JPS62118255A - 磁界を用いた免疫反応の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は抗原−抗体反応に基く免疫反応を、抗体また
は抗原を固定した磁性体からなる微粒子の磁界による変
位に基く散乱光を利用して検出する磁界を用いた免疫反
応の検出法に関する。

〔従来の技術〕

免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体内微量成
分の検出法として免疫反応の特異的選択反応を利用した
免疫分析法がある。この免疫分析法には大別して酵素や
放射性アイソトープを標識物質として用いる標識免疫分
析法と、抗原・抗体複合対を直接測定する非標識免疫分
析法との２つの方法があり、前者の標識免疫分析法とし
ては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、フルオロイムノアッセイ（Ｆ
ＩＡ）等がよく知られている。また、後者の非標識免疫
分析法としては、免疫電気泳動法、免疫拡散法、沈降法
等があり、例えば「臨床検査法提要」　（金井泉原著、
金井正光絹著、金属出版）や、［臨床検査Ｊ　Ｖｏｌ　
、２２．　Ｎ（Ｌ５　（１９７８）　、第４７１〜４８
７頁に詳しく説明されている。

更に、非標識免疫分析法の１つに、「１ｍｍｕｎｏ−ｃ
ｈｅｒｎｉｓｔｒｙ　Ｊ、　Ｖｏｌ、１２．　　Ｎｏ、
４　（１９７５）　、第３４９〜３５１頁には、抗体ま
たは抗原を表面に固定させた微粒子を被測定液中の抗原
または抗体と反応させ、凝集粒子の大きさに比例して減
少するブラウン運動の指標となる平均拡散定数を、レー
ザ光の拡散光のスペクトル幅の変化から求めることによ
り抗原または抗体を定量分析する方法が開示されている
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上述した標識免疫分析法にあっては、高
感度であるが、測定に長時間を要するうえに標識試薬が
高価であるため、検査コストが高くなるという問題があ
り、また特にＲＩＡにおいてはアイソトープの取扱いや
廃棄物処理等において種々の制限があるという問題があ
る。

また、非標識免疫分析法として、抗体または抗原を固定
した微粒子を用いないものにあっては、簡便ではあるが
、感度、定量性、再現性の点で精密測定としては不十分
であると共に、測定時間が長くなるという問題がある。

更に、上述した抗体または抗原を固定した微粒子を用い
るものにあっては、標識試薬を用いない利点はあるが、
微粒子のブラウン運動によるドツプラ効果によって入射
光のスペクトルが広がるのを分光計を用いて検出してい
るため、装置が大形で高価となる問題があると共に分光
計を機械的に駆動する際に誤差が生じ、感度および再現
性が悪くなるという問題がある。また、この方法では光
のスペクトル幅から平均拡散定数を求めているだけであ
り、情報量が少ないという問題もある。

この発明は、このような従来の問題点に着目してなされ
たもので、高価な標識試薬や高価でかつ大形な分光計を
用いずに、高い精度および再現性を以って順次の試料の
測定を能率良く行なうことができ、しかも測定時間の短
縮、抗原−抗体反応測定の自動化が可能であると共に抗
原−抗体反応について多くの有用な情報を得ることがで
きる磁界を用いた免疫反応の検出法を提供することを目
的とする。

〔問題点を解決するための手段および作用〕上記目的を
達成するため、この発明では、抗体または抗原を固定し
た磁性体から成る微粒子を反応液中で磁界により変位さ
せながら、該反応液に偏光された輻射線を投射し、その
微粒子の抗原−抗体反応によって生じる散乱光を偏光面
を有する検光子を介して検知して、その検知出力に基い
て抗原−抗体反応を検出する。

第１図はこの発明の概念図である。光源１から放射され
る光を偏光子２を経てセル３に投射する。

セル３内には試料中の測定すべき抗原または抗体と特異
的に抗原−抗体反応を起こす抗体または抗原を表面に面
相化した磁性体より成る例えば球形の微粒子と試料との
混合反応液４を収容する。偏光子２によって、例えば直
線偏光された光は反応液４中の微粒子により散乱される
が、その散乱光の偏光状態は微粒子の凝集状態に応じて
変化することになる。互いに凝集していない微粒子は球
形であるため、直線偏光された入射光の電磁波の電場ベ
クトルの振動方向と同一方向に分極する。したがって、
微粒子による散乱光は入射光と同じ面内の直線偏光され
たものとなる。一方、抗原−抗体反応が起こり、微粒子
が互いに凝集すると、粒子塊は球形とはならなくなるか
ら光学的に異方性を呈することになり、散乱光は入射光
とは異なる偏光成分をもつものとなる。

この発明では、更にセル３内に収容された微粒子を外部
磁界発生装置５による磁界によって変位させる。ここで
、磁界による微粒子の変位を、例えば入射光の方向を軸
とするそれと直交する平面内での周期的な回転運動とす
ると、未反応の凝集していない微粒子は球形であるため
回転運動をしてもその散乱光の偏光方向は入射光の偏光
方向と変わらないが、互いに凝集した粒子塊の散乱光の
偏光方向は粒子塊の回転に伴って回転することになる。

したがって、散乱光を検光子６を経て光検出器７に入射
させると、その出力は反応液４中の微粒子の凝集状態す
なわち抗原−抗体反応の状態に応じて変化することにな
る。すなわち、検光子６の偏光面を偏光子２の偏光面と
同一方向とすると、凝集しない微粒子の散乱光が凝集し
た粒子塊の散乱光に重畳されて光検出器７に入射し、検
光子６の偏光面を偏光子２のそれと直交させると、凝集
した粒子塊の散乱光のみが光検出器７に入射することに
なる。また、いずれの場合においても、光検出器７に入
射する粒子塊の散乱光は、その回転の２倍の周波数でピ
ークとなる。したがって、光検出器７の出力の変化を検
出することにより免疫反応を測定することができる。

〔実施例〕

第２図はこの発明による免疫反応検出装置の一実施例の
構成を示し、前方散乱光を検出するようにしたものであ
る。この実施例では、コヒーレント光を放出する光源と
して波長６３２．８　ｎｍの）ｌｅ−Ｎｅガスレーザ１
１を用いる。コヒーレント光を放射する光源としては、
このようなガスレーザの他に半導体レーザのような固体
レーザを用いることもできる。光源１１から放射される
レーザ光束１２は半透鏡１３により光束１４と光束１５
とに分離する。一方の光束１４は集光レンズ１６により
集光した後、例えばグラントムソンプリズムより成る偏
光子１７に通して直線偏光された光として、透明なセル
１８に投射する。また、他方の光束１５はシリコンフォ
トダイオードより成る光検出器１９に入射させ、光源１
１の出力光強度の変動を表わすモニタ信号に変換する。

セル１８の中には、先ず表面に抗体または抗原を結合し
た磁性体より成る球形の微粒子、例えば表面に免疫グロ
ブリンＧ　（Ｉ　ｇＧ）を固定した粒径０．１μｍ〜０
．０５μｍのＮｉ、Ｃｏあるいはそれらの合金より成る
強磁性体で自発磁化のないものを分散させた緩衝液を加
えておき、その後抗原または抗体を含む被検液を加えて
抗原−抗体反応液２０を収容する。また、このセル１８
の近傍には、外部磁界発生装置２１を配置し、これによ
り微粒子を入射光の方向を軸としてそれと直交する平面
内で周期的に回転させるような磁界を発生させる。

セル１８中の微粒子によって散乱された散乱光を、一対
のピンホールを有するコリメータ２２に入射させ、前記
偏光子１７の偏光面とは異なる本実施例では直交する偏
光面を有する検光子２３を経て光電子増倍管より成る光
検出器２４に入射させる。この出力信号は低雑音増幅器
２５および低域通過フィルタ２６を経てデータ処理装置
２７に供給する。また、このデータ処理装置２７には、
光検出器１９の出力モニタ信号も低雑音増幅器２８を経
て供給する。データ処理装置２７にはＡ／Ｄ変換部２９
、高速フーリエ変換部３０および演算処理部３１を設け
、後述するような信号処理を行って、抗原−抗体反応の
測定結果を出力し、これを表示装置３２に供給して表示
させる。

第３図は第２図に示す外部磁界発生装置２１の一例の構
成を示すものである。本例では、セル１８の　゛入射光
方向と直交し、かつ互いに直交する方向にコイル３５．
３６を配置し、これらコイル３５．３６に発振器３７に
より周波数ｆ。＃　１０Ｈｚで位相が９０°異なる正弦
波状あるいはパルス状の交番電流を供給して、微粒子に
入射光方向と直交する平面内で、互いに直交する方向に
９０°の位相差をもって、すなわち磁界の方向が前記平
面内で回転するように交番磁界を作用させる。

このように微粒子に入射光方向と直交する平面内で互い
に直交する方向において９０″の位相差をもって交番磁
界を作用させると、微粒子は磁性体から成るので磁界が
作用したときの誘導磁化との相互作用により、入射光方
向と直交する平面内で、交番磁界の周波数と同じ周波数
で回転する。

第４図は第２図に示したコリメータ２２の詳細な構成を
示す図である。本例のコリメータ２２は空洞構造で、空
洞２２ａは外光の影響を除くために暗箱構造となってお
り、その内面は反射防止構造となっている。空洞２２ａ
の前後にはピンホール２２ｂおよび２２ｃを形成する。

このコリメータ２２は、光検出器２４の視野を限定する
ことにより迷光を少なくするためのもので、本例では直
径Ｑ、３ｍｍのピンホール２２ｂ、　２２Ｇを３Ｑｃｍ
離して形成したものを用いる。

この発明の一実施例では、前方散乱光の強度ゆらぎのパ
ワースペクトル密度を検出するが、このパワースペクト
ル密度は、ブラウン運動によるランダムな成分と、回転
磁界による周期的な成分と、散乱体積への微粒子の出入
りによって生じる粒子数のゆらぎによる成分とから成っ
ている。

第２図において、セル１８中で反応液２０が抗原−抗体
反応を起さず、粒子が凝集しない場合には、球状の粒子
の持つ光学的等方性は失われないため、その回転運動中
の散乱光は入射光と同じ直線偏光をもつ。したがって散
乱光は検光子２３を透過せず、光検出器２４の出力は理
論上零となる。これに対し抗原−抗体反応が起こり、粒
子が凝集すると粒子塊は球状とはならず、光学的異方性
を呈することになり、したがって散乱光は入射光と直交
する偏光成分を持つようになるのでその一部は検光子２
３を透過するようになり、光検出器２３の出力は零では
なくなる。しかも、この粒子塊の散乱光は、磁界による
粒子塊の回転運動に伴ってその偏光方向が回転するので
光検出器２４で受光される散乱光はその回転９２倍の周
波数で変動する成分をもつようになる。ここで血清試料
等被検液中に存在する高分子そｑ他の不純物の散乱光は
、偏光成分の直交する成分に寄与するがそれらは外部か
ら印加される磁界によっては位置および方向を変えない
ので抗原−抗体反応による散乱から区別すことができる
。したがって、抗原−抗体反応をＳ／Ｎ比良く、高感度
で検出することができる。

この実楕例では、この強度ゆらぎのパワースペクトル密
度からその変動成分を検知し、免疫反応を検出する。以
下、データ処理装置２７において、光検出器２４の出力
信号を光検出器１９からのモニタ信号と共に処理して散
乱光の強度ゆらぎのパワースペクトル密度を求める過程
を説明する。ここで定常確率過程ｘ　（ｔ）のパワース
ペクトル密度Ｓ　（ｆ）は、次のように表わすことがで
きる。

この式をもとに高速フーリエ変換を用いてパワースペク
トル密度の計算を行なう。すなわち、光検出器２４から
の出力信号を低雑音増幅器２５により、データ処理装置
２７におけるＡ／Ｄ変換の量子化レベルを信号の値域が
できるだけ広くおおうように増幅し、この量子化したデ
ータをマイクロプロセッサによって演算処理してパワー
スペクトル密度を求め、このパワースペクトル密度にも
とづいて免疫反応を検出してその結果を表示装置３２に
表示する。ここで、凝集粒子が周波数ｆ０で回転すると
その光学的異方性は周波数２ｆｏで変化するので、パワ
ースペクトル密度は、粒子の凝集に応じて変化する。し
たがって、このパワースペクトル密度の周波数２ｆ、成
分の強度あるいは２ｆｏ近傍のパワースペクトル密度の
形状から、抗原−抗体反応が起こったか否かを検出して
抗原の有無を同定したり、抗原濃度を定量することがで
きる。

この実施例によれば、酵素やラジオアイソトープのよう
な高価で、取り扱いの面倒な標識試薬を用いる必要がな
いので、安価且つ容易に実施することができる。また、
免疫電気泳動法、免疫拡散法、沈降法などの非標識免疫
分析法に比べ精度が高く、再現性が高いので信頼性の高
い測定結果を高精度で得ることができる。更に、平均拡
散定数を散乱光のスペクトル幅の変化から求めることに
より抗原または抗体を定量する方法に比べ、分光計が不
要であるので装置は小形かつ安価となると共に精度およ
び信頼性の高い測定結果が得られる。

また、光ゆらぎのパワースペクトル密度に基づいて測定
を行うので、抗原−抗体反応についての多くの有用な情
報を得ることができる。

第５図はこの発明による免疫反応検出装置の他の実施例
の要部を示すものである。この実施例では、光検出器２
４の出力信号を同期検出装置４１において発振器３７か
らの周波数ｆ。をもった参照信号により周波数２ｆｏを
もった成分を同期検波し、その出力を表示装置３２に表
示させるようにした点が第２図と異なるものである。

このようにすれば、同期検出装置４１の出力は、粒子の
凝集状態すなわち抗原濃度にのみ依存することになる。

したがって、抗原濃度既知の試料について予め検量線を
もとめておけば、未知試料にける同期検出装置４１の出
力からその抗原濃度を高精度で求めることができる。

この実施例によれば、信号処理が簡単となり、短時間で
の測定が可能であると共に、高いＳ／Ｎ比で高精度の検
出を行うことができる。

なお、この発明は上述した実施例にのみ限定されるもの
ではなく、幾多の変更または変形が可能でる。例えば、
上述した説明は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）について例
示したが、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、ＩｇＮ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＥ、オーストラリア抗原、梅毒抗原、インシュ
リンなど抗原−抗体反応によって凝集を生ずるすべての
物質の測定に適用することができる。また、上述した実
施例では、微粒子の表面に抗体を固定して、被検体中の
抗原を検出するようにしたが、微粒子の表面に抗原を固
定し、被検体中の抗体を検出することもできる。また上
述した実施例では抗原−抗体反応液をセルに収容して測
定を行うバッチ方式としたが、抗原−抗体反応液を連続
的に流しながら測定を行うフロ一方式とすることも勿論
可能である。さらに上述した実施例では光源としてコヒ
ーレントな光を放射するレーザ光源を用いたが、インコ
ヒーレントな光を放射する光源を用いることもできる。

また、磁性体より成る微粒子は球形に限らず、入射光の
波長の数十分の−の大きさを持つ超微粒子を用いれば、
球形でなくともよい。

また、上述した実施例では検光子２３の偏光面を偏光子
１７のそれに対して直交させたので、光検出器２４には
凝集しない微粒子の散乱光は入射しない。

したがって、光検出器２４の出力強度、あるいはその平
均値から免疫反応を高精度で検出することもできる。更
に、検光子２３の偏光面は偏光子１７の偏光面に対して
任意に設定することができる。

更に、第３図においては、コイル３５．３６を入射光方
向と直交し、かつ互いに直交する方向においてセル１８
の一方の側にそれぞれ配置したが、第６図Ａに示すよう
にコイル３５ａ　と３５ｂおよびコイル３６ａと３６ｂ
とをそれぞれセル１８を介して対向するように２対にし
て配置することもできる。また、上述した実施例では、
微粒子を入射光方向を軸としてそれと直交する平面内で
回転させるよろうにしたが、任意の方向に回転させても
同様にして免疫反応を検出することができると共に、回
転のみでなく一方のコイル３５または３６、あるいは第
６図已に示すように対向する一対のコイル３５ａ、　３
５ｂにより交番磁界を加えて微粒子を任意の方向で揺動
させても同様にして免疫反応を検出することができる。

また、このような微粒子の磁界による変位は、コイルに
直流電流を断続的に供給して行うこともできるし、また
コイルを用いる代わりに永久磁石を回転させて行うこと
もできる。また、測定に先立って外部磁界発生装置２１
により反応液２０に均一または不均一な磁界を断続的に
作用させることもでき、これにより同一装置で断続的に
微粒子を磁界の方向に配向させて抗原−抗体反応を促進
させることもできる。このようにすれば、より短時間で
免疫反応を検出することができる。

また、上述した実施例では前方散乱光を検出するように
したが、側方散乱光を検出して抗原−抗体反応を測定す
ることもできる。

更にまた、上述した実施例では直線偏光した光をセル１
８に入射させるようにしたが、円偏光あるいは楕円偏光
した光を入射させるようにしてもよい。このような場合
には、粒子からの散乱光を１７４波長板を経て検光子１
７に導くことにより、同様にして免疫反応を検出するこ
とができる。

また、この発明は磁界によって磁性体より成る微粒子を
変位させるものであるから、大気汚染検査や水質検査等
の環境衛生の分野において磁性粒子の検出に適用するこ
とができる。

〔発明の効果〕

以上述べたように、この発明によれば偏光された光を用
いると共に、磁性体より成る微粒子を用いてそれを変動
磁界によって変位させるようにし、それに応じて変動す
る散乱光成分のみを検出するようにしたので、被検液中
に存在する高分子等の不純物成分による散乱光の影響を
除去することができる。したがって、超微量の被検液で
高感度かつ高精度の測定ができると共に測定時間も短時
間にできる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の概念図、 第２図はこの発明による免疫反応検出装置の一実施例の
要部の構成を示す線図、 第３図は第２図に示す外部磁界発生装置の一例の構成を
示す図 第４図は同じくコリメータの詳細な構成を示す図、 第５図はこの発明による免疫反応検出装置の他の実施例
の要部の構成を示す図、 第６図ＡおよびＢはそれぞれ外部磁界発生装置の変形例
を示す図である。 １・・・光源　　　　　　　２・・・偏光子３・・・セ
ル　　　　　　　４・・・反応液５・・・外部磁界発生
装置　６・・・検光子７・・・光検出器　　　　　１１
・・・レーザ光源１７・・・偏光子　　　　　　１８・
・・セル２０・・・反応液　　　　　　２１・・・外部
磁界発生装置２２・・・コリメータ　　　　２３・・・
検光子２４・・・光検出器　　　　　２５・・・低雑音
増幅器２６・・・低域通過フィルタ　２７・・・データ
処理装置３２・・・表示装置　　　　　３５．３６・・
・コイル３７・・・発振器　　　　　　４１・・・同期
検出装置第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、抗体または抗原を固定した磁性体から成る微粒子を
   反応液中で磁界により変位させながら、該反応液に偏光
   された輻射線を投射し、その微粒子の抗原−抗体反応に
   よって生じる散乱光を偏光面を有する検光子を介して検
   知して、その検知出力に基いて抗原−抗体反応を検出す
   ることを特徴とする磁界を用いた免疫反応の検出法。