DE3639352C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen einer spezifischen
Bindereaktion.
Die immunologische Analyse wurde entwickelt, um Immun-Substanzen,
Hormone, Medikamente und verschiedene Komponenten, wie
Immun-Regulatoren, welche in geringen Mengen in lebenden Körpern
vorhanden sind, mittels spezifischer immunologischer Reaktionen
zu vermessen. Der Ausdruck "spezifische Bindereaktion"
soll nachfolgend so verstanden werden, daß alle Reaktionen
erfaßt sind, bei denen Liganden mit spezifischen Substanzen
reagieren. Der Begriff "spezifische Bindereaktion"
umfaßt deshalb nicht nur immunologische Antigen/Antikörper-Reaktionen,
sondern auch Avidin/Biotin-Reaktionen, Protein
A-IgG Fc-Fragment-Reaktionen und Hormon/Rezeptor-Reaktionen.
Beispielsweise kann die immunologische Analyse grob eingeteilt
werden in eine Gruppe, in welcher eine Markierung stattfindet,
wobei Enzyme und Isotope als Indikatoren verwendet werden, sowie
eine nicht-markierende immunologische Analyse, bei welcher
Antigen/Antikörper-Komplexe direkt gemessen werden.
Bei der zuerst genannten, markierenden immunologischen Analyse
ist insbesondere die Radio-Immuno-Analyse (RIA), die Enzym-Immuno-Analyse
(EIA) und die Fluoro-Immuno-Analyse (FIA) bekannt.
Diese Analysemethoden haben den Vorteil hoher Empfindlichkeit,
sind aber mit dem Nachteil behaftet, daß die Handhabung der
Isotope sowie der verbrauchten Flüssigkeit schwierig ist. Auch
sind die Meßzeiten sehr lang und die für die Markierung erforderlichen
Substanzen teuer, so daß die Analysekosten pro Probe
verhältnismäßig groß sind.
Bei der oben genannten nicht-markierenden immunologischen Analyse
sind insbesondere die Immuno-Elektrophorese, die Immuno-Diffusion
und die Sedimentation bekannt. Diese Verfahren sind
eingehend in der japanischen Fachzeitschrift "Summary of
Clinical Test Method", Verlag Kinbara, sowie in der Zeitschrift
"Clinical Test", Vol. 22, Nr. 5 (1978), Seiten 471-487, beschrieben.
In der Zeitschrift "Immuno Chemistry", Vol. 12, Nr. 4 (1975),
Seiten 349-351, ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, das zur
nicht-markierenden immunologischen Analyse zählt, wobei an die
Oberfläche von feinen Partikeln gebundene Antigene oder Antikörper
mit Antikörpern oder Antigenen reagieren, die in der
Prüfflüssigkeit vorhanden sind. Eine mittlere Diffusionskonstante
wird gemessen, welche ein Maß für die Brown'sche Molekularbewegung
der aus agglutinierten Partikeln zusammengesetzten
Aggregate ist. Die mittlere Diffusionskonstante wird
aus der Änderung der spektralen Breite von Laser-Licht ermittelt,
welches in einer Lösung der Teilchen gestreut wird. Dieses
Verfahren hat den Vorzug, daß kein Reagens benutzt werden
muß. Da aber die Aufweitung des Spektrums aufgrund des Doppler-Effektes
entsprechend der Brown'schen Bewegung der Aggregate
mittels eines Spektrometers gemessen wird, handelt es sich um
eine sehr große und teure Vorrichtung. Ist das Spektrometer
mechanisch betrieben, so können sich Fehler einschleichen und
die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung läßt zu wünschen
übrig. Die bei diesen bekannten Verfahren vorgesehene
Messung der mittleren Diffusionskonstante aufgrund der spektralen
Breite ermöglicht auch nur eine begrenzte Information über
die Antigen/Antikörper-Reaktion.
In der nicht vorveröffentlichten DE-OS 35 25 719 der Anmelderin
wird ein Verfahren zum Messen einer Antigen/
Antikörper-Reaktion beschrieben, bei dem es nicht erforderlich
ist, teure Reagentien und Spektrometer zu benutzen. Die Messung
kann mit hoher Genauigkeit und guter Reproduzierbarkeit ausgeführt
werden. Überdies läßt sich die Messung auch automatisch
in sehr schneller Zeit durchführen.
Dieses Verfahren zum Messen immunologischer Reaktionen weist
die folgenden Schritte auf:
Strahlung wird auf eine Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die zumindest ein Antigen und Antikörper aufweist;
durch Partikel-Substanzen in der Reaktionsflüssigkeit gestreute Strahlung wird gemessen;
das Leistungsdichte-Spektrum der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung wird abgeleitet; und
die Antigen/Antikörper-Reaktion wird auf der Grundlage dieses Leistungsdichte-Spektrums gemessen.
Strahlung wird auf eine Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die zumindest ein Antigen und Antikörper aufweist;
durch Partikel-Substanzen in der Reaktionsflüssigkeit gestreute Strahlung wird gemessen;
das Leistungsdichte-Spektrum der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung wird abgeleitet; und
die Antigen/Antikörper-Reaktion wird auf der Grundlage dieses Leistungsdichte-Spektrums gemessen.
Befinden sich aber Verunreinigungen, wie hochpolymere Substanzen
in der Prüfflüssigkeit, so wird der Lichtstrahl auch durch
diese Verunreinigungen gestreut, weshalb das Ausgangssignal des
Photodetektors Fehlerkomponenten aufgrund der hochpolymeren
Substanzen enthält.
Aus der Zeitschrift "Laboratory Practice", May 1985, Seiten 74,
77, 78 und 81 sowie aus der US-PS 45 21 522 ist es bekannt,
beim Messen spezifischer Bindereaktionen polarisiertes Licht zu
verwenden.
Aus der Zeitschrift "Journal of Immunological Methods", Vol.
18, 1977, S. 365 bis 375 ist es bekannt, feine Teilchen mit Liganden
zu beschichten und das gestreute Licht zu vermessen. In
der DE-OS 30 14 036 schließlich werden bei der immunologischen
Analyse Teilchen aus magnetischem Material verwendet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum
Messen einer spezifischen Bindereaktion anzugeben, bei
dem die spezifische Bindereaktion sehr genau ohne Verwendung
teurer Markierungssubstanzen oder teurer Spektrometer
durchgeführt werden kann, ohne daß Verunreinigungen das
Meßergebnis stören können.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Anspruch 1 und ihre Ausgestaltungen sind
in den Patentansprüchen 2-22 gekennzeichnet.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher
erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 schematisch eine Anordnung zur Messung einer spezifischen
Bindereaktion gemäß der Erfindung;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum
Messen einer spezifischen Bindereaktion;
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Einrichtung zum
Erzeugen eines magnetischen Feldes in einer Vorrichtung
gemäß Fig. 2;
Fig. 4 eine schematische Darstellung des in der Vorrichtung
gemäß Fig. 2 verwendeten Kollimators;
Fig. 5 eine schematische Darstellung einer anderen Anordnung
zur Durchführung einer erfindungsgemäßen Messung
einer spezifischen Bindereaktion;
Fig. 6A und 6B schematische Darstellungen weiterer Ausführungsbeispiele
von Einrichtungen zur Erzeugung magnetischer
Felder; und
Fig. 7 ein Block-Diagramm zur Erläuterung einer
Signal-Verarbeitungsschaltung gemäß der Erfindung.
Fig. 1 zeigt schematisch den grundsätzlichen Aufbau des Meßverfahrens
zum Messen der spezifischen Bindereaktion. Aus der
Lichtquelle 1 stammendes Licht wird über einen Polarisator 2 zu
einer Zelle 3 gelenkt, die Reaktionsflüssigkeit 4 enthält, in
welcher eine Probe aus feinen Teilchen aus magnetischem Material
enthalten ist.
Die Teilchen können rund geformt sein. Auf die Oberfläche der
Teilchen ist ein Antikörper oder Antigen fixiert, das mit einem
Antigen bzw. Antikörper spezifisch reagiert, welches in der zu
analysierenden Probe enthalten ist. Das Licht wird mittels des
Polarisators 2 linear polarisiert und durch die in der
Reaktionsflüssigkeit 4 enthaltenen Teilchen gestreut. In diesem
Falle wird der Polarisationszustand des gestreuten Lichts entsprechend
dem Agglutinationszustand der Teilchen geändert. Da
die nicht-agglutinierten Teilchen im wesentlichen kugelförmig
sind und somit optische Isotropie aufweisen, sind sie in der
gleichen Richtung bezüglich ihrer Vibration polarisiert, wie
der elektrische Feldvektor der elektromagnetischen Welle des
einfallenden, linear polarisierten Lichtes. Dementsprechend ist
das von nicht-agglutinierten Teilchen gestreute Licht ebenfalls
linear polarisiert in derselben Polarisationsebene wie das einfallende
Licht. Findet eine Antigen/Antikörper-Reaktion statt
und führen die Teilchen eine Agglutination miteinander aus, so
ist die gesamte Anordnung der agglutinierten Teilchen nicht
mehr kugelförmig, sondern weicht hiergegen in der Form ab, so
daß dieser Agglutinationskörper optische Anisotropie aufweist.
Wird das polarisierte Licht durch die agglutinierten Teilchen,
die optische Anisotropie aufweisen, gestreut, so weist das gestreute
Licht Polarisationskomponenten auf, die sich von den
Polarisationskomponenten des einfallenden Lichts unterscheiden.
Gemäß der Erfindung werden nicht-agglutinierte Teilchen und
agglutinierte Teilchen mittels eines Magnetfeldes bewegt, welches
durch eine außerhalb der Zelle 3 angeordnete Einrichtung 5
erzeugt wird. Beispielsweise können Teilchen periodisch in
einer Ebene gedreht werden, die senkrecht auf der Richtung des
einfallenden Lichtes steht. Da die nicht-agglutinierten Teilchen
kugelförmig sind (und nach der Drehung auch bleiben), ist
die Polarisationsrichtung des von den nicht-agglutinierten
Teilchen gestreuten Lichtes gleich der des einfallenden Lichts.
Die Polarisationsrichtung des von den agglutinierten Teilchen
gestreuten Lichtes ist aber entsprechend der Drehung der agglutinierten
Teilchen ebenfalls gedreht.
Wird das gestreute Licht über einen Analysator 6 auf den
Photodetektor 7 gerichtet, so ändert sich das Ausgangssignal des
Photodetektors entsprechend dem Agglutinationszustand der Teilchen
in der Reaktionsflüssigkeit 4, d. h. entsprechend der Antigen/
Antikörper-Reaktion. Das heißt, wenn die Polarisationsebene
des Analysators 6 der Polarisationsebene des Polarisators 2
entspricht, so wird das durch die nicht-agglutinierten Teilchen
gestreute Licht zusammen mit dem von den agglutinierten Teilchen
gestreuten Licht auf den Photodetektor 7 gelenkt. Wenn
hingegen die Polarisationsebene des Analysators 6 senkrecht auf
der Polarisationsebene des Polarisators 2 steht, so wird nur
der Teil des gestreuten Lichtes auf den Photodetektor 7 gelangen,
der von den agglutinierten Teilchen gestreut wird. In
jedem Falle wird das von den agglutinierten Teilchen gestreute
Licht, welches auf den Photodetektor 7 fällt, um eine Frequenz
geändert, die der doppelten Rotationsfrequenz der Teilchen
entspricht. Dementsprechend ist es möglich, die immunologische
Reaktion dadurch zu messen, daß die Änderung des Ausgangssignals
des Photodetektors 7 verfolgt wird.
Fig. 2 zeigt schematisch ein weiteres Ausführungsbeispiel einer
Vorrichtung zum Durchführen einer immunologischen Messung. Bei
diesem Ausführungsbeispiel wird ein Heterodyn-Verfahren angewandt,
bei dem das gemessene gestreute Licht die gleiche Richtung
wie das einfallende Licht aufweist. Als Lichtquelle für
kohärente Strahlung dient ein He-Ne-Gaslaser 11, der einen
Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 632,8 nm hat. Die Strahlungsquelle
für kohärentes Licht kann auch von einem Festkörperlaser,
wie einem Halbleiterlaser, gebildet sein. Der Laser-Lichtstrahl
12, der von der Lichtquelle 11 abgegeben wird, wird
durch den halbdurchlässigen Spiegel 13 in zwei Teilstrahlen 14
und 15 aufgeteilt. Der Lichtstrahl 14 wird durch eine Sammellinse
16 fokussiert und über einen Polarisator 17 (Glan-Thompson-Prisma)
linear polarisiert auf die Zelle 18 gelenkt.
Die Zelle 18 besteht aus durchsichtigem Quarz. Der Lichtstrahl
15 fällt auf einen Photodetektor 19, wie eine Silizium-Photodiode.
Der Photodetektor 19 erzeugt ein Vergleichssignal, welches
die Schwankungen der Intensität des von der Lichtquelle 11
erzeugten Lichtstrahles wiedergibt. Der Strahl 15 dient also
als Referenz-Strahl.
Zunächst wird in die Zelle 18 eine Pufferlösung mit feinen,
kugelförmigen Teilchen eingegeben, die einen Durchmesser im
Bereich von 0,05 bis 0,1 µm haben. Die Teilchen können aus
ferromagnetischem Material bestehen, wie Ni, Co sowie Legierungen
daraus, welche keine oder nur eine sehr kleine spontane
Magnetisierung aufweisen. Auf der Oberfläche der Partikel sind
Antigene oder Antikörper fixiert, wie beispielsweise Immunoglobulin G
(IgG). Sodann wird eine Probe, die Antikörper oder
Antigen enthält, in die Zelle 18 eingegeben, um die Antigen/Antikörper-Reaktion
in der Flüssigkeit 20 einzuleiten. Neben
der Zelle 18 ist eine Einrichtung 21 zur Erzeugung eines magnetischen
Feldes angeordnet. Bei diesem Ausführungsbeispiel erzeugt
die Einrichtung 21 ein magnetisches Feld, um die magnetischen
Teilchen periodisch in einer Ebene zu rotieren, die
senkrecht auf der Richtung des einfallenden Lichtes steht.
Die durch Partikel in der Zelle 18 gestreuten Lichtstrahlen
fallen über einen Kollimator 22 auf einen Photodetektor 24. Der
Kollimator 22 hat ein Paar von feinen Löchern. Weiterhin ist
ein Analysator 23 gemäß Fig. 2 zwischengeschaltet. Der Photodetektor
24 wird von einem Photovervielfacher hoher Empfindlichkeit
gebildet. Der Analysator 23 hat eine Polarisationsebene,
die von derjenigen des Polarisators 17 verschieden ist.
Bei diesem Ausführungsbeispiel steht die Polarisationsebene des
Analysators 23 senkrecht auf der des Polarisators 17.
Das Ausgangs-Referenzsignal des Photodetektors 19 wird über
einen Verstärker 28 mit geringem Rauschen in eine
Daten-Verarbeitungseinrichtung 27 eingegeben, in welche auch das
Ausgangssignal des Photodetektors 24 über einen Verstärker 25 (mit
geringem Rauschen) und einem Tiefpaßfilter 26 eingegeben wird.
Der Tiefpaßfilter 26 hat eine Abschneidefrequenz von einigen
hundert Hertz. Die Datenverarbeitungsanlage 27 weist einen
Analog/Digital-Wandler 29, einen schnellen Fourier-Transformator
(FET) 30 und einen Rechner 31 auf. Die Anlage verarbeitet
die Signale, wie nachfolgend näher erläutert werden wird, und
gibt ein Meßsignal bezüglich der Antigen/Antikörper-Reaktion
ab. Das Meßergebnis wird auf der Anzeigeeinrichtung 32 angezeigt.
Das Ausgangssignal des Photodetektors 24 ist ein Maß für die
Intensität des gestreuten Lichtes, welches aus der Meßzelle 18
dringt. Das Signal wird mittels des Referenzsignals normaliert,
das vom Photodetektor 28 stammt, und sodann über eine kurze
Zeitspanne gemittelt. Auf diese Weise können alle Schwankungen
der Intensität des Laser-Strahls 12 der Lichtquelle 11 ausgeschaltet
werden. Sodann wird ein Leistungs-Dichtespektrum der
Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes gemessen und der
Agglutinationszustand der Teilchen in der Zelle 18 und somit
die Antigen/Antikörper-Reaktion wird gemessen.
Fig. 3 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel für die Einrichtung
21 zum Erzeugen eines magnetischen Feldes. Die Einrichtung
21 weist ein Paar von Spulen 35
und 36 auf, die jeweils
zueinander und zur Richtung des einfallenden Lichtstrahles
14 senkrecht stehen. Diese Spulen 35, 36 sind mit einem
Oszillator 37 zum Erzeugen von Wechselströmen mit einer Frequenz
f 0 von etwa 10 Hz und einer relativen Phasenverschiebung
von 90° verbunden. Die Wechselströme können sinusförmig oder
auch pulsförmig sein. Wenn die Spulen 35, 36 alternierende
Magnetfelder mit einer Phasendifferenz von 90° erzeugen und
senkrecht zueinander stehen, so wird in der Zelle 18 ein rotierendes
Magnetfeld erzeugt. Werden die magnetischen Teilchen
einem solchen rotierenden Magnetfeld ausgesetzt, so werden sie
mit der Frequenz f 0 in einer Ebene gedreht, die senkrecht zur
Ebene des einfallenden Lichtes 14 steht.
Wie vorstehend erläutert, werden die dem magnetischen Wechselfeld,
welches eine Phasendifferenz von 90° aufweist und senkrecht zur Ebene
des einfallenden Lichtes steht, ausgesetzten
Teilchen mit der gleichen Frequenz gedreht, wie das magnetische
Wechselfeld. Dies beruht auf der magnetischen Induktion.
Fig. 4 zeigt schematisch Einzelheiten des in Fig. 2 gezeigten
Kollimators 22. Der Kollimator 22 weist ein Röhrchen 22 a auf,
das aus nicht-durchsichtigem Material besteht, um alle Störungen
durch äußeres Licht zu vermeiden. Weiterhin ist die
Innenwand des Röhrchens 22 a mit einer nicht-reflektierenden
Beschichtung versehen. An beiden Enden des Röhrchens 22 a sind
feinste Löcher 22 b bzw. 22 c vorgesehen. Der Kollimator 22 dient
dazu, den Erfassungswinkel des Photodetektors 24 zu begrenzen,
so daß Störungen durch nicht zu vermessendes Streulicht vermieden
sind. Die feinen Löcher 22 b und 22 c haben Durchmesser von
0,3 mm und einen Abstand von 30 cm.
Findet in der Zelle 18 keine Antigen/Antikörper-Reaktion statt
und agglutinieren die Teilchen nicht (d. h. bilden sie keine
Zusammenballungen), so werden die kugelförmigen Teilchen
weiterhin optische Isotropie aufweisen und auch nach einer
Drehung der Teilchen wird das gestreute Licht die gleiche Polarisationsrichtung
aufweisen wie das einfallende, linear polarisierte
Licht 14. Deshalb wird das gestreute Licht nicht durch
den Analysator 23 durchgelassen und das Ausgangssignal des Photodetektors
24 wird (theoretisch) Null. Im Gegensatz hierzu
wird bei Auftreten einer Antigen/Antikörper-Reaktion eine
Agglutination der Teilchen erfolgen (Zusammenballung) und die
agglutinierten Teilchen werden eine optische Anisotropie aufweisen,
so daß das gestreute Licht Polarisationskomponenten
aufweist, die senkrecht zur Polarisationsebene des einfallenden
Lichtes stehen. Somit wird ein Teil des gestreuten Lichtes
durch den Analysator 23 durchgelassen und gelangt zum Photodetektor
24, welcher ein Ausgangssignal erzeugt, das von Null
verschieden ist. Darüberhinaus wird die Polarisationsrichtung
des gestreuten Lichtes aufgrund der Drehung der agglutinierten
Teilchen entsprechend dem Magnetfeld gedreht. Somit enthält das
vom Photodetektor 24 empfangene gestreute Licht eine Komponente,
die mit einer Frequenz 2f 0 variiert, also der zweifachen
Frequenz des magnetischen Wechselfeldes. Sine Verunreinigungen,
wie hochpolymere Substanzen in der Prüfflüssigkeit (wie einem
Serum) enthalten, so kann das von diesen Verunreinigungen
gestreute Licht ebenfalls Polarisationskomponenten enthalten,
die senkrecht zur Polarisationsebene des linear polarisierten,
einfallenden Lichtes stehen, weshalb ein Teil des von den Verunreinigungen
gestreuten Lichtes ebenfalls durch den Analysator
23 durchgelassen werden kann. Somit kann das Ausgangssignal des
Photodetektors 24 Störkomponenten enthalten, die dem Signal der
agglutinierten Teilchen überlagert sind. Da aber diese Verunreinigungen
nicht magnetisch sind, werden sie nicht durch das
Magnetfeld gedreht und die von den Verunreinigungen stammenden
Komponenten des Ausgangssignals ändern sich nicht synchron mit
dem magnetischen Wechselfeld. Somit kann eine Verarbeitung des
Ausgangssignals des Photodetektors 24 auf der Grundlage der
Frequenz 2f 0 diejenigen Signalkomponenten auswählen, die nur
von den agglutinierten Teilchen stammen. Somit kann die Antigen/Antikörper-Reaktion
mit großer Empfindlichkeit und mit
einem guten Signal/Rausch-Verhältnis vermessen werden.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird das Leistungs-Dichtespektrum
der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes
gemessen. Hierzu wird das Ausgangssignal des Photodetektors 24
in die Datenverarbeitungsanlage 27 über den Verstärker 25 und
das Tiefpaßfilter 26 eingegeben und darin zusammen mit dem Ausgangssignal
des Photodetektors 19 verarbeitet, um das
Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten
Lichtes zu ermitteln. Das Leistungs-Dichtespektrum S(f)
eines stationären stochastischen Prozesses x(t) kann wie folgt
ausgedrückt werden:
Auf der Grundlage dieser Gleichung wird die Fourier-Transformation
ausgeführt, um das Leistungs-Dichtespektrum zu gewinnen.
Das Ausgangssignal des Photodetektors 24 wird vom Verstärker 25
mit geringem Rauschen verstärkt und zwar derart, daß die Signalhöhen
einen großen Bereich von Analog/Digital-Umwandlungswerten
überdecken. Die derart quantisierten Daten werden durch
den Mikroprozessor verarbeitet, um das Leistungs-Dichtespektrum
zu gewinnen. Aus dem Leistungs-Dichtespektrum wird der Zustand
der immunologischen Reaktion ermittelt und numerisch auf dem
Display 32 angezeigt.
Wie vorstehend erläutert, wird bei einer Drehung der agglutinierten
Teilchen mit der Frequenz f 0 die optische Anisotropie
der agglutinierten Teilchen periodisch mit der Frequenz 2f 0
geändert. Durch Messen derjenigen Komponenten des Leistungs-Dichtespektrums,
die eine Frequenz 2f 0 aufweisen oder durch
Messen des Leistungs-Dichtespektrums nahe der Frequenz 2f 0 ist
es deshalb möglich, die Antigene in der Probe zu identifizieren
oder die Menge an Antigenen zu ermitteln, die in der Probe enthalten
sind.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist es nicht erforderlich,
teure und schwierig zu handhabende markierende Reagenzien,
wie Enzyme und Radioisotope, zu verwenden und die Messung
kann einfach und kostengünstig durchgeführt werden. Die Genauigkeit
und Reproduzierbarkeit der Messung ist wesentlich besser
als die der nicht-markierenden Immuno-Analyse, wie der Immuno-Elektrophorese,
der Immuno-Diffusion und -Sedimentation. Es ist
auch möglich, sehr zuverlässige Meßergebnisse zu erhalten. Im
Vergleich mit einem herkömmlichen Verfahren, bei dem eine mittlere
Diffusionskonstante aus der Änderung der spektralen Breite
des gestreuten Lichtes ermittelt wird, ist es bei einem erfindungsgemäßen
Verfahren nicht mehr erforderlich, teure und große
Spektrometer zu verwenden. Deshalb kann die Vorrichtung insgesamt
sehr kostengünstig,
kompakt und leichtgewichtig gestaltet
werden. Überdies ist es möglich, aufgrund einer Messung des
Leistungs-Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen des gestreuten
Lichtes mehr Informationen über die Antigen/Antikörper-Reaktion
zu gewinnen.
Fig. 5 ist eine Block-Darstellung einer anderen Vorrichtung zum
Vermessen einer immunologischen Reaktion. Bei diesem Ausführungsbeispiel
wird das Ausgangssignal des Photodetektors 24 in
einen Synchron-Detektor 41 eingegeben, in den auch ein Referenz-Signal
der Frequenz f 0 des Oszillators 37 eingegeben wird
und eine Signal-Komponente mit der Frequenz 2f 0 wird synchron
nachgewiesen. Das derart gewonnene Ausgangssignal wird auf der
Anzeigeeinrichtung 32 dargestellt.
Bei diesem Ausführungsbeispiel hängt das Ausgangssignal des
Synchron-Detektors 41 ausschließlich vom Agglutinationszustand,
d. h. der Konzentration des in der Probe enthaltenen Antigen,
ab. Wenn deshalb eine Eichkurve vorab unter Verwendung einer
Standardprobe mit bekannter Antigenkonzentration abgeleitet
wird, ist es möglich, die unbekannten Konzentrationen von
Antigen in den Proben präzise zu messen. Im Vergleich zum zuvor
beschriebenen Ausführungsbeispiel ist beim vorliegenden Ausführungsbeispiel
die Signalverarbeitung wesentlich einfacher und
die Meßzeit kann verkürzt werden. Auch wird die Messung mit
einem besseren Signal/Rausch-Verhältnis und größerer Genauigkeit
durchgeführt.
Die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lassen verschiedene
Abwandlungen zu. Statt der Immunoglobulin G (IgG)
können verschiedene andere Substanzen, wie Immunoglobulin A
(IgA), IgM, IgD, IgE, Australia-Antigen, Syphilis-Antigen und
Insulin benutzt werden, welche im Verlaufe der Antigen/Antikörper-Reaktion
Agglutinationen erzeugen. Auch sind andere
spezifische Bindereaktionen als immunologische Antigen/Antikörper-Reaktionen
meßbar. Beispielsweise können Teilchen
benutzt werden, die mit Hormonen beschichtet sind und es ist
möglich, die in der Probe enthaltenen Rezeptoren zu analysieren.
Falls Teilchen benutzt werden, die mit Avidin, Biotin,
Protein A oder IgG Fc-Fragment beschichtet sind, so können
Biotin, Avitin, IgG Fc-Fragmente oder Protein A in Proben
vermessen werden. Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel sind
Antikörper auf der Oberfläche der Partikel fixiert, um in der
Probe enthaltenes Antigen zu messen. Es ist aber auch möglich,
in der Probe enthaltene Antikörper mittels Partikeln zu messen,
auf denen Antigene fixiert sind. Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel
ist die Antigen/Antikörper-Reaktionsflüssigkeit in
einer Zelle enthalten und die Messung wird stationär durchgeführt,
es ist aber auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren
im Fließzustand einzusetzen, bei dem eine Antigen/Antikörper-Reaktionsflüssigkeit
kontinuierlich durch eine Strömungszelle
fließt. Weiterhin ist in den vorstehenden Ausführungsbeispielen
von einer Laser-Lichtquelle zur Erzeugung kohärenter Strahlung
die Rede; es ist aber auch möglich, Lichtquellen zu benutzen,
die inkohärente Strahlung erzeugen. Auch müssen die magnetischen
Teilchen nicht immer kugelförmig sein, es können auch
nicht-kugelförmige Teilchen verwendet werden, solange die Teilchengröße
hinreichend klein ist (und den beschriebenen optischen
Anforderungen genügt ist).
Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel steht die Polarisationsebene
des Analysators 23 senkrecht auf der des Polarisators 17,
so daß von nicht-agglutinierten Teilchen gestreutes Licht nicht
auf den Photodetektor 24 fällt. Deshalb kann die immunologische
Reaktion genauestens aufgrund der Intensität oder eines Mittelwertes
des Ausgangssignals des Photodetektors 24 gemessen werden.
Es kann aber auch die Polarisationsebene des Analysators
23 willkürlich in bezug auf die Polarisationsebene des Polarisators
17 gesetzt werden.
Beim in Fig. 3 gezeigten Ausführungsbeispiel sind die beiden
Spulen 35 und 36 senkrecht auf die Richtung des einfallenden
Lichtstrahls sowie senkrecht zueinander ausgerichtet. Bei dem
in Fig. 6A gezeigten Ausführungsbeispiel sind ein Paar von
Spulen 35 a und 35 b in bezug auf die Zelle 18 gegenüberliegend
angeordnet und ein Paar von Spulen 36 a und 36 b ist ebenfalls
gegenüberliegend beiderseits der Zelle angeordnet. Es sei erwähnt,
daß es nicht immer erforderlich ist, die Teilchen in
einer Ebene zu drehen, die senkrecht auf der Richtung des einfallenden
Lichtes steht. Durch Anordnung eines Paares von
Spulen 35 a und 35 b gegenüberliegend in bezug auf die Zelle 18
und eine Serienschaltung dieser Spulen mit einem Oszillator 37
gemäß Fig. 6B ist es möglich, die Teilchen mit einer Frequenz
f 0 hin- und herzuschwingen. Auch in diesem Falle schwankt das
Ausgangssignal des Photodetektors periodisch mit der Frequenz
2f 0. Auch können die Teilchen dadurch bewegt werden, daß
intermittierend ein Gleichstrom durch die Spulen fließt, oder daß
ein Permanentmagnet ohne Verwendung von Spulen gedreht wird.
Überdies ist es möglich, vor Durchführung der Messung die
Reaktionsflüssigkeit 20 intermittierend einem gleichförmigen
oder nicht gleichförmigen Magnetfeld auszusetzen, welches durch
die Magnetfeld-Erzeugungseinrichtung 21 erzeugt wird, um die
Teilchen intermittierend in Richtung des Magnetfeldes auszurichten.
Sodann werden die Teilchen gerührt und die Antigen/Antikörper-Reaktion
wird durchgeführt. Auf diese Weise ist es
möglich, die Meßzeit wesentlich zu kürzen.
Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel wird das
Streulicht in der gleichen Richtung nachgewiesen, in der auch
das einfallende Licht nachgewiesen wird. Es ist aber auch möglich,
das seitwärts gestreute Licht zu messen, um die Antigen/Antikörper-Reaktion
zu verfolgen.
Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel fällt linear
polarisiertes Licht auf die Zelle 18. Es ist aber auch möglich,
zirkular polarisiertes oder elliptisch polarisiertes Licht zu
verwenden. In diesem Falle kann das Streulicht nach Passieren
eines Viertelwellenlängen-Plättchens auf den Analysator 17
treffen.
Da beim beschriebenen Ausführungsbeispiel magnetische Teilchen
mittels eines Magnetfeldes bewegt, rotiert oder geschwungen
werden, ist es möglich, auch magnetische Teilchen in der Umwelt
zu vermessen, also beispielsweise die atmosphärische Verschmutzung
oder auch die Wasserqualität.
Beim in Fig. 5 gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Signalkomponente
mit einer vorgegebenen Frequenz 2f 0 durch den Synchron-Detektor
abgeleitet. Es ist auch möglich, die gewünschte
Signal-Komponente mittels eines Band-Durchlaßfilters zu gewinnen.
Fig. 7 ist ein Blockdiagramm eines derartigen Ausführungsbeispieles.
Hier wird das Ausgangssignal des Photodetektors,
der das durch die Teilchen gestreute und durch einen
Analysator geschickte Licht empfängt, mittels eines Verstärkers
52 verstärkt, der ein geringes Rauschen aufweist. Sodann
passiert das vom Verstärker 53 verstärkte Signal das Band-Durchlaßfilter
53, dessen Durchlaß-Mittenfrequenz 2f 0 der zweifachen
Frequenz f 0 entspricht,
mit welcher die magnetischen
Teilchen in der Prüfflüssigkeit gedreht werden. In diesem Falle
hat ein Ausgangssignal aus dem Filter 53 eine Signalkomponente
der Frequenz 2f 0. Dieses Signal wird in die Signal-Verarbeitungsschaltung
54 eingegeben, um den Grad der Agglutination der
magnetischen Teilchen zu messen, d. h. die Agglutinationsreaktion
selbst. Die Signal-Verarbeitungsschaltung bei diesem Ausführungsbeispiel
ist wesentlich einfacher als die der zuvor beschriebenen
Ausführungsbeispiele.
Wie zuvor beschrieben, werden die magnetischen Teilchen durch
Änderung eines Magnetfeldes bewegt und eine Komponente des
gestreuten Lichtes, die entsprechend der Bewegung der Teilchen
schwankt, wird selektiv vermessen. Dementsprechend läßt sich
der störende Einfluß von Verunreinigungen, wie in der Prüfflüssigkeit
enthaltenen hochpolymeren Substanzen, im wesentlichen
ausschalten. Somit ergibt sich eine hohe Meßgenauigkeit
und Empfindlichkeit bei sehr kurzer Meßzeit.
Es ist auch möglich, magnetische Teilchen zu verwenden, die
nicht vollständig aus magnetischem Material bestehen. Beispielsweise
ist es möglich, magnetotaktische Bakterien, wie
Aquaspirilum Magnetotacticum oder magnetotaktisches Coccus, zu
verwenden. Diese Teilchen enthalten fein magnetische Partikel,
Magnetosome genannt. Derartige Magnetosome bestehen aus Fe3O4-Teilchen
mit einem mittleren Durchmesser von 0,05 bis 0,15 µm.
Weiterhin ist es auch möglich, magnetische Mikrokapseln zu
verwenden, bei denen sehr feine magnetische Teilchen durch eine
Polymer-Schicht bedeckt sind.
Claims (22)
1. Verfahren zum Messen einer spezifischen Bindereaktion,
gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- polarisiertes Licht wird auf eine Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die eine Probe und feine Teilchen aus magnetischem Material enthält, welche mit Liganden beschichtet sind, die selektiv mit bestimmten Substanzen der Probe reagieren;
- die genannten Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit werden mittels eines Magnetfeldes bewegt;
- das durch die Teilchen gestreute Licht wird in einen Analysator eingegeben;
- das den Analysator passierende Licht wird in einen Photodetektor eingegeben, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- das Ausgangssignal des Photodetektors wird zum Vermessen der spezifischen Bindereaktion verarbeitet.
- polarisiertes Licht wird auf eine Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die eine Probe und feine Teilchen aus magnetischem Material enthält, welche mit Liganden beschichtet sind, die selektiv mit bestimmten Substanzen der Probe reagieren;
- die genannten Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit werden mittels eines Magnetfeldes bewegt;
- das durch die Teilchen gestreute Licht wird in einen Analysator eingegeben;
- das den Analysator passierende Licht wird in einen Photodetektor eingegeben, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- das Ausgangssignal des Photodetektors wird zum Vermessen der spezifischen Bindereaktion verarbeitet.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Magnetfeld derart angelegt wird, daß die Teilchen
periodisch mit einer vorgegebenen Frequenz f 0 bewegt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Teilchen mit der Frequenz f 0 gedreht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Teilchen mit der Frequenz f 0 geschwungen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß von den Teilchen in der gleichen Richtung wie das einfallende
Licht gestreutes Licht auf den Analysator fällt und
daß die Teilchen in einer Ebene bewegt werden, die senkrecht
zur genannten Richtung steht.
6. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Licht einer Lichtquelle nach Passieren eines Polarisators
auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Analysator eine Polarisationsebene hat, die verschieden
ist von der Polarisationsebene des Polarisators.
8. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Polarisationsebene des Analysators senkrecht auf der
Polarisationsebene des Polarisators steht.
9. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ausgangssignal des Photodetektors in einen schnellen
Fourier-Transformator gegeben wird, um ein Leistungs-Dichtespektrum
der Intensitätsschwankungen des Streulichtes sowie
zumindest eine Komponente der Frequenz 2f 0, also der zweifachen
vorgegebenen Frequenz f 0, selektiv aus dem Leistungs-Dichtespektrum
abgeleitet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß die immunologische Reaktion derart vermessen wird, daß die
Intensität der Komponente mit der Frequenz 2f 0 gemessen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß die immunologische Reaktion derart gemessen wird, daß der
Verlauf eines Teiles des Leistungs-Dichtespektrums vermessen
wird, wobei der Teil die Komponente mit der Frequenz 2f 0
enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ausgangssignal des Photodetektors synchron mit der Veränderung
des Magnetfeldes gemessen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ausgangssignal des Photodetektors in einen Synchron-Detektor
eingegeben wird, in den auch ein Referenz-Signal mit der
Frequenz 2f 0 eingegeben wird, also der verdoppelten gegebenen
Frequenz f 0, und daß die immunologische Reaktion entsprechend
einer Amplitude des Ausgangssignals des Synchron-Detektors gemessen
wird.
14. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß das veränderliche Magnetfeld zum Rotieren der Teilchen
durch ein Paar von Spulen erzeugt wird, die senkrecht zueinander
angeordnet sind und mit Wechselstrom gleicher Frequenz f 0
aber mit einer Phasenverschiebung von 90° beschickt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß das veränderliche Magnetfeld durch ein erstes Paar von
Spulen erzeugt wird, die einander in bezug auf die Reaktionsflüssigkeit
gegenüberliegen, sowie ein zweites Paar von Spulen,
die ebenfalls in bezug auf die Reaktionsflüssigkeit einander
gegenüberliegen, wobei die ersten und zweiten Paare von Spulen
zueinander senkrecht stehen und mit Wechselstrom versorgt werden,
der die gleiche Frequenz f 0 bei einer Phasenverschiebung
von 90° aufweist.
16. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß das veränderliche Magnetfeld zum Schwingen der Teilchen
durch ein Paar von Spulen erzeugt wird, die in bezug auf die
Reaktionsflüssigkeit einander gegenüberliegen und mit Wechselstrom
versorgt werden, der die Frequenz f 0 hat.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Teilchen kugelförmig sind.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Teilchen aus ferromagnetischem Material
bestehen.
19. Verfahren nach Anspruch 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Teilchen aus Ni, Co oder deren Legierungen
bestehen.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die magnetischen Teilchen Durchmesser im Bereich von 0,05
bis 0,1 µm aufweisen.
21. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die feinen Partikel mit Liganden beschichtet sind, wobei es
sich bei den Liganden um folgende Stoffe handeln kann: Antigen,
Antikörper, Avidin, Biotin, Protein A, IgG Fc-Fragmente und
Hormone.
22. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Ausgangssignal des Photodetektors in ein Band-Filter
eingegeben wird, welches eine Mitten-Frequenz 2f 0 aufweist, die
dem doppelten der gegebenen Frequenz entspricht, um eine Signal-Komponente
abzuleiten, die die Frequenz 2f 0 hat.
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