JP6795188B2

JP6795188B2 - フコース検出用電極

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Publication number: JP6795188B2
Application number: JP2017020395A
Authority: JP
Inventors: 諒楠岡; 康太武田; 暢文中村; 大野　弘幸; 弘幸大野
Original assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY
Current assignee: NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF AGRICULUTURE & TECHNOLOGY
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2020-12-02
Anticipated expiration: 2037-02-07
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Description

本発明は、フコースを検出するための電気化学測定用電極、フコース濃度測定用バイオセンサ、フコース検出方法及びフコース濃度測定方法に関する。

フコース（ｆｕｃｏｓｅ）は、デオキシ糖の一種である６−デオキシ−ガラクトースであり、六炭糖、単糖に分類される。天然にはＬ型が動植物に幅広く存在し、Ｌ−フコースは生体内で複合糖鎖の非還元末端に結合している。肝臓癌又は嚢胞性線維症等の疾患を持つ患者においては、Ｌ−フコースの代謝経路が異常となり、Ｌ−フコースが尿中に遊離して尿中のＬ−フコース濃度が上昇することが知られている。したがって、尿等の体液中のＬ−フコースを検出し、濃度を測定することは癌等の疾患の判定に役立てられる。

従来、Ｌ−フコースの濃度を測定する方法としては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とする脱水素酵素（ＮＡＤＰＨ依存型フコース脱水素酵素）を用いた分光学的な測定法（非特許文献１〜４）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた定量法（非特許文献５）、さらに、ＮＡＤＰＨ依存型フコース脱水素酵素を用いた電気化学的フコース測定法（非特許文献６）が知られている。

Ｍ．Ａ．Ｃｏｈｅｎｆｏｒｄら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８１年、１１２巻、７６−８１頁Ｍ．Ａ．Ｃｏｈｅｎｆｏｒｄら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８９年、１７７巻、１７２−１７７頁Ｔ．Ｓａｋａｉら、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年、３６巻、４７４−４７６頁Ｖ．Ｄｊｕｒｄｊｉｃら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０年、１８８巻、２２２−２２７頁Ｋ．Ｒ．Ａｎｕｍｕｌａら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２２０巻、２７５−２８３頁Ｃ．Ｇ．Ｔｓｉａｆｏｕｌｉｓら、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、２００４年、２０巻、６２０−６２７頁

しかしながら、上記分光学的な測定法を行うためには、高価な装置が必要であったり、測定に時間がかかったり、尿検体に含まれる測定の妨害となる夾雑物質を除去するための前処理に時間がかかったりする等の問題があった。また、上記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いたフコース定量法は、ｐＭレベルの微量のＬ−フコースを検出することができる反面、５０ｐＭ以上の濃度のＬ−フコースを測定しようとすると測定の際にピークが振り切れてしまい、定量することができないという問題があった。また、上記ＮＡＤＰＨ依存型フコース脱水素酵素を用いた電気化学的フコース測定法では、高価なＮＡＤＰＨが必要であったり、酵素と電極間の電子移動反応を仲介するメディエータとしてヘキサシアノ鉄酸塩を必要とし、反応系が複雑となったり、さらに尿中夾雑物質を除去するための前処理が必要であったりする等の問題があった。

そこで本発明は、簡便にフコースを検出する方法及び簡便にフコースの濃度を測定する方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明者らは、電極触媒として担子菌の一種であるコプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を用い、さらに前記酵素の電子伝達ドメインであるシトクロムｂドメインを欠損させて、電極触媒として使用することにより、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、フコースを検出する、電気化学測定用電極であって、上記電極は、表面に、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、上記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、電極を提供する。

上記コプリノプシス・シネレア由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持する電極は、酵素と電極間の電子移動反応を仲介するメディエータを用いることなく、フコースから直接的に電子の移動を行うことができる直接電子移動型の酵素電極である。さらに、上記酵素のうち、電子伝達ドメインであるシトクロムｂドメインを欠損させることにより、電子移動の際に電子伝達部位を介すことで生じる電位のロスがなくなり、被検試料中の夾雑物質よりも低電位で酵素から電流が電極に流れ、被検試料中の夾雑物質から流れる電流の影響を排除し、フコースを検出するために十分な感度を得ることが可能となる。すなわち、本発明の電極によれば、フコースを電気化学的に十分な感度で検出することができる。電気化学的な検出は、測定時間が短く、操作が容易であるため、簡便にフコースを検出することができる。また低コストで検出を行えるという利点もある。

また、本発明は、作用極及び対極を含む電極系を備え、上記作用極は、表面に、コプリノプシス・シネレア由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、上記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、フコース濃度測定用バイオセンサを提供する。

上記バイオセンサは、作用極として、上記本発明の電極を備え、電子メディエータを必要としない直接電子移動型のバイオセンサとなる。したがって、上記バイオセンサによれば、フコース濃度の測定に際し複雑な反応系を必要とせず、簡便に測定を行うことができる。

また、本発明は、電極系に電圧を印加するステップと、上記電圧に応じて上記電極系に流れる電流値に基づいて被検試料中のフコースを検出するステップとを含む、フコース検出方法であって、上記電極系は作用極及び対極を含み、上記作用極は、表面に、コプリノプシス・シネレア由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、上記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、方法を提供する。

上記方法は、上記本発明の電極を作用極として使用し、フコースを電気化学的に検出する方法であり、この方法によれば、被検試料中のフコースを十分な感度で検出することができる。また電気化学的な方法であるため、短い測定時間及び容易な操作で、簡便にフコースを検出することができる。さらに低コストで検出を行える。

上記フコース検出方法において、上記電圧が、−５０〜＋１５０ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）であることが好ましい。電極系に印加する電圧が上記範囲であることにより、フコースの検出感度がより高くなり、フコースを検出する被検試料中に含まれる夾雑物質の影響をより受け難くなる。すなわち、被検試料によっては前処理を行わずともフコースの検出が可能となる。

また、本発明は、電極系に電圧を印加するステップと、上記電圧に応じて上記電極系に流れる電流値に基づいて被検試料のフコース濃度を測定するステップとを含む、フコース濃度測定方法であって、上記電極系は作用極及び対極を含み、上記作用極は、表面に、コプリノプシス・シネレア由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、上記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、方法を提供する。

上記方法は、上記本発明の電極を作用極として使用し、フコース濃度を電気化学的に測定する方法であり、この方法によれば、溶液のフコース濃度を十分な感度で測定することができる。また電気化学的な方法であるため、短い測定時間及び容易な操作で、簡便にフコース濃度を測定することができる。さらに低コストで測定を行える。

上記フコース濃度測定方法において、上記電圧が、−５０〜＋１５０ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）であることが好ましい。電極系に印加する電圧が上記範囲であることにより、フコースに対する測定感度がより高くなり、フコース濃度を測定する被検試料中に含まれる夾雑物質の影響をより受け難くなる。すなわち、被検試料によっては前処理を行わずともフコース濃度の測定が可能となる。

本発明の電極を用いることにより、フコースを簡便に検出することができる。また、本発明の電極を用いることにより、電子メディエータを必要としない直接電子移動型のバイオセンサを構築することができ、フコース濃度の測定に際し複雑な反応系を必要とせず、簡便に測定を行うことができる。また、本発明のフコース検出方法によれば、簡便に被検試料中のフコースを検出することができ、本発明のフコース濃度測定方法によれば、被検試料のフコース濃度を簡便に測定することができる。

図１は、各電位におけるアンペロメトリー測定の結果を示す図である。図１Ａは＋５００ｍＶｖｓ．ＮＨＥ、図１Ｂは＋２００Ｖｖｓ．ＮＨＥ、図１Ｃは＋１００ｍＶｖｓ．ＮＨＥの電圧で印加したときの結果である。図２は、実施例１〜３の電極を用いたアンペロメトリー測定の結果を示す図である。図２Ａは、Ｌ−フコースを添加したときの電流密度の変化を表す図であり、図２Ｂは、Ｌ−フコース濃度に対する電流密度をプロットした図である。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
（電極）
本発明の電極は、フコースを検出する電気化学測定用電極であって、その表面に、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、コプリノプシス・シネレア由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持している電極である。なお、以下場合により、「コプリノプシス・シネレア由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素」を「ＣｃＰＤＨ」と称する。本発明の電極は、酵素触媒機能を備えた酵素電極である。酵素電極とは、電極が酵素反応の電子受容体または供与体として機能し、酵素の基質が電気化学的に酸化または還元され生成物となる。酵素電極で得られる電流は、酵素反応の速度で規定され、酵素の基質に対して特有の濃度依存性を示す。本発明においては、フコースが電極表面に担持されたＣｃＰＤＨの触媒ドメインにより酸化され、フコースから電極にメディエータを介さず直接電子が移動する。

本発明で用いられるピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素は、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のものである。「ピロロキノリンキノン依存性」とは、触媒時にピロロキノリンキノンを補酵素として必要とすることを意味する。したがって、本発明の電極は、使用する際に触媒ドメイン中にピロロキノリンキノンを含むものである。

ＣｃＰＤＨは、Ｎ末端のシトクロムｂドメイン、Ｃ末端の糖質結合モジュールドメイン、酵素反応時にピロロキノリンキノンを補酵素として含む触媒ドメイン（ＰＱＱドメイン）の３つのドメインを含む酵素である。本発明の電極表面に担持される酵素は、この３つのドメインのうち、シトクロムｂドメインを欠損させたものである。シトクロムｂドメインは、電子伝達部位であり、酵素から電極への電子の授受には必要不可欠な部位と予想された。しかしながら、本発明においては、意外なことに、シトクロムｂドメインを欠損させることにより、電子移動の際に電子伝達部位を介すことで生じる電位のロスがなくなり、被検試料中の夾雑物質よりも低電位で酵素から電流が電極に流れ、被検試料中の夾雑物質から流れる電流の影響を排除し、フコースを検出するために十分な感度を得ることができる。

本発明の電極表面に担持される酵素は、シトクロムｂドメインを欠損しており、かつ触媒ドメインを有してさえいれば、十分に本発明の効果を奏することができ、糖質結合モジュールドメインについては欠損していてもいなくてもよい。しかしながら、フコースに対する感度がより上がるため、糖質結合モジュールドメインも欠損していることが好ましい。

シトクロムｂドメインを欠損させる前のＣｃＰＤＨとして、例えば、配列暗号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができ、このタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号２記載の核酸配列によって表される核酸を挙げることができる。配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、１〜２２１番のアミノ酸配列からなるタンパク質がシトクロムｂドメインであり、２２２〜６３１番のアミノ酸配列からなるタンパク質が触媒ドメインであり、６３２〜７０８番のアミノ酸配列からなるタンパク質が糖質結合モジュールドメインである。なお、シトクロムｂドメインである１〜２２１番のアミノ酸配列のうち、特に電子伝達効果を奏する部位を欠損していれば、本発明の効果を奏することができるため、電極表面に担持される酵素が１〜２２１番のアミノ酸配列からなるシトクロムｂドメイン全てを欠損している必要はない。同様に、触媒ドメインである２２２〜６３１番のアミノ酸配列のうち、基質結合及び触媒活性を奏する部位を有していれば、触媒効果を奏することができるため、電極表面に担持される酵素が２２２〜６３１番のアミノ酸配列からなる触媒ドメイン全てを有している必要はない。

例えば、配列番号３記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、フコース脱水素活性を有するタンパク質を、本発明の電極表面に担持される酵素とすることができる。配列番号３記載のアミノ酸配列は、配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、シトクロムｂドメインを欠損させたものである。同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号４記載の核酸配列によって表される核酸を挙げることができる。

また例えば、配列番号５記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、フコース脱水素活性を有するタンパク質を、本発明の電極表面に担持される酵素とすることができる。配列番号５記載のアミノ酸配列は、配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、シトクロムｂドメインと糖質結合モジュールドメインの両方を欠損させたものである。同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。配列番号５記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子として、配列番号６記載の核酸配列によって表される核酸を挙げることができる。なお、本発明において「核酸」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのことをいう。

上記シトクロムｂドメイン又は糖質結合モジュールドメインを欠損させた酵素は、例えば、これらのドメインを欠損させた酵素の遺伝子を、当業者には公知の方法により、酵母及び大腸菌等の微生物に形質転換させ、該形質転換された微生物の菌体又は培地から、酵素活性を指標に精製し、得ることができる。具体的には、例えば、実施例に記載の方法により、上記特定のドメインを欠損させた酵素を作製することができる。

本発明の電極は、上記シトクロムｂドメインを欠損させたＣｃＰＤＨを電極表面上に担持させる（固定化する）ことにより製造できる。

電極の材料としては、例えば、金、白金、カーボン、銀等を用いることができるがこの中でも金、白金、カーボンが好ましい。これらの導電材料からなる電極に酵素を固定化させてもよいが、これらの導電材料からなるナノ粒子を、基礎となる電極表面上に吸着させたナノ粒子修飾電極であってもよい。このようなナノ粒子の材料としては、金、白金、カーボンが好ましい。ナノ粒子の平均粒子径を、５〜１００ｎｍとすることが、電極の感度向上の観点から好ましい。ナノ粒子を電極表面上に吸着させるには、自己集合法、キャスト法、電荷を持ったポリマーを用いた積層法等が挙げられるが、この中でもキャスト法により吸着させることが好ましい。キャスト法は、ナノ粒子分散溶液を、基礎となる電極表面上に塗布して溶媒を揮発させ、ナノ粒子を吸着させる手法であるが、ナノ粒子分散溶液を塗布する回数が多いほど、電極表面上のナノ粒子数が増え、電極の感度が向上し、検出限界も小さくなるので好ましい。キャスト法によりナノ粒子を電極表面上に吸着させる場合、例えば、１回の塗布に際し、１×１０^−７ｍｏｌ／ｌ〜５×１０^−６ｍｏｌ／ｌの濃度のナノ粒子分散溶液を、電極表面の単位面積あたり５〜２５０μＬ／ｃｍ^２塗布することができ、好ましくは３回以上、より好ましくは５回以上、さらに好ましくは１５回以上塗布することができる。電極としては、回転ディスク電極を用いてもよいし、静止電極を用いてもよい。

酵素を電極表面上に担持させる（固定化する）には、当業者には公知の方法を用いることができ、例えば、物理的に吸着させる方法、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被膜する方法、光架橋ポリマー又は酸化還元ポリマーを用いて固定化する方法が例示でき、これらを組み合わせて用いてもよい。具体的には、例えば、電極を２−メルカプトエタノールに浸漬して、電極表面上に２−メルカプトエタノールの自己組織化単分子膜を形成させ、この自己組織化単分子膜修飾電極を、酵素を含む緩衝液中に浸漬することで、酵素が２−メルカプトエタノールの水酸基に結合し、電極表面上に酵素を担持させることができる。この方法では、２−メルカプトエタノール以外の化合物でも、酵素と結合できる官能基を有する化合物からなる膜を電極表面上に形成させて、該官能基と酵素とを結合させることにより、酵素を電極表面上に担持させることが可能である。このような化合物としては、例えば、末端に水酸基を有する化合物が挙げられる。

上記電極を使用するには、上記電極を作用極として含む電極系に一定の電圧を印加する。電圧を印加すると、電極系に電流が流れる。電流値が定常になった後、被検試料を加えて電流値の増加を測定する。被検試料中にフコースが含まれていれば、フコースが電極表面上の酵素により酸化され、酵素を通じて電極（作用極）に電流が流れ、電流値が増加する。したがって、電流値が増加すれば、被検試料中にフコースが含まれていると判断することができ、被検試料中のフコースを検出することができる。
（バイオセンサ）
本発明のバイオセンサは、フコース濃度測定用のバイオセンサであって、作用極として上記本発明の電極、すなわち、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有しているＣｃＰＤＨを表面に担持する電極を備えるものである。

本明細書において「バイオセンサ」とは、酵素の基質認識能と触媒能とを利用して、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系のことをいう。本発明においては、作用極と対極とから構成される２電極系であってもよく、作用極、対極及び参照極とから構成される３電極系であってもよい。また、バイオセンサは、緩衝液及び被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を備えていてもよく、バッチ型であってもフロー型であってもよい。恒温セル、電源、電流計、記録計は、公知のものを使用することができる。

本発明におけるバイオセンサは、作用極として上記本発明の電極を用いるが、対極として白金電極を、参照電極として銀−塩化銀電極を用いる構成を例示できる。

上記バイオセンサを用いて、被検試料中に含まれるフコース濃度を測定するには、例えば、恒温セルに緩衝液を入れ、電極系に一定の電圧を印加して、電流値が定常になった後、恒温セルに被検試料を加えて電流値の増加を測定する。被検試料中にフコースが含まれていれば、フコースが上記本発明の電極上の酵素により酸化され、酵素を通じて電極（作用極）に電流が流れ、電流値が増加する。標準濃度のフコースを含有する溶液による電流値の増加を同様に測定し、作製した標準曲線に基づいて、被検試料中のフコースの濃度を求めることができる。
（フコース検出方法）
本発明のフコース検出方法は、電極系に電圧を印加するステップと、前記電圧に応じて前記電極系に流れる電流値に基づいて被検試料中のフコースを検出するステップとを含み、前記電極系は作用極及び対極を含み、前記作用極として上記本発明の電極、すなわち、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有しているＣｃＰＤＨを表面に担持する電極を用いるものである。

上記方法において、電極系は作用極と対極とから構成される２電極系であってもよく、作用極、対極及び参照極とから構成される３電極系であってもよい。上記方法においては、作用極として上記本発明の電極を用いるが、対極として白金電極を、参照電極として銀−塩化銀電極を用いる構成を例示できる。また、上記方法において、電極系のほかに、緩衝液、緩衝液及び被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を用いてもよい。

上記方法においては、例えば、恒温セルに緩衝液を入れ、電極系に一定の電圧を印加する。電圧を印加すると、電極系に電流が流れる。電流値が定常になった後、恒温セルに被検試料を加えて電流値の増加を測定する。被検試料中にフコースが含まれていれば、フコースが電極表面上の酵素により酸化され、酵素を通じて電極（作用極）に電流が流れ、電流値が増加する。したがって、電流値が増加すれば、被検試料中にフコースが含まれていると判断することができ、被検試料中のフコースを検出することができる。

上記方法においては、印加する電圧が、−５０〜＋１５０ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）であることが好ましく、０〜＋１２０ｍＶｖｓ．ＮＨＥであることがより好ましく、＋１００〜＋１２０ｍＶｖｓ．ＮＨＥであることがさらに好ましい。電圧が上記範囲であることにより、夾雑物質から流れる電流の影響をより受け難くなる。したがって被検試料が夾雑物質を含む場合でも、前処理をせずに測定することができる。これは特に夾雑物質がアスコルビン酸、ドーパミン又は尿酸を含む場合に有効であり、この中でも夾雑物質がアスコルビン酸を含む場合に特に有効である。このような夾雑物質を含む被検試料としては、例えば、ヒトを含む動物の体液又は組織、植物体又は植物体の抽出液が挙げられる。

上記方法においては、２０〜３０℃の温度で測定を行うことが好ましい。また緩衝液としては、当業者には公知のものを使用することができるが、例えば酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等を用いることができ、緩衝液の温度を２０〜３０℃とし、濃度を５０〜１００ｍＭとし、ｐＨを５．５〜６．５とすることが好ましい。
（フコース濃度測定方法）
本発明のフコース濃度測定方法は、電極系に電圧を印加するステップと、前記電圧に応じて前記電極系に流れる電流値に基づいて被検試料のフコース濃度を測定するステップとを含み、前記電極系は作用極及び対極を含み、前記作用極として上記本発明の電極、すなわち、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有しているＣｃＰＤＨを表面に担持する電極を用いるものである。

上記フコース濃度測定方法において、フコース検出方法同様、電極系は作用極と対極とから構成される２電極系であってもよく、作用極、対極及び参照極とから構成される３電極系であってもよい。また、作用極として上記本発明の電極を用いるが、対極として白金電極を、参照電極として銀−塩化銀電極を用いる構成を例示できる。また、電極系のほかに、緩衝液、緩衝液及び被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を用いてもよい。

上記フコース濃度測定方法においては、例えば、恒温セルに緩衝液を入れ、電極系に一定の電圧を印加する。電圧を印加すると、電極系に電流が流れる。電流値が定常になった後、恒温セルに被検試料を加えて電流値の増加を測定する。被検試料中にフコースが含まれていれば、フコースが電極表面上の酵素により酸化され、酵素を通じて電極（作用極）に電流が流れ、電流値が増加する。標準濃度のフコースを含有する溶液による電流値の増加を同様に測定し、作製した標準曲線に基づいて被検試料中のフコースの濃度を求めることができる。

上記方法においては、印加する電圧が、−５０〜＋１５０ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）であることが好ましく０〜＋１２０ｍＶｖｓ．ＮＨＥであることがより好ましく、＋１００〜＋１２０ｍＶｖｓ．ＮＨＥであることがさらに好ましい。電圧が上記範囲であることにより、夾雑物質から流れる電流の影響をより受け難くなる。したがって被検試料が夾雑物質を含む場合でも、前処理をせずに測定することができる。これは特に夾雑物質がアスコルビン酸、ドーパミン又は尿酸を含む場合に有効であり、この中でも夾雑物質がアスコルビン酸を含む場合に特に有効である。このような夾雑物質を含む被検試料としては、例えば、ヒトを含む動物の体液又は組織、植物体又は植物体の抽出液が挙げられる。
（被検試料）
本発明においてフコースを検出またはフコース濃度を測定できる被検試料としては、固体でも液体でもよく、固体であれば緩衝液に溶解させて測定することが好ましい。被検試料としては特に限定されず、ヒトを含む動物の体液又は組織、植物体又は植物体の抽出液が挙げられる。例えば、癌等の疾病の診断に必要なデータ採取のためには、ヒトを含む動物の体液が被検試料として挙げられ、体液として血液、リンパ液、組織液、腹水、脳脊髄液、消化液、唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液、汗、涙、鼻水、尿、精液、膣液、羊水、乳汁等が挙げられる。この中でも血液及び尿が、採取が容易であり、測定において前処理をせずとも夾雑物質の影響を受け難いことから好ましく、特に尿はアスコルビン酸、ドーパミン又は尿酸等の夾雑物質を含むことから前述した電圧の効果が最も高く奏される。

なお、本発明によれば、動植物に存在するのは主にＬ体であるため、検出するフコースは通常Ｌ−フコースである。

フコースの検出または濃度測定のために、被検試料の前処理をおこなってもよい。前処理の方法としては、例えば、破砕、抽出、濾過、濃縮、希釈、ｐＨ調整、透析、脱塩、塩析、分画、タンパク質沈殿等、測定する物質の性質に応じて、様々な方法を行うことができる。本発明の電極は、特にフコースが１００μＭ〜１．０ｍＭの範囲で良好な測定感度を有するため、被検試料の濃度がこの範囲に入るように被検試料を適宜希釈又は濃縮することが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（シトクロムｂドメイン欠損酵素の生産及び精製）
まず、発現ベクターを作製した。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カリフォルニア州カールスバッド）のＥｃｏＲＩ部位及びＮｏｔＩ部位へのライゲーションのために、２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーを酵素タンパク質のヌクレオチド配列に基づいて設計した：５’プライマー（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＧＣＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＧＴＧ−３’：配列番号７）及び３’プライマー（５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＣ−３’：配列番号８）。合成した第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーペアとＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２、東洋紡社製、日本、大阪）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ（登録商標）−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ウィスコンシン州マディソン）にサブクローニングした。続いてＤＮＡシーケンサー（３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて塩基配列決定を行った。標的遺伝子をＥｃｏＲＩ部位及びＮｏｔＩ部位で切断し、ｐＰＩＣＺαベクターの対応する制限部位に組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列分析により確認した。ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）への形質転換の前に、ｐＰＩＣＺα内のＤＮＡコンストラクト約１０μｇを、Ｂｐｕ１１０２Ｉ（タカラ社、日本）を用いて線状化した。エレクトロポレーション、形質転換体の選択、及び、組換えタンパク質の生産を、キット（ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔＰｉｃｈｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｋｉｔｖｅｒｓｉｏｎＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、説明書に従って行った。完全長遺伝子を含むｐＰＩＣＺαを鋳型として用いたＰＣＲによる酵素タンパク質の、シトクロムｂドメイン及び糖質結合モジュールドメインのコード領域を削除することにより、酵素タンパク質の触媒ドメインを作製した。シトクロムｂドメイン（Ｎ−末端から２２１アミノ酸）を切り捨てるために用いた２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＧＣ−３’（５’プライマー、配列番号９）及び５’−ＧＣＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧ−３’（３’プライマー、配列番号１０）である。これらのプライマーは、ｐＰＩＣＺαベクターのαファクターシグナル配列を、組換えタンパク質遺伝子の上流に含み、酵素タンパク質の遺伝子はＴ２２２残基以降のアミノ酸をコードする。糖質結合モジュールドメインを切り捨てるために停止コドンが以下のプライマーを用いて挿入された：５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＣＴＡＧＴＣＣＧＧＣＣＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡＧＣ−３’（５’プライマー、配列番号１１）及び５’−ＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＡＧＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧ−３’（３’プライマー、配列番号１２）。下線がされたコドンは、停止コドンを導入し、糖質結合モジュールドメインを含むＣ末端の７７個のアミノ酸の翻訳を防ぐためのミスマッチを表している。ＤＮＡ解析により変異を確認し、組換えプラスミドをピキア酵母に形質転換し、続いてタンパク質発現を行った。

培養物を遠心（３０分、１５００×ｇ）し、セルフリー培養物から硫酸アンモニウム（７０％飽和水溶液）を用いて組換えタンパク質を含む粗タンパク質を沈殿させた。沈殿物を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）に溶解した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へのリニアリバースグラジエントで組換えタンパク質を溶出した。組換えタンパク質を含む画分を回収し、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に対して平衡化した。同バッファーのリニアグラジエント溶出により酵素をカラムから溶出した（０〜５００ｍＭＮａＣｌ）。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｓ（カラム体積；７５ｍＬ）に供した。組換えタンパク質を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）の直線勾配で溶出した。目的タンパク質の画分を集めた後、酢酸緩衝液２０ｍＭ（ｐＨ４．５）に置換した。組換えタンパク質の脱グリコシル化をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）を用いて行った。この脱グリコシル化反応後の溶液を同緩衝液で置換したＵＮＯＳ６カラム（カラム体積；６ｍＬ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に供し、０−４００ｍＭＮａＣｌの直線勾配により溶出し、組換えタンパク質を含む画分を集めた。１２％ポリアクリルアミドゲル上へのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認し、組換えタンパク質の濃度を波長２８０ｎｍのＵＶ吸光度により、吸光係数７２．４ｍＭ^−１ｃｍ^−１を用いて決定した。
（実施例１）
（酵素電極の作製と電気化学測定）
クエン酸還元法により合成した金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（平均粒子径１４ｎｍ）を回転ディスク多結晶金電極上に塗布、風乾し、溶媒を揮発させた（キャスト法）。この塗布、風乾を３回繰り返し、ＡｕＮＰ修飾電極を作製した。これらの電極を２０ｍＭの２−メルカプトエタノールに１時間浸漬し、電極表面上に２−メルカプトエタノールによる自己組織化単分子膜を形成させ、自己組織化単分子膜修飾電極を作製した。上で作製したシトクロムｂドメイン欠損酵素１．０μＭを含む酢酸緩衝液２０ｍＭ（ｐＨ６．０）中に自己組織化単分子膜修飾電極を浸漬することで酵素を固定し、酵素電極を作製した。
（酵素電極を用いたＬ−フコースの検出）
作製した酵素電極のＬ−フコースへの応答性を評価するため、酵素電極を作用極とし、対極として白金線、参照極として銀−塩化銀電極を用い、電極の回転速度を５００ｒｐｍに設定して１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でアンペロメトリー測定を行い、Ｌ−フコース測定用バイオセンサとしての評価を行った。また、尿中夾雑物質であるアスコルビン酸（ＡＡ）、ドーパミン（ＤＡ）、尿酸（ＵＡ）の影響を検討するため、印加電圧を＋５００ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）、＋２００ｍＶｖｓ．ＮＨＥ、または＋１００ｍＶｖｓ．ＮＨＥとした。測定する物質の濃度をそれぞれ、Ｌ−フコース０．１ｍＭ、アスコルビン酸０．１９ｍＭ、ドーパミン０．００４６ｍＭ、尿酸１．９ｍＭとした。その結果、どの電位を印加してもＬ−フコースの酸化触媒電流が観測され、上記酵素電極によりＬ−フコースの検出が可能であった（図１Ａ〜Ｃ）。しかしながら、＋５００ｍＶｖｓ．ＮＨＥ（図１Ａ）、＋２００ｍＶｖｓ．ＮＨＥ（図１Ｂ）の電位を印加したときは尿中夾雑物質の酸化反応に由来する電流も観測された。一方で、＋１００ｍＶｖｓ．ＮＨＥ（図１Ｃ）の電位を印加したときは尿中夾雑物質の酸化反応に由来する電流は観測されなかった。すなわち、作動電位を＋１００ｍＶｖｓ．ＮＨＥに設定すると、尿中夾雑物質の影響を排除しつつ、Ｌ−フコースの検出が可能であった。
（酵素電極を用いたＬ−フコースの濃度測定）
印加電圧を＋１００ｍＶｖｓ．ＮＨＥとし、作製した酵素電極のＬ−フコースへの応答性の検討を行ったところ、Ｌ−フコースに対して迅速に応答し、電流密度はＬ−フコースの添加に伴い階段状に増大した（図２Ａ（実施例１））。Ｌ−フコースの酸化電流密度を測定し、Ｌ−フコース濃度に対してプロットしたところ、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲において良好な直線性（決定係数ｒ^２＝０．９９９２）を示した（図２Ｂ（実施例１））。センサ感度は０．９１±０．０２ｍＡ・Ｍ^−１ｃｍ^−２、検出限界は５．５２μＭであった（表１）。
（実施例２及び３）
ＡｕＮＰ溶液の塗布、風乾を５回（実施例２）又は１５回（実施例３）繰り返してＡｕＮＰ修飾電極を作製した以外は、実施例１と同様の方法で酵素電極を作製し、印加電圧を＋１００ｍＶｖｓ．ＮＨＥとして、アンペロメトリー測定を行った。その結果、０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲において良好な直線性（ｒ^２＝０．９９８３（実施例２）、ｒ^２＝０．９９９６（実施例３））を示した（図２Ｂ）。センサ感度は２．３８±０．０９ｍＡ・Ｍ^−１ｃｍ^−２（実施例２）、３．１２±０．０５ｍＡ・Ｍ^−１ｃｍ^−２（実施例３）、検出限界は４．０６μＭ（実施例２）、０．６１μＭ（実施例３）であり、ＡｕＮＰ溶液の塗布回数が多いほど、センサ感度及び検出限界ともに向上した（表１）。実施例１〜３のいずれの結果も、Ｌ−フコースバイオセンサとして十分使用可能な値であった。

本発明の電極、バイオセンサ、フコース検出方法、フコース濃度測定方法によれば、簡便に感度よくフコースを検出し、濃度を測定することが可能である。したがって、ヒトの体液を被検試料として、癌等の疾患の診断に用いるデータ採集を簡単に行うことが可能となる。

Claims

フコースを検出する、電気化学測定用電極であって、
前記電極は、表面に、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、
前記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、電極。
作用極及び対極を含む電極系を備え、
前記作用極は、表面に、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、
前記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、
フコース濃度測定用バイオセンサ。
電極系に電圧を印加するステップと、
前記電圧に応じて前記電極系に流れる電流値に基づいて被検試料中のフコースを検出するステップとを含む、フコース検出方法であって、
前記電極系は作用極及び対極を含み、
前記作用極は、表面に、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、
前記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、方法。
前記電圧が、−５０〜＋１５０ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）である、請求項３に記載の方法。
電極系に電圧を印加するステップと、
前記電圧に応じて前記電極系に流れる電流値に基づいて被検試料のフコース濃度を測定するステップとを含む、フコース濃度測定方法であって、
前記電極系は作用極及び対極を含み、
前記作用極は、表面に、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓｃｉｎｅｒｅａ）由来のピロロキノリンキノン依存性ピラノース脱水素酵素を担持しており、
前記酵素は、シトクロムｂドメインを欠損し、触媒ドメインを有している、方法。
前記電圧が、−５０〜＋１５０ｍＶｖｓ．標準水素電極（ＮＨＥ）である、請求項５に記載の方法。