的生物样品的方法，而没有干扰的可浸出物的问题且同时保持其它合乎需要的特征，例如保持纸的抗菌性质和亲水/芯吸(wicking)性质。
EP 1534269A1描述了肟与例如多糖的缀合物，但没有公开可用作用于储存和分析生物材料的基材(substrate)的任何纸制剂。
发明简述
在一个实施方案中，本发明提供通过使生物样品与纤维素基材接触而储存来自所述生物样品的遗传材料或分析物的方法，所述纤维素基材包含式I的结构单元：
Figure 201180059086X100002DEST_PATH_IMAGE002
其中X和Y独立地为N-O-L-A或O，条件为当Y为O时，则X为N-O-L-A，而当X为O时，则Y为N-O-L-A；L为直键(direct bond)、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且A = COOH、SO3H或其组合。
在一个实施方案中，本发明提供用于储存来自生物样品的遗传材料或分析物的制品，所述制品包含纤维素基材，所述纤维素基材包含式I的结构单元。
在另一实施方案中，本发明提供包含式I的结构单元的纤维素基材及其制造方法。
附图简述
在参考附图阅读以下详述时将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面及优势，在所述附图中相同的符号表示相同元件。
图1为来自包括阳性对照(当前的FTA纸)和阴性对照(未改性的纸)的使用不同表面化学品和制剂处理的纸的可提取物的LC-MS迹线。
图2为用不同化学品和分子家族处理的多种纸的芯吸性能的图示；除了标准的阳性对照纸和阴性对照纸之外，对于氨氧基/胺家族，包括相应的氧化纸作为对照。
图3显示根据对于不同纸制剂的回收百分比表示的多种模型药物的分析物回收率。
图4显示根据对于不同纸制剂在提取物中量化的平均LPC (溶血磷脂酰胆碱)表示的磷脂保留。
发明详述
定义
为了更清楚且简明地描述并指出要求保护的发明的主题，对于特定术语提供以下定义，其用于以下描述和附加到此的权利要求书中。
脂族基团为具有至少一个碳原子、至少为1的化合价的有机基团且可为直链或支链的原子阵列。脂族基团可包含杂原子，例如氮、硫、硅、硒和氧，或者可排外地由碳和氢构成。脂族基团可包括各种官能团，例如烷基、烯基、炔基、卤烷基、共轭二烯基、醇基、醚基、醛基、酮基、羧酸基、酰基(例如，羧酸衍生物，例如酯和酰胺)、胺基、硝基等。例如，4-甲基戊-1-基为包含甲基的C6脂族基团，所述甲基为官能团，其为烷基。类似地，4-硝基丁-1-基为包含硝基的C4脂族基团，所述硝基为官能团。脂族基团可为包含一个或多个卤素原子的卤烷基，所述卤素原子可相同或不同。卤素原子例如包括氟、氯、溴和碘。具有一个或多个卤素原子的脂族基团包括卤代烷：三氟甲基、溴二氟甲基、氯二氟甲基、六氟异亚丙基、氯甲基、二氟亚乙烯基、三氯甲基、溴二氯甲基、溴乙基、2-溴三亚甲基(例如，-CH2CHBrCH2-)等。脂族基团的其它实例包括烯丙基、氨羰基(-CONH2)、羰基、二氰基异亚丙基(-CH2C(CN)2CH2-)、甲基(-CH3)、亚甲基(-CH2-)、乙基、亚乙基、甲酰基(-CHO)、己基、1,6-亚己基、羟甲基(-CH2OH)、巯基甲基(-CH2SH)、甲硫基(-SCH3)、甲硫基甲基(-CH2SCH3)、甲氧基、甲氧羰基(CH3OCO-)、硝基甲基(-CH2NO2)、硫羰基、三甲基甲硅烷基、((CH3)3Si-)、叔丁基二甲基甲硅烷基、三甲氧基甲硅烷基丙基((CH3O)3SiCH2CH2CH2-)、乙烯基、亚乙烯基等。进一步举例，“C1-C30脂族基团”含有至少一个、但不多于30个碳原子。甲基(CH3-)为C1脂族基团的实例。癸基(CH3(CH2)9-)为C10脂族基团的实例。
脂环族基团为具有至少为1的化合价且具有原子阵列的基团，其为环状的，但其不是芳族的。脂环族基团可包含一种或多种非环状组分。例如，环己基甲基(C6H11CH2-)为脂环族基团，其包含环己基环(原子阵列，其为环状的，但其不是芳族的)和亚甲基(非环状组分)。脂环族基团可包含杂原子，例如氮、硫、硒、硅和氧，或者可排外地由碳和氢构成。脂环族基团可包含一个或多个官能团，例如烷基、烯基、炔基、卤烷基、共轭二烯基、醇基、醚基、醛基、酮基、羧酸基、酰基(例如，羧酸衍生物，例如酯和酰胺)、胺基、硝基等。例如，4-甲基环戊-1-基为包含甲基的C6脂环族基团，所述甲基为官能团，其为烷基。类似地，2-硝基环丁-1-基为包含硝基的C4-脂环族基团，所述硝基为官能团。脂环族基团可包含一个或多个卤素原子，所述卤素原子可相同或不同。卤素原子例如包括氟、氯、溴和碘。具有一个或多个卤素原子的脂环族基团包括2-三氟甲基环己-1-基、4-溴二氟甲基环辛-1-基、2-氯二氟甲基环己-1-基、六氟异亚丙基2,2-双(环己-4-基)(-C6H10C(CF3)2C6H10-)、2-氯甲基环己-1-基、3-二氟亚甲基环己-1-基、4-三氯甲基环己-1-基氧基、4-溴二氯甲基环己-1-基硫基、2-溴乙基环戊-1-基、2-溴丙基环己-1-基氧基(例如，CH3CHBrCH2C6H10-)等。脂环族基团的其它实例包括4-烯丙氧基环己-1-基、4-氨基环己-1-基(H2NC6H10-)、4-氨基羰基环戊-1-基(NH2COC5H8-)、4-乙酰氧基环己-1-基、2,2-二氰基异亚丙基双(环己-4-基氧基)(-OC6H10C(CN)2C6H10O-)、3-甲基环己-1-基、亚甲基双(环己-4-基氧基)(-OC6H10CH2C6H10O-)、1-乙基环丁-1-基、环丙基乙烯基、3-甲酰基-2-四氢呋喃基、2-己基-5-四氢呋喃基、1,6-亚己基-1,6-双(环己-4-基氧基)(-OC6H10(CH2)6C6H10O-)、4-羟基甲基环己-1-基(4-HOCH2C6H10-)、4-巯基甲基环己-1-基(4-HSCH2C6H10-)、4-甲硫基环己-1-基(4-CH3SC6H10-)、4-甲氧基环己-1-基、2-甲氧基羰基环己-1-基氧基(2-CH3OCOC6H10O-)、4-硝基甲基环己-1-基(NO2CH2C6H10-)、3-三甲基甲硅烷基环己-1-基、2-叔丁基二甲基甲硅烷基环戊-1-基、4-三甲氧基甲硅烷基乙基环己-1-基(例如，(CH3O)3SiCH2CH2C6H10-)、4-乙烯基环己烯-1-基、亚乙烯基双(环己基)等。术语“C3-C30脂环族基团”包括含有至少3个但不多于10个碳原子的脂环族基团。脂环族基团2-四氢呋喃基(C4H7O-)代表C4脂环族基团。环己基甲基(C6H11CH2-)代表C7脂环族基团。
芳族基团为具有至少为1的化合价且具有至少一个芳族基团的原子阵列。这可包含杂原子，例如氮、硫、硒、硅和氧，或者可排外地由碳和氢构成。合适的芳族基团可包括苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、萘基、亚苯基和联苯基。所述芳族基团可为具有4n+2个“离域”电子的环状结构，其中“n”为等于1或更大的整数，如由苯基(n = 1)、噻基(n = 1)、呋喃基(n = 1)、萘基(n = 2)、基(n = 2)、蒽基(n = 3)等所说明。所述芳族基团也可包含非芳族组分。例如，苄基可为包括苯环(芳族基团)和亚甲基(非芳族组分)的芳族基团。类似地，四氢萘基为包含稠合到非芳族组分-(CH2)4-的芳族基团(C6H3)的芳族基团。芳族基团可包含一个或多个官能团，例如烷基、烯基、炔基、卤烷基、卤芳族基团、共轭二烯基、醇基、醚基、硫基、醛基、酮基、羧酸基、酰基(例如，羧酸衍生物，例如酯和酰胺)、胺基、硝基等。例如，4-甲基苯基为包含甲基的C7芳族基团，所述甲基为官能团，其为烷基。类似地，2-硝基苯基为包含硝基的C6芳族基团，所述硝基为官能团。芳族基团包括卤代芳族基团，例如三氟甲基苯基、六氟异亚丙基双(4-苯-1-基氧基)(-OPhC(CF3)2PhO-)、氯甲基苯基、3-三氟乙烯基-2-噻吩基、3-三氯甲基苯-1-基(3-CCl3Ph-)、4-(3-溴丙-1-基)苯-1-基(BrCH2CH2CH2Ph-)等。芳族基团的其它实例包括4-烯丙氧基苯-1-氧基、4-氨基苯-1-基(H2NPh-)、3-氨基羰基苯-1-基(NH2COPh-)、4-苯甲酰基苯-1-基、二氰基异亚丙基双(4-苯-1-基氧基)(-OPhC(CN)2PhO-)、3-甲基苯-1-基、亚甲基双(苯-4-基氧基)(-OPhCH2PhO-)、2-乙基苯-1-基、苯基乙烯基、3-甲酰基-2-噻吩基、2-己基-5-呋喃基、1,6-亚己基-1,6-双(苯-4-基氧基)(-OPh(CH2)6PhO-)、4-羟基甲基苯-1-基(4-HOCH2Ph-)、4-巯基甲基苯-1-基(4-HSCH2Ph-)、4-硫代苯基(-S-Ph)、4-甲基硫代苯-1-基(4-CH3SPh-)、3-甲氧基苯-1-基、2-甲氧基羰基苯-1-基氧基(例如，甲基水杨酰基)、2-硝基甲基苯-1-基(-PhCH2NO2)、3-三甲基甲硅烷基苯-1-基、4-叔丁基二甲基甲硅烷基苯-1-基、4-乙烯基苯-1-基、亚乙烯基双(苯基)等。术语“C3-C30芳族基团”包括含有至少3个但不多于30个碳原子的芳族基团。芳族基团1-咪唑基(C3H2N2-)代表C3芳族基团。苄基(C7H7-)代表C7芳族基团。
许多本文所述的化合物可含有一个或多个不对称中心，且因此可产生可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-的对映异构体、非对映异构体及其它立体异构形式。本发明意欲包括所有可能的此类异构体以及其外消旋和光学纯形式。光学活性(R)-和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备或使用常规技术拆分。当本文所述的化合物含有烯属双键或几何不对称性的其它中心时，且除非另外指明，否则预期化合物包括E几何异构体和Z几何异构体二者。同样，还预期包括所有互变异构形式。
FTA纸为用裂解细胞且保存核酸的化学品浸渍的基于纤维素的基质。所述化学品在生物流体接触表面时活化。化学处理的其它特征为细菌和病毒灭活。这保护生物样品不被微生物生长污染且也可保护使用者不受在生物样品中存在的潜在生物危害。照此，FTA纸为保护且稳定DNA以便自多种生物样品收集、运输、储存和归档的优选介质。随后可分析生物样品。该分析可包括但不限于对生物样品内存在的分析物的遗传分析或定性或定量测定。
生物样品(也称作遗传样品)可包括植物和动物组织样品两者，其包括但不限于颊(面颊)样品、脑脊液、粪便、血浆、血液、淋巴、尿、精液、阴道流体、腺分泌物、细胞或病毒的悬浮液、病毒斑或含有核酸的血清样品。样品可呈纯化态或来自例如细胞提取物或培养物的粗制品或作为样品转移物例如表面拭子或斑点(spotting)直接获得。核酸可包括DNA和RNA、核糖体RNA和信使RNA及核酸引物和适体。遗传样品一旦储存在FTA纸或类似的基于纤维素的材料上，就可将其提交以供使用多种方案进行分析。
分析物是指在生物样品中测量的一种或多种物质。在干血样品(DBS)中测量的分析物可包括循环化学品、药物或代谢物的定量或定性测定。这可包括但不限于关于多种代谢疾病的检测的代谢物筛选、关于例如用药物筛选候选物的药物动力学(DMPK)分析的药物代谢物；或在毒物动力学(TK)研究中的化学品和药物暴露。
包括遗传材料的扩增或限制酶消化的分析可在FTA纸或类似的基于纤维素的材料上直接进行，而不需要提取程序。在其它情况下，可在分析之前进行自纸提取并纯化遗传材料。这可通过用提取试剂洗涤该纸的一部分例如穿孔样品(punch sample)来实现。
然而，与分析无关，在纸上可能存在可浸出组分，其可干扰来自生物样品的目标分析物的下游分析，例如但不限于组成试验(compositional testing)、药物发现和代谢物。
纤维素的结构由平行的D-葡萄糖链组成。所述结构通过使其具有纤维性质的氢键稳定化。所述纤维素基材可在纸片、纸浆形式、片剂或通过机械或化学分解α-纤维素、硬或软木浆、纯化木浆、棉绒片、棉浆等制备的纤维素粉中。纤维素的其它来源包括低结晶度纤维素及市售的纤维素赋形剂，例如微纤维化纤维素、粉状纤维素、再生纤维素和微晶纤维素。在某些实施方案中，纤维素基材可包括硝化纤维或羧甲基纤维素纸。优选所述纤维素基材具有多孔性质以便于遗传材料的固定、储存、洗脱和随后的分析。
根据一个实施方案，描述了如下方法，其中纤维素基材经历开环氧化以在C2-C3位置形成醛基。在某些实施方案中，除了在C2-C3位置处的开环氧化之外，还可能发生在纤维素的表面上存在的一个或多个羟基的氧化。
在某些实施方案中，所述纤维素基材的开环氧化可经由基材与氧化剂例如但不限于氯气、高碘酸和氢氧化钠的水溶液、过硫酸盐及高锰酸盐接触而发生。在其它实施方案中，氧化由用高碘酸钠和亚氯酸钠的连续氧化组成。在其它实施方案中，氧化可涉及酶。除了未经处理的基材的羟基之外，氧化的纤维素还可含有羧酸基、醛基、酮基或其组合。氧化的量取决于氧化剂的性质和反应条件。
所述纤维素基材可刚好在与氨氧基试剂的随后反应之前氧化。在其它实施方案中，可使用具有某一氧化程度的纤维素基材，其可自预先氧化处理或自市售来源得到并储存。
在某些实施方案中，将氧化纤维素基材随后用具有末端硫酸基(-OSO3H)、磺酸基(-SO3H)或羧酸基(-COOH)的氨氧基试剂处理。一个或多个醛基发生氨氧基化，在纤维素表面上形成侧链的α-肟基羧酰胺基团。氨氧基化在C2位置、C3位置或两者处发生。在某些实施方案中，氨氧基化也可在表面醛基处发生，这由在纤维素表面上的侧链羟基的氧化而引起。
流程1图示说明在C2位置和C3位置处的氨氧基化。
Figure 201180059086X100002DEST_PATH_IMAGE006
流程1：在开环的C2和C3位置处的氨氧基化(Aminooxylation at the ring opened C2 and C3 and positions)。
这产生包含式I的结构单元的改性的纤维素基材：
Figure 201180059086X100002DEST_PATH_IMAGE008
其中X和Y独立地为N-O-L-A或O，条件为当Y为O时，则X为N-O-L-A，而当X为O时，则Y为N-O-L-A；L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且A = COOH、SO3H或其组合。
在某些实施方案中，氨氧基试剂可包括：
式II的被取代的氨氧基，其中：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其混合物；
A = COOH、SO3H或其混合物。
在某些实施方案中，L可为二取代的(CH2)n脂族基团，其中n为1-20的整数。所述脂族基团可为直链或支链的原子阵列。
在某些实施方案中，L可被杂原子取代。在某些实施方案中，L可等于-(CH2)n-Z-(CH2)m-，其中n为0-20的整数，m为0-20的整数，且X为含杂原子的部分。在某些实施方案中，Z可等于但不限于：O、NH、C(O)NH、NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O或其组合。在各实施方案中，L连接磺酸基(-SO3H)、羧酸基(-COOH) (或当L为直键时，末端硫酸基)与肟基羧酰胺(oximocarboxamide)部分。例如，Z为O，n为0，m为1且A为COOH。
氨氧基试剂可作为其盐的水溶液使用。盐包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、氢卤化物和磷酸盐。在某些实施方案中，水溶液可具有0.05-0.5摩尔%范围的氨氧基。在某些实施方案中，可使用醇共溶剂。在另一实施方案中，水溶液还可含有缓冲溶液。在其它实施方案中，水溶液还可含有稳定剂。
施用氨氧基试剂的方法可包括使氨氧基试剂与氧化纤维素基材接触以使得涉及氨氧基试剂与氧化纤维素结合的化学反应发生。在一个实施方案中，可通过将氧化纤维素基材浸在氨氧基试剂的溶液中而使氨氧基试剂与氧化纤维素基材接触。在另一实施方案中，氨氧基试剂可通过喷雾、润湿或印到表面上而施用到氧化纤维素。如果使用的话，则氨氧基试剂的溶液可包含具有足够挥发性的溶剂，从而允许溶剂蒸发。
在一个实施方案中，氧化纤维素基材可呈粉末形式。可使用含有氨氧基试剂和氧化纤维素的浆料来允许接触和结合。可将浆料滗析、挤压并干燥以得到氧化的粉末。
在一个实施方案中，结合可在室温下开始。在另一实施方案中，结合可通过施用热而开始。在某些实施方案中，温度在约40℃-约90℃范围内。
试剂的结合进行足以使式I的氨氧基化合物与在氧化纤维素基材上的醛基反应的时间。在一个实施方案中，所述反应进行约1分钟-约30分钟的时间。在另一实施方案中，所述时间为约1分钟-约10分钟。所述反应可在常压或加压条件下进行。
制品可使用上文描述的组合物和方法制造。在一个实施方案中，提供制品。制品包含具有结合部位的氧化纤维素与氨氧基试剂的反应产物。在一个实施方案中，使用本文公开的组合物和方法制造的制品可具有大于约0.1毫米、大于约0.5毫米、大于约1毫米或大于约0.5厘米的厚度。在一个实施方案中，制品可呈粉末形式且容纳在适当尺寸的样品小瓶中。在又一实施方案中，制品可呈片剂形状。在其它实施方案中，制品可在凝胶或溶液中。
在其它实施方案中，对所述氧化纤维素基材的另外处理可发生，其包括但不限于施用化学涂布溶液，例如蛋白质变性剂和自由基捕集剂(free radical trap)。变性剂可为将使在遗传样品中的蛋白质和致病生物变性的表面活性剂或阴离子去污剂。变性剂可用以裂解遗传材料且允许遗传材料固定并保存。在某些实施方案中，变性剂用以裂解含有遗传材料的细胞以释放目的分析物。化学溶液可包含弱碱、螯合剂和阴离子表面活性剂或去污剂。也可使用尿酸或尿酸盐。弱碱可为作为游离碱或作为碳酸盐的Tris(三羟甲基氨基甲烷)，且螯合剂可为EDTA。阴离子去污剂可为十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠。也可使用具有类似功能的其它涂料(coating)。例如，在某些实施方案中，可使用能够裂解细胞但不使蛋白质变性的涂料。在其它实施方案中，涂料可例如通过螯合充当酶功能的辅助因子的金属而用以使酶灭活而不变性。
在某些实施方案中，涂布溶液可以将涂料布置、吸附或另外与氧化纤维素相关联的方式施用到基材。在某些实施方案中，涂料可经由化学结合附着到基材上，而在其它实施方案中，附着可例如经由浸渍而为物理的。
在某些实施方案中，氨氧基试剂在其它化学处理之前施用。在其它实施方案中，氨氧基试剂在其它化学处理之后施用。在其它实施方案中，氨氧基试剂作为中间步骤施用。
改性的氧化纤维素基材可用作储存与基材接触的遗传材料的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使遗传材料与基材接触。遗传材料可包括植物和动物组织样品两者，其包括但不限于颊(面颊)样品、脑脊液、粪便、血浆、血液、淋巴、尿、细胞或病毒的悬浮液、病毒斑或含有核酸的血清样品。
改性的纤维素基材可用作或用于储存(但不限于)可掺入诸如DMPK等应用中的小药物和代谢物的方法。在临床前情景中，例如使用干血斑点(dried blood spot, DBS)法储存包含在生物介质中的分析物样品的能力可简化实验工作流程。这可通过减少需要的生物样品体积实现，且因此使所用的动物受试者的数量和大小减至最小，同时保存分析物用于后续分析(later analytes)。实验工作流程的简化也可减小人为误差的可能性。
在某些实施方案中，储存方法还包括干燥在纤维素基材上的生物样品的步骤和储存具有干燥的生物样品的纤维素基材至少24小时例如至少一周的步骤。干燥可为主动的，例如通过施用干燥空气流到基材或通过使基材经受中等高温例如25-40℃。其也可以是被动的，其中将具有样品的基材在例如实验台表面上干燥。储存可在干燥条件下例如在存在干燥剂的情况下进行，且可在室温(例如，20-35℃)下、在制冷(例如，0-10℃)下或在冷冻条件下。
在一些实施方案中，储存方法还包括自所述纤维素基材提取遗传材料或至少一种分析物的步骤。提取可用水性液体(例如，缓冲液)或非水性液体(例如，溶剂)或甚至用超临界气体例如二氧化碳进行。可对所产生的提取物进行进一步的分离步骤，例如色谱。
在某些实施方案中，储存方法还包括例如通过质谱分析分析物的步骤。
分析物可为药物或药物候选物或者药物或药物候选物的代谢物。具体地讲，所述方法可用于DMPK研究，其中，例如将少量血液样品施用并储存在基材上且关于药物/药物候选物和/或药物/药物候选物的代谢物的浓度进行分析。
遗传样品可呈纯化态或来自粗制品例如细胞提取物或培养物或作为样品转移物例如表面拭子或斑点直接获得。核酸可包括但不限于DNA和RNA、核糖体RNA和信使RNA或核酸引物和适体。
在某些实施方案中，使改性的氧化纤维素基材成型为制品，其将便于遗传材料的储存。制品可呈纸、片剂或粉末的形式。在某些实施方案中，可使用纸形式，其可为例如卡片原料(card stock)，其中与该形式接触的样品可随后例如通过穿孔通过卡片原料而除去。在其它实施方案中，制品可呈容纳在样品管或小瓶内的粉末的形式。样品管或小瓶可按尺寸制作以匹配遗传样品或分析物的尺寸且允许随后的试剂或提取技术直接加到制品上以允许遗传孵育、扩增或其它试验。在另一实施方案中，制品可呈片剂形式，其中基于不同压实压力的片剂可具有不同的物理性质，例如孔径分布和表面积。
作为制品，可用于收集、储存和保存生物样品的纤维素基材的合乎需要的性质可包括低可浸出组分、抗菌性质、抗病毒性质和有效的芯吸性质。
在某些实施方案中，改性的氧化纤维素基材可具有与其它类似形成的纤维素制品相比水平更低的可浸出物(leachables)。可浸出物定义为可在纤维素基材上或在纤维素基材内存在的可在遗传样品的后续处理期间从基材中浸出或提取出的残留化学物，使得残留物可存在于分离的遗传样品中且干扰下游分析。可浸出物的水平可使用溶剂洗涤测量为来自纤维素基材的可提取物，其中溶剂自纤维素基材提取或溶解材料。在某些实施方案中，不含可浸出物的基材可定义为在洗涤溶液中具有小于200ppm、优选小于100ppm且更优选小于25ppm的可提取物。照此，不含可提取物的组合物或由不含可提取物的组合物形成的制品是指该组合物相对不含残留物使得残留物没有污染遗传样品的潜在性。在DMPK应用的情形下，不希望有可干扰目的代谢物或分析物的分析的可浸出物和可提取物。
用以使纤维素基材改性的各种化学品和制剂示于表1中。Whatman 31ETF为未经处理的光滑纤维素纸，[O]ETF为通过用NaIO4处理而经历C2和C3开环表面氧化的31ETF。FTA?为用于遗传取样且用TRIS、EDTA、尿酸和十二烷基硫酸钠处理的市售纸。
表1：化学改性
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE014
1b; w = 0.02, x = 0.45,y = 0.33, z = 0.2 
1d; w= 0.02, x = 0.38, y = 0.33, z = 0.27
2; w =0.02, x =0.28, y=0.54, z = 0.16 
3a= 26 wt%增加(add on)，e-光束起始
3b= 9% wt%增加，硝酸高铈铵起始
在纤维素纸或氧化纤维素上试验的不同化学品和制剂的可浸出程度通过使各种纸经历用70%的水性四氢呋喃提取来测定。提取物使用LC-MS方法鉴别并量化。可提取物分析显示，与其它化学品形成对比，借助于氨氧基化学衍生化的纤维素显示相对来讲没有来自纤维素纸的提取物。该结果可与在图1中显示为液相色谱迹线的阴性对照(31ETF)相当。如所示，31ETF显示没有可提取物，这与阳性对照(FTA纸)形成对比，阳性对照含有浸渍在表面上的分子混合物且显示可干扰代谢物分析的可提取物。包括使用氨氧基“S”与胺分子“D”的组合(S-D)的制剂显示与氧化纤维素纸形成肟键的氨氧基分子不具有可提取物(不浸出)，而与氧化纤维素纸形成席夫碱(Schiff base)的来自季胺盐的胺分子具有可提取物。另外，在制剂(S、C、T)中仅存在氨氧基分子的样品未显示可提取物。
这些结果可部分地通过与席夫碱的可逆特性相比肟键的不可逆特性解释。在包括季胺的制剂中，可提取物与所使用的单体单元和水解产物两者相对应。因此，这些结果提示肟改性化学可为提供不可浸出性质的优选方法。
在某些实施方案中，改性的氧化纤维素可具有抗菌和抗病毒性质，这与市售FTA纸相当或更好。这些性质使得在包括处理生物样品的程序中对于高度监管的安全性分类和准则的需要减至最小。这可转化成可包括生物样品的使用、储存和运输的成本较低的简化方法。另外，纸的抗菌性质可使在储存时可能损害生物样品的细菌的潜在生长减至最少。
各种改性的氧化纤维素制剂的抗菌性质针对代表革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株两者以及多重抗药性菌株的三种不同菌株来评价。表2汇总了来自影印铺板测定的结果且显示与未改性的纤维素基材和使用基团化学法来固定基于聚合或季胺的制剂而制备的制剂的代表性实例，用氨氧基/胺部分改性的氧化纸显示最高抗菌活性。因此，抗菌特性是改性步骤、而不是先前氧化步骤的结果。聚合分子没有显示出抗菌活性，而季胺家族显示菌株依赖性结果，但仍相当温和。如在表2中所描述，没有抗菌活性指示为(-)，对细菌生长的极小抑制作用指示为(+)，对细菌生长的部分抑制作用指示为(++)且对细菌生长的完全抑制作用指示为(+++)。
表2：抗菌性质结果
在包括收集生物样品的应用中，纸芯吸或在湿式作用中使生物样品快速且均匀地流经纸的能力是重要的，以便确保可靠且可重现的样品读数。在某些实施方案中，改性的氧化纤维素具有所要的芯吸性质，其中这些芯吸性质与市售FTA纸相当。
图2为不同的改性纸样品可怎样快速地吸收10μL全血的图示。显示对照纤维素纸(31ETF、FTA和[O] 31ETF)在3-4秒内吸收10μL全血。31ETF和[O] 31ETF纸使用如先前在表1中所示的不同分子和制剂家族改性。尽管在使用包括自由基化学的方法将分子固定到纤维素纸上之前，分子具有亲水和水溶性特性，但包括使用聚合(SDS样)分子的制剂提供相当疏水的表面。尽管如此，在未氧化纤维素纸(31ETF)上与氨氧基和胺分子以及季胺制剂反应(包括自由基化学)的氧化纤维素纸显示可与对照相当的结果。
如所证明，氨氧基化学使基材具有芯吸、抗菌和不可浸出性质，这适于在储存和分析生物材料领域的改善用途。其使可抑制下游分析的可浸出物的来源减至最少或消除可浸出物的来源，同时保持在目前市场上购得的产品(例如FTA)中的一些所需性质。
内部试验证明纤维素基材在暴露于极端的pH和温度时可变褐色且变脆。这对于大规模生产应用不实用。预期氨氧基硫酸(S和T)产生大于5 pH单位的溶液，在当量浓度下这比氨氧基乙酸(C)的pH低。虽然制剂和加工条件的优化可以规避与不可浸出且抗菌的制剂S和T有关的该问题，但选择制剂C以针对与DMPK应用更密切关联的性能试验进行试验。
在DMPK应用中，储存和分析以非常低浓度存在的小药物分子及其代谢物的能力是关键的。在DBS应用中吸附存在于体液例如血液中的磷脂的能力也是受关注的，因为这些分子也可以与表面活性剂相同的方式干扰分析，导致较低灵敏度和高可变性。这些性质通过实验方法试验，显示制剂C具有提取模型药物分子的能力，范围仅比市售DMPK标准纸低约25-40%，而保持多约40-50%的磷脂在该纸上。干扰分子的该显著保留可显著增强不仅更可重现地、而且在较低浓度下更好地检测目的分析物的能力。除了先前描述的其它性质之外，这些结果还提示制剂C为适合的制剂，特别是对于DMPK应用或可能需要相当组合的性能性质的其它应用。
本发明包括通常涉及适于分析、诊断或预后应用的方法的实施方案，所述应用例如但不限于法医学(forensics)、转基因识别、输注医药/HLA分型、质粒筛选、食品和农业试验、药物发现、基因组、STR分析、动物识别、全基因组扩增和分子生物学。在一些实施方案中，本文公开的方法可特别适于DMPK分析。应当注意不同实施方案的特征可以组合以形成其它实施方案。
实验
使纤维素氧化的通用程序
将由GE Healthcare供应的Whatman级31ETF纤维素浸没在NaIO4水溶液中且允许在给定温度下反应预定的时间。温度改变，但通常在50-90℃下自1至5分钟改变。随后将完全湿透的膜在去离子水中洗涤，直至水性洗涤液的导电率小于3μS。随后将样品在室温下干燥过夜。
使氨氧基化合物(AO)与氧化纤维素反应的通用程序
将氧化的31ETF纤维素样品预称重且随后在室温下将其浸没于氨氧基化合物的水溶液中。在完全湿透之后，将样品用镊子从溶液中移出，且允许自饱和的膜排干过量的溶液。随后将样品用热风器部分地干燥，且置于结晶盘中以便在预定温度和时间下干燥。通常将样品在室温下或在50-70℃的温暖循环空气烘箱中干燥12-24小时的时间。在干燥之后将样品称重，用去离子水洗涤且记录溶液电导率。将样品在相同的预定烘箱温度下再次干燥约1小时，且用去离子水再次洗涤。重复该过程，直至离子导电率小于3μS。将样品在相同的预定温度下再次干燥，且记录最后的重量。重量%增加通过以下等式确定：
重量%增加 = (最后重量-初始重量)/初始重量 * 100%
样品还通过元素分析表征。测定元素硫或氮含量以推断氨氧基(AO)官能化的程度。
在AO-CO2H DOE中对样品4a的程序
在80℃下将14cm x 14cm 31ETF纤维素片浸没在1.0M的NaIO4水溶液中且允许反应5分钟。随后将完全湿透的膜在去离子水中洗涤，直至水性洗涤液的导电率小于3μS。随后将氧化的31ETF纤维素在室温下干燥过夜。随后将该14cm x 14cm片切割成多个6cm x 4cm的片以便随后用氨氧基试剂处理。在室温下将6cm x 4cm的片浸没在水性0.2M氨氧基试剂溶液中。在完全湿透之后，将样品用镊子从溶液中移出，且允许自饱和的膜排干过量的溶液。随后将样品用热风器部分地干燥，且置于结晶盘中以便在60℃下干燥过夜。样品在加热过夜时变成褐色。将干燥的样品称重，用去离子水洗涤且记录溶液电导率。将该样品在60℃下再次干燥1小时，且用去离子水再次洗涤。重复该过程，直至离子导电率小于3μS。提交该样品用于氮元素分析以测定共价连接的氨氧基部分的程度。元素氮分析结果表示为在所提交的样品中的N% ± 95%置信区间(CI)。
样品制备
样品作为大致?”正方形提交，每种样品类型提交两个正方形。用IPA预清洁的刀片将样品切割成小正方形。使用微量天平，将各样品的重复试样称量到配衡的5 x 9mm的锡胶囊中，且随后压成胶囊密封的小球，并再次称重。各样品类型的重量根据大致的氮浓度改变。在整个分析中，带有两个锡胶囊空白对照(blank)。
标准物
使用THAB (1.407% N)作为标准材料对EA1108元素分析仪(Thermo Scientific, Waltham, MA)进行CHN校准。8pt校准(0.068mg、0.187mg、0.416mg、0.826mg、1.552mg、2.404mg、3.450mg、6.323mg)生成R2 = 99.98%的氮曲线。除了THAB之外，分析第二标准材料(阿托品(atropine)，4.84% N)作为未知数，以证实校准曲线的准确性。THAB氮回收率：97%-109%。阿托品氮回收率：96%-106%。
实验技术
在Carlo Erba EA1108分析仪上分析样品的N 4次。该技术基于样品在1000℃下在富氧气氛中的定量急骤燃烧以分别由氮、碳、氢和硫形成CO2、H2O和NOx。燃烧气体穿过加热的元素铜以将所有NOx形式还原成N2。随后通过载气将它们携带穿过色谱柱，在此它们被分离并通过热导检测器检测以便量化。分析物浓度通过与一系列已知标准物相比较来计算。该校准制作为分析物的总mg数，其基于所分析样品的重量转变成%。(仪器参数：氦气流速设定为150mL/分钟，氧气流速设定为60mL/分钟，540秒/样品。测定元素硫分析结果，在95%置信区间(CI)内测量在纤维素纸上的金属wt%，以证实表面改性。样品制备
微波容器用10mL HNO3酸使用一次微波循环预清洁一次。将0.06-0.09g样品的一个重复试样(所提交的整个样品用于一个重复试样)通过差异称重且置于特氟隆(Teflon) XP1500微波衬管(liner)中。加入10ml HNO3酸，冲洗衬管壁。将衬管盖住，置于微波中，且运行“纸”程序(10分钟匀变到100℃；在100℃下保持10分钟；压力控制到100psi，10分钟匀变到150℃；在150℃下保持10分钟；压力控制到200psi，分钟匀变到180℃；在180℃下保持10分钟；压力控制到300psi；分钟匀变到200℃；在200℃下保持10分钟；压力控制到400psi，10分钟匀变到220℃；在220℃下保持10分钟；压力控制到600psi)。在加热循环之后，允许样品完全冷却到室温，之后打开。将容器内含物转移到橙色盖子的管中，加入5mL的10ppm Sc，且将该溶液用去离子水(DIW)稀释到50mL。在整个程序中，带有空白对照和加料样品(sample spike)。酸加料回收率：S：110%。Spex QC回收率：S：102%。标准物：S：在具有20% HNO3 (具有1ppm Sc)的50ml橙色盖子的塑料管中0.05ppm-10ppm。QC1：1ppm Spex4。漂洗：20% HNO3。
技术：Spectro Arcos ICP-AES
高温等离子体通过诱导性耦合射频功率到氩气流中生成。样品通过喷雾器作为溶液气溶胶引入该等离子体中，其中相应元素发射其特性辐射。在该光学器件中，Arcos使用在优化的Paschen-Runge mount ORCA (Optimized Rowland Circle Alignment)(SPECTRO Analytical Instruments GmbH, Germany)中的32个线型CCD检测器以便同时记录在130-770nm之间的波长。信号的大小与样品中元素的浓度成正比。比较样品信号强度与通过校准标准物产生的信号强度，产生定量结果。
影印铺板测定(抗菌测定)实验
抗菌性质使用以下进行评价：革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(侵染分离物09-010，Brooke Army Medical Center Molecular Biology Lab和US Army Institute of Surgical Research)、革兰氏阳性细菌MRSA USA300 (侵染分离物NRS384的抗甲氧西林(methicillin)金黄色葡萄球菌，关于金黄色葡萄球菌中抗微生物的网络(Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus))和实验室菌株-大肠杆菌(HB101)。将接种物在Luria Broth中培养超过6小时，直至中晚对数期(0.6-1.2 OD600)，此时，培养物密度使用0.5 McFarland标准估计。将约1-2 x 107个细胞(14-20μL培养物)施用到移植的(grafted) 31-ETF以及阳性对照纸(FTA)和阴性对照纸(31-ETF)的7mm穿孔中，且将样品风干30分钟(临床分离物)或60-90分钟(实验室菌株大肠杆菌)。使用无菌镊子，通过将各穿孔反转到琼脂表面且轻轻挤压，将样品影印铺板到新鲜的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上。将穿孔样品除去，之后将板在37℃下孵育过夜，且在12-24小时之后评价细菌生长。
通过HPLC-电喷雾ToFMS分析来自31-ETF氧化基材的可提取试剂：
将直径为7mm的纸圆形穿孔用500μL在水中的70 THF使用1分钟涡旋提取。可提取物的色谱分析使用在线连接到装备有电喷雾电离附件的AB Sciex Q Star Elite?四极杆飞行时间质谱仪的装备有1200系列光电二级管阵列检测器的Agilent 1200系列HPLC系统实现。分离使用由3μm粒子介质组成的Cadenza CL C18 1 x 50mm反相柱进行。电喷雾电离质谱以正电离模式获得。定量分析自已知质量的相应参考材料的提取的质量色谱图的积分峰面积来获得。方法参数如下：流动相：溶剂A，2mM甲酸铵(pH = 4)；溶剂B，含有0.1%甲酸的100%乙腈；流速：0.2ml/分钟；光电二极管阵列检测器获取：200-800nm；柱：Cadenza CL C18 3μm (1 x 50mm)；注射体积：50μl；ESI条件：Neb气体：40；干燥气体：40；所施用的针头电压：3000V，温度：400℃。
在不脱离本发明的精神及其本质特性的情况下，本发明可包含其它特定形式。因此，在各方面，可将上述实施方案视为说明性的，而不是限制本文所述的本发明。本发明的范围因此由附加权利要求书、而不是上述说明书指出，因此预期在权利要求书的等效物的含义和范围内的所有改变都包含在其中。
分析物回收率和磷脂保留
模型药物分子的原料在甲醇中制备。模型分子代表不同的化学基团：碱、季胺、中性的和酸。这些分别为氯胍、海亚敏(hyamine)、辛伐他汀(simvastatin)和2,4,6-三异丙基苯甲酸。前三种以100μg/ml的浓度制备且最后一种制备为200μg/ml。全人血用这些药物溶液加料，以使得最终药物浓度为原始浓度的1/10且在血液中存在不多于10%的甲醇。将各配制的纸用10μL的各种药物-血液混合物点样。将纸在干燥室中干燥过夜。全血斑点使用7mm孔穿孔器穿孔并收集且斑点在500μl的70%甲醇中提取。理论的100%的最终回收率对于前三种药物将是200ng/mL，且对于最后一种药物将是400ng/mL。对于分析物回收率，各组分使用LC-MS定量，与相同组分的校准标准物相比较。使用二壬基胺(阳离子)和三异丙基苯甲酸(阴离子)的内标物来确保在运行中的恒定信号。用于色谱分析的系统和条件使用如下所用的反相HPLC-ToF MS进行。所使用的仪器为装备有电喷雾电离附件的AB Sciex Q Star Elite?四极杆飞行时间质谱仪。分离使用由3μm粒子介质组成的Cadenza CL C18 1 x 50mm反相柱进行。电喷雾电离质谱以正电离模式获得。定量分析自已知质量的相应参考材料的提取的质量色谱图的积分峰面积来获得。方法参数如下：流动相：溶剂A，2mM甲酸铵(pH = 4)；溶剂B，含有0.1%甲酸的100%乙腈；流速：0.2ml/分钟；梯度概况：95%-0 A，10分钟内，保持在100% B下2分钟，在初始条件下再次平衡10分钟。光电二极管阵列检测器获取：200-800nm；柱：Cadenza CL C18 3μm (1 x 50 mm)；注射体积：5μl；ESI条件：G1 40、G2 30、CG 25，所施用的针头电压：3000V，温度：400℃。
用于磷脂群的色谱分析的系统和条件使用反相HPLC-ToF MS实现且方法条件如下：所使用的仪器为装备有电喷雾电离附件的AB Sciex Q Star Elite?四极杆飞行时间质谱仪。分离使用由3μm粒子介质组成的Cadenza CL C18 1 x 50mm反相柱进行。电喷雾电离质谱以正电离模式获得。定量分析自已知质量的相应参考材料(溶血磷脂酰胆碱-LPC、鞘磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，溶解于乙腈和异丙醇50:50中)的提取的质量色谱图的积分峰面积来获得。方法参数如下：流动相：溶剂A，2mM甲酸铵(pH = 4) + 10%异丙醇；溶剂B，含有0.1%甲酸和10%异丙醇的100%乙腈；流速：0.25ml/分钟；梯度概况：95%-0 A，10分钟内，保持在100% B下10分钟，在初始条件下再次平衡10分钟。光电二极管阵列检测器获取：200-800nm；柱：Cadenza CW C18 3μm (1 x 50mm)；注射体积：5μl；ESI条件：G1 40、G2 30、CG 25，所施用的针头电压：3000V，温度：450℃。

Claims (39)

1. 通过使生物样品与纤维素基材接触而储存来自所述生物样品的遗传材料或分析物的方法，所述纤维素基材包含式I的结构单元：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：
X和Y独立地为N-O-L-A或O，条件为当Y为O时，则X为N-O-L-A，而当X为O时，则Y为N-O-L-A；且
L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且
A = COOH、SO3H或其组合。
2. 权利要求1的方法，其中L为-(CH2)n-，其中n为1-20的整数。
3. 权利要求1的方法，其中L为直键且A为SO3H。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中L被杂原子取代。
5. 权利要求4的方法，其中：
L为-(CH2)n-Z-(CH2)m-；
n为0-20的整数；
m为0-20的整数；且
Z等于O、NH、C(O)NH、 NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O或其组合。
6. 权利要求5的方法，其中Z为O，n为0，m为1且A为COOH。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述纤维素基材为纸、片剂或纤维素粉。
8. 权利要求7的方法，其中所述纤维素基材为纸。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述生物样品为颊样品、脑脊液、粪便、血浆、血液、淋巴、尿、精液、阴道流体、腺分泌物、细胞或病毒的悬浮液、病毒斑、血清样品或其组合。
10. 权利要求9的方法，其中所述生物样品为血液。
11. 前述权利要求中任一项的方法，其还包括干燥在所述纤维素基材上的所述生物样品的步骤和储存具有干燥的生物样品的所述纤维素基材至少24小时例如至少一周的步骤。
12. 前述权利要求中任一项的方法，其还包括自所述纤维素基材提取遗传材料或至少一种分析物的步骤。
13. 权利要求12的方法，其还包括例如通过质谱分析所述至少一种分析物的步骤。
14. 权利要求13的方法，其中所述至少一种分析物为药物或药物候选物或者药物或药物候选物的代谢物。
15. 用于储存来自生物样品的遗传材料或分析物的制品，其包括：
包含式I的结构单元的纤维素基材：
其中：
X和Y独立地为N-O-L-A或O，条件为当Y为O时，则X为N-O-L-A，而当X为O时，则Y为N-O-L-A；且
L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且
A = COOH、SO3H或其组合。
16. 权利要求15的制品，其中L等于(CH2)n且n为1-20的整数。
17. 权利要求15的制品，其中L为直键且A为SO3H。
18. 权利要求15的制品，其中L被杂原子取代。
19. 权利要求18的制品，其中：
L为-(CH2)n-Z-(CH2)m-；
n为0-20的整数，
m为0-20的整数；且
Z等于O、NH、C(O)NH、 NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O或其组合。
20. 权利要求18的制品，其中Z为O，n为0，m为1且A为COOH。
21. 权利要求15-20中任一项的制品，其还包括附着到所述纤维素基材的化学涂层，所述涂层能够使蛋白质变性、使酶灭活或其组合。
22. 权利要求21的制品，其中所述化学涂层包含表面活性剂、阴离子去污剂、弱碱、螯合剂、自由基捕集剂、尿酸、尿酸盐及其组合。
23. 权利要求15-22中任一项的制品，其中所述制品为纸、片剂或粉末。
24. 包含式I的结构单元的纤维素基材：
其中：
X和Y独立地为N-O-L-A或O，条件为当Y为O时，则X为N-O-L-A，而当X为O时，则Y为N-O-L-A；且 
L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且
A = COOH、SO3H或其组合。
25. 权利要求24的基材，其中L为-(CH2)n-且n为1-20的整数。
26. 权利要求24的基材，其中L为直键且A为SO3H。
27. 权利要求24的基材，其中L被杂原子取代。
28. 权利要求27的基材，其中：
L为-(CH2)n-Z-(CH2)m-；
n为0-20的整数；
m为0-20的整数；且
Z等于O、NH、C(O)NH、 NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O或其组合。
29. 权利要求28的基材，其中Z为O，n为0，m为1且A为COOH。
30. 权利要求24-29中任一项的基材，其中所述纤维素基材为纸、片剂或纤维素粉。
31. 权利要求30的基材，其中所述纤维素基材为纸。
32. 制造纤维素基材的方法，其包括：
使C2-C3开环氧化的纤维素与式II的被取代的氨氧基在使所述式I与所述纤维素基材有效结合的时间和温度下接触：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
其中：
L为直键、脂族基团、芳族基团、脂环族基团或其组合；且
A =-COOH、-SO3H或其组合；和
洗涤所述C2-C3开环氧化的纤维素以除去未反应的式II的被取代的氨氧基。
33. 权利要求32的方法，其中L等于(CH2)n且n为1-20的整数。
34. 权利要求32的方法，其中L为直键且A为SO3H。
35. 权利要求32的方法，其中L被杂原子取代。
36. 权利要求35的方法，其中：
L为-(CH2)n-Z-(CH2)m-；
n为0-20的整数；
m为0-20的整数；且
Z等于O、NH、C(O)NH、 NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O或其组合。
37. 权利要求36的方法，其中Z为O，n为0，m为1且A为COOH。
38. 权利要求32-37中任一项的方法，其还包括使所述C2-C3开环氧化的纤维素与一种或多种化学能够使蛋白质变性、使酶灭活或其组合的涂布溶液接触的步骤。
39. 权利要求38的方法，其中所述化学涂布溶液包含表面活性剂、阴离子去污剂、弱碱、螯合剂、自由基捕集剂、尿酸、尿酸盐及其组合。
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C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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