JPH0329836A - 免疫反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、抗原抗体反応に基づく免疫反応を、微粒子
による散乱光強度ゆらぎを利用して測定する免疫反応の
測定方法に関する。

【従来の技術］ 光強度ゆらぎを利用する従来の免疫反応の測定方法とし
て、例えば特開昭６１−２８８６６号公報には、担体粒
子による散乱光の強度ゆらぎのパワースペクトル密度の
変化を測定して抗原の濃度を求めるようにしたものが開
示されている。

［発明が解決しようとする課題１ しかしながら、上述した従来の免疫反応測定方法は、高
感度の測定を行うことができるが、データの解析にＦＦ
Ｔ　（高速フーリエ変換）等の複雑な信号処理が必要と
なるため、装置が複雑かつ高価になるという問題がある
。

この発明は、このような従来の問題点に着目してなされ
たもので、装置を簡単かつ安価に構或できると共に、免
疫反応を高感度で測定できる免疫反応の測定方法を提供
することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 上記目的を達威するため、この発明では、抗原および抗
体を含む反応液に輻射線を投射して散乱光の強度を時系
列的に検出し、その検出出力が所定値と交差する頻度に
基づいて免疫反応を測定する。

［作　用１ 免疫反応において、例えば表面に抗体または抗原を固相
化したラテックス粒子にレーザ光等のコヒーレント光を
照射すると、散乱光はラテックス粒子によるブラウン運
動のために時間と共にゆらぎ、その散乱光強度の時系列
な検出信号は免疫反応が起こる前と後とで変化する。

すなわち、免疫反応が起こる前は、ラテックス粒子は互
いに分散しているので活発なブラウン運動が行われ、そ
のとき検出される散乱光強度の時系列信号は、第１図八
に示すように速い変動を繰り返すものとなる。

これに対して、免疫反応が起こり、ラテックス粒子が抗
原抗体反応によって互いに凝集して凝集塊が形成される
と、ブラウン運動が低下し、そのとき検出される散乱光
強度の時系列信号は、第Ｉ図Ｂに示すように、その変動
が第１図Ａにおけるよりも緩やかなものとなり、しかも
その変動は測定すべき抗原または抗体濃度に応して異な
るものとなる。

したがって、第２図に示すように、散乱光の強度を時系
列的に検出し、その検出出力Ｉが一定時間中に所定値■
と交差する回数（第２図において矢印の回数）すなわち
頻度を求めることにより、その頻度に基づいて免疫反応
を測定することができるので、ＦＦＴ等の複雑な信号処
理が不要となり、装置を簡単かつ安価に構戒することが
可能となる。

【実施例Ｊ 第３図はこの発明の免疫反応の測定方法を実施する測定
装置の一例の構威を示すものである。光源ｌは、コヒー
レント光を放射する半導体レーザあるいはＨ．−Ｎ．レ
ーザ等のガスレーザを用い、この光源ｌからの光を集光
レンズ２により透明なセル３に、その中央に収束するよ
うに投射する。

セル３は、例えば直方体のガラスをもって構成し、この
セル３内に、表面に抗体または抗原を固相化したラテッ
クス粒子等の微粒子を分散させた緩衝液と、測定すべき
血清等のサンプルとを収容する。

セル３に投射された光の内、該セル３を透過する光は光
トラップ４で吸収し、散乱角（θ）が１２０゜の後方散
乱光はアバーチャ５Ａ、共焦点レンズ６およびアパーチ
ャ５Ｂを経て光電子増倍管７で検出する。なお、アパー
チャ５八の開口は例えば直径１ｍｍ　、アパーチャ５Ｂ
の開口は例えば直径０．４ｍｍとする。

光電子増倍管７の出力（光電流）は、＾／Ｄ変換器８で
例えば１２ビットのデジタル信号に変換した後、増幅器
９およびローバスフィルタ１０を経てコンピュータ等の
演算装置１１に供給し、ここで所要の演算処理を行って
セル３内のサンプル中の所定の抗原または抗体濃度を測
定する。なお、ローバスフィルタ１０におけるカットオ
フ周波数は、例えば５００Ｈｚとする。

この発明の第１実施例においては、／／Ｄ変換器８にお
けるサンプリング周波数をＩＫＨｚとして、１回の測定
で約６２万点のデータを取り込み、゛その取り込んだデ
ータに基づいて平均散乱光強度（１．．．，）を求める
と共に、このＩイ．３。と交差する平均値交差頻度（Ｍ
ＣＴ）を求めるようにする。このようにして、例えば抗
原濃度を測定する場合にあっては、コントロール液（抗
原濃度ゼロＩＵ／ｍｌ）におけるＭＣＴと、サンプルに
対して抗原抗体反応を行わせた後のＭＣＴとの比、すな
わち反応前後において散乱光強度が平均散乱光強度を横
切る回数の比（ＲＭＣＴ）を演算し、そのＲＭＣ↑に基
づいてサンプル中の所定の抗原濃度を測定する。なお、
平均散乱光強度および平均値交差頻度は、取り込んだ約
６２万点のデ二夕に対して、例えば４０９６点毎に求め
た平均強度およびそれに対する交差頻度のそれぞれの平
均値とする。

第４図はこの場合の実験結果を示すもので、縦軸はＲＭ
ＣＴを、横軸は抗原濃度（ＩＵ／ｍｌ）を表す。この実
験結果は、異なる濃度既知の１９Ｂ抗原試料に対して、
抗原濃度ゼロ１０／ｍｌのコントロール液におけるＭＣ
Ｔと、各濃度のＩ，　Ｅ抗原試料について抗原抗体反応
後３０分経過して測定したＭＣＴとの５ −６ 比（ＲＭＣＴ）を測定したもので、各濃度のＲＭＣＴは
５回の測定値の平均値とした。

第４図の実験結果から明らかなように、ＲＭＣＴは抗原
濃度依存性を示し、抗原１，　Ｈについて１０ＩＵ／ｍ
１程度の感度を有することがわかる。したがって、測定
すべき所定の抗原について、濃度既知の標準試料を用い
て予め第４図に示す抗原濃度とＲＭＣＴとの関係を表す
検量線を作威しておけば、未知濃度のサンプルについて
のＲＭＣＴを求めることにより、検量線からサンプル中
の所定の抗原の濃度を高感度で測定することができる。

しかも、ＲＭＣＴを求めるにあたっては、平均散乱光強
度、これと交差する平均値交差頻度および、抗原濃度ゼ
ロ１０７ｍｌのコントロール液における平均値交差頻度
と、サンプルに対して抗原抗体反応を行わせた後の平均
値交差頻度との比、すなわち反応前後において散乱光強
度が平均散乱光強度を横切る回数の比を演算すればよく
、上述した従来例におけるようにＦＦＴ等の複雑な信号
処理を行う必要がないので、装置を簡単かつ安価に構戒
することができる。

この発明の第２実施例においては、抗原抗体反応後に第
１実施例と同様に約６２万点の散乱光強度データを取り
込み、その取り込んだデータを基に第１実施例と同様に
して平均値交差頻度を求め、その平均値交差頻度に基づ
いてサンプル中の所定の抗原濃度を測定した。

その結果、抗原濃度に対する平均値交差頻度は第５図に
示すようになり、抗原濃度依存性があることが判明した
。したがって、第５図に示す検量線を予め作成しておけ
ば、サンプルに対して抗原抗体反応後にその平均値交差
頻度を求めることにより、該サンプル中の所定の抗原濃
度を高精度で測定することができる。なお、第５図に示
す検量線は、濃度既知の数種のＩ，　Ｅ抗原試料の各々
について３７℃で抗原抗体反応を行わせ、反応後３０分
経過した後平均値交差頻度を求めて作威したものである
。

この第２実施例によれば、取り込んだデータを基に、平
均散乱光強度を求めると共に、それを横切る散乱光強度
の回数すなわ−ち平均値交差頻度を求めればよいので、
信号処理をより簡単にでき、したがって装置をより簡単
かつ安価に構威することができる。

この発明の第゛３実施例においては、第１実施例におい
て、反応前後における交差頻度を求めるための基準とな
る所定値を、それぞれその平均散乱光強度の９５％の値
とする。

このようにして、反応前後における交差頻度の比を求め
れば、その交差頻度の比は第６図に示すような抗原濃度
依存性を有することになる。したがって、第６図に示す
検量線を予め作威しておけば、サンプルに対して抗原抗
体反応前後の交差頻度の比を求めることにより、該サン
プル中の所定の抗原濃度を高精度で測定することができ
る。なお、第６図に示す検量線は、濃度既知の数種のＩ
，Ｅ抗原試料の各々について３７゜Ｃで抗療抗体反応を
行わせ、反応前および反応後３０分経過して取り込んだ
データを基に作威したものである。

なお、この発明は上述した実施例にのみ限定されるもの
ではなく、幾多の変更が可能である。例？ば、演算装置
ｌ１に取り込まれるデータが電圧ゼロを中心に変動する
■場合には、そのゼロ交差頻度を求めて免疫反応を測定
することもできる。このようにすれば、平均散乱光強度
を求める必要がないので、信号処理および回路構戒をよ
り簡単にできる。

また、交差頻度を求めるための所定値は、上述した平均
散乱光強度、平均散乱光強度の９５％の値あるいは電圧
ゼロに限らず、任意に設定することができる。

さらに、上述した実施例では、平均散乱光強度、平均値
交差頻度等を求めるにあたって、１回の測定で取り込ん
だ約６２万点のデータについて、４０９６点毎に平均強
度、交差頻度等を求めてその平均をとるようにしたが、
４０９６点毎に限らず、１万点毎、１０万点毎あるいは
６２万点全てに対して同様の演算を行って所要の測定値
を得るようにしてもよい。

また、１回の測定で取り込むデータ数も６２万点に限ら
ず、測定毎のバラツキが小さく、有効な再現性が得られ
る範囲で１０万点、１００万点等、任意に９ １０ 設定することができる。

さらにまた、この発明は抗原濃度の測定に限らず、抗体
濃度、その他各種の免疫物質の検出、同定に有効に適用
することができる。

［発明の効果１ 以上のように、この発明によれば、散乱光強度を時系列
的出力が所定値と交差する頻度に基づいて免疫反応を測
定するようにしたので、ＦＦＴ等の複雑な信号処理を行
うことなく、免疫反応を高感度で測定でき、装置を簡単
かつ安価に構威することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ，Ｂおよび第２図はこの発明の作用を説明する
ための図、 第３図はこの発明の免疫反応の測定方法を実施する測定
装置の一例の構威を示す図、 第４図はこの発明の第１実施例における測定値と抗原濃
度との関係を示す図、 第５図は同じくこの発明の第２実施例における測定値と
抗原濃度との関係を示す図、 第６図は同しくこの発明の第３実施例における測定ｊ直
と抗原濃度との関係を示す図である。 １一光源　　　　　　２一集光レンズ ３・−セル　　　　　　４一光トラップ５八，　５Ｂ−
アパーチャ　６一共焦点レンズ７一光電子増倍管　　８
−・一Ａ／Ｄ変換器９−・・増幅器１　０−　ローパス
フィルタ１ｌ一演算装置

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原および抗体を含む反応液に輻射線を投射して散
   乱光の強度を時系列的に検出し、その検出出力が所定値
   と交差する頻度に基づいて免疫反応を測定することを特
   徴とする免疫反応の測定方法。 ２、前記所定値を散乱光強度の平均値としたことを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の免疫反応の測定方法
   。 ３、前記所定値を散乱光強度の平均値とし、免疫反応の
   前後において前記検出出力が該平均値と交差する頻度の
   比に基づいて免疫反応を測定することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の免疫反応の測定方法。