JP5997703B2 - 生物学的材料の保存及び分析のためのセルロース基材、組成物及び方法 - Google Patents
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Description
る。
特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。
Lは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
AはCOOH、SO3H又はこれらの組合せである。
一実施形態では、結合は室温で開始させることができる。別の実施形態では、結合は加熱によって開始させることができる。若干の実施形態では、温度は約40〜約90℃の範囲内にある。
GE Healthcare社から供給されたWhatmanグレード31ETFセルロースをNaIO4の水溶液中に浸漬し、所定の温度で所定の時間にわたり反応させた。温度は様々に変化したが、通例は50〜90℃で1〜5分間であった。次いで、完全に湿潤した膜を、水性洗液の導電率が3μS未満になるまで脱イオン水で洗浄した。次いで、試料を室温で一晩乾燥した。
酸化31ETFセルロース試料を予め秤量し、次いで室温でアミノオキシ化合物の水溶液中に浸漬した。完全な湿潤後、試料をピンセットで溶液から取り出し、過剰の溶液を十分に濡れた膜から排出させた。次いで、試料をヒートガンで部分的に乾燥し、結晶化皿内に配置して所定の温度及び時間で乾燥した。通例、試料は室温で又は50〜70℃の温風循環オーブン内で12〜24時間乾燥した。乾燥後に試料を秤量し、脱イオン水で洗浄し、溶液導電率を記録した。試料を同じ所定のオーブン温度で約1時間再乾燥し、脱イオン水で再洗浄した。このプロセスを、イオン導電率が3μS未満になるまで繰り返した。試料を同じ所定の温度で再乾燥し、最終重量を記録した。次の式によってパーセント重量増加を求めた。
パーセント重量増加=(最終重量−初期重量)/初期重量×100%
試料はまた、元素分析によっても特性決定した。元素状硫黄又は窒素含有量を求めることで、アミノオキシ(AO)官能化の程度を推定した。
14cm×14cmの31ETFセルロースシートを80℃でNaIO4の1.0M水溶液中に浸漬し、5分間反応させた。次いで、完全に湿潤した膜を、水性洗液の導電率が3μS未満になるまで脱イオン水で洗浄した。次いで、酸化31ETFセルロースを室温で一晩乾燥した。次いで、続くアミノオキシ試薬での処理のため、14cm×14cmのシートを複数の6cm×4cmシートに切断した。6cm×4cmのシートを室温でアミノオキシ試薬の0.2M水溶液中に浸漬した。完全な湿潤後、試料をピンセットで溶液から取り出し、過剰の溶液を十分に濡れた膜から排出させた。次いで、試料をヒートガンで部分的に乾燥し、結晶化皿内に配置して60℃で一晩乾燥した。一晩加熱した後、試料は褐色になった。乾燥した試料を秤量し、脱イオン水で洗浄し、溶液導電率を記録した。試料を60℃で1時間再乾燥し、脱イオン水で再洗浄した。このプロセスを、イオン導電率が3μS未満になるまで繰り返した。試料を窒素元素分析に付すことで、共有結合したアミノオキシ部分の量を求めた。窒素元素分析の結果は、分析した試料中のN%±95%信頼区間(CI)として表される。
各試料タイプについて、試料は約3/4インチ平方の2つの正方形として分析した。IPAで予め清浄にしたカミソリの刃で、試料を小さな正方形に切断した。マイクロ天秤を用いて、各々の反復試験試料を風袋測定済みの5×9mmスズカプセル中に秤取し、次いでそれを押しつぶしてカプセルで包囲された小さい球体とし、再び秤量した。各試料タイプの重量は概略窒素濃度に応じて変化した。2個のスズカプセルブランクについても分析を行った。
EA1108元素分析装置(Thermo Scientific社、ウォルサム、米国マサチューセッツ州)について、THAB(1.407%N)を標準物質として用いてCHN較正を実施した。8点較正(0.068mg、0.187mg、0.416mg、0.826mg、1.552mg、2.404mg、3.450mg、6.323mg)により、R2=99.98%の窒素曲線を作成した。THABに加えて、第2の標準物質(アトロピン、4.84%N)を未知物質として分析することで、較正曲線の正確さを確認した。THAB窒素回収率:97%〜109%。アトロピン窒素回収率:96%〜106%。
試料をCarlo Erba EA1108分析装置上でNについて4回分析した。その技術は、酸素富化雰囲気中において1000℃で試料を定量的フラッシュ燃焼させることで、窒素、炭素、水素及び硫黄からそれぞれCO2、H2O及びNOxを生成させることに基づいている。燃焼ガスを加熱した元素銅中に通すことで、あらゆる形態のNOxをN2に還元した。次いで、これらをキャリヤーガスでクロマトグラフィーカラムに通し、そこでこれらは分離され、熱伝導率検出器で検出されて定量化される。検体濃度は、一連の既知標準との比較によって算出される。較正曲線は検体の総mg数として作成されるが、これは分析する試料の重量に基づいて%に換算される。計器パラメーター:ヘリウム流量は150mL/分に設定、酸素流量は60mL/分に設定、試料当たり540秒。元素状硫黄分析の結果は、95%信頼区間(CI)でセルロース紙中のwt%金属を測定して表面修飾を確認することで判定した。
マイクロ波容器は、1マイクロ波サイクルを用いて10mLのHNO3酸で予め1回清浄にした。1組の0.06〜0.09g反復試験試料(1回の反復試験については分析する試料全体を使用した。)を差によって秤量し、テフロン(登録商標)XP1500マイクロ波ライナー中に配置した。10mlのHNO3酸を添加してライナーの壁を洗浄した。ライナーにキャップを付け、マイクロ波中に配置し、「紙」プログラム(10分で100℃に昇温、100℃で10分間保持、圧力を100psiに調節、10分で150℃に昇温、150℃で10分間保持、圧力を200psiに調節、分で180℃に昇温、180℃で10分間保持、圧力を300psiに調節、分で2000℃に昇温、200℃で10分間保持、圧力を400psiに調節、10分で2200℃に昇温、220℃で10分間保持、圧力を600psiに調節)を用いて運転した。加熱サイクル後、試料を室温まで完全に放冷した後に開放した。容器内容物をオレンジキャップ管に移し、5mLの10ppm Scを添加し、溶液を脱イオン水(DIW)で50mLに希釈した。ブランク及び試料スパイクについて、すべての手順を実施した。酸スパイク回収率:S:110%。Spex QC回収率:S:102%。標準:S:1 ppm Scを加えた20%HNO3を含むオレンジキャッププラスチック管中で0.05ppm〜10ppm。QC1:1ppm Spex4。すすぎ液:20%HNO3。
アルゴンガス流中に高周波電力を誘導結合することで高温プラズマを発生させる。噴霧器により、試料をプラズマ中に溶液エーロゾルとして導入すると、それぞれの元素はその固有放射を放出する。光学系では、130〜770nmの波長を同時記録するため、Arcosは最適化Paschen−RungeマウントORCA(最適化ローランド円整列)で32の線形CCD検出器を使用している(SPECTRO Analytical Instruments GmbH、ドイツ)。信号の大きさは試料中の元素の濃度に正比例する。試料信号強度を較正標準から生じるものと比較することで、定量的な結果が生み出される。
グラム陰性細菌Pseudomonas aeruginosa(感染単離物09−010、Brooke Army Medical Center Molecular Biology Lab及びUS Army Institute of Surgical Research)、グラム陽性細菌MRSA USA300(メチシリン耐性Staphylococcus aureus感染単離物NRS384、Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus)及び実験菌株Escherichia coli(HB101)を用いて抗菌性を評価した。その際、培養密度は0.5McFarland標準を用いて推定した。グラフト31−ETF紙並びに陽性(FTA)及び陰性(31−ETF)対照紙の7mm打抜き片に約1〜2×107個の細胞(14〜20μLの培養物)を適用し、試料を10分間(臨床単離物)又は60〜90分間(実験菌株E.coli)風乾した。無菌鉗子を用いて、試料を新鮮なトリプチカーゼダイズ寒天(TSA)にレプリカプレーティングした。その際には、各打抜き片を寒天表面上に裏返して置き、静かに押し付けた。打抜き片試料を取り除いた後、プレートを37℃で一晩インキュベートし、12〜24時間後に細菌増殖を評価した。
1分間の渦動を用いて、紙円形打抜き片(直径7mm)を500μLの水中70THFで抽出した。抽出分のクロマトグラフィー分析は、Electro Sprayイオン化アクセサリを備えたAB Sciex Q Star Elite(登録商標)Quadropole Time of Flight Mass Spectrometerと直列に配置された、1200 Series Photo−Diode Array検出器を備えたAgilent 1200 Series HPLCシステムを用いて達成した。分離は、3μm粒子媒体からなるCadenza CL C18 1×50mm逆相カラムを用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを正イオン化モードで取得した。定量分析結果は、それぞれの基準材料の既知質量の抽出質量クロマトグラムの積分ピークから求めた。方法パラメーターは次の通りであった。移動相:溶媒A,2mMギ酸アンモニウム(pH=4)、溶媒B,0.1%ギ酸を含む100%アセトニトリル、流量:0.2ml/分、ホトダイオードアレイ検出器取得:200〜800nm、カラム:Cadenza CL C18 3μm(1×50mm)、注入量:50μl、ESI条件:噴霧ガス:40,乾燥ガス:40,印加ニードル電圧:3000V、温度:400℃。
モデル薬物分子の原液をメタノール中に調製した。モデル分子は、異なる化学物質群、即ち塩基、第四級アミン、中性物質及び酸を代表していた。これらは、それぞれプログアニル、ハイアミン、シムバスチン及び2,4,6−トリイソプロピル安息香酸であった。最初の3者は100μg/mLの濃度に調製し、最後のものは200μg/mLに調製した。最終薬物濃度が元の濃度の1/10になり、かつ血液中に10%以下のメタノールしか存在しないようにして、ヒト全血をこれらの薬物溶液でスパイクした。各処方紙に各々の薬物−血液混合物10μLをスポットした。紙を乾燥室内で一晩乾燥した。7mmホールパンチャーを用いて全血スポットを打ち抜いて集め、500μlの70%メタノールでスポットを抽出した。理論上の100%最終回収量は、最初の3種の薬物に関しては200ng/mLであり、最後のものに関しては400ng/mLであった。検体回収率を得るためには、LC−MSを用いて各成分を定量し、同じ成分の較正標準と比較した。試験全体を通じて一定の信号を確保するため、ジノニルアミン(陽イオン)及びトリイソプロピル安息香酸(陰イオン)の内標準を使用した。クロマトグラフィー分析のために使用したシステム及び条件は、次のようにして使用した逆相HPLC−ToFMSを用いて実行された。使用した計測器は、Electro Sprayイオン化アクセサリを備えたAB Sciex Q Star Elite(登録商標)Quadropole Time of Flight Mass Spectrometerであった。分離は、3μm粒子媒体からなるCadenza CL C18 1×50mm逆相カラムを用いて実施した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを正イオン化モードで取得した。定量分析結果は、それぞれの基準材料の既知質量の抽出質量クロマトグラムの積分ピークから求めた。方法パラメーターは次の通りであった。移動相:溶媒A,2mMギ酸アンモニウム(pH=4)、溶媒B,0.1%ギ酸を含む100%アセトニトリル、流量:0.2ml/分、勾配プロファイル:10分で95〜0%A,100%Bに2分間保持,初期条件で10分間再平衡化、ホトダイオードアレイ検出器取得:200〜800nm、カラム:Cadenza CL C18 3μm(1×50mm)、注入量:5μl、ESI条件:G1 40,G2 30,CG 25、印加ニードル電圧:3000V、温度:400℃。
Claims (11)
- 次の式Iの構造単位を含むセルロース基材に生物学的試料を接触させることによって生物学的試料からの遺伝学的材料又は検体を保存する方法。
X及びYは独立にN−O−L−A又はOであるが、YがOである場合にはXがN−O−L−Aであり、XがOである場合にはYがN−O−L−Aであることを条件とし、
Lは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
AはCOOH又はSO3Hである。 - Lが−(CH2)n−(式中、nは1〜20の整数である。)であるか、Lが直接結合であってAがSO3Hであるか、或いはLがヘテロ原子置換されている、請求項1記載の方法。
- Lが−(CH2)n−Z−(CH2)m−であり、
nが0〜20の整数であり、
mが0〜20の整数であり、
ZがO、NH、C(O)NH、NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O又はこれらの組合せに等しい、請求項2記載の方法。 - 生物学的試料が頬側試料、脳脊髄液、糞便、血漿、血液、リンパ液、尿、精液、膣液、腺分泌液、細胞又はウイルスの懸濁液、ウイルスプラーク、血清試料或いはこれらの組合せである、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- さらに、セルロース基材上で生物学的試料を乾燥する段階、及びセルロース基材を乾燥した生物学的試料と共に24時間以上保存する段階を含む、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- さらに、遺伝学的材料又は1以上の検体をセルロース基材から抽出する段階を含む、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 生物学的試料からの遺伝学的材料又は検体を保存するための物品であって、次の式Iの構造単位を含むセルロース基材を含む物品。
X及びYは独立にN−O−L−A又はOであるが、YがOである場合にはXがN−O−L−Aであり、XがOである場合にはYがN−O−L−Aであることを条件とし、
Lは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
AはCOOH又はSO3Hである。 - Lが−(CH2)n−(式中、nは1〜20の整数である。)であるか、Lが直接結合であってAがSO3Hであるか、或いはLがヘテロ原子置換されている、請求項7記載の物品。
- セルロース基材の製造方法であって、
酸化C2−C3開環セルロースを次の式IIの置換アミノオキシに接触させ、式IIをセルロース基材に結合させるのに有効な時間及び温度に保つ段階と、
酸化C2−C3開環セルロースを洗浄して未反応の式IIの置換アミノオキシを除去する段階と
を含む方法。
Lは直接結合、脂肪族基、芳香族基、脂環式基又はこれらの組合せであり、
Aは−COOH又は−SO3Hである。 - Lが(CH2)n−(式中、nは1〜20の整数である。)であるか、Lが直接結合であってAがSO3Hであるか、或いはLがヘテロ原子置換されている、請求項9記載の方法。
- Lが−(CH2)n−Z−(CH2)m−であり、
nが0〜20の整数であり、
mが0〜20の整数であり、
ZがO、NH、C(O)NH、NHC(O)、N(CO)N、O(CO)O、N(CS)N、O(CS)O又はこれらの組合せに等しい、請求項10記載の方法。
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