CH621410A5 - - Google Patents

Description

L'invention concerne l'analyse d'échantillons de très faibles volumes, analyses que nous désignerons ci-après sous le terme général de «micro-analyses».

La pratique des analyses sur des quantités très petites de substance est dictée par des raisons diverses. Parmi celles-ci, on peut mentionner le coût très élevé de certains réactifs, ou encore le fait qu'ils ne soient disponibles qu'en quantités limitées, mais la principale raison est de ne disposer que d'échantillons très petits. Ces contraintes sont fréquentes dans le domaine des analyses biochimiques, et plus précisément dans certaines analyses de diagnostic médical. Un domaine privilégié d'utilisation des techniques de micro-analyse est celui de l'analyse enzymatique.

Un avantage décisif de l'utilisation des très petits volumes est d'améliorer le rapport signal/bruit de fond dans la mesure des phénomènes observés. Ainsi, lorsqu'on effectue une réaction enzymatique dans laquelle l'activité enzymatique est très faible, la présence d'une quantité disproportionnée de substrat peut compromettre la mesure. En effet, les substrats utilisés pour ce type d'analyse ne sont jamais parfaitement purs, et le bruit de fond, dû à ces impuretés, rend le signal difficilement lisible. Il est donc souhaitable, pour des réactions de ce type, de réduire le volume de substrat jusqu'à des quantités comparables à celles des substances à analyser. Par suite, le bruit de fond est diminué sans que le signal soit modifié, ce qui rend la mesure plus sûre et plus aisée.

L'utilisation de quantités très petites de substance dans la mise en œuvre des réactions soulève des difficultés particulières liées aux manipulations des échantillons et des réactifs utilisés au cours de ces analyses. C'est à celles-ci que l'invention se rapporte.

Pour la mesure exacte d'échantillons liquides de faibles volumes, on dispose à l'heure actuelle principalement d'instruments du type pipette à constriction ou microseringue. Ces instruments sont cependant d'un emploi mal commode, voire même impossible lorsque les volumes traités deviennent trop faibles, en particulier lorsque l'échantillon ou le réactif de volume mesuré doit être constitué tel quel, c'est-à-dire sans qu'il soit volatilisé (comme en Chromatographie gazeuse) ou qu'il soit introduit dans un milieu liquide de volume beaucoup plus important. Ainsi, sous l'effet des forces électrostatiques, les gouttelettes de faible volume, lorsqu'elles sont séparées de l'instrument qui sert à les former, ont tendance à éclater spontanément. Le mélange de deux gouttelettes, pour les faire réagir, est aussi un problème, les forces de cohésion de chacune d'elles s'opposant à leur fusion.

L'invention a pour but de faciliter la mise en œuvre des réactifs et des échantillons dans les techniques de «micro-analyse» et d'en améliorer ainsi la précision et la sensibilité. En particulier, l'invention se propose d'aboutir à un dosage très précis des constituants mis en réaction et d'assurer la bonne formation du mélange de ceux-ci de telle sorte que la réaction puisse se développer normalement.

On a en effet montré qu'il était possible de remédier aux difficultés de manipulation rencontrées précédemment dans les techniques de micro-analyse au moyen d'un dispositif pour le prélèvement, le dosage et la mise en contact des constituants de la réaction, qu'il s'agisse des échantillons à analyser ou des réactifs

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et qu'on désignera indifféremment ci-après, pour simplifier, par le terme général de «réactifs», qui comprend :

— au moins un élément préleveur-doseur dont une partie au moins se présente sous forme d'une tige ou d'une aiguille; l'extrémité de cette tige ou de cette aiguille servant au prélèvement étant agencée de telle sorte que, lorsqu'elle est plongée, puis retirée du réactif, elle retienne, par le jeu des tensions superficielles, un volume déterminé de celui-ci;

— un support capable de recevoir un ou plusieurs éléments préleveurs-doseurs, l'élément préleveur-doseur pouvant être fixé, de façon temporaire ou permanente, sur ce support;

— un récipient sur lequel ledit support peut être positionné, et éventuellement fixé, de telle façon que les extrémités des éléments préleveurs-doseurs portant les fractions de réactifs se trouvent à l'intérieur dudit récipient, la section droite de celui-ci, dans la partie opposée à celle sur laquelle le support est positionné, se réduisant progressivement de façon que les gouttes de réactif puissent se rassembler par centrifugation en un même point.

Pour obtenir la fixation d'une goutte de très faible volume, par capillarité, à l'extrémité d'une tige ou d'une aiguille, ou encore au voisinage de cette extrémité, les dispositions les plus variées peuvent être adoptées. Elles sont conditionnées par le matériau de la tige, de ses dimensions, de son état en surface et, bien entendu, de la nature du liquide prélevé, toutes caractéristiques dont dépendent les interactions du liquide et de l'aiguille ou de la tige.

L'extrémité de la tige ou de l'aiguille de l'élément préleveur-doseur sera d'une dimension et d'un état de surface tels que la fixation du liquide s'effectue à l'emplacement prévu à cet effet, et à cet emplacement seulement. Celui-ci peut être matérialisé de diverses façons; dans certains cas, la simple section droite d'une aiguille peut suffire à retenir une gouttelette, alors que, en raison de la courbure de l'aiguille, le liquide n'est pas retenu sur les parties cylindriques. Il est aussi possible de prévoir une cavité, une anfractuosité ou encore une modification de l'état de surface à l'extrémité de la tige ou de l'aiguille, ou encore latéralement à proximité de cette extrémité, ces dispositions ayant pour but de faciliter 1'«accrochage» de la gouttelette sur la tige ou l'aiguille. On peut, en particulier, percer l'aiguille d'une ouverture latérale. On utilisera avantageusement des aiguilles cylindriques en acier ou en matériaux plastiques (polyamides, polyesters, polytétra-fluoréthylène, etc.) suffisamment rigides.

Les éléments préleveurs-doseurs peuvent être fixés sur leur support de façons très diverses. En particulier, les tiges ou aiguilles peuvent être emboîtées avec friction dans des logements prévus à cet effet dans la masse du support. On peut également prévoir d'introduire les aiguilles ou les tiges dans des canaux traversant le support et disposer des moyens de blocage (clavette, goupille, vis, etc.) pour les maintenir en position fixe lorsque cela est nécessaire.

La forme du support est avantageusement telle que celui-ci s'adapte au récipient à la façon d'un chapeau ou d'un couvercle. Le positionnement du support sur le récipient peut être obtenu en particulier par emboîtement partiel du support dans le récipient, ou inversement. Dans les deux cas, une position en butée limite les mouvements du support par rapport au récipient. L'assemblage peut aussi être effectué par vissage du support sur le récipient, ou réciproquement, ou encore par tout autre moyen traditionnel pour réaliser ce type d'assemblage.

Avantageusement, le récipient présente la forme générale d'un tube dont l'extrémité opposée à celle qui reçoit le support se rétrécit en formant entonnoir. Celui-ci peut être soit fermé, dans le cas où la réaction et l'analyse sont réalisées dans le tube même, soit ouvert pour déboucher alors sur un réceptacle annexe. L'ouverture du tube, dans ce cas, est limitée aux dimensions utiles pour laisser passer les réactifs dans le réceptacle, et, de toute façon, l'ouverture est de dimensions au plus égales à celles du réceptacle correspondant, de telle sorte que tous les réactifs soient bien canalisés vers le réceptacle. Avantageusement, le dispositif selon l'invention est ainsi combiné à des réceptacles connus, utilisés pour les micro-analyses et désignés sous le nom de «microcuvettes». Ces réceptacles sont formés dans des feuilles de matériaux plastiques de faible épaisseur et sont généralement transparents, facilitant ainsi l'observation de la réaction, notamment pour les mesures spectrophotométriques ou spectrofluorimé-triques. Les microcuvettes sont avantageusement constituées par de simples alvéoles formés dans la feuille même de matériau polymère, par poinçonnage par exemple. Elles peuvent aussi être formées par l'ensemble d'une feuille polymère plane prise entre deux plaques munies d'une ouverture. Dans ce cas, la microcuvette est délimitée par la feuille formant le fond et par l'ouverture de l'une des plaques pour les parois latérales. Lorsque de tels réceptacles sont utilisés pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, on prévoit des moyens pour le positionnement relatif du tube et de la microcuvette, de telle sorte que celle-ci soit placée face à l'ouverture de «l'entonnoir».

L'ensemble constitué par le support, le tube et éventuellement le réceptacle annexe délimite, de préférence, un espace pratiquement clos.

Le dispositif selon l'invention peut également comprendre une multiplicité de tubes avec les supports correspondants. Cette disposition est particulièrement souhaitable pour les analyses de routine pour lesquelles un grand nombre de manipulations de même nature peuvent être réalisées en série. Une disposition particulière consiste à réaliser les tubes par moulage ou façonnage dans une pièce unique. Dans ce cas, à chaque tube peut correspondre un support distinct, mais avantageusement les supports sont réunis en une seule pièce s'ajustant à celle formant les tubes. Dans ce cas également, l'usage de microcuvettes est particulièrement avantageux. On peut disposer en effet, sur une même feuille de matériau plastique, autant de microcuvettes que l'on a de tubes, le positionnement des uns par rapport aux autres étant réalisé en une seule opération.

Dans les procédés qui sont décrits plus loin, les tubes ou ensembles de tubes dont il vient d'être question sont soumis à une centrifugation. Ils peuvent donc encore être munis de moyens permettant leur fixation dans une centrifugeuse.

L'invention pourra être bien comprise en se reportant aux figures annexées de modes particuliers de réalisation de dispositifs selon l'invention dans lesquelles :

les fig. 1 à 5 représentent de façon schématique un agrandissement de quelques types d'extrémités des tiges ou aiguilles de prélèvement utilisables dans les dispositifs selon l'invention;

la fig. 6 est une coupe schématique de l'ensemble monté comprenant un support 2 avec deux aiguilles 1 maintenues par des vis de blocage, et un tube 3 dont l'extrémité en entonnoir est fermée;

la fig. 7 est une coupe schématique d'un autre type d'assemblage tube/support;

la fig. 8 est une coupe schématique de l'extrémité ouverte du tube en forme d'entonnoir 3 et d'un réceptacle 4 formé par deux plaques support 5 et 6, dont l'une présente une ouverture en regard de l'entonnoir, une feuille de matériau polymère 7, emprisonnée entre les deux plaques, forme le fond du réceptacle, une pièce de positionnement 8 maintenant le tube 3 ;

la fig. 9 est une coupe schématique d'une autre réalisation du réceptacle 4; une microcuvette est formée dans la feuille 7 et vient se loger dans une cavité correspondante de la plaque 6 ;

la fig. 10 représente en perspective, avec une coupe partielle au niveau d'un tube, un ensemble de tubes réunis dans un même bloc, la plaque portant microcuvettes et la pièce support.

Pour effectuer une micro-analyse selon l'invention et à l'aide d'un des dispositifs présentant les caractéristiques de ceux qui ont été décrits précédemment, on procède de la façon suivante: — chaque élément préleveur-doseur est plongé dans le réactif approprié, puis retiré avec la gouttelette prélevée et retenue

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par capillarité; à ce stade, les éléments préleveurs-doseurs sont avantageusement déjà fixés sur un support, mais ils peuvent également être fixés postérieurement au prélèvement; — le support est mis en place sur le récipient correspondant et l'ensemble est soumis à une centrifugation suffisamment intense pour que les gouttelettes se détachent des préleveurs-doseurs et soient projetées vers l'extrémité du récipient où elles se réunissent, suivant le cas, soit au fond du récipient, soit dans un réceptacle disposé à l'extrémité ouverte de ce dernier. La réaction et l'analyse sont ensuite poursuivies selon les modalités et avec les moyens habituels en micro-analyse.

Les quantités de liquide prélevées pour ces micro-analyses sont ordinairement inférieures à 1 jil. Elles peuvent être aussi faibles que 0,01 ni ou même moins. Le plus souvent, les quantités prélevées sont comprises entre 0,1 et 1 jj.1.

Il faut remarquer qu'en se servant des dispositifs de prélèvement selon l'invention on obtient, pour un même liquide et un même préleveur, un volume remarquablement reproductible avec un minimum de précaution. De plus, la précision relative est pratiquement indépendante du volume considéré alors que, avec les dispositifs utilisés antérieurement, l'erreur relative sur le volume croît très rapidement lorsqu'on atteint les quantités les plus faibles utilisables. Si cela est nécessaire, on pourra déterminer avec précision la quantité prélevée dans chaque opération par un étalonnage préalable du préleveur utilisé.

Les fractions de liquide fixées par capillarité sur les tiges ou aiguilles doivent être intégralement récupérées, puis réunies pour former le mélange réactionnel. On a dit les difficultés qui résultent ordinairement de la manipulation des très faibles volumes. Par la centrifugation, on sépare sans difficulté les gouttelettes de liquide et on les rassemble dans le même réceptacle. La force centrifuge exercée doit être suffisante pour vaincre les tensions superficielles qui retiennent la gouttelette sur le préleveur, et surtout pour vaincre les forces de cohésion qui s'opposent à la réunion de plusieurs gouttelettes entre elles. Par exemple, une centrifugation de l'ordre de 3000 g ou plus convient.

Au cours des diverses manipulations de ces volumes très petits, il faut éviter les pertes par évaporation. C'est au cours de la centrifugation que les risques d'évaporation sont les plus grands. Aussi, pour éviter ces difficultés, les réactifs prélevés sont maintenus dans un espace clos délimité par le tube, le support et éventuellement le réceptacle, au moins pendant l'opération de centrifugation.

Lorsqu'on utilise un tube fermé, le milieu réactionnel est constitué au fond du tube, et la réaction et l'analyse doivent être poursuivies dans le tube, ce qui peut présenter de réelles difficultés compte tenu des dimensions du tube par rapport à celles de ce milieu réactionnel. Il est donc préférable de récupérer ce milieu au sein d'un réceptacle dont les caractéristiques facilitent les opérations ultérieures. C'est pour cette raison que l'on utilise avantageusement un réceptacle du type microcuvette. Le volume de la microcuvette peut être aussi petit que l'on souhaite, notamment de l'ordre de quelques microlitres.

Après la centrifugation, la microcuvette est séparée du tube pour procéder aux mesures des résultats de la réaction. A ce stade, il peut être avantageux d'enfermer le mélange réactionnel de façon étanche dans la microcuvette pour éviter toute perte. Une deuxième feuille de matériau polymère peut être alors utilisée pour fermer la microcuvette. Cette opération est particulièrement utile lorsque la réaction n'est pas immédiate et qu'un certain temps d'«incubation» doit être observé. C'est notamment le cas pour les analyses enzymatiques qui constituent le domaine le plus important de la micro-analyse.

Le procédé selon l'invention qui vient d'être décrit s'applique également dans le cas où l'on opère avec un dispositif à tubes multiples pour les analyses en série. Dans ce cas, une seule centrifugation est nécessaire et l'ensemble des microcuvettes peut, par exemple, subir simultanément un traitement uniforme d'incubation. Ces dispositifs se prêtent également à l'analyse automatisée sur un appareil de mesure approprié, notamment sur les appareils du type spectrophotomètre ou spectrofluorimétrie.

En raison de leur faible coût, les microcuvettes ne sont pas réutilisées. Par ailleurs, après centrifugation, aucune trace de liquide ne reste accrochée aux aiguilles ou aux tubes, si bien qu'il n'est pas nécessaire, avant de réutiliser les dispositifs, de prévoir aucune opération de nettoyage ou de stérilisation, ce qui est un avantage certain pour les analyses de routine faites en très grand nombre.

Les dispositifs et procédés selon l'invention sont applicables à toutes les analyses qui doivent être réalisées sur des volumes très faibles de substance. Le domaine d'application le plus important, comme on l'a indiqué, est celui des réactions enzymatiques, et en particulier des réactions de diagnostic. Dans ces réactions, on met en évidence des caractéristiques de l'activité enzymatique d'un organe, d'un tissu, etc. La micro-analyse est alors d'autant plus intéressante que l'on est conduit à effectuer la mesure sur des échantillons correspondant à l'activité enzymatique d'un nombre très restreint de cellules, voire même d'une seule cellule. La précision de la mesure est liée en effet, pour une large part, à la concentration de l'enzyme dans le milieu analysé. Donc, pour une même activité enzymatique, il est souhaitable d'opérer sur un volume aussi petit que possible pour limiter la dilution. De même, les quantités de substrat utilisées pour ces analyses doivent être aussi faibles que possible.

Ces techniques de micro-analyse sont utiles notamment pour effectuer des diagnostics, par exemple pour des affections hépatiques ou rénales, à partir de petites quantités de sérum, ou encore de maladies du sang. Elles permettent également des analyses commodes de différentes sécrétions internes ou du liquide céphalo-rachidien.

Elles permettent aussi le dépistage de maladies génétiques fréquentes telles que la mucoviscidose, ou rares telles que les gangliosidoses GMi et GM2 (par l'absence de ganglioside-ß-galactosidase), les maladies de Gaucher et de Fabry, de même que le syndrome de Lesch-Nynan (dû à la déficience en hypoxanthine-guanine-phosphoryl-transférase), et ceci dès le début de la grossesse, en étudiant par exemple les cellules du liquide amniotique.

Au laboratoire, la micro-analyse, dans les mesures enzymatiques, est également un moyen très efficace pour les études de complémentation génétique. Ces études servent notamment à déceler les hétérogénéités génétiques, à classifier les maladies héréditaires, à déterminer la nature des protéines intervenant dans ces affections, etc.

Dans ces mesures d'activité enzymatique selon les modes de la micro-analyse, la mesure est avantageusement réalisée par spec-trophotométrie, spectrofluorimétrie, ou encore par des techniques de comptage radio-actif. Ces méthodes présentent en effet l'avantage de pouvoir être mises en œuvre même lorsque l'échantillon étudié est d'un très faible volume, ce qui est le cas par définition lorsqu'on effectue une micro-analyse. On pourra utiliser la spec-trophotométrie ou la spectrofluorimétrie chaque fois que la réaction enzymatique s'accompagnera de la formation ou de la disparition d'un composé présentant un spectre d'absorption particulier. C'est le cas notamment de nombreuses hydrolases qui libèrent de la méthylumbelliférone à partir des substrats artificiels appropriés ou des déhydrogénases qui réduisent le NADP, lesquels deviennent fortement fluorescents en présence d'une solution alcaline. Lorsqu'on utilise un substrat radio-actif, après l'incubation, on effectue une séparation des constituants suivant des techniques habituelles de Chromatographie, d'électrophorèse, etc., et l'on mesure par comptage l'activité des différents constituants du mélange réactionnel.

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Ces applications n'ont bien entendu aucun caractère limitatif; elles ont pour seul but d'indiquer des domaines dans lesquels les procédés et dispositifs selon l'invention sont particulièrement utiles.

Bien qu'on ait décrit spécialement l'utilisation des procédés de micro-analyse aux mesures enzymatiques, il va de soi que ceux-ci ne constituent qu'un exemple préféré.

On dispose ainsi, grâce à l'invention, d'un dispositif et d'un procédé améliorés facilitant la réalisation de micro-analyses.

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1 feuille dessins

Claims (13)

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1. Dispositif pour le prélèvement, le dosage et la mise en contact de réactifs au cours d'une micro-analyse comprenant:

— au moins un élément préleveur-doseur dont une partie au moins se présente sous forme d'une tige ou d'une aiguille, l'extrémité de cette tige ou de cette aiguille étant agencée de telle sorte que, lorsqu'elle est plongée dans le réactif, puis retirée de celui-ci, elle retienne, par le jeu des tensions superficielles, un volume déterminé de ce réactif;

— un support capable de recevoir un ou plusieurs éléments préleveurs-doseurs, le ou les éléments préleveurs-doseurs pouvant être fixés sur le support;

— un récipient sur lequel ledit support peut être positionné de telle façon que les extrémités des éléments préleveurs-doseurs portant les réactifs se trouvent à l'intérieur dudit récipient, la section droite de celui-ci, dans la partie opposée à celle sur laquelle le support est positionné, se réduisant progressivement de façon que les gouttes de réactif puissent se rassembler par centrifugation en un même point.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les tiges ou aiguilles des éléments préleveurs-doseurs présentent à leur extrémité, ou latéralement au voisinage de celle-ci, une anfractuo-sité, une perforation ou une zone de surface irrégulière constituant le point de fixation par capillarité du réactif prélevé.

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REVENDICATIONS

3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'élément préleveur-doseur est constitué par une aiguille cylindrique percée d'un chas au voisinage de son extrémité.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le récipient est un tube fermé à une extrémité formant entonnoir.

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le récipient est un tube dont une extrémité formant entonnoir débouche sur un réceptacle qui prolonge le tube mais est distinct de celui-ci.

6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le réceptacle est constitué par une microcuvette formée dans une feuille de matériau polymère.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'ensemble support récipient, éventuellement prolongé par le réceptacle, est réalisé de telle façon qu'il puisse être disposé dans une centrifugeuse.

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de récipients réunis dans un même ensemble ou formés dans une seule pièce pour effectuer simultanément des séries d'analyses analogues.

9. Utilisation du dispositif selon la revendication 1 pour le prélèvement, le dosage et la mise en contact de réactifs au cours d'une micro-analyse dans laquelle:

a) on prélève un ou plusieurs réactifs mis en jeu au cours de l'analyse, à l'aide des éléments préleveurs-doseurs ;

b) les éléments préleveurs-doseurs sont positionnés à l'intérieur d'un récipient;

c) l'ensemble est soumis à une centrifugation d'une intensité suffisante pour que les prélèvements se séparent des éléments préleveurs-doseurs et soient projetés vers le fond du récipient où ils sont réunis en un même mélange.

10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que les volumes prélevés sont compris entre 0,01 ni et 1 ni.

11. Utilisation selon les revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que pendant la centrifugation, pour éviter la perte de substance par évaporation, les prélèvements sont maintenus dans un espace pratiquement clos, constitué par le récipient, un support des éléments préleveurs-doseurs et éventuellement le réceptacle.

12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que les prélèvements sont précipités par centrifugation dans une microcuvette d'une feuille de matériau polymère, celle-ci étant placée à l'extrémité d'un tube formant entonnoir.

13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que les prélèvements sont précipités par centrifugation dans un réceptacle formé, pour le fond, par une feuille de matériau polymère maintenue entre deux plaques, et, pour les parois latérales du réceptacle, par les parois internes d'une ouverture percée dans la plaque disposée à l'extrémité d'un tube formant entonnoir.