WO1990004016A1 - Optrodes a enzymes immobilises - Google Patents

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WO1990004016A1
WO1990004016A1 PCT/FR1989/000531 FR8900531W WO9004016A1 WO 1990004016 A1 WO1990004016 A1 WO 1990004016A1 FR 8900531 W FR8900531 W FR 8900531W WO 9004016 A1 WO9004016 A1 WO 9004016A1
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WO
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enzyme
film
enzymatic
substance
fluorescent
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PCT/FR1989/000531
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English (en)
Inventor
Universite De Paris Vii
Claude Burstein
Jean-Louis Fave
Roger Poisson
Jean-Charles Gayet
Original Assignee
Univ Paris Vii
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C12Q1/003—Functionalisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to optical microprobes with immobilized enzymes (enzymatic optrodes), in particular portable and automated, for the assays of effectors of the respiratory chain (which are several in number), oxidases (several hundred), and NAD + or NADP + dehydrogenases (several thousand), the dehydrogenases being, for the assay, coupled to the respiratory chain.
  • the invention also relates to the corresponding assay methods. Many applications of these optrodes are envisaged, in various biological environments, in medicine, pharmacy, veterinary medicine, food industry, water treatment and fine chemistry.
  • effectors includes both the specific substrate (s) of each enzyme as well as the specific inhibitor (s), the specific activator (s), the specific inactivating substances involved in the enzymatic reactions involved, as well as the products resulting from said reactions.
  • Clark electrodes for measuring oxygen associated with the abovementioned enzymes, immobilized in a gelatin film treated with glutaraldehyde, is already known, having been the subject of French patent No. 2,576,318 filed on January 18, 1985 (see also, European patent n ° 193 420 filed on January 17, 1986, American patent application n ° 06/819 199 filed on January 15, 1986 and Japanese patent application KOKAI n ° 170 648/1986, filed on January 18, 1986).
  • the method used in this patent is an amperometric method with imposed potential.
  • the immobilized enzymes are, in this case, those of the chain
  • the volume of the sample to be assayed is between 1 and 5 ml. It is necessary to use industrially heavy equipment, weighing several kilograms, which also requires the environment of a research or control laboratory (electrical and fluid supply, recording, small laboratory equipment), as well as a Qualified staff.
  • the immobilized enzymes can be reused more than 1000 times, the drawbacks of such devices are numerous: weight, high cost, and also the fact that they cannot be used directly by users such as example, doctors or patients. The same applies in cases where it is necessary to follow very quickly and “continuously" the evolution of a substance, for example, in sports medicine, for monitoring the evolution of L-lactate in athletes on field.
  • the invention offers the additional advantage of allowing the dosing of many different substrates with the same basic device with which is associated a set of elements allowing specific measurement and each carrying one of the enzymes and / or the respiratory chain immobilized.
  • the element which carries the appropriate enzyme for this assay and which can be for single use or reusable will be chosen from this set, each optrode comprising an enzyme system specific for the substance to be assayed.
  • the present invention therefore relates to a series of optical microprobes with enzymes for the assays of effectors, contained in biological media, of the respiratory chain, of oxidases and dehydrogenases with
  • the invention is characterized in that the enzymatic material is immobilized in crosslinked form and is associated with luminescent material (fluorescent or phosphorescent), said enzymatic material and said luminescent material together constituting a composite material or film which is associated with means to detect the increase in the emission of luminescence or the increase in the lifetime of the excited states responsible for this emission, these increases being caused by the consumption of oxygen during the catalytic transformation, by the enzyme, of the substance to be assayed (phenomenon of extinction of luminescence by oxygen), the sample to be assayed having been brought into contact with the enzymatic material, said increase in the emission or the lifetime of the excited states being a representative parameter the concentration of the substance to be dosed.
  • luminescent material fluorescent or phosphorescent
  • an enzymatic optical microprobe according to the invention constitutes what, in the technique, is called "enzymatic optrode".
  • an optrode is an enzymatic sensor with luminescent material (fluorescent or phosphorescent).
  • luminescent material fluorescent or phosphorescent.
  • fluorescence and fluorescent material
  • the term “respiratory chain” is intended to mean a multienzymatic membrane system which functions globally as an oxidase transforming stoichiometrically and specifically a substrate using oxygen.
  • the respiratory chain comes from immobilized bacteria, immobilized microorganisms, immobilized mitochondria, or their immobilized membrane preparations. These bacteria and these microorganisms have, in certain cases, been previously cultivated on a medium the composition of which has resulted in a modification of the synthesis of the flavoprotein corresponding to the compound to be assayed, which increases the specificity of the assay.
  • the immobilized respiratory chain can be used alone (for a dozen substrates) or allow the NADH and / or NADPH formed by dependent NAD and / or NADP dehydrogenases (for a thousand substrates) to be determined, which generally amounts to use enzyme systems behaving like oxidases (consuming oxygen). According to the invention, any oxidase capable of specifically transforming a substrate in the presence of oxygen can be used.
  • the enzymatic material is immobilized by covalent crosslinking by bridging agents, which are chosen in particular from glutaraldehyde, carbodiimides, sodium N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate (SPDP) and azides.
  • bridging agents chosen in particular from glutaraldehyde, carbodiimides, sodium N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate (SPDP) and azides.
  • the enzymatic material is immobilized to constitute the enzymatic film in the presence of at least one inert protein in excess, such as serum albumin, hemoglobin and / or gelatin.
  • the aqueous sample of approximately 10 ⁇ l, is deposited on the layer of immobilized enzymatic material, separated from the fluorescent material by a hydrophobic layer, permeable to oxygen.
  • the layer of fluorescent material contains an active substance sensitive to oxygen adsorbed on a support, separated from the enzymatic material by a hydrophobic film and permeable to oxygen.
  • the support advantageously consists of silica, alumina, alumina silicate (kaolin) or resins obtained by copolymerization of styrene and divinylbenzene and known under the name of Amberlite.
  • the hydrophobic film permeable to oxygen, it is for example constituted by a polyolefin, such as polypropylene, or by a fluoropolymer, such as polytetrafluoroethylene (PTFE), also known under the name of Teflon, or by a resin.
  • silicone for example polydi ethylsiloxane.
  • the active fluorescent substance is directly formed in a thin layer, for example, by sublimation, by evaporation (under vacuum or from a solvent).
  • the hydrophobic film or layer can be either added or formed on site from solutions, dispersions or aerosols, the latter case being particularly suitable for PTFE.
  • the active fluorescent substance is trapped in a polymeric film, for example, in a film of the silicone resin type.
  • the active fluorescent substance is packaged in the form of microcapsules, microemulsions or liposomes, and it is then found within the enzymatic material.
  • the active fluorescent substance is dissolved directly in the inert protein constituting the enzymatic film.
  • a light opaque film can be incorporated. This film can be interposed for example, between two of the layers of the structure, attached above the composite material or else be an integral part of one of the layers (for example in the form of an opaque, hydrophobic and gas-permeable film).
  • the active fluorescent substance is chosen for example from the perylene family:
  • the active substance is perylene 3,9-isobutyl dicarboxylate, (compound for which:
  • fluorescent agents can be used to increase the sensitivity to oxygen, or to modify the wavelength of fluorescence emission or that of its excitation.
  • the fluorescent enzyme composite material can be placed on a transparent support plate.
  • the enzyme optrode according to the invention comprises a support having a recess intended to receive the composite material, possibly on its support plate, said support comprising optical paths for the excitation of the fluorescent substance and the emission of fluorescence, the composite material constituting a removable measuring element, disposable after use, or reusable, several measuring elements of this type being able to be successively associated with the support.
  • the optrode according to the invention comprises a transparent support, on which the composite material is disposed, and a circulation tank attached against said support, so that the sample to be assayed enters said tank , comes into contact with the enzyme layer of the film and then leaves said tank.
  • the excitation and fluorescence emission beams can be transmitted via an optical fiber.
  • the detection means they advantageously consist of: excitation means, intended to excite the fluorescent substance and arranged upstream of the composite film; a first optical filter interposed between said excitation means and the composite film, and intended to improve the selectivity of the excitation wavelength (.); - a photodetector intended to capture the emission of fluorescence, arranged downstream of the composite film; a second optical filter interposed between the composite film and said photodetector, and intended to improve the selectivity of the fluorescence wavelength ( ⁇ -); - Detection and amplification means arranged at the output of said photodetector; means for digital processing of the analog signal supplied by the detection and amplification means; display or peripheral control means controlled by the digital processing means.
  • the present invention also relates to a method for the enzymatic assay of effectors, contained in biological media, of the respiratory chain, oxidases and dehydrogenases with NAD or NADP, the latter being, for the assay, coupled to the respiratory chain.
  • This process is characterized by the fact that the enzymatic material is immobilized in the form of a crosslinked film, and it is associated with a luminescent material (fluorescent or phosphorescent); the sample containing the substance to be assayed is applied to the enzyme material; the increase in the luminescence emission or the increase in the lifetime of the excited states which is caused by the consumption of oxygen during the catalytic transformation, by the enzyme, of the substance to be determined, is detected increase being a parameter representative of the concentration of the substance to be assayed.
  • a luminescent material fluorescent or phosphorescent
  • the optrode according to the present invention is applicable in medicine (portable tests in a hospital environment, tests in general or specialized medical practices, home tests by patients themselves), pharmacy, veterinary medicine, food industry, water treatment, ecotoxicology, fine chemistry, space technologies and others.
  • Figure 1 is a schematic sectional view, on an enlarged scale, of an immobilized enzyme optrode, thermostatically controlled, according to a first embodiment of the invention
  • Figure 2 is a view, on an enlarged scale, of detail D of the optrode of Figure 1, which shows the composite material or film (enzyme material and fluorescent material)
  • - Figure 3 is an exploded perspective view of
  • Figure 4 is a schematic sectional view on an enlarged scale of an immobilized enzyme optrode, thermostatically controlled, according to a second embodiment of the invention
  • Figure 5 is a view, on a still enlarged scale, of the detail D of Figure 1 or 4
  • Figure 6 is an exploded perspective view of the optrode of Figure 4
  • - Figures 7 and 8 are detailed views similar to Figures 2 and 5, showing alternative enzymatic and fluorescent composite material that can be used in the optrode according to the embodiment shown in Figures 1 and 4
  • - Figure 9 is an opto-electronic circuit diagram of an optrode of the present invention measuring variations in luminescence intensity
  • - Figure 10 is an opto-electronic circuit diagram of an optrode of the present invention measuring the variations in lifetime of the excited states
  • Figure 11 is a calibration curve obtained with 1 Optrode of Figure 1 or Figure 4.
  • the optrode 1 comprises a support 2, made for example of brass and having the shape of a parallelepipedal assembly, with two equal cut sides formed along two lower parallel edges, the support 2 being considered in the measurement position, such that shown in the drawing.
  • the support 2 is delimited by an upper wall 3, by a lower wall 4, by two opposite lateral walls 5 (not shown in the sectional view), perpendicular to the preceding ones, and, finally, by two opposite parallel walls 6, which are perpendicular to the upper wall 3 by being attached to it, and which are connected to the lower wall 4 by two oblique walls 7.
  • a central recess 8 is formed, delimited by a bottom 9 and by a cylindrical side wall 10. Furthermore, in the optrode holder 2, there are formed, in the median transverse plane parallel to the side walls 5, two symmetrical optical paths 11 and 12, both emerging side by side in the bottom 9, each starting from an oblique wall 7.
  • a support plate 13 transparent or translucent, made, for example, of poly (methacrylate methyl)
  • a double-sided adhesive film 14 (for example Scotch 3M), of the same shape as the support plate 13, the lower face 14a of which is fixed on the upper face of the support plate 13, and the other face 14b of which receives fluorescent material 15;
  • the latter is constituted by grains, for example of silica with an average particle size of 15 m, on which is adsorbed an active fluorescent substance constituted, for example, by isylene 3,9-isobutyl dicarboxylate, said grains being collected above the central part of the recess 8 • ;
  • the fluorescent enzymatic composite film 18 (FIG. 2), which is constituted by the enzymatic layer 17, the hydrophobic protective film 16, the opaque film 16a. and the fluorescent material 15, and which is held, by the adhesive film 14, on the support plate 13, advantageously forms with the latter, a measuring element which can be part of a set of measuring elements, differing from each other others by the nature of the enzyme used to constitute layer 17.
  • Such a measuring element is, prior to each dosing, introduced into the recess 8 of the support 2, and it is held in said recess 8 by a ring 19, made for example of brass, with an outside diameter corresponding substantially to the diameter of the support plate 13.
  • the composite film 18 has a total thickness of a few hundred .m, each layers 14, 15, 16, 16a. and 17 having a thickness ranging from 10 ⁇ tm to 500 m.
  • This composite film 18 on its support is in particular in the form of a pellet of approximately 10 mm in diameter, which can be for single use and can be quickly replaced or reused.
  • the excitation of the fluorescent material 15 could also be carried out by a diode-laser, if the excitation wavelength of the fluorescent substance is greater than 650 nm.
  • a two-channel demodulation of the detected signal is provided, one of the two channels making it possible to control the phase of the demodulator 124. This gives simultaneous access to the intensity of the signal and , from the phase shift measurement, to the lifetime of the excited states.
  • the digital processing data 25 can also be used to control various peripherals or actuators such as, for example, printer, pump, sampler 28.
  • FIG. 1 there has also been shown, on the free surface of the enzymatic layer 17, a drop 28 of a sample to be assayed, the optrode 1 in fact making it possible to assay such samples of very small volume, from 1 order of the drop, approximately 10 ⁇ l, of which it is not necessary to measure the exact volume, since concentrations are determined.
  • the specific substance to be determined depends on the nature of the enzyme which is immobilized in layer 17, and which is, as indicated above, the respiratory chain, an oxidase or a dehydrogenase a NAD + or NADP +, associated for the assay, with the respiratory chain.
  • the specific substance to be assayed is catalytically transformed by the enzyme by consuming oxygen, this reduction in oxygen increasing the emission of the fluorescent substance.
  • an immobilized enzyme optrode incorporating for this purpose a flow cell 129, suitable for dosing in continuous flow of biological substances. during fermentation for example.
  • This optrode can be integrated into the opto-electronic assembly diagram of Figures 9 and 10.
  • This last optrode has a parallelepiped shape.
  • a central recess 131 is formed, delimited by a bottom 132 and by a cylindrical side wall 133.
  • two oblique channels open respectively 134 and 135, s opening both in opposite side walls 136a, 136b of the flow cell 129.
  • the channel 134 constitutes the inlet channel of the sample containing the substance to be dosed, and the channel 135, the outlet channel.
  • all around the recess 131 is formed in the wall 130, a groove 137 intended to receive an O-ring 138 whose role is indicated below.
  • the wall 130 also includes four corner holes 139 whose role is also indicated below. On the wall 130, is reported a support 102 in
  • Plexiglas in the form of a rectangular plate, at the angles of which through holes 140 are made, in correspondence with the holes 139, for the passage of screws 141 used for assembling the support 102 on the circulation tank 129, said screws 141 being received in the holes 139 in the assembled position of 1 Optrode 101.
  • a composite film 118 is applied, constituted, as can be seen for example in FIG.
  • a film 115 of fluorescent material formed in this case, by a perylene derivative trapped in a hydrophobic silicone matrix, and by a crosslinked enzymatic film 117, the film 115 lying against the support 102, and the enzymatic film 117, turned on the side of the sample to measure 128.
  • an opaque layer 116a permeable to oxygen can be inserted between the film 115 of fluorescent material, and the enzymatic film 117.
  • the sample 128 enters through the channel 134, circulates in the recess 131 where it is in contact with the enzyme layer 117, and it exits through the channel 135.
  • the seal is ensured by the O-ring 138
  • Means for circulating the samples and thermostation means are provided.
  • the excitation (,) and fluorescence emission ( ⁇ _) waves have also been shown diagrammatically. The latter are advantageously transmitted via a multi-strand optical fiber in Y 142 of about 5 mm in diameter, for example.
  • an optical fiber as just described, can also be used in the case of the optrode 1 shown in FIG. 1, by replacing the channels 11 and 12, by a channel perpendicular to the bottom 9 of the central recess 8 and joining this bottom 9 to the bottom wall 4 of the optrode.
  • a variant 218 of the composite films 18, 118 which consists of an enzyme layer 217, formed, for example, by crosslinked serum albumin, in which the enzymes are trapped, said layer 217 also containing liposomes with a diameter of the order of 100 nm trapping a fluorescent substance 215.
  • an opaque film 216a. can be placed above the enzyme film 217 and, given its position, must be permeable to the substrate to be measured 228 and permeable to oxygen.
  • FIG. 8 another variant 318 of the composite films 8, 118 and 218 is shown where the luminescent substance is dissolved directly in the enzymatic film 317.
  • films of the type of films 18 and 218, as just described can be used in an optrode of the type shown in FIG. 4, in which case the opaque films respectively '16a and 216a are not necessary.
  • the film 118 as described with reference to FIG. 4, could just as well be incorporated into an optrode of the type shown in FIG. 1, in which case it may be added, between the films 115 and 117, a film opaque 116a., permeable to oxygen.
  • EXAMPLE 1 Preparation of a fluorescent measuring element as described with reference to Figures 1 to
  • a double-sided adhesive film (Scotch 3M) (film 14) is glued, by its face 14a., To the support plate 13 in Plexiglas, as shown in FIG. 3.
  • the mask is removed, and it is replaced by another mask, with a diameter of 6 mm, through which is sprayed sparingly and in several times, an aerosol of PTFE. After spontaneous drying, the hydrophobic film 16 of PTFE intimately covers the silica grains on which the perylene dibutyrate is adsorbed.
  • EXAMPLE 2 Preparation of a fluorescent measuring element as described with reference to FIGS. 4 to 6.
  • a stock solution is prepared with approximately 10 -3M of perylene dibutyrate in anhydrous dichloromethane.
  • a cold-polymerizable silicone resin of the polydimethylsiloxane type (sold under the name "RTV 128" by the company "General Electric
  • Silicone France is diluted with this stock solution, so that after evaporation of the solvent, the proportion of perylene dibutyrate in the silicone resin is less than 0.1%.
  • the silicone film, hydrophobic and permeable to oxygen is left for 24 hours until complete polymerization, which constitutes the fluorescent material 115 (which is hydrophobic and permeable to oxygen), then 20 to 50 ⁇ l of enzyme and inert protein solution are spread on its surface and immobilized as described in Example 1, which constitutes the enzyme material 117.
  • Escherichia coli K12 from strain 3300, was cultivated at 37 ° C. on a minimum aerated mineral medium (reference No. 63, concentrated twice), containing: KH 2 P0 4 10.6 g / 1;
  • 10 g / l of modifier were introduced into the medium each time.
  • Four different cultures were performed, each with a different modifier to induce the corresponding flavoproteins respectively to the substrates to be assayed, namely lactate (racemic), succinate, malate (racemic) and glycerol, in order to constitute optrodes respectively to L-lactate, succinate, L-malate and glycerophosphate.
  • the bacteria were harvested in the exponential phase by centrifugation and resuspended in the same minimum medium, without carbon source, at a rate of 0.1 to 1 g of bacteria per ml in the wet state.
  • Escherichia coli is cultivated on one of the usual culture media, minimum or rich, to which 10 g / l of glucose have been added.
  • thermophilic strain PS3 can also be cultivated at 65 ° C. in a rich medium containing 10 g / l of glucose. With this strain, the enzymes of the respiratory chain are thermostable, and also more stable at 35 ° C, the usual temperature of the assay.
  • This step is optional; it is carried out during the preparation of an optrode suitable for assaying NADH, NADPH, pyruvic acid and its salts, which are substrates which do not freely pass the plasma membrane of whole bacteria in suspension (the site of action of specific flavoproteins being accessible on the internal face of these membranes).
  • the previously obtained bacterial suspension is treated by one of the following two methods to reverse the polarity of the bacterial membranes:
  • the bacterial suspension is passed through a cell fractionator at 15 ° C and under a pressure of about 1600 bars.
  • the whole bacteria and the fragments of external membrane are eliminated by centrifugation at 60,000 g, for 20 minutes.
  • the supernatant is a crude breaking containing, inter alia, inverted internal membrane vesicles, with the flavoproteins of the respiratory chain accessible to NADH, NADPH and pyruvate (and also to D- and L-lactate, L-malate, 3- glycerophosphate and succinate).
  • the bacteria or the membrane preparations are mixed with a solution of serum albumin at 15 mg / ml of final concentration, or alternatively, with 15 mg / ml of hemoglobin or alternatively with an aqueous solution of 50 mg / ml of gelatin (the latter being supercooled to 40 ° C), at a rate of 20 mg / ml of bacterial proteins.
  • Crosslink at 0 ° C with glutaraldehyde at a final concentration of 0.4%.
  • the mixture is homogenized, then part is spread quickly on the fluorescent material, protected by a hydrophobic layer, permeable to oxygen, as indicated in Examples 1 and 2.
  • the composite material can be stored at 4 ° C., in the absence of oxygen, in this latter buffer additionally containing 0.5 mM sodium azide.
  • E. coli cultivated as described, in minimum medium, on D-L-lactate, has an activity induced preferentially for the respiration of L-lactate.
  • These bacteria are immobilized by glutaraldehyde as above in the presence of an excess of serum albumin, DL-lactate and MgSO 4 .
  • K ⁇ The global “K-, apparent”, hereinafter referred to as “K ⁇ .” is 5 M in 20 mM K phosphate buffer at pH 7.5.
  • the fluorescence signal expressed in% of the “apparent Vmax” varies with the known concentrations of L-lactate according to FIG. 11, which is a calibration curve of The enzymatic optrode.
  • FIG. 11 is a calibration curve of The enzymatic optrode.
  • concentrations of L-lactate lower than the concentration "K-.” divided by 10 (zone 1), a pseudo ⁇ linearity of the initial speed of the reaction.
  • the determination of the unknown L-lactate concentrations is then carried out with an error of less than 2%.
  • the concentration of L-lactate increases to the concentration of the substrate equal to "K >> (zone 2), the uncertainty increases, and it increases even more at concentrations greater than" - - * "'' ( zone 3 ) •
  • L-lactate with this enzyme optrode (membrane proteins of the respiratory chain) between 0.05 mM and 1 mM, range of concentrations of the standard range. Knowing that the concentration of L-lactate in yogurt is around 80 mM, in wine 15 mM, in the blood of an athlete after an average physical effort of about 4 mM, and in fruit juice d about 3 mM, these biological media should be diluted respectively and directly in the assay buffer, that is to say respectively 30 times, 6 times, 1.6 times, and 1.2 times.
  • the optrode used in Example 4A is insufficiently sensitive.
  • another enzyme is immobilized, for example, an oxidase such as the L-lactate oxidase from Pediococcus species having a lower "K ⁇ ", a better "Vmax” and the possibility of introducing more enzyme into the enzymatic film.
  • an oxidase such as the L-lactate oxidase from Pediococcus species having a lower "K ⁇ ", a better "Vmax” and the possibility of introducing more enzyme into the enzymatic film.
  • This enzyme makes it possible to increase, for a lower concentration to be measured, the sensitivity and the signal of the assay.
  • L-lactate can thus be carried out with different enzyme optrodates. Most of these enzymes (oxidases and dehydrogenases) are available from a variety of enzyme suppliers. Can be used icroorganisms induced by D-L-lactate and immobilized.
  • Bacillus stearo-thermophilus, NAD and NADP dehydrogenases such as L-lactate dehydrogenases from rabbit muscle, pigeon breast, beef, pork, chicken, dog and trout, rat heart, beef, pork and chicken, adrenal gland of beef, chicken liver, human erythrocytes, lobster tail, bull semen and potato bulb.
  • the enzyme which, in the state of immobilized film, will present both the best stability and the best kinetic constants: "K ⁇ ", "Vmax”, optimum pH and ionic strength, in connection with the assay conditions. of the substance to be dosed in a given biological medium, where the L-lactate must be measured.
  • the optimum pH may not be a limiting factor, as the biological sample can be diluted in the assay buffer.
  • the high “Vmax” and the increase in the concentration of enzyme make it possible to increase the sensitivity of the assay.
  • the immobilization conditions varying the charge or the degree of hydrophobicity of the enzymatic polymer also makes it possible to modulate the kinetic parameters allowing the optimization of the assay ("K ⁇ ", "Vmax", buffer, pH and ionic strength). In each case, a pseudo order 1 calibration curve will be established. We will try to avoid complicated dilutions, while obtaining a signal compatible with the enzyme optrodes of the invention. For biological media, dilutions can be automated, if necessary.
  • the enzymatic optrode measuring an oxygen concentration is not a handicap for the assay.
  • the speed (less than 30 seconds) allows the obtaining of the result almost instantaneously and avoids freezing the sample which otherwise evolves during the times of current dosages (traditional dosages last at least 30 minutes, not counting the time necessary for transport to 'at the analysis laboratory).
  • succinate for example, is present in the L-lactate sample to be assayed, to avoid interference (in the respiratory chain)
  • a known volume of a solution is introduced before measurement. aqueous sodium fumarate or sodium malonate, so that the final concentration is 100 mM to 300 mM, concentrations specifically inhibiting the measurement of succinate.
  • the calibration curve is not changed.
  • the disposable part of the enzyme optrode (enzyme material and fluorescent material) can be replaced manually in less than 10 seconds.
  • the assembly of Figure 1 is then preferred.
  • the assay is carried out in less than 15 seconds and can be carried out directly on a microdrop of blood (approximately 10 ⁇ l) without treatment of the sample.
  • a microdrop of blood approximately 10 ⁇ l
  • EXAMPLE 6 Determinations of NADH or NADPH at concentrations between 0.05 and 1 mM (range of the standard range.
  • This assay is carried out by preparing the optrode with
  • the bacteria are broken before immobilization by glutaraldehyde in the presence of an excess of serum albumin, NAD and MgSO.
  • glutaraldehyde in the presence of an excess of serum albumin, NAD and MgSO.
  • NAD serum albumin
  • MgSO MgSO.
  • the pH of the sample it is preferable to adjust the pH of the sample to 7.6 and around 5.8 for NADPH.
  • NAD + + NAD and NADP are carried out in the same way by co-immobilizing the specific dehydrogenase and the respiratory chain with excess albumin serum in the presence of NAD and MgSO.
  • NAD protects both the respiratory chain and dehydrogenases.
  • EXAMPLE 7 Determinations of ethanol at concentrations of between 0.01 and 0.2 mM (range of the standard range).
  • Reverse vesicles of E. coli cultured on glucose, exhibiting NADH respiration, are co-immobilized with 2 IU / ml of yeast alcohol dehydrogenase, in the presence of an excess of serum albumin, 10 mM NAD and MgSO, with glutaraldehyde.
  • the chemical reactions are as follows:
  • the global “1 ⁇ ,” under these conditions, is ImM.
  • More sensitive dosages use other alcohol dehydrogenases with NAD or NADP or alcohol oxidases.
  • dehydrogenases specific for substances other than ethanol, with NAD + or NADP4- co-factors can be used in place of alcohol dehydrogenase. These enzymes make it possible to dose a few thousand effectors such as for example: glucose, glycerol, methanol, certain steroid, cortisone, cholesterol, L-lactate, L-malate, pyruvate and glutamate.
  • effectors can be dosed in various biological media coming from various fields of applications, such as medicine (blood alcohol level), medicine veterinarian, pharmacy, food (fermentations, wine, alcohol, vinegar, fruit juice, beer); fine chemicals (perfumes, cosmetics) and ecotoxicology.
  • Inhibitors and inactivators can be used to monitor their concentration in ecotocoxilogy and civil defense, for example. Automation enables biological experiments in space.
  • E. coli , cultivated as described above on glucose in a minimum medium, has a constitutive activity for the respiration of pyruvate, this activity is generally equivalent to a pyruvate oxidase.
  • the membrane vesicles are immobilized by glutaraldehyde, as above, in the presence of an excess of serum albumin and 5 mM of TPP, 5 ⁇ M of FAD and 200 mM of D, L-lactate or pyruvate.
  • the overall “K” under the assay conditions is 20 mM in maleate buffer of K pH 6.0 at 35 ° C.
  • bacterial vesicles can be heated for 2 hours at 57 ° C. You can also eliminate the respiration of succinate by inhibiting it with malonate or fumarate.
  • pyruvate we prefer to measure the pyruvate with this enzyme optrode (membrane proteins of the respiratory chain) between 0.2 mM and 4 mM, range of the standard range. Pyruvate can be measured in lactic fermentations. To measure bacterial contamination in milk (pyruvate ⁇ 0.3 mM), another source of enzymes must be used, for example under the following conditions:
  • POP Pediococcus species
  • the assay is carried out in 20 mM of K phosphate, at pH 7.0, at 35 ° C, with the various effectors mentioned above.
  • the "K j .” for the pyruvate is 0.5 mM, the pyruvate can be dosed between 0.05 mM and 0.1 mM, range of the standard range.
  • This dosage is suitable for measuring the contamination of milk by bacteria (the dosage of pyruvate by a biochemical dosage is already used by several countries - the dosage with the enzymatic optrode has many advantages: duration, cost and ease).
  • the dosage of pyruvate opens up many applications given the role of a hub played by pyruvate in metabolism (applications in medicine, in fermentations and in the flavor industry for example).
  • EXAMPLE 9 Automated measurements, by enzyme optrodes, of the variation in oxygen concentration.
  • the oxygen consumption caused by the oxidation of metabolites specifically catalyzed by enzymatic materials is measured by the luminescence optrode.
  • the sample to be assayed approximately 10 ⁇ l, is automatically deposited on the immobilized enzymatic material which is isolated for example by a hydrophobic layer, permeable to oxygen, of luminescent material sensitive to the consumption of oxygen.
  • the probe conforms to the assembly of FIG. 1, in the case of disposable and automatically replaceable inserts, or of FIG. 4, allowing a continuous and successive flow of metabolite and of rinsing solution.
  • the optrode (enzymatic material + luminescent material) is, in this second case, sequentially exposed:
  • the slope of the initial speed of oxygen consumption is calculated by the microprocessors and automatically compared with the standard curve obtained beforehand with various known concentrations of metabolites ( about a tenth of
  • the assay is carried out in less than 15 seconds, the process of rinsing and saturation with oxygen of the probe takes approximately 1 minute.
  • the assay can thus be automatically repeated more than 500 times.
  • the result makes it possible to adjust various automatisms (pumps, valves, additives and stops).
  • Miniaturization and automation make it possible, for example, to carry out biological experiments in conditions of weightlessness as in space research.

Abstract

Cette optrode enzymatique, notamment miniaturisée, portable et automatisée, utilisable en médecine humaine et vétérinaire, pharmacie, agro-alimentaire, traitement des eaux, écotoxicologie, chimie fine, technologie spatiale et autres, permet le dosage par voie enzymatique des effecteurs de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD+ ou NADP+, celles-ci étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire. Le matériel enzymatique (17) est immobilisé sous forme réticulée, et est associé à un matériel luminescent (15), cet ensemble étant associé à des moyens de détection de l'augmentation de l'émission de luminescence (ou de la durée de vie des états excités), provoquée par la consommation d'O2 lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser, l'échantillon à doser ayant été amené au contact du matériel (17). L'invention concerne les procédés de dosage correspondants avec des optrodes jetables et remplaçables automatiquement ou permettant un flux continu et successif de métabolite et de solution de rinçage. Le dosage est effectué en moins de 15 s avec environ 10 mul d'échantillon.

Description

OPTRODES A ENZYMES IMMOBILISES
La présente invention porte sur des microsondes optiques à enzymes immobilisés (optrodes enzymatiques) , en particulier portables et automatisées, pour les dosages des effecteurs de la chaîne respiratoire (qui sont au nombre de plusieurs dizaines) , des oxydases (plusieurs centaines) , et des déshydrogénases à NAD + ou NADP+ (plusieurs milliers) , les déshydrogénases étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire. L'invention concerne également les procédés de dosage correspondants. De nombreuses applications de ces optrodes sont envisagées, à divers milieux biologiques, en médecine, pharmacie, médecine vétérinaire, agro-alimentaire, traitement des eaux et chimie fine.
Selon la présente description, l'expression "effecteurs" englobe aussi bien le ou les substrats spécifiques de chaque enzyme que le ou les inhibiteurs spécifiques, le ou les activateurs spécifiques, les substances inactivatrices spécifiques intervenant dans les réactions enzymatiques mises en jeu, ainsi que les produits résultant desdites réactions. Dans ce qui suit, pour les besoins de l'exposé, et par commodité pratique, il sera essentiellement question des substrats, mais l'invention n'est aucunement limitée à ce type d'effecteurs.
L'utilisation d'électrodes de Clark pour la mesure de l'oxygène, associées aux enzymes précités, immobilisés dans un film de gélatine traité au glutaraldéhyde, est déjà connue, ayant fait l'objet du brevet français n° 2 576 318 déposé le 18 janvier 1985 (voir également, brevet européen n° 193 420 déposé le 17 janvier 1986, demande de brevet américain n° 06/819 199 déposée le 15 janvier 1986 et demande de brevet japonais KOKAI n° 170 648/1986, déposée le 18 janvier 1986) . La méthode utilisée dans ce brevet est une méthode ampérométrique à potentiel imposé. Les enzymes immobilisés sont, dans ce cas, ceux de la chaîne
_. respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD et NADP . Le volume de l'échantillon à doser est compris entre 1 et 5 ml. Il est nécessaire d'utiliser industrielle¬ ment un appareillage lourd, pesant plusieurs kilogrammes, nécessitant par ailleurs l'environnement d'un laboratoire de recherche ou de contrôle (alimentation électrique et fluidique, enregistrement, petit matériel de laboratoire) , ainsi qu'un personnel qualifié.
Bien que les enzymes immobilisés puissent être réutilisés plus de 1000 fois, il reste que les inconvénients de tels appareils sont nombreux : poids, coût élevé, et également le fait qu'ils ne soient pas utilisables directe¬ ment par les utilisateurs que sont, par exemple, les médecins ou les patients. Il en va de même dans les cas où il faut suivre très rapidement et «en continu» l'évolution d'une substance, par exemple, en médecine sportive, pour le suivi de l'évolution du L-lactate chez l'athlète sur le terrain.
Les problèmes scientifiques et techniques à résoudre consistaient donc dans la mise au point d'un nouveau procédé de dosage pouvant être facilement mis en oeuvre avec des quantités très faibles de substance à doser, grâce à l'utilisation d'un capteur enzymatique sous forme de sonde qui puisse être de petites dimensions.
Egalement, en plus de cette miniaturisation, l'invention offre l'avantage complémentaire de permettre le dosage de nombreux substrats différents avec le même dispositif de base auquel est associé un ensemble d'éléments permettant la mesure spécifique et portant chacun l'un des enzymes et/ou la chaîne respiratoire immobilisés. Pour effectuer un dosage, on choisira dans cet ensemble l'élément qui porte l'enzyme approprié pour ce dosage et qui peut être à usage unique ou réutilisable, chaque optrode comprenant un système enzymatique spécifique de la substance à doser. Ainsi, il est maintenant proposé, conformément à la présente invention, des microsondes optiques enzymatiques portables, à affichage automatique du résultat du dosage et automatisées, et de plus, comme on vient de l'indiquer, pouvant être associées à un jeu d'éléments de mesure réutilisable ou jetable après un ou plusieurs usages.
La présente invention a donc pour objet une série de microsondes optiques à enzymes pour les dosages des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à
NAD ou NADP , ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire. L'invention est caractérisée par le fait que le matériel enzymatique est immobilisé sous forme réticulée et est associé à un matériel luminescent (fluorescent ou phosphorescent) , ledit matériel enzymatique et ledit matériel luminescent constituant ensemble un matériel ou film composite qui est associé à des moyens pour détecter l'augmentation de l'émission de luminescence ou l'augmentation de la durée de vie des états excités responsables de cette émission, ces augmentations étant provoquées par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser (phénomène d'extinction de luminescence par l'oxygène) , l'échantillon à doser ayant été amené au contact du matériel enzymatique, ladite augmentation de l'émission ou de la durée de vie des états excités étant un paramètre représentatif de la concentration de la substance à doser.
Une microsonde optique enzymatique selon l'invention constitue ce qui, dans la technique, est dénommé "optrode enzymatique". Dans le cas présent, une telle optrode est un capteur enzymatique à matériel luminescent (fluorescent ou phosphorescent) . Dans la suite de la description, on n'utilisera plus que les expressions «fluorescence» et «matériel fluorescent», mais il est bien entendu que l'invention est applicable dans le cas de phosphorescence ou de matériel phosphorescent. Par ailleurs, on entend par «chaîne respiratoire», un système multienzymatique membranaire, fonctionnant globalement comme une oxydase transformant stoechiométrique- ment et spécifiquement un substrat à l'aide de l'oxygène. La chaîne respiratoire provient de bactéries immobilisées, de microorganismes immobilisés, de mitochondries immobilisées, ou de leurs préparations membranaires immobilisées. Ces bactéries et ces microorganismes ont été, dans certains cas, préalablement cultivés sur un milieu dont la composition a entraîné une modification de la synthèse de la flavoprotéine correspondant au composé à doser, ce qui augmente la spé ificité du dosage. La chaîne respiratoire immobilisée peut être utilisée seule (pour une dizaine de substrats) ou permettre de doser le NADH et/ou le NADPH formé par les déshydrogénases à NAD et/ou NADP dépendantes (pour un millier de substrats) , ce qui globalement revient à utiliser des systèmes enzymatiques se comportant comme des oxydases (consommant de l'oxygène) . Selon l'invention, on peut utiliser toute oxydase capable de transformer spécifiquement un substrat en présence d'oxygène.
Le matériel enzymatique est immobilisé par réticulation covalente par des agents pontantε, qui sont choisis notamment parmi le glutaraldéhyde, les carbodiimides, le N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]- propionate de sodium (SPDP) et les azotures.
Avantageusement, le matériel enzymatique est immobilisé pour constituer le film enzymatique en présence d'au moins une protéine inerte en excès, comme la sérum albumine, l'hémoglobine et/ou la gélatine. Conformément à un premier mode de réalisation de l'invention, l'échantillon aqueux, d'environ 10 ni, est déposé sur la couche de matériel enzymatique immobilisé, séparée du matériel fluorescent par une couche hydrophobe, perméable à l'oxygène. Selon une première variante, la couche de matériel fluorescent renferme une substance active sensible à l'oxygène adsorbée sur un support, séparée du matériel enzymatique par un film hydrophobe et perméable à l'oxygène. Le support est avantageusement constitué par de la silice, de l'alumine, du silicate d'alumine (kaolin) ou des résines obtenues par copolymérisation de styrène et de divinyl- benzène et connues sous la dénomination d'Amberlite. Quant au film hydrophobe, perméable à l'oxygène, il est par exemple constitué par une polyoléfine, comme le polypropylène, ou par un polymère fluoré, comme le polytétrafluoréthylène (PTFE) , connu aussi sous le nom de Teflon, ou encore par une résine de silicone, par exemple de polydi éthylsiloxane. Selon une deuxième variante, la substance fluorescente active est directement formée en couche mince, par exemple, par sublimation, par évaporation (sous vide ou à partir d'un solvant) .
Dans le cas des deux variantes précédentes, le film ou couche hydrophobe peut être soit rapporté, soit formé sur place à partir de solutions, de dispersions ou d'aérosols, ce dernier cas convenant notamment au PTFE.
Selon une troisième variante, la substance fluorescente active est piégée dans un film polymérique, par exemple, dans un film de type résine de silicone.
Conformément à un second mode de réalisation de l'invention, la substance fluorescente active est conditionnée sous forme de microcapsules, de microémulsions ou de liposomes, et elle se trouve alors au sein du matériel enzymatique.
Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, la substance fluorescente active est solubilisée directement dans la protéine inerte constituant le film enzymatique. Dans l'un quelconque des modes de réalisation précités, on peut incorporer un film opaque à la lumière. Ce film peut être intercalé par exemple, entre deux des couches de la structure, rapporté au-dessus du matériel composite ou bien faire partie intégrante de l'une des couches (par exemple sous forme de film opaque, hydrophobe et perméable aux gaz) .
La substance fluorescente active est choisie par exemple dans la famille du pérylène :
Figure imgf000008_0001
où R à R ont diverses significations, le pérylène étant le composé pour lequel R = R_ = R = R H. Avantageusement, la substance active est le pérylène 3,9-dicarboxylate d'isobutyle, (composé pour lequel :
R, , = -C-O- CH2-CH(CH3)2 et 2 R. = H) , appelé souvent 3 il
dans la littérature «dibutyrate de pérylène» et vendu sous le nom de «Solvent green 5» par la Société BASF AG, ou bien des dérivés du diimide de l'acide pérylène tetracarboxylique
pour lesquels — .
Figure imgf000008_0002
Toutefois, on peut utiliser d'autres agents fluorescents choisis pour accroître la sensibilité à l'oxygène, ou pour modifier la longueur d'onde d'émission de fluorescence ou celle de son excitation.
C'est le cas des dérivés des métalloporphyrines ou des métallophtalocyanines. Suivant la nature du métal inclus dans ces composés, on pourra mesurer l'intensité de la fluorescence ou de la phosphorescence, ou encore la durée de vie des états excités responsables de cette phosphorescence Le matériel composite enzymatique fluorescent peut être placé sur une plaque-support transparente.
Suivant une première forme de réalisation, 1'optrode à enzymes selon l'invention comporte un support présentant un évidement destiné à recevoir le matériel composite, éventuellement sur sa plaque-support, ledit support comportant des chemins optiques pour l'excitation de la substance fluorescente et l'émission de la fluorescence, le matériel composite constituant un élément de mesure amovible, jetable après usage, ou réutilisable, plusieurs éléments de mesure de ce type pouvant être associés successivement au support.
Suivant une deuxième forme de réalisation, 1'optrode selon l'invention comporte un support transparent, sur lequel est disposé le matériel composite, et une cuve à circulation rapportée contre ledit support, de telle sorte que l'échantillon à doser pénètre dans ladite cuve, vienne en contact avec la couche enzymatique du film et sorte ensuite de ladite cuve.
Les faisceaux d'excitation et d'émission de fluorescence peuvent être transmis par l'intermédiaire d'une fibre optique.
Quant aux moyens de détection, ils sont avantageusement constitués par : des moyens d'excitation, destinés à exciter la substance fluorescente et disposés en amont du film composite ; un premier filtre optique interposé entre lesdits moyens d'excitation et le film composite, et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde d'excitation ( . ) ; - un photodétecteur destiné à capter l'émission de fluorescence, disposé en aval du film composite ; un deuxième filtre optique interposé entre le film composite et ledit photodétecteur, et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde de fluorescence (Λ-) ; - des moyens de détection et d'amplification disposés en sortie dudit photodétecteur ; des moyens de traitement numérique du signal analogique fourni par les moyens de détection et d'amplification ; des moyens d'affichage ou de commande de périphériques pilotés par les moyens de traitement numérique.
Avantageusement, afin d'améliorer la qualité du signal lorsqu'on' mesure des intensités lumineuses, on peut utiliser une modulation de l'excitation conjointement à une détection synchrone du signal de sortie du photodétecteur. Lorsqu'on mesure la durée de vie des états excités, on peut utiliser un système démodulateur synchrone à asservissement de phase.
La présente invention porte également sur un procédé de dosage, par voie enzymatique, des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à NAD ou NADP , ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire. Ce procédé est caractérisé par le fait qu'on immobilise sous la forme d'un film réticulé le matériel enzymatique, et on l'associe à un matériel luminescent (fluorescent ou phosphorescent) ; on applique l'échantillon contenant la substance à doser sur le matériel enzymatique ; on détecte l'augmentation de l'émission de luminescence ou l'augmentation de la durée de vie des états excités qui est provoquée par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser, ladite augmentation étant un paramètre représentatif de la concentration de la substance à doser. L'optrode selon la présente invention, telle qu'elle vient d'être définie ci-dessus est applicable en médecine (tests portables en milieu hospitalier, tests dans les cabinets de médecine générale ou spécialisée, tests à la maison par les patients eux-mêmes) , pharmacie, médecine vétérinaire, industrie agroalimentaire, traitement des eaux, écotoxicologie, chimie fine, technologies spatiales et autres.
Pour mieux illustrer l'objet de la présente invention, on en décrira plus en détail ci-après, à titre d'exemples purement illustratifs et non limitatifs, plusieurs modes de réalisation représentés sur le dessin annexé.
Sur ce dessin : la Figure 1 est une vue schématique en coupe, à échelle agrandie, d'une optrode à enzymes immobilisés, thermostatée, conforme à un premier mode de réalisation de l'invention ; la Figure 2 est une vue, à échelle encore agrandie, du détail D de l'optrode de la Figure 1, qui montre le matériel ou film composite (matériel enzymatique et matériel fluorescent) ; - la Figure 3 est une vue en perspective éclatée de
1Optrode de la Figure 1 ; la Figure 4 est une vue schématique en coupe à échelle agrandie d'une optrode à enzymes immobilisés, thermostatée, conforme à un second mode de réalisation de l'invention ; la Figure 5 est une vue, à échelle encore agrandie, du détail D de la Figure 1 ou 4 ; la Figure 6 est une vue en perspective éclatée de l'optrode de la Figure 4 ; - les Figures 7 et 8 sont des vues de détail analogues aux Figures 2 et 5, montrant des variantes de matériel composite enzymatique et fluorescent pouvant être utilisée dans l'optrode conforme au mode de réalisation représenté sur les Figures 1 et 4 ; - la Figure 9 est un schéma de montage opto-électronique d'une optrode de la présente invention mesurant des variations d'intensité de luminescence ; et - la Figure 10 est un schéma de montage opto-électronique d'une optrode de la présente invention mesurant les variations de durée de vie des états excités ; la Figure 11 est une courbe d'étalonnage obtenue avec 1Optrode de la Figure 1 ou de la Figure 4.
Si l'on se réfère maintenant aux Figures 1 à 3, on voit que l'on a désigné par 1, dans son ensemble, une optrode à enzyme immobilisé, dont l'équipement opto¬ électronique complémentaire est représenté sur la Figure 8 sous la forme de son schéma de montage.
L'optrode 1 comprend un support 2, réalisé par exemple en laiton et présentant une forme d'ensemble parallélépipédique, avec deux pans coupés égaux formés le long de deux arêtes parallèles inférieures, le support 2 étant considéré dans la position de mesure, telle que représentée sur le dessin. Ainsi, le support 2 est délimité par une paroi supérieure 3, par une paroi inférieure 4, par deux parois latérales opposées 5 (non représentées dans la vue en coupe) , perpendiculaires aux précédentes, et, enfin, par deux parois parallèles opposées 6, qui sont perpendi¬ culaires à la paroi supérieure 3 en lui étant rattachées, et qui sont reliées à la paroi inférieure 4 par deux parois obliques 7.
Dans la paroi supérieure 3, est formé un évidement central 8, délimité par un fond 9 et par une paroi latérale cylindrique 10. Par ailleurs, dans le porte-optrode 2, sont pratiqués, dans le plan transversal médian parallèle aux parois latérales 5, deux chemins optiques symétriques 11 et 12, débouchant tout deux côte à côte dans le fond 9, en partant chacun d'une paroi oblique 7.
Le fond 9 de l'évidement 8, qui est parallèle à la paroi 3, reçoit, successivement, comme on peut le voir sur la Figure 3 : une plaque-support 13, transparente ou translucide, réalisée, par exemple, en poly(méthacrylate de méthyle)
(Plexiglas) , en forme de disque, de diamètre légèrement inférieur au diamètre interne de 1'évidement 8 ; un film adhésif double face 14 (par exemple Scotch 3M) , de même forme que la plaque-support 13, dont la face inférieure 14a vient se fixer sur la face supérieure de la plaque-support 13, et dont l'autre face 14b reçoit un matériel fluorescent 15 ; ce dernier est constitué par des grains, par exemple de silice d'une granulométrie moyenne de 15 m, sur lesquels est adsorbée une substance fluorescente active constituée, par exemple, par du pérylène 3,9-dicarboxylate d'isobutyle, lesdits grains étant rassemblés au-dessus de la partie centrale de l'évidement 8 •; un film 16, perméable à l'oxygène et hydrophobe, réalisé, par exemple, en polypropylène ou en polytétrafluoréthylène (PTFE) , de forme circulaire, de diamètre inférieur à celui de la plaque-support 13 et du film adhésif 14, et qui vient s'appliquer sur les grains de matériel fluorescent 15, adhérant principale¬ ment par sa bordure sur la face supérieure 14b du film 14 et maintenant en place lesdits grains 15 ; - un film opaque 16a., sensiblement de mêmes dimensions que le film 16 ; on peut du reste se dispenser du film opaque 16a. à la condition de choisir un film 16 lui- même opaque ; et une couche 17 de matériel enzymatique immobilisé sous forme de film réticulé, par exemple, en présence de sérum albumine par le glutaraldéhyde.
Le film composite enzymatique fluorescent 18 (Figure 2), qui est constitué par la couche enzymatique 17, le film de protection hydrophobe 16, le film opaque 16a. et le matériel fluorescent 15, et qui est maintenu, par le film adhésif 14, sur la plaque-support 13, forme avantageusement avec cette dernière, un élément de mesure pouvant faire partie d'un ensemble d'éléments de mesure, différant les uns des autres par la nature de l'enzyme utilisé pour constituer la couche 17.
Un tel élément de mesure est, préalablement à chaque dosage, introduit dans l'évidement 8 du support 2, et il est maintenu dans ledit évidement 8 par un anneau 19, réalisé par exemple en laiton, d'un diamètre extérieur correspondant sensiblement au diamètre de la plaque-support 13. Le film composite 18 présente une épaisseur totale de quelques centaines de .m, chacune des couches 14, 15, 16, 16a. et 17 présentant une épaisseur allant de 10 Λtm à 500 m. Ce film composite 18 sur son support se présente notamment sous la forme d'une pastille d'environ 10 mm de diamètre, pouvant être à usage unique et remplaçable rapidement ou réutilisable.
Des montages opto-électroniques de l'optrode 1 sont maintenant décrits en liaison avec les Figures 9 et 10. Le dispositif 20 d'excitation de la substance fluorescente est avantageusement, dans le cas où la substance fluorescente est constituée par du pérylène 3,9-dicarboxylate d'isobutyle adsorbé sur des grains de silice, une diode électroluminescente (DEL) bleue, sur la sortie de laquelle est disposé un filtre optique 21 destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde d'excitation (A-. = 470 n dans le cas précité) . L'excitation du matériel fluorescent 15 pourrait être également effectuée par une diode-laser, si la longueur d'onde d'excitation de la substance fluorescente est supérieure à 650 nm.
Le dispositif de détection 22 , destiné à capter l'émission de fluorescence, est disposé en aval du film composite 18 placé sur son support 13. Toujours dans le cas précité, ce dispositif 22 est avantageusement constitué par une photodiode au silicium, un deuxième filtre optique 23 étant interposé entre le film composite 18 et ladite photodiode 22, afin d'améliorer la spécificité de la longueur d'onde de fluorescence ( _ = 520 nm dans le cas précité ; émission dans le vert-jaune) . Sur la Figure 1, l'ensemble émetteur, constitué par le dispositif d'excitation 20 et le filtre 21 a été représenté, en place dans l'entrée du canal 11, alors que l'ensemble récepteur, constitué par le filtre 23 et la photodiode 22 est représenté en place dans la sortie du canal 12, le trajet du rayonnement ayant également été symbolisé sur cette Figure 1 (respectivement λ. etA-) • Le dispositif ainsi décrit permet de suivre l'évolution de l'oxygène transmis à la substance fluorescente du matériel 15 lors de la réaction au niveau de la couche enzymatique 17. Le signal analogique, délivré à la sortie de la photodiode 22, est amplifié en 24, puis traité numériquement en 25, les résultats étant affichés en 26 sous forme de la concentration de la substance dosée, exprimée en g/litre ou en molarité (M) . Un oscillateur 27 est prévu pour coopérer avec le dispositif d'excitation 20 ainsi qu'avec le dispositif de détection 24, lorsqu'on mesure uniquement des variations d'intensité, l'ensemble constituant un dispositif connu sous le nom de détection synchrone.
Quand on souhaite mesurer des durées de vie de phosphorescence, on prévoit une démodulation bicanale du signal détecté, l'un des deux canaux permettant d'asservir la phase du démodulateur 124. On a ainsi accès simultané¬ ment à l'intensité du signal et, à partir de la mesure de déphasage, à la durée de vie des états excités. Les données du traitement numérique 25 peuvent également servir à piloter divers périphériques ou actionneurs tels que, par exemple, imprimante, pompe, échantillonneur 28.
Sur cette Figure 1, on a également fait figurer, sur la surface libre de la couche enzymatique 17, une goutte 28 d'un échantillon à doser, l'optrode 1 permettant en effet de doser de tels échantillons de volume très faible, de l'ordre de la goutte, soit environ 10 μl , dont il n'est pas nécessaire de mesurer le volume exact, car on détermine des concentrations.
La substance spécifique à doser dépend de la nature de l'enzyme qui est immobilisé dans la couche 17, et qui est, comme indiqué ci-dessus, la chaîne respiratoire, une oxydase ou une deshydrogenase a NAD + ou NADP+, associée pour le dosage, à la chaîne respiratoire. La substance spécifique à doser est transformée catalytiquement par l'enzyme en consommant de l'oxygène, cette diminution d'oxygène accroissant l'émission de la substance fluorescente.
Si l'on se réfère maintenant aux Figures 4 à 6, on voit que l'on a désigné par 101, une optrode à enzyme immobilisé, incorporant à cet effet une cuve à circulation 129, adaptée pour doser en flux continu des .substances biologiques lors d'une fermentation par exemple.
Cette optrode peut être intégrée dans le schéma de montage opto-électronique des Figures 9 et 10. Cette dernière optrode présente une forme parallélépipédique. Dans l'une des parois 130 de plus grande dimension de la cuve 129, est pratiqué un évidement central 131, délimité par un fond 132 et par une paroi latérale cylindrique 133. Dans cette dernière, débouchent deux canaux obliques respectivement 134 et 135, s'ouvrant tous deux dans des parois latérales opposées 136a, 136b de la cuve à circulation 129. Le canal 134 constitue le canal d'entrée de l'échantillon contenant la substance à doser, et le canal 135, le canal de sortie. De plus, tout autour de l'évidement 131, est pratiqué dans la paroi 130, une gorge 137 destinée à recevoir un joint torique 138 dont le rôle est indiqué plus loin. La paroi 130 comporte également quatre trous d'angle 139 dont le rôle est également indiqué plus loin. Sur la paroi 130, est rapporté un support 102 en
Plexiglas, en forme de plaquette rectangulaire, aux angles de laquelle sont pratiqués des trous traversants 140, en correspondance avec les trous 139, pour le passage de vis 141 servant à l'assemblage du support 102 sur la cuve à circulation 129, lesdites vis 141 étant reçues dans les trous 139 en position assemblée de 1Optrode 101. Sur la face 102a. du support 102, destinée à venir s'appliquer contre la paroi 130 de la cuve à circulation 129, est appliqué un film composite 118, constitué, comme on peut le voir par exemple sur la Figure 5, par un film 115 de matériel fluorescent formé, dans ce cas, par un dérivé du pérylène emprisonné dans une matrice hydrophobe de silicone, et par un film enzymatique réticulé 117, le film 115 se trouvant contre le support 102, et le film enzymatique 117, tourné du côté de l'échantillon à doser 128. Entre le film 115 de matériel fluorescent, et le film enzymatique 117, peut être intercalée une couche opaque 116a perméable à l'oxygène.
Dans la position assemblée, l'échantillon 128 entre par le canal 134, circule dans l'évidement 131 où il est en contact avec la couche enzymatique 117, et il sort par le canal 135. L'étanchéité est assurée par le joint torique 138. Des moyens de mise en circulation des échantillons et des moyens de thermostation sont prévus. Sur la Figure 4, on a également schématisé les ondes d'excitation (, ) et d'émission de fluorescence (λ_) . Ces dernières sont transmises avantageusement par l'intermé¬ diaire d'une fibre optique multibrin en Y 142 d'environ 5 mm de diamètre, par exemple.
Par ailleurs, il va de soi qu'une fibre optique, telle qu'elle vient d'être décrite, peut également être uti¬ lisée dans le cas de l'optrode 1 représentée sur la Figure 1, moyennant le remplacement des canaux 11 et 12, par un canal perpendiculaire au fond 9 de l'évidement central 8 et joignant ce fond 9 à la paroi inférieure 4 de l'optrode. Sur la Figure 7, on a représenté une variante 218 des films composites 18, 118, qui est constituée d'une couche enzymatique 217, formée, par exemple, par de la sérum albumine réticulée, dans laquelle sont piégés les enzymes, ladite couche 217 renfermant également des liposomes d'un diamètre de l'ordre de 100 nm emprisonnant une substance fluorescente 215. Dans cet exemple, un film opaque 216a. peut être placé au-dessus du film enzymatique 217 et, vu sa position, sera obligatoirement perméable au substrat à doser 228 et perméable à l'oxygène.
Sur la Figure 8, on a représenté une autre variante 318 des films composites 8, 118 et 218 où la substance luminescente est dissoute directement dans le film enzymatique 317.
Par ailleurs, il va de soi que les films du type des films 18 et 218, tels qu'ils viennent d'être décrits, peuvent être utilisés dans une optrode du type de celle représentée sur la Figure 4, auquel cas les films opaques respectivement'16a et 216a ne sont pas nécessaires. Réciproquement, le film 118, tel que décrit en référence avec la Figure 4, pourrait aussi bien être incorporé dans une optrode du type de celle représentée sur la Figure 1, auquel cas on peut lui adjoindre, entre les films 115 et 117, un film opaque 116a., perméable à l'oxygène.
On décrira maintenant des exemples de préparation du film composite enzymatique fluorescent, ainsi que des exemples de dosage à l'aide des optrodes qui viennent d'être décrites. Dans ces exemples, les pourcentages indiqués sont donnés en poids/volume sauf indication contraire.
EXEMPLE 1 : Préparation d'un élément de mesure fluorescent tel que décrit en référence avec les Figures 1 à
3
On mélange, dans un ballon rodé, 1 g de silice à chromatographie de granulométrie 15 ^im (MERCK) , 1 mg de dibutyrate de pérylène, et 10 ml de dichlorométhane anhydre. On évapore le tout à 1'évaporateur rotatif, jusqu'à obtention d'une poudre sèche de couleur jaune qui constitue la substance fluorescente active.
On pourrait, le cas échéant, remplacer - l'évaporation à l'évaporateur rotatif par une filtration du mélange sur papier-filtre, en faisant suivre par un séchage à l'étuve à 50°C. Ceci obligerait cependant à utiliser une plus grande quantité de dibutyrate de pérylène, ce qui présente l'inconvénient d'être moins précis quant à la quantité finale de colorant adsorbé sur la silice.
Un film adhésif double face (Scotch 3M) (film 14) est collé, par sa face 14a., sur la plaque-support 13 en Plexiglas, comme représenté sur la Figure 3.
Sur la face adhésive libre 14b du film 14, est déposée, à travers un masque d'un diamètre de 4 mm, une petite quantité de la poudre fluorescente précédemment préparée (matériel fluorescent 15) . Cette poudre est légèrement tassée pour assurer le collage et éliminer le surplus.
Le masque est ôté, et il est remplacé par un autre masque, d'un diamètre de 6 mm, au travers duquel est vaporisé parcimonieusement et en plusieurs fois, un aérosol de PTFE. Après séchage spontané, le film hydrophobe 16 de PTFE recouvre intimement les grains de silice sur lesquels est adsorbé le dibutyrate de pérylène.
On peut maintenant déposer, sur le film 16, de 10 à 50 ul d'une solution d'enzyme mélangée à une protéine inerte, l'ensemble étant immobilisé suivant l'un des modes opératoires indiqués ci-après, et étaler cette solution sur le matériel fluorescent 15 déjà préparé en profitant de la zone externe de l'adhésif, qui est encore libre pour assurer un bon collage de ce matériel enzymatique 17.
EXEMPLE 2 : Préparation d'un élément de mesure fluorescent tel que décrit en référence avec les Figures 4 à 6. On prépare une solution-mère a environ 10 -3M de dibutyrate de pérylène dans du dichlorométhane anhydre.
Une résine de silicone, polymérisable à froid, de type polydiméthylsiloxane (commercialisée sous la dénomination «RTV 128» par la Société «General Electric
Silicone France») est diluée avec cette solution-mère, de telle manière qu'après evaporation du solvant, la proportion de dibutyrate de pérylène dans la résine de silicone soit inférieure à 0,1%.
10 à 100 ul de cette solution de dibutyrate de pérylène/silicone/solvant sont déposés sur une lamelle de microscope en verre (épaisseur : 100 um ; diamètre : 12 mm) , préalablement dégraissée, nettoyée et séchée.
Après evaporation du solvant, le film de silicone, hydrophobe et perméable à l'oxygène, est laissé 24 heures jusqu'à polymérisation complète, ce qui constitue le matériel fluorescent 115 (qui est hydrophobe et perméable à l'oxygène) , puis 20 à 50 ul de solution d'enzyme et de protéine inerte sont étalés à sa surface et immobilisés comme décrit à l'Exemple 1, ce qui constitue le matériel enzymatique 117.
EXEMPLE 3 :
A - Préparation de films enzymatiques avec la chaîne respiratoire des bactéries al) Mode opératoire de la culture de bactéries entraînant l'induction de la synthèse d'une flavoprotéine
Escherichia coli K12, de la souche 3300, a été cultivé à 37°C sur un milieu minimum minéral aéré (référence n° 63, concentré 2 fois), contenant : KH 2 P04 10,6 g/1 ;
K2HP04 174 g/1 ;
(NH4)2S04 4 g/1 ;
MgS04. 7H20 0,4 mg/1 ;
FeS04. 7H20 0,001 mg/1 ; Thiamine 1 mg/ml, ajusté à pH 7,2 avec de la potasse 1 M.
On a introduit, dans le milieu, à chaque fois, 10 g/1 de modificateur. Quatre cultures différentes ont été effectuées, comportant chacune un modificateur différent pour induire les flavoprotéines correspondant respectivement aux substrats à doser, à savoir lactate (racémique) , succinate, malate (racémique) et glycérol, en vue de constituer des optrodes respectivement à L-lactate, succinate, L-malate et glycéro-phosphate. Les bactéries ont été récoltées en phase exponentielle par centrifugation et remises en suspension dans le même milieu minimum, sans source de carbone, à raison de 0,1 à 1 g de bactéries par ml à l'état humide. Après agitation violente, à 37°C, pendant 1 heure, pour éliminer la plupart des substrats endogènes respiratoires, on a lavé les bactéries trois fois avec un tampon phosphate de K (0,2M, pH : 7,8) et on les a remises en suspension, à raison de 1 g de bactéries humides par ml dans un tampon phosphate de K (0,05M, pH : 7,8), contenant du MgSO (10 mM) , avant de les congeler à -80°C pour les conserver. Avant utilisation, on effectue une décongélation rapide à 37°C. L'activité respiratoire n'est pas modifiée après une conservation à -80°C pendant plus d'un an. a2) Mode opératoire de la culture de bactéries entraînant une répression catabolique
Escherichia coli est cultivé sur l'un des milieux de culture habituel, minimum ou riche, auquel on a ajouté 10 g/1 de glucose.
On peut aussi cultiver à 65°C la souche thermophile PS3 dans un milieu riche contenant 10 g/1 de glucose. Avec cette souche, les enzymes de la chaîne respiratoire sont thermostables, et également plus stables à 35°C, température habituelle du dosage.
La récolte, l'isolement et la conservation des bactéries ainsi cultivées se font comme précédemment.
On obtient ainsi les optrodes à NADH, NADPH, pyruvate et D-lactate, dont les flavoprotéines sont constitutives. En revanche, les flavoprotéines inductibles mentionnées en Aal) ci-dessus sont réprimées cataboliquement par le glucose. B - Procédé d'inversion de la polarité de la membrane plasmique bactérienne
Cette étape est optionnelle ; elle est conduite lors de la préparation d'une optrode convenant au dosage de NADH, NADPH, de l'acide pyruvique et de ses sels, qui sont des substrats ne passant pas librement la membrane plasmique des bactéries entières en suspension (le site d'action de flavoprotéines spécifiques se trouvant accessibles sur la face interne de ces membranes) . La suspension bactérienne préalablement obtenue est traitée par l'une des deux méthodes qui suivent pour inverser la polarité des membranes bactériennes :
Action des ultrasons : de 2 à 5 ml de suspension bactérienne sont soumis 4 fois durant 10 secondes, à
0°C, à l'action d'un appareil à ultrasons MSE(__ comportant une sonde de 0,6 cm de diamètre ;
- Méthode de la presse de French : la suspension bactérienne est passée dans un fractionnateur de cellules à 15°C et sous une pression d'environ 1600 bars.
Dans les deux types de traitement, les bactéries entières et les fragments de membrane externe sont éliminés par une centrifugation à 60 000 g, pendant 20 minutes. Le surnageant est un cassage brut contenant, entre autres, des vésicules de membrane interne inversées, avec les flavoprotéines de la chaîne respiratoire accessibles au NADH, NADPH et au pyruvate (et également au D- et L-lactate, L-malate, 3-glycérophosphate et au succinate) .
C - Immobilisation
Les bactéries, ou les préparations membranaires sont mélangées avec une solution de sérum albumine à 15 mg/ml de concentration finale, ou bien, en variante, à 15 mg/ml d'hémoglobine ou encore à une solution aqueuse de 50 mg/ml de gélatine ( cette dernière étant en surfusion à 40°C) , à raison de 20 mg/ml de protéines bactériennes. On réticule, à 0°C, avec du glutaraldéhyde à une concentration finale de 0,4%. Le mélange est homogénéisé, puis une partie est étalée rapidement sur le matériel fluorescent, protégé par une couche hydrophobe, perméable à l'oxygène, comme indiqué aux Exemples 1 et 2. Après environ 2 heures à 4°C, le matériel enzymatique est immergé à 0°C, dans une solution aqueuse à 1,25% de glutaraldéhyde pendant 6 minutes, pour parfaire la réticulation. On lave immédiatement 3 fois avec une solution aqueuse de lysine (0,1 M, pH = 7,6) dans du tampon phosphate (0,1 M, pH = 7,6). La lysine permet, lors des lavages, l'élimination de l'excès de glutaraldéhyde.
Le matériel composite peut être conservé à 4°C, en l'absence d'oxygène, dans ce dernier tampon contenant en outre 0,5 mM d'azoture de sodium.
EXEMPLE 4 : Dosages du L-lactate
A - Dosage du L-lactate à l'aide de E. coli
E. coli, cultivé comme décrit, en milieu minimum, sur D-L-lactate, présente une activité induite préférentiellement pour la respiration du L-lactate.
La respiration du L-lactate est globalement équivalente à une L-lactate oxydase :
chaîne respiratoire L-Lactate + 1/2 0„ > Pyruvate + H_0
Ces bactéries sont immobilisées par le glutaraldéhyde comme ci-dessus en présence d'un excès de sérum albumine, de D-L-lactate et de MgS04.
Le «K-, apparent» global, désigné ci-après par «K^.» est de 5 M en tampon 20 mM de phosphate de K à pH 7,5.
Le signal de fluorescence exprimé en % du «Vmax apparent» varie avec les concentrations connues de L-lactate selon la Figure 11, qui est une courbe d'étalonnage de 1'optrode enzymatique. On observe, sur cette figure, pour des concentrations de L-lactate inférieures à la concentration «K-.» divisée par 10 (zone 1) , une pseudo¬ linéarité de la vitesse initiale de la réaction. Le dosage des concentrations de L-lactate inconnues s'effectue alors avec une erreur inférieure à 2%. Quand la concentration de L-lactate s'accroît jusqu'à la concentration du substrat égale à «K >> (zone 2) , l'incertitude augmente, et elle augmente encore plus à des concentrations supérieures à "- -*«'' (zone 3) •
On préférera doser le L-lactate avec cette optrode à enzymes (protéines membranaires de la chaîne respiratoire) entre 0,05 mM et 1 mM, domaine de concentrations de la gamme étalon. Sachant que la concentration de L-lactate dans le yoghourt est aux environs de 80 mM, dans le vin de 15 mM, dans le sang d'un sportif après un effort physique moyen d'environ 4 mM, et dans le jus de fruit d'environ 3 mM, il conviendra de diluer respectivement et directement ces milieux biologiques dans le tampon du dosage, c'est-à-dire respectivement 30 fois, 6 fois, 1,6 fois, et 1,2 fois.
Pour doser le L-lactate dans le lait, qui contient moins de 1 mM de L-lactate, on immobilise un autre enzyme.
B - Dosage du L-lactate à l'aide de la L-lactate oxydase de Pediococcus species.
Pour doser le L-lactate dans le lait, qui contient moins de 0,1 mM de L-lactate, l'optrode utilisée à l'Exemple 4A est insuffisamment sensible. Pour effectuer ce dosage, on immobilise un autre enzyme, par exemple, une oxydase comme la L-lactate oxydase de Pediococcus species présentant un «K^» inférieur, un meilleur «Vmax» et la possibilité d'introduire plus d'enzyme dans le film enzymatique. L'utilisation de cet enzyme permet d'augmenter, pour une plus faible concentration à mesurer, la sensibilité et le signal du dosage. On peut alors doser entre 0,005 mM et 0,1 mM de L-lactate, domaine de concentrations de la gamme étalon.
De fait, on peut choisir, parmi plusieurs dizaines de chaînes respiratoires induites pour la respiration du L-lactate provenant de divers colibacilles, diverses bactéries ou diverses levures par exemple, et parmi divers enzymes utilisant le L-lactate, ces enzymes peuvent être purifiés ou non, provenir de divers microorganismes ou de divers tissus animaux ou végétaux et de diverses espèces du monde vivant. Il s'agit essentiellement d'une centaine d'oxydases et d'un millier de déshydrogénases à NAD et NADP , ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire.
C - Dosage du L-lactate à l'aide d'autres enzymes.
Le dosage du L-lactate peut ainsi s'effectuer avec des optrodes à enzymes différents. On peut se procurer la plupart de ces enzymes (oxydases et déshydrogénases) auprès de divers fournisseurs d'enzymes. On peut utiliser des icroorganismes induits par le D-L-lactate et immobilisés.
On peut notamment utiliser la L-lactate oxydase immobilisée à partir de Mvcobacteriuro sme matis ou de
Bacillus stearo-thermophilus, les déshydrogénases à NAD et NADP , telles que les L-lactate déshydrogénases de muscle de lapin, de poitrail de pigeon, de boeuf, de porc, de poulet, de chien et de truite, de coeur de rat, de boeuf, de porc et de poulet, de glande surrénale de boeuf, de foie de poulet, d'érythrocytes humains, de queue de langouste, de semence de taureau et de bulbe de pomme de terre. On choisira l'enzyme qui, a l'état de film immobilisé, présentera à la fois la meilleure stabilité et les meilleures constantes cinétiques : «K^», «Vmax», pH optimum et force ionique, en liaison avec les conditions du dosage de la substance à doser dans un milieu biologique donné, où l'on doit mesurer le L-lactate. Le pH optimum peut ne pas être un facteur limitant, car on peut diluer l'échantillon biologique dans le tampon du dosage.
Le «I .» pour le L-lactate est, en revanche, très important. On choisira le système enzymatique proche du
«K,», ce qui limitera les dilutions et facilitera le dosage.
Le «Vmax» élevé et l'augmentation de la concentration d'enzyme permettent d'augmenter la sensibilité du dosage. Les conditions d'immobilisation faisant varier la charge ou le degré d'hydrophobicité du polymère enzymatique permet également de moduler les paramètres cinétiques permettant l'optimisation du dosage («K^», «Vmax», tampon, pH et force ionique) . Dans chaque cas, une courbe d'étalonnage de pseudo ordre 1 sera établie. On cherchera à éviter des dilutions compliquées, tout en obtenant un signal compatible avec les optrodes enzymatiques de l'invention. Pour les milieux biologiques, les dilutions peuvent être automatisées, si nécessaire.
L'optrode enzymatique mesurant une concentration d'oxygène, le trouble persistant après dilution d'un milieu biologique, tel que le sang ou le yoghourt, n'est pas un handicap pour le dosage. La rapidité (moins de 30 secondes) permet l'obtention du résultat quasiment instantanément et évite de figer l'échantillon qui sinon évolue pendant les délais des dosages actuels (les dosages traditionnels durent au moins 30 minutes, sans compter le temps nécessaire au transport jusqu'au laboratoire d'analyse) . Dans le cas où le succinate, par exemple, est présent dans l'échantillon de L-lactate à doser, pour éviter une interférence (au niveau de la chaîne respiratoire) , on introduit préalablement à la mesure, un volume connu d'une solution aqueuse de fumarate de sodium ou de malonate de sodium, de telle sorte que la concentration finale soit de 100 mM à 300 mM, concentrations inhibant spécifiquement la mesure du succinate. La courbe d'étalonnage n'est pas modifiée.
Dans le cas de la médecine sportive, la partie jetable de l'optrode enzymatique (matériel enzymatique et matériel fluorescent) peut être remplacée manuellement en moins de 10 secondes. Le montage de la Figure 1 est alors préféré. Le dosage est effectué en moins de 15 secondes et peut être directement effectué sur une microgoutte de sang (environ 10 ul) sans traitement de l'échantillon. Il n'y a aucun risque de contamination bactérienne ou virale du sportif. Cela permet de suivre l'effort du sportif par le taux de L-lactate dans le sang. Avec une prise toutes les 10 minutes pendant 24 heures, un seul appareil permet d'établir les courbes d'accumulation de L-lactate dans le sang d'au moins 10 sportifs.
Dans le cas du suivi de fermentation lactique, on préférera la cuve à circulation (Figure 2) dosant successivement et automatiquement des échantillons toutes les 2 ou 3 minutes. EXEMPLE 5 : Dosages de l'acide succinigue ou de ses sels à des concentrations comprises entre 0.1 mM et 2 mM (domaine de la gamme étalon^ . On réalise ce dosage avec une optrode préparée avec E. coli cultivé en milieu minimum en présence de succinate.
Dans ces conditions, on a préférentiellement une activité globalement équivalente à une succinate oxydase. chaîne respiratoire succinate + 0 > fumarate + H O .
En cas d'interférence avec les autres métabolites de la chaîne respiratoire, on préférera utiliser ces mêmes bactéries chauffées à 57°C pendant 2 heures avant leur immobilisation. Ce chauffage n'a aucune influence sur la respiration du succinate, mais il diminue au moins d'un facteur de 10, la plupart des autres activités respiratoires contaminantes, telle que celle du L-lactate. Les bactéries induites et chauffées sont immobilisées comme décrit ci-dessus (en présence d'un excès de sérum albumine) par le glutaraldéhyde, en présence de succinate et de MgSO . Les applications sont multiples (métabolisme et industrie des peintures et des laques) .
EXEMPLE 6 : Dosages du NADH ou du NADPH à des concentrations comprises entre 0.05 et 1 mM (domaine de la gamme étalon..
On effectue ce dosage en préparant l'optrode avec
E. coli cultivé à 37°C, ou la souche PS3 cultivée à 65°C, sur un milieu riche en présence de glucose.
Les bactéries sont cassées avant immobilisation par le glutaraldéhyde en présence d'un excès de sérum albumine, de NAD et de MgSO.. Pour le dosage du NADH, il est préférable d'ajuster le pH de l'échantillon vers 7,6 et vers 5,8 pour le NADPH.
La réaction chimique peut s'écrire : chaîne respiratoire H + NAD(P)H + 1/2 02 » NAD(P) H20
Le dosage des déshydrogénases à co-facteurs
+ + NAD et NADP s'effectue de la même façon en co-immobilisant la déshydrogénase spécifique et la chaîne respiratoire avec l'excès de sérum albumine en présence de NAD et du MgSO .
Le NAD protège à la fois la chaîne respiratoire et les déshydrogénases.
On peut prendre l'exemple ci-dessous de l'alcool déshydrogénase (ADH) .
Le dosage de plusieurs milliers d'effecteurs des déshydrogénases est alors possible. EXEMPLE 7 : Dosages de l'éthanol à des concentrations comprises entre 0,01 et 0,2 mM (domaine de la gamme étalon) .
Des vésicules inversées d'E. coli, cultivé sur glucose, présentant une respiration du NADH, sont co-immobilisés avec 2 Ul/ml d'alcool déshydrogénase de levure, en présence d'un excès de sérum albumine, de NAD 10 mM et de MgSO , par le glutaraldéhyde. Les réactions chimiques sont les suivantes :
+ ADH > +
Ethanol + NAD < éthanal + NADH + H chaîne respiratoire H + NADH + 1/2 02 > H20 + NAD
Bilan: Ethanol + 1/2 O > éthanal + H_0.
Le «1^,» global, dans ces conditions, est de ImM.
On peut ainsi doser l'éthanol lors de fermentations alcooliques, dans le sang, dans le vin, dans le vinaigre, dans la bière, dans le jus de fruit, dans l'industrie des solvants et l'industrie des carburants, par exemple.
Des dosages plus sensibles utilisent d'autres alcools dééshydrogénases à NAD ou NADP ou des alcools oxydases.
D'autres déshydrogénases, spécifiques d'autres substances que l'éthanol, à co-facteurs NAD + ou NADP4- peuvent être utilisées à la place de l'alcool déshydrogénase. Ces enzymes permettent de doser quelques milliers d'effecteurs tels que par exemple : le glucose, le glycérol, le methanol, certains εtéroïdes, la cortisone, le cholestérol, le L-lactate, le L-malate, le pyruvate et le glutamate.
Ces effecteurs peuvent être dosés dans divers milieux biologiques provenant de divers champs d'applications, tels la médecine (alcoolémie) , la médecine vétérinaire, la pharmacie, l'agroalimentaire (fermentations, vin, alcools, vinaigres, jus de fruits, bière) ; la chimie fine (parfums, cosmétiques) et l'écotoxicologie. Les inhibiteurs et inactivateurs peuvent permettre de suivre leur concentration en écotocoxilogie et en défense civile par exemple. L'automatisation permet d'effectuer des expériences biologiques dans l'espace.
EXEMPLE 8 : Dosages du pyruvate
A - Dosage du pyruvate à l'aide de E. coli.
E. coli, , cultivé comme décrit ci-dessus sur glucose en milieu minimum, présente une activité constitutive pour la respiration du pyruvate, cette activité est globalement équivalente à une pyruvate oxydase.
chaîne respiratoire pyruvate + 1/2 0 > acide acétique + H 0 + CO
Les vésicules membranaires sont immobilisées par le glutaraldéhyde, comme ci-dessus, en présence d'un excès de sérum albumine et de 5mM de TPP, de 5 uM de FAD et de 200 mM de D,L-lactate ou de pyruvate.
Le «K„» global, dans les conditions du dosage, est de 20 mM en tampon maléate de K pH 6,0 à 35°C.
Afin d'éliminer, si nécessaire, la plupart des autres oxydations de la chaîne respiratoire, qui pourraient interférer avec le dosage (telles que celle du L-lactate, glycérophosphate, L-malate, NADH et du NADPH) , les vésicules bactériennes peuvent être chauffées 2 heures à 57°C. On peut également éliminer la respiration du succinate en l'inhibant par le malonate ou le fumarate.
On préférera doser le pyruvate avec cette optrode à enzymes (protéines membranaires de la chaîne respiratoire) entre 0,2 mM et 4 mM, domaine de la gamme étalon. On peut doser le pyruvate dans les fermentations lactiques. Pour doser la contamination bactérienne dans le lait (pyruvate < 0,3 mM) , il faut utiliser une autre source d'enzymes comme, par exemple, dans les conditions suivantes:
B - Dosage du pyruvate à l'aide de la pyruvate oxydase de
Pediococcus species (POP) .
2 Ul/ml sont immobilisées par le glutaraldéhyde en présence d'un excès de sérum albumine avec les divers protecteurs, dans les mêmes conditions que ci-dessus (TPP,
FAD, pyruvate et MgS04) . La réaction chimique s'écrit :
POP pyruvate + Pi + 0_ _ acétyl-phosphate + CO + H_0
Le dosage s'effectue en 20 mM de phosphate de K, à pH 7,0, à 35°C, avec les divers effecteurs cités ci-dessus. Le «Kj.» pour le pyruvate est de 0,5 mM, le pyruvate peut être dosé entre 0,05 mM et 0,1 mM, domaine de la gamme étalon.
Ce dosage convient à la mesure de la contamination du lait par les bactéries (le dosage du pyruvate par un dosage biochimique est déjà utilisé par plusieurs pays - le dosage avec l'optrode enzymatique présente de nombreux avantages : durée, coût et facilité) .
Le dosage du pyruvate ouvre de nombreuses applications étant donné le rôle de plaque tournante joué par le pyruvate dans le métabolisme (applications en médecine, dans les fermentations et dans l'industrie des arômes par exemple) .
EXEMPLE 9 : Mesures automatisées, par les optrodes à enzymes, de la variation de concentration d'oxygène.
La consommation d'oxygène provoquée par l'oxydation des métabolites catalysée spécifiquement par les matériels enzymatiques est mesurée par l'optrode à luminescence. L'échantillon à doser, d'environ 10 ul, est déposé automatiquement sur le matériel enzymatique immobilisé qui est isolé par exemple par une couche hydrophobe, perméable â l'oxygène, du matériel luminescent sensible à la consommation d'oxygène. La sonde est conforme au montage de la Figure 1, en cas d'optrodes jetables et remplaçables automatiquement, ou de la Figure 4, permettant un flux continu et successif de metabolite et de solution de rinçage
L'optrode (matériel enzymatique + matériel luminescent) est, dans ce deuxième cas, séquentiellement exposée :
1) au tampon saturé d'oxygène à 35°C,
2) à l'air, pour finir de saturer la sonde d'oxygène,
3) à l'échantillon dilué dans le tampon saturé d'oxygène à 35°C.
La pente de la vitesse initiale de consommation d'oxygène (augmentation de l'intensité de luminescence ou de la durée de vie des états excités) est calculée par les microprocesseurs et comparée automatiquement avec la courbe étalon obtenue préalablement avec diverses concentrations connues de métabolites (aux environ de un dixième de
«KM» du matériel enzymatique immobilisé) .
Le dosage est effectué en moins de 15 secondes, le processus de rinçage et de saturation par l'oxygène de la sonde prend environ 1 minute. Le dosage peut ainsi être répété automatiquement plus de 500 fois. Le résultat permet de régler divers automatismes (pompes, vannes, additifs et arrêts) . La miniaturisation et l'automatisation permettent, par exemple, d'effectuer des expériences biologiques dans des conditions d'apesanteur comme dans la recherche spatiale.
On notera que, dans un appareil conforme à l'invention, on utilise, pour chaque substance à doser, un enzyme spécifique immobilisé et un système informatique à programme interchangeable, ce qui permet d'obtenir des optrodes à enzyme à usages multiples. Il est bien entendu que les modes de réalisation de l'invention ci-dessus décrits ne sont aucunement limitatifs et pourront donner lieu à toutes modifications désirables sans sortir pour cela du cadre de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Optrode à enzyme pour les dosages des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à
NAD ou NADP , ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire, caractérisée par le fait que le matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217 ; 317) est immobilisé sous forme réticulée, et est associé à un matériel luminescent (fluorescent ou phosphorescent) (15 ; 115 ; 215; 315) , ledit matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217 ; 317) et ledit matériel luminescent (15 ; 115 ; 215 ; 315) constituant ensemble un matériel ou un film composite (18 ; 118 ; 218 ; 318) qui est associé à des moyens pour détecter l'augmentation de l'émission de luminescence ou l'augmentation de la durée de vie des états excités responsables de cette émission, ces augmentations étant provoquées par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser, l'échantillon à doser (28 ; 128 ; 228 ; 328) ayant été amené au contact du matériel enzymatique, ladite augmentation de l'émission ou de la durée de vie des états excités étant un paramètre représentatif de la concentration de la substance à doser. 2 - Optrode à enzyme selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217 ; 317 ; 317) est immobilisé par réticulation covalente par des agents pontants.
3 - Optrode à enzyme selon la revendication 2, caractérisée par le fait que les agents pontants sont choisis parmi le glutaraldéhyde, les carbodiimides, le N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate de sodium (SPDP) et les azotures.
4 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée par le fait que le matériel enzymatique (17 ; 117 ; 217 ; 317) est immobilisé pour constituer le film enzymatique, en présence d'au moins une protéine inerte en excès, comme la sérum albumine, l'hémoglobine et/ou la gélatine.
5 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que l'échantillon aqueux à doser (28 ; 128 ; 228) est appliqué sur le matériel enzymatique immobilisé (17 ; 117 ; 217) séparé, par un film hydrophobe perméable à l'oxygène (16 ; 116a ; 216a) , du matériel fluorescent (15 ; 115 ; 215) . 6 - Optrode à enzyme selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la couche de matériel fluorescent (15) renferme une substance active adsorbée sur un support, séparée du matériel enzymatique (17) par le film (16) hydrophobe et perméable à l'oxygène. 7 - Optrode à enzyme selon la revendication 6, caractérisée par le fait que le support adsorbant est constitué par de la silice, de l'alumine, du silicate d'alumine (kaolin) , ou des résines obtenues par copolymérisation de styrène et de divinylbenzène. 8 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée par le fait que le film (16) hydrophobe et perméable à l'oxygène est un film en polyoléfine, polymère fluoré, ou en silicone, ledit film pouvant être soit rapporté, soit formé sur place à partir de solutions, de dispersions ou d'aérosols.
9 - Optrode à enzyme selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est directement formée en couche mince, par exemple par sublimation, evaporation sous vide ou à partir d'un solvant, ladite couche pouvant être soit rapportée, soit formée sur place à partir de solutions, de dispersions ou d'aérosols.
10 - Optrode à enzyme selon la revendication 5, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est piégée dans un film polymérique (115) , par exemple, dans un film du type résine de silicone. 11 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est conditionnée sous forme de microcapsules, de microémulsions ou de liposomes (215) , et qu'elle se trouve au sein du matériel enzymatique (217) .
12 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active (315) est solubilisée directement dans la protéine inerte constituant le film enzymatique (317) .
13 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée par le fait qu'elle peut incorporer un film (16a ; 116a ; 216a.) . opaque à la lumière, adapté pour éviter toute influence parasite de la lumière ambiante, ledit film pouvant être constitué par l'une des couches ou films de la structure, en dehors de la couche de matériel fluorescent.
14 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée par le fait que la substance fluorescente active est choisie parmi les dérivés du pérylène ou d'autres substances fluorescentes sensibles à l'oxygène.
15 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée par le fait que le film composite enzymatique et fluorescent est placé sur une plaque-support transparente (13 ; 102 ; 213) .
16 - Optrode à enzyme selon la revendication 1 à 15, caractérisé par le fait qu'elle comporte un support (2) comportant un évidement (8) destiné à recevoir le matériel composite (18) éventuellement sur sa plaque-support (13) , ledit support (2) comportant des chemins optiques (11 ; 12) pour l'excitation de la substance fluorescente et l'émission de la fluorescence, le matériel composite (18) constituant un élément de mesure amovible, jetable ou réutilisable après usage, plusieurs éléments de mesure de ce type pouvant être associés successivement au support (2) . 17 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé par le fait qu'elle comporte un support transparent (102) , sur lequel est disposé le film composite (118) , et une cuve à circulation (129) rapportée contre ledit support (102) , de telle sorte que l'échantillon à doser (128) pénètre dans ladite cuve (129) , vienne en contact avec la couche enzymatique du film et sorte ensuite de ladite cuve.
18 - Optrode à enzyme selon l'une des revendica- tions 1 à 17, caractérisée par le fait que les faisceaux d'excitation et d'émission de fluorescence peuvent être transmis par l'intermédiaire d'une fibre optique (142), cette fibre optique pouvant également être utilisée avec l'optrode (1) . 19 - Optrode à enzyme selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée par le fait que les moyens de détection sont constitués par : des moyens d'excitation (20) , destinés à exciter la substance fluorescente et disposés en amont du film composite (18 ; 118 ; 218 ; 318) ; un premier filtre optique (21) interposé entre lesdits moyens d'excitation (20) et le film composite (18 ; 118 ; 218 ; 318) , et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde d'excitation (X. ) ; - un photodétecteur (22) destiné à capter l'émission de fluorescence, disposé en aval du film composite (18 ; 118 ; 218 ; 318) ; un deuxième filtre optique (23) interposé entre le film composite (18 ; 118 ; 218 ; 318) et ledit photo- détecteur (22) , et destiné à améliorer la sélectivité de la longueur d'onde de fluorescence (A. ) ; des moyens de détection et d'amplification (24 ; 124) disposés en sortie dudit photodétecteur (22) ; des moyens (25) de traitement numérique du signal analogique fourni par les moyens de détection et d'amplification (24 ; 124) ; des moyens d'affichage (26) ou de commande de périphériques (28) , pilotés par les moyens de traitement numérique.
20 - Optrode à enzyme selon la revendication 19, caractérisée par le fait que, lorsqu'on mesure des intensités lumineuses, il est prévu une modulation (27) de l'excitation (20) conjointement à une détection synchrone du signal de sortie du photodétecteur (22) .
21 - Optrode à enzyme selon la revendication 19, caractérisée par le fait que, lorsqu'on mesure la durée de vie des états excités, il est prévu un système démodulateur synchrone à asservissement de phase (124) .
22 - Procédé de dosage par voie enzymatique des effecteurs, contenus dans des milieux biologiques, de la chaîne respiratoire, des oxydases et des déshydrogénases à
+ + NAD ou NADP , ces dernières étant, pour le dosage, couplées à la chaîne respiratoire, caractérisé par le fait qu'on immobilise sous la forme d'un film réticulé le matériel enzymatique et on l'associe à un matériel luminescent ; on applique l'échantillon contenant la substance à doser sur le film enzymatique ; on détecte l'augmentation de l'émission de luminescence ou l'augmentation de la durée de vie des états excités qui est provoquée par la consommation d'oxygène lors de la transformation catalytique, par l'enzyme, de la substance à doser, ladite augmentation de l'émission ou de la durée de vie des états excités étant un paramètre représentatif de la concentration de la substance à doser.
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