FR2622973A1 - Procede de determination de la luminescence de cultures cellulaires et dispositif pour mettre en oeuvre ce procede - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination de la luminescence de cultures cellulaires, ainsi qu'un dispositif pour mettre en oeuvre ce procédé. Dans un procédé de détermination de la luminescence de cultures cellulaires, on les munit d'une première substance luminescente amplifiant la luminescence naturelle puis on les traite par une seconde substance déclenchant la luminescence, et l'on capte la luminescence photo-électroniquement. On propose de cultiver la culture cellulaire à examiner en la faisant d'abord adhérer à un support, puis de traiter le support par une première substance luminescente et de retirer la première substance non absorbée par la culture cellulaire qui adhère au support et de mesurer seulement le rayonnement émis par la culture cellulaire après addition de la seconde substance déclenchant la luminescence. Le dispositif correspondant comporte un ensemble de boîtes de Pétri pouvant être isolé de l'environnement extérieur, où au moins un support peut être logé de façon amovible dans des conditions stériles. Le support placé au moins à un exemplaire peut être traité alternativement par une solution nutritive (bouillon de culture), des solutions de lavage ou des substances luminescentes.

Description

La présente invention concerne un procédé de dé-

termination de la luminescence de cultures cellulaires,

dans lequel on les munit d'une première substance lumines-

cente amplifiant la luminescence naturelle, puis on la traite par une seconde substance déclenchant la luinescence et l'on capte la luminescence photoélectroniquement, ainsi

qu'un dispositif pour mettre en oeuvre le procédé.

On connaît de tels procédés, entre autres, par

B. Becker et autres, "Application of intracellular ATP De-

termination in lymphocytes for HLA-typing", Journal of Bioluminescence and Chemie luminescence, Vol: 1,47-51 (1986). Il faut entendre par luminescence dans un sens

élargi, toutes les émissions de quanta de rayonnement, sur-

tout des phénomènes luminescents que présentent des sub-

stances après excitation quantique sans l'aide d'énergie thermique. Dans le cas de ce qu'on appelle bioluminescence, l'excitation précédant l'émission de quanta de lumière est produite par une oxydation commandée enzymatiquement. On

connaît au mieux ce processus dans ce cas chez les coléo-

ptères luisants, appelés également communément "Vers luisants", o il faut, pour le démarrage de la réaction, la

présence de luciférine, d'ions magnésium, d'ATP (adénosine-

triphosphate) et d'oxygène. L'enzyme luciférase catalyse

l'oxydation de la luciférine, un photon étant émis. Le nom-

bre des photons émis permet de faire des déductions sur

l'activité ou la vitalité des cellules.

De tels processus ne se déroulent pas, de façon prédominante, avec le rayonnement intense connu pour les

vers luisants, de sorte que le rayonnement n'est pas suf-

fisant pour être mesuré directement. Par suite, dans la

technologie de la luminescence, on introduit dans les orga-

nismes ou les cellules des substances luminescentes en tant qu'amplificateurs ou renforçateurs qui sont oxydées ensuite

par une substance déclenchante, éventuellement avec la co-

opération d'une enzyme propre aux cellules, la luminescence pouvant alors être observée. A partir de l'intensité de la

luminescence, on peut alors tirer des conclusions sur l'ac-

tivité de l'enzyme ou de la culture cellulaire. La lumines-

cence ou la technique de bioluminescence a ét -de plus en plus appliquée ces dernières années, du fait qu'un "marquage" de cellules par des substances luminescentes est beaucoup plus simple et inoffensif que, par exemple, le marquage par

des isotopes radioactifs.

Pour la mise en oeuvre de tels procédés d'analyse de luminescence, on produit des suspensions cellulaires avec les substances amplifiant la luminescence et l'on ajoute dans ces suspensions les substances déclenchant la

luminescence. Dans ce cas, non seulement les cellules émet-

tent un rayonnement, mais également la substance amplifica-

trice encore présente dans la solution. Il en résulte un rapport signal/bruit défavorable entre la lumière émise par

les cellules et la solution environnant ces cellules.

Un autre inconvénient de la technologie de la lu-

minescence consiste en ce que les cellules détachées, en

suspension dans la suspension, se distinguent par leur mor-

phologie des cellules qui adhèrent initialement (cellules adhérentes). Le point de départ des cultures cellulaires le plus utilisées actuellement est constitué par des types cellulaires qui croissent in situ en regroupant et forment des tissus correspondants. De telles cellules nécessitent, pour pouvoir se diviser et se multiplier, même in vitro, un substrat sur lequel la culture qui croît forme finalement un "gazon" en forme de couche. Si l'on détache une telle couche de culture cellulaire adhérente de la façon usuelle, c'est-à-dire par voie enzymatique, de son substrat, et qu'on

la met en suspension, la morphologie de ces cellules change.

Ainsi, elles s'arrondissent et prennent une forme sensible-

ment sphérique. Cet état diffère, morphologiquement et phy-

siologiquement, de celui dans lequel les cellules adhérentes ou même croissant in situ se trouvent normalement. Il en est de même pour des lignées cellulaires qui sont cultivées dès le début sous la. forme de cultures en suspension. Si l'on doit étudier le comportement de cellules adhérentes et que l'on veut ainsi énoncer des indications utilisables dans le cadre des techniques d'analyse de luminescence, il faut réa- liser chaque expérience de façon à se rapprocher le plus

possible de l'état in vivo des cultures cellulaires utili-

sées. Cela ne peut être obtenu actuellement dans une mesure

suffisante avec la technologie de la suspension.

En conséquence, la présente invention a pour objet de modifier un procédé du type précité de façon à pouvoir

effectuer des analyses de luminescence sur des cultures cel-

lulaires adhérentes, en captant seulement la lumière irra-

diée par les cellules, pour pouvoir obtenir ainsi des indi-

cations directes sur l'activité ou la vitalité cellulaire.

L'invention a en outre pour objet un dispositif pour mettre

en oeuvre un tel procédé.

On atteint cet objectif, selon l'invention, par les stades opératoires suivants: a) on cultive la culture cellulaire à examiner en la faisant adhérer à un support, b) on traite la culture cellulaire qui adhère au support par une première substance luminescente, c) on élimine la première substance non absorbée par la culture cellulaire adhérant au support, et d) on mesure le rayonnement émis seulement par la culture cellulaire après addition de la seconde substance

déclenchant la luminescence.

En cultivant la culture cellulaire,en la faisant adhérer à un support, cela a pour effet que les cellules présentent une morphologie qui correspond à un assemblage ou un tissu ayant crû in vivo. En traitant les cellules adhérant au support par la première substance luminescente, on 1' introduit dans la culture cellulaire, sans que les cellules se détachent en même temps, c'est-à-dire sans que

leurs propriétés morphologiques ou physiologiques varient.

La première substance non absorbée par la culture cellulaire peut être éliminée par lavage, de sorte que, si l'on ajoute la seconde substance déclenchant le rayonnement, il n'est produit de rayonnement que dans les cellules. Par suite, le

rayonnement émis et, par suite, mesuré, correspond exacte-

ment à l'activité ou à la vitalité des cellules, et l'on ne

fausse pas la mesure par un rayonnement naissant à l'exté-

rieur du groupement de cellules. Cela permet, par exemple, des mesures absolues très simples, sans qu'il y ait, par exemple, à effectuer des mesures de comparaison compensant

le bruit de fond. Dans le cas d'un dispositif selon l'in-

vention pour mettre en oeuvre le procédé, on prévoit un en-

semble de boites de Pétri pouvant être isolé de l'environ-

nement extérieur, dans lequel au moins un support peut être logé de façon amovible dans des conditions stériles, et le support logé, à au moins un exemplaire, peut être traité alternativement par des solutions nutritives, des solutions de lavage, la première substance luminescente, ainsi que la substance déclenchant la luminescence. On cultive la culture cellulaire à examiner sur le support et l'on effectue alors

tous les autres stades de traitement sur la culture cellu-

laire qui adhère fermement au support. On conserve ainsi les propriétés morphologiques en permanence. Il est en même temps possible, une fois une mesure effectuée, de continuer à cultiver la culture adhérant au support et éventuellement

d'effectuer d'autres mesures à un instant ultérieur.

Avec la culture cellulaire adhérant au support, on peut effectuer aussi, en outre, des tests de toxicité, de concentration, d'action et d'efficacité. Ainsi, on peut munir la structure cellulaire ou tissulaire qui adhère de substances toxiques à diverses concentrations, qui ont une

influence sur l'activité enzymatique ou sur la luminescence.

Par des mesures de comparaison, c'est-à-dire des comparai-

sons entre les cultures cellulaires sur des supports sans substances toxiques et de telles mesures avec des substances toxiques, on peut étudier très simplement l'influence de

telles substances au moyen du procédé ou du dispositif se-

lon l'invention.

Selon un mode d'exécution particulièrement avan-

tageux du procédé selon l'invention, on utilise comme sup-

port au stade a) une plaquette mince en matière plastique, en verre ou analogue, dont une face est cultivée avec une monocouche de culture cellulaire. Cela a pour avantage que

sur des plaquettes minces, dites "Cover Slips", les cellu-

les peuvent croître en une couche (dite monolayer ou mono-

couche). Par confluence, c'est-à-dire une disposition aussi dense que possible de cellules adhérentes comme monocouche

dans une culture, on obtient une structure cellulaire mono-

couche dense uniforme sur le support, qui d'une partadhère

fermement et, d'autre part, représente une source de rayon-

nement uniforme. On peut cependant effectuer aussi des me-

sures de luminescence-avec des cellules adhérant au support,

sans obtenir de confluence.

On obtient une adhérence particulièrement bonne à la surface du support, en appliquant d'abord la culture cellulaire à la surface du support et en lui donnant un certain temps, par exemple 3 minutes, pour se fixer à la

surface du support, puis en ajoutant une solution nutritive.

La culture cellulaire "nue" prend contact avec la surface de support dans ce court laps de temps et elle n'est alors pas éliminée par lavage par la solution nutritive (bouillon de culture) appliquée avec précaution par la suite, de sorte qu'il ne se produit de multiplication recherchée que

sur le support.

On y parvient particulièrement avantageusement en maintenant le support horizontal, en appliquant la culture cellulaire à la face supérieure et en la recouvrant de la solution nutritive. La multiplication des cellules a lieu en étuve d'incubation. Au bout de 2 à 3 jours, on obtient

la confluence.

On obtient une séparation particulièrement bonne

de la couche appliquée et de la solution nutritive, en in-

troduisant le support, à la suite du stade a), dans une so-

lution de lavage. Dans ce cas, la solution de lavage est constituée de façon appropriée, par une solution saline tamponnée au phosphate. Cela a pour avantage que la culture cellulaire est pourvue d'un environnement compatible avec

elle et bioadapté.

On peut aussi garantir une fixation permanente de la couche au support si, lors du processus de lavage, la face de croissance de la culture cellulaire est orientée en

permanence vers le haut.

Une mesure de luminescence particulièrement infor-

mative est possible du fait qu'après le stade a), mais avant

le stade b), on effectue un contrôle de la culture cellu-

laire adhérant au support. La couche monolayer (monocouche) présente sur la plaquette mince permet une observation, par exemple au moyen d'un microscope optique usuel, sans qu'il faille une préparation particulière pour cela. On peut par suite constater exactement l'occupation de la surface du

support avant la mesure de luminescence proprement dite.

On effectue l'introduction de la première sub-

stance luminescente dans la culture cellulaire du support

avec des précautions particulières et sans risque de sépa-

ration, du fait qu'au stade b) on recouvre le support d'un

liquide comportant la première substance.

De façon appropriée, cette première substance est,

dans ce cas, le luminol.

On obtient une élimination particulièrement appro-

priée de l'excès de première substance au stade c) en immer-

geant le support dans une solution de lavage et en éliminant par lavage la première substance, sans séparer ainsi les

cellules adhérentes.

On obtient un processus d'élimination particuliè-

rement approprié, n'influençant pas l'activité ou la vitalité de la culture cellulaire adhérant au support au stade c), du fait que la solution de lavage est la même que celle d'élimination par lavage de la solution nutritive. De

ce fait, la culture cellulaire adhérant au support est re-

çue après ce lavage dans le même milieu compatible avec elle et vital pour elle. Cela permet également de combler, par exemple dans le cas d'une automatisation du procédé,

certains temps morts en gardant le support dans cette solu-

tion. On peut obtenir une mesure particulièrement exacte et informative en plaçant au stade d) le support en forme

de plaque dans un récipient comportant une solution de me-

sure, la surface de croissance étant orientée vers l'appa-

reil de mesure photo-électronique. La "source de rayonne-

ment" correspond, par suite, exactement à la surface du

support sur laquelle croit la culture cellulaire, qui pré-

sente une distance constante à l'appareil photo-électroni-

que, ce qui permet un agencement de mesure particulièrement

simple à ajuster.

De façon particulièrement avantageuse, le milieu de mesure constitue le même milieu que le milieu de lavage pour l'élimination par lavage de la solution nutritive ou

pour l'élimination par lavage de la substance luminescente.

Ainsi, la culture cellulaire est, même pendant le processus

de mesure proprement dit, balayée par la solution avec la-

quelle elle était déjà en contact lors des stades prépara-

toires, de sorte que ce milieu ne peut exercer d'effet de

changement sur la culture cellulaire.

Dans le cas d'un procédé dans lequel on doit me-

surer l'effet d'une troisième substance ayant une influence sur la structure cellulaire, on la met particulièrement avantageusement en contact avant le stade b) avec la culture

cellulaire, puis l'on élimine cette substance par lavage.

Selon une autre variante du procédé selon l'in-

vention, dans laquelle on doit mesurer l'effet d'une troi-

sième substance exerçant une influence sur les structures cellulaires, on peut l'ajouter à la solution nutritive dès

le stade a).

Un dispositif selon l'invention comporte un en-

semble de boites de Pétri pouvant être isolé de l'environ-

nement extérieur, dans lequel au moins un support peut être logé de façon amovible dans des conditions stériles, et le support présent à au moins un exemplaire peut être traité alternativement par la solution nutritive, la solution de

lavage et la première substance.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du dispositif selon l'invention destiné à mettre en oeuvre le procédé, le support présent à au moins un

exemplaire a la forme d'une plaque mince de verre, de ma-

tière plastique ou analogue, que l'on peut faire passer en position horizontale sous une nervure de fixation d'une boite de Pétri, et l'ensemble de boites de Pétri comporte

plusieurs zones de réception de support reliées entre elles.

Cela permet de maintenir les supports en position horizon-

tale avec la couche de culture appliquée sur la face supé-

rieure, et de cultiver en même temps dans les mêmes condi-

tions plusieurs supports de ce type. Les différents supports qui comportent une couche de culture cellulaire identique

et homogène peuvent alors être traités par diverses sub-

stances, par exemple toxiques, de sorte que les mesures de comparaison qui sont alors effectuées sont particulièrement informatives, du fait qu'on est bien parti de couches de

culture cellulaire exactement identiques.

On va décrire à présent l'invention avec davanta-

ge de détails sur des exemples d'exécution non limitatifs, en regard du dessin annexé dont la figure unique représente de façon très schématique, une variante sélectionnée du procédé selon l'invention, que l'on met en oeuvre avec un

dispositif selon l'invention.

La boite de Pétri 10 représentée schématiquement sur la figure 1, qui appartient à un dispositif selon l'invention, comprend une cuve rectangulaire en matière plastique avec un couvercle (non représenté ici) qui la

recouvre. L'intérieur est subdivisé par une nervure longi-

tudinale 12 ne prenant pas toute la longueur, ainsi que plusieurs nervures transversales 14 qui en partent et ne s'étendent pas, non plus, sur toute la largeur, en plusieurs zones 18. Dans l'exemple de réalisation représenté ici, on

a représenté six zones 18, tandis que, dans d'autres exem-

ples de réalisation, on prévoit dix de ces zones. -

Chaque zone 1& est prévue pour loger un support 20.

On peut, dans ce cadre, faire passer chaque sup-

port 20 sous une nervure de fixation 16 faisant saillie de la nervure longitudinale 12, à peu près à mi-chemin entre deux nervures transversales 14, également en direction longitudinale, qui est suffisamment longue pour-retenir un

support 20 dans une zone 18, mais avec toutefois la possi-

bilité de retirer un support 20 d'une zone 18 en le saisis-

sant avec une pincette.

Dans l'exemple de réalisation précité d'une boite de Pétri à dix zones, elle a une longueur intérieure de

290 mm et une largeur intérieure d'environ 130 mm. La ner-

vure longitudinale peut aussi, à la différence de la réali-

sation décrite précédemment, s'étendre sur toute la lon-

gueur de la boite et la diviser en deux moitiés séparées de cinq zones chacune. Cela permet de réaliser des conditions d'essai et de contrôle en même temps dans un système fermé, en traitant les cellules d'une série par une substance d'essai, mais sans agir sur la série opposée. La hauteur d'ouverture de l'intérieur de la boite de Pétri est de18 mm la hauteur des nervures longitudinales ou transversales à partir du fond intérieur d'environ 15 mm. La longueur de la nervure de fixation est de 15 mm et elle ressort de la zone inférieure de la nervure longitudinale juste au-dessus du fond de la cuve, de sorte qu'un support qu'on a fait passer au-dessous est maintenu au voisinage du fond de la boite de Pétri. Cela garantit que, lorsque la boite de

Pétri est pleine, le support est toujours suffisamment cou-

vert de milieu et qu'en outre on peut contrôler la crois-

sance cellulaire, la boite étant fermée, au microscope à redressement. Dans l'exemple de réalisation à six zones 18 représenté sur la figure 1, on n'a représenté, pour des raisons de clarté, qu'une nervure de fixation 16 avec un support 20 bloqué au-dessous, mais il va de soi que les

cinq autres zones 18 sont munies de la même façon de ner-

vures de fixation 16 et peuvent recevoir un support 20.

La boite de Pétri 10 comporte un conduit 11 par lequel on peut introduire un milieu à l'intérieur, comme on

l'a indiqué par une flèche 26.

Lorsqu'on met en oeuvre le procédé, on applique sur un support 20 inséré, au moyen d'une pipette 22, une culture cellulaire comprenant des fibroblastes de souris

de la lignée L 929, comme on l'a indiqué par la flèche 24.

L'intérieur de la boite de Pétri 10 est ainsi vide. Si la

culture cellulaire doit croître dans des conditions stéri-

les, le couvercle non représenté ici est posé sur la boite de Pétri 10 et l'intérieur a été stérilisé préalablement avec les supports 20 déjà introduits. On retire alors le

couvercle (non représenté ici) dans des conditions stériles.

Au moyen de la pipette 22, on applique ensuite la suspen-

sion cellulaire sur le support 20. On attend ensuite envi-

ron 3 minutes que les cellules aient pris contact avec la

surface, puis l'on amène par le conduit 11 un milieu nutri-

tif (bouillon de culture), la proportion étant calculée de façon que le milieu nutritif recouvre la surface du support 20. Selon le milieu nutritif, on obtient déjà la confluence sur le support 20 au bout d'un jour et au plus tard au bout de deux jours. La confluence signifie une disposition aussi dense que possible de cellules qui adhèrent ou cellules

adhérentes sous forme de monocouche en culture.

On retire avec précaution de la boite de Pétri 10 avec une pincette, un support 20 sur lequel s'est ainsi développée une culture cellulaire 28 de cellules adhérentes appelé aussi "Cover Slip" (CS), et on l'introduit dans une autre boite de Pétri 30 qui est réalisée, en principe, de la même façon que la boîte de Pétri 10, de sorte qu'on uti- lise, dans cette mesure, des références identiques. La boîte de Pétri 30 est ainsi remplie d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS = phosphate buffered saline),

qui sert de solution de lavage pour l'élimination par la-

vage de la solution nutritive de la culture cellulaire 28.

On fait ce faisant passer le support 20 sous la nervure de fixation 16 de la botte de Pétri 30 de façon que la surface de développement de la culture cellulaire 28 soit dirigée vers le haut. En faisant tourner avec précaution la boite de Pétri 30 ou le support 20, on lave la surface d'adhérence des cellules. On peut également effectuer le lavage en faisant passer le tampon de lavage PBS par la botte de Pétri , comme on l'a indiqué par les flèches 32 et 34. Du fait

que les nervures longitudinales et transversales 12, res-

pectivement 14, ne s'étendent pas sur toute la boîte de Pétri 30, on peut laver plusieurs supports en même temps

(soit six supports 20, dans l'exemple de réalisation repré-

senté ici).

Avant un autre traitement, on fait passer la boîte de Pétri fermée 30 sous un microscope optique 36, pour contrôler la constitution et la structure de la culture

cellulaire 28. On voit ainsi si la confluence est effecti-

vement atteinte, et si seule la culture souhaitée s'est

établie sur le support 20.

La dimension de la boîte de Pétri 30 est choisie

de façon qu'on puisse l'introduire directement dans des mi-

croscopes optiques courants comportant un dispositif de re-

dressement, de façon-qu'on puisse effectuer ces opérations

de contrôle dans des conditions stériles.

Au cours d'un autre stade opératoire, on retire le support 20 comportant des cellules qui adhèrent de la botte de Pétri 30 et on l'introduit dans une autre boîte de Pétri 40, qui est réalisée de la même façon que les bottes

de Pétri 10 et 30 décrites précédemment, en ce qui concer-

ne les dimensions et le compartimentage. Dans ce cas également, on introduit le support 20

sous la nervure de fixation 16, la face comportant les cel-

lules adhérentes étant dirigée vers le haut.

On remplit ensuite la botte de Pétri 40 d'une so-

lution de luminol (hydrazide de l'acide 3-aminophtalique) à 0,01 %, de façon que la face de culture du support 20 soit recouverte. Pour cela, on peut introduire la solution de luminol entièrement automatiquement dans la botte de Pétri , comme on l'a indiqué par une flèche 42, de sorte que ce

traitement aussi peut avoir lieu de nouveau dans des condi-

tions stériles.

Le temps d'action du luminol est d'environ 1 à 3

minutes. Selon la culture cellulaire ou les conditions ex-

périmentales, on peut aussi utiliser, bien entendu, d'autres

concentrations de luminol.

Après le passage de la durée d'action, on retire le support 20 de la botte de Pétri 40 et on le transfère

dans une autre botte de Pétri 50 dans laquelle est intro-

duite une solution - tampon de lavage PBS chauffée à environ 37 C, et dans laquelle le luminol en excès, c'est-à-dire non absorbé par la culture cellulaire 28, est éliminé par lavage. On peut encore une fois effectuer cette opération, comme on l'a décrit précédemment, en faisant pivoter la botte de Pétri 50 ou le support 20 ou encore, comme on l'a représenté sur la figure 1, en faisant passer à travers la boite de Pétri 50 le tampon de lavage PBS, comme on l'a

indiqué par les flèches, respectivement 52 et 54.

On prépare alors le support 20 de façon qu'on

puisse y effectuer la mesure proprement dite.

Pour cela, on introduit le support 20 dans une cuvette de quartz 60 qui comporte des rainures de guidage

verticales 62 entre lesquelles on peut introduire le sup-

port 20.

Les rainures de guidage 62 y sont placées au voi-

sinage d'une paroi transversale 63 de la cuvette 60. La face du support 20 sur laquelle on cultive les cellules est

dans ce cas, orientée vers une face avant ou paroi anté-

rieure 65 de la cuvette 60.

La cuvette 60 est remplie de milieu de mesure qui

est de nouveau, dans le cas présent, la même solution sa-

line tamponnée au phosphate (PBS) que celle qu'on a déjà

décrite et qui constituait une solution de lavage.

Au fond de la cuvette se trouve un petit barreau aimanté recouvert de Teflon, ce qu'on appelle un "agitateur", qui est mis en rotation par l'intermédiaire d'un dispositif d'agitation non représenté placé audessous de la cuvette, pour agiter le milieu de mesure. Le processus d'agitation met la substance déclenchant la luminescence immédiatement et uniformément en contact avec les cellules. La cuvette de mesure 60 présente une longueur de 40 mm, une largeur ou hauteur de 50 mm et elle a une capacité d'environ 100 ml de liquide. La cuvette est déposée dans une chambre de mesure non représentée ici, complètement opaque, sur un socle qui

est placé sur un disque rotatif. La chambre de mesure pré-

sente ici les mesures intérieures suivantes: longueur et largeur, 290 mm chacune environ, hauteur environ 265 mm. On prévoit à distance de la cuvette un photomultiplicateur 68 qui capte le rayonnement provenant de la cuvette 60, ce qui est indiqué par une flèche 66. La cathode photosensible du photomultiplicateur est ici refroidie à -30 C. Les photons incidents sont transformés en impulsions de tension par le photomultiplicateur 68, lesquelles sont amplifiées par ut

* système électronique 70 monté en aval et peuvent être mémo-

risées et traitées par un calculateur 72 raccordé. Les ré-

sultats peuvent sortir sous forme graphique ou numérique grâce à une imprimante 74 sur un support d'impression

de sortie 76.

Lors de la mesure elle-même, au bout d'une pério-

de préalable de longueur choisie à volonté selon la problé-

matique, pendant laquelle l'objet à mesurer, c'est-à-dire les cellules adhérentes sur le support 20, n'est soumis à

aucune influence, on injecte de l'extérieur 1 ml d'une so-

lution de peroxydase à 1 % par un conduit d'amenée opaque, comme on l'a indiqué par la flèche 64, dans la cuvette 60

se trouvant dans la chambre de mesure. La peroxydase dé-

clenche la réaction d'oxydation qui est accompagnée d'une émission lumineuse, ce qui veut dire que la luminescence à mesurer apparaît alors. L'intensité du rayonnement dépend

de la quantité de luminol absorbée par les cellules adhé-

rentes du support 20, laquelle dépend elle-même de l'acti-

vité ou de la vitalité des cellules. Cela permet de tirer directement, de l'intensité de rayonnement, des conclusions

sur l'activité ou la vitalité des cellules.

On peut choisir une durée quelconque pour le temps de mesure. Du fait quecependant l'émission de photons mesurable décroît relativement rapidement, il est judicieux de limiter la durée de mesure à 5 minutes au maximum, la

durée préalable étant au plus d'environ 2 minutes.

On mesure (en coups par seconde = cps) l'inten-

sité initiale et la cinétique de l'émission de photons après avoir ajouté la peroxydase. On peut aussi utiliser

d'autres enzymes ou groupes d'enzymes appropriés.

Dans le déroulement opératoire schématique décrit

précédemment, on a décrit la préparation de la culture cel-

lulaire seulement, de sorte que la mesure finale donne des

indications sur la culture cellulaire en tant que telle.

Cela ne représente cependant qu'un petit domaine

d'application du procédé selon l'invention. Un autre domai-

ne d'application essentiel consiste en l'examen de la toxicité des composés qui ont été mis en liaison avec la

culture cellulaire. Cela signifie que des substances toxi-

ques diminuent l'activité ou la vitalité des cultures cel-

lulaires, ce qui entraîne une émission de photons réduite

lors d'une mesure de luminescence.

Si l'on doit tester l'effet d'une substance toxi-

que sur la culture cellulaire 28, il y a diverses possibi-

lités de faire agir cette substance toxique.

Une première possibilité consiste à introduire un support 20, après l'avoir retiré de la boite de Pétri 30, c'est-à-dire après avoir contrôlé la densité de croissance au moyen d'un microscope 36, et avant de l'introduire dans la boite de Pétri 40 avec du luminol, dans une autre boite de Pétri de même configuration, non représentée ici, dans laquelle on le recouvre alors de la solution de la substance à tester. La durée d'action dépend de la toxicité supposée ou de la problématique correspondante. Lors de l'essai, par exemple de la toxicité du méthanol sur les fibroblastes de souris de la lignée L 929 précitées, on choisit des durées

d'action comprises entre 1 et 5 minutes, en testant diver-

ses concentrations de méthanol (100,90,80,70,40,10 et 1 %).

Après le passage de la durée d'action, on lave de nouveau le support 20, comme on l'a décrit précédemment, dans un tampon PBS et ensuite on l'introduit dans la boite de Pétri

pour le recouvrir de luminol.

Au cours du processus de mesure proprement dit, on mesure alors dans la cuvette 60 d'une part,la culture

cellulaire 28 sans l'influence du méthanol, substance toxi-

que, puis les autres échantillons traités par les diverses concentrations.

Par la diminution de chaque photo-émission res-

pective, on peut alors déterminer l'influence ou la toxici-

té. Les mesures sont, par suite, très informatives, du

fait que la culture des cellules adhérentes sur les sup-

ports 20 est, comme on l'a décrit précédemment en liaison avec les boites de Pétri 20 ou 30, possible dans exactement les mêmes conditions, de sorte qu'il suffit alors de tenir compte des paramètres des différentes doses toxiques ou

durées d'action.

Ce procédé convient comme test rapide pour déter- miner les limites d'action ou de toxicité des substances d'essai utilisées, par exemple des substances polluantes, des médicaments, etc.

Une autre possibilité pour introduire les subs-

tances à tester consiste à les ajouter aux cellules dès le début de leur culture. Dans ce cas, on ajoute la substance d'essai à la solution nutritive que l'on a amenée, comme on

l'a décrit précédemment, au cours du premier stade prépara-

toire, dans la boîte de Pétri 10 au moyen du conduit 11.

Les mesures d'émission effectuées donnent alors des infor-

mations riches sur l'influence de ces substances sur la vi-

tesse de croissance ou la vitalité des cultures cellulaires.

Cette possibilité s'offre en particulier pour des essais à

long terme ou de longue durée et surtout pour la détermina-

tion des limites d'action ou de toxicité de substances

d'essai très diluées.

Lors des mesures d'émission, on mesure alors

l'intensité initiale et la cinétique de l'émission des pho-

tons après addition de la peroxydase. La comparaison entre

des cellules vitales (c'est-à-dire non influencées) et des.

cellules ayant subi une influence toxique (ici, diverses concentrations de méthanol) donne une intensité initiale différente, l'intensité de rayonnement des cellules vitales étant chaque fois nettement supérieure à celle de cellules qui ont été affaiblies ou tuées. On a pu aussi, pour des cellules tuées, mesurer encore un certain rayonnement que

l'on explique par le fait que toutes les protéines des cel-

lules tuées ne sont pas dénaturées immédiatement et

peuvent donc encore fixer certaines quantités de luminol.

Le procédé décrit précédemment en regard de la représentation schématique de la figure 1 utilisait, au cours des différents stades de traitement, différentes

bottes de Pétri 10, 30, 40, 50. Cette subdivision en diver-

ses boites de Pétri convient en particulier pour des expé-

rimentations scientifiques qui doivent se dérouler dans di- verses conditions expérimentales présentant de nombreuses variantes.

Si l'on doit appliquer le procédé pour des mesu-

res de routine des influences de substances déterminées sur des cultures cellulaires, par exemple l'effet d'un poison

ou d'un médicament sur des cellules humaines, on peut uti-

liser, au lieu des diverses bottes de Pétri, une seule bo1te

dans laquelle on effectue alors successivement les diffé-

rents stades. Comme on l'a décrit précédemment, les bottes de Pétri 10, 30, 40 et 50 ont toutes la même structure, de sorte que les activités qui s'y déroulent peuvent aussi être mises en oeuvre dans une seule botte de Pétri. Dans ce cas, la botte de Pétri est alors munie des raccordements

correspondants par lesquels on peut amener ou évacuer suc-

cessivement le bouillon de culture lors de la culture, puis

les diverses solutions de lavage ou solutions de luminol.

Il suffit alors de transférer le support dont la préparation

à la mesure est achevée dans une cuvette de mesure, ce pro-

cessus pouvant aussi avoir lieu complètement automatique-

ment ou dans des conditions stériles, de sorte qu'on peut mettre en oeuvre le procédé entièrement automatiquement

avec le dispositif selon l'invention.

Après l'achèvement d'une mesure de luminescence, la culture cellulaire 28 continue à adhérer au support 20,

de sorte qu'il est possible de retirer de nouveau ce sup-

port de la cuvette 60 après la mesure, de le laver, par exemple, avec le tampon de phosphate et de le réintroduire

dans une solution nutritive ou une solution-tampon, c'est-

à-dire que la culture cellulaire n'est pas perdue après une mesure d'émission, mais on peut l'utiliser à d'autres fins

de recherche ou encore simplement la conserver.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détermination de la luminescence de

cultures cellulaires, dans lequel on les munit d'une pre-

mière substance luminescente amplifiant la luminescence na-

turelle, ensuite on les traite par une seconde substance déclenchant la luminescence et l'on capte la luminescence photo-electroniqueent, caractérisé en ce que: a) on cultive la culture cellulaire à examiner en la faisant adhérer sur un support, b) on traite la culture cellulaire adhérant au support par la première substance luminescente, c) on évacue la première substance excédentaire non absorbée par la culture cellulaire adhérant au support, et d) on mesure le rayonnement émis seulement par la culture cellulaire après addition de la seconde substance

déclenchant la luminescence.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce qu'on utilise comme support, au stade a), une pla-

quette mince de matière plastique, verre ou analogue dont on cultive une face avec une monocouche (monolayer) de

culture cellulaire.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, carac-

térisé en ce qu'on applique à la surface du support d'abord seulement la culture cellulaire et l'on donne à celle-ci un certain délai, de préférence environ 3 minutes, puis l'on

ajoute une solution nutritive.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on maintient le support horizontal, en ce qu'on applique la culture cellulaire sur la face supérieure, et

en ce qu'on recouvre le support de la solution nutritive.

5. Procédé selon la revendication 1 ou l'une des suivantes, caractérisé en ce qu'on immerge le support dans

une solution de lavage à la suite du stade a).

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la solution de lavage est une solution saline

tamponnée au phosphate.

7. Procédé selon la revendication 5 ou l'une des

suivantes, caractérisé en ce que la face du support sur la-

quelle croît la culture cellulaire est chaque fois orientée

vers le haut, ou bien est immergée verticalement.

8. Pocédé selon la revendication 1 ou l'une des suivantes, caractérisé en ce qu'à la suite du stade a), mais avant le stade b), on effectue un contrôle de la

culture cellulaire adhérant au support.

9. Procédé selon la revendication 1 ou l'une des suivantes, caractérisé en ce qu'au stade b) on recouvre la

culture cellulaire adhérant au support d'un liquide compor-

tant la première substance luminescente.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la première substance est du luminol ou une autre

substance provoquant et/ou amplifiant la luminescence.

11. Procédé selon la revendication 1 ou l'une des suivantes, caractérisé en ce qu'au stade c), on immerge le support dans une solution de lavage et on retire par lavage la première substance dans celle-ci, dans la mesure o elle n'a pas été fixée par les cellules, sans détacher ainsi les

cellules adhérentes.

12. Procédé selon la revendication 1-1, caractéri-

sé en ce que, lors du processus de lavage, on immerge le support en forme de plaque horizontalement, la couche de

culture cellulaire étant tournée vers le hautou verticale-

ment.

13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, ca-

ractérisé en ce que la solution de lavage est la même que

celle destinée à retirer par lavage la solution nutritive.

14. Procédé selon la revendication 1 ou l'une des suivantes, caractérisé en ce qu'au stade d) on place un support en forme de plaque dans un récipient comportant une solution de mesure, la surface de croissance de la culture

cellulaire étant orientée vers un appareil de mesure photo-

électronique.

15. Procédé selon la revendication 14, caractéri-

sé en ce que la solution de mesure est le même milieu que le milieu de lavage pour retirer par lavage la solution

nutritive ou la substance luminescente.

16. Procédé selon la revendication 1 ou l'une des suivantes, dans lequel on mesure l'effet d'une troisième substance ayant une influence sur la structure cellulaire, caractérisé en ce qu'avant le stade b), on met la culture

cellulaire qui adhère en contact avec la substance influen-

çante, et en ce qu'on élimine ensuite cette substance par lavage.

17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15

dans lequel on mesure l'effet d'une troisième substance

ayant une influence sur la structure cellulaire, caractéri-

sé en ce qu'au stade a), on ajoute à une solution nutritive

pour cultiver la culture cellulaire la substance influen-

çante.

18. Dispositif pour mettre en oeuvre le procédé

selon l'une des revendications 1 à 17, comportant un dispo-

sitif à cuvette (60) pour recevoir un échantillon compor-

tant une substance luminescente, une seconde substance dé-

clenchant la luminescence pouvant être introduite dans le

dispositif à cuvette (60), ainsi qu'un dispositif photomul-

tiplicateur (68, 70, 72, 74, 76) pour capter, mesurer et

traiter le rayonnement émanant de l'échantillon, caractéri-

sé en ce qu'il est prévu au moins un ensemble de boites de

Pétri (10, 30, 40, 50) pouvant être isolé du milieu exté-

rieur dans lequel au moins un support (20) peut être logé de façon amovible dans des conditions stériles, et en ce que le support (20) logé au moins à un exemplaire peut être

traité alternativement par la solution nutritive, la solu-

tion de lavage, la première substance luminescente.

19. Dispositif selon la revendication 18, carac-

térisé en ce que le support (20) à au moins un exemplaire

présente la forme d'une plaquette mince de verre, de ma-

tière plastique Qu analogue, que l'on peut faire passer, en position horizontale, sous une nervure de fixation (16)

d'une boîte (20, 30, 40, 50), et en ce que la botte compor-

te plusieurs zones de réception de support (18) reliées

entre elles.