DE69426642T2

DE69426642T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Analyse der Immunität mit Ramanspektrometrie

Info

Publication number: DE69426642T2
Application number: DE69426642T
Authority: DE
Inventors: Toshio Takama; Dou Xiaoming
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 2001-08-02
Anticipated expiration: 2014-11-11
Also published as: EP0654670A3; EP0654670A2; US5607643A; DE69426642D1; US5869346A; JPH07146295A; EP0654670B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum immunologischen Analysieren eines Meßobjekts auf dem Gebiet des klinischen Testens, der biochemischen Probenmessung, der Arzneimittelqualitätsprüfung oder dergleichen.
Immunologische Analyseverfahren, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwenden, umfassen eine Fluoreszenzimmunoanalyse und eine Lumineszenzimmunoanalyse. Diese Verfahren sind angepaßt, um ein Antigen, das mit einem fluoreszierenden Material oder einem chemilumineszenten Material markiert ist, mit einem Meßobjektantigen bezüglich eines Antikörpers zum Messen der Fluoreszenz oder der Lumineszenz von der Markierung eines Antigen-Antikörper-reagierten Immunokomplexes konkurrierend reagieren zu lassen, wodurch quantitativ das Meßobjektmaterial analysiert wird.
Ein Verfahren zum Hinzufügen eines Antigens oder eines Antikörpers eines Meßobjektmaterials zu einem Antikörper oder einem Antigen und zum Messen der Lichtabsorption oder der Lichtstreuung durch einen immunokomplex, der durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird, wodurch eine quantitative Analyse, die als ein optisches Meßverfahren bekannt ist, das weder die Fluoreszenz noch die Lumineszenz verwendet, durchgeführt wird. Quantitative Analyseverfahren, die die Lichtstreuung verwenden, umfassen die Turbidimetrie und die Nephelometrie, die angepaßt sind, um transmittiertes Licht zu messen, das durch Absorption und Streuung gedämpft wird, bzw. um die Intensität des gestreuten Lichts zu messen.
Das Verfahren, das die Lichtstreuung verwendet, mißt die Rayleigh- oder Mie-Streuung ansprechend auf die gemessenen Partikelgrößen. Es wird keine Wellenlängenverschiebung bei der Rayleigh- oder der Mie-Streuung verursacht, und die Streuintensität wird bei einer Anregungslichtwellenlänge gemessen.
Auf der anderen Seite wird eine oberflächensensibilisierte Raman-Spektrometrie als ein Verfahren zum Messen eines Schwingungsspektrums von Molekülen verwendet. Dieses Verfahren verwendet das Phänomen, daß eine starke Raman-Streuung verursacht wird, wenn ein Material auf der Oberfläche einer Edelmetallelektrode oder eines Kolloids aus Gold oder Silber (unter Bezugnahme z. B. auf "Bunseki", 1993, S. 577-585) adsorbiert wird. Protein, Bilirubin und dergleichen werden durch eine solche oberflächensensibilisierte Raman-Spektrometrie untersucht. Es ist bekannt, daß Schwingungsspektren um 107 bis 108 mal beim Auftreten einer oberflächensensibilisierten Raman-Streuung verstärkt werden, um eine Messung einer hohen Empfindlichkeit zu ermöglichen.
Die Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Immunoanalyse erfordert jedoch eine komplizierte chemische Behandlung zum Markieren eines Antigens oder eines Antikörpers mit einem fluoreszierenden oder chemilumineszenten Material. Allgemein ist ferner eine derartige Immunoanalyse eine heterogene Immunoanalyse, die eine B-F-Trennhandlung zum Trennen eines antigen-antikörper-reagierten Immunokomplexes (B) von einem nicht-reagierten Antigen (F) und eine Waschhandlung erfordert, was zu einer Erhöhung der Anzahl der Analyseschritte führt.
Auf der anderen Seite kann das Verfahren, das die Lichtstreuung verwendet, und das eine homogene Immunoanalyse ist, ohne weiteres ohne die Erfordernis einer B-F-Trennung oder einem Waschen durchgeführt werden. Das Verfahren, das die Rayleigh- oder Mie-Streuung verwendet, besitzt jedoch, beispielsweise bei einem Material mit niedriger Konzentration, ein Problem einer niedrigen Erfassungsempfindlichkeit und einer niedrigen Meßgenauigkeit.
Obwohl Studien der oberflächensensibilisierten Raman-Spektrometrie an Protein und Bilirubin durchgeführt wurden, wurde nicht von einer Messung einer oberflächensensibilisierten Raman-Streuung bezüglich eines Immunokomplexes, der durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird, berichtet.
In einem Artikel von T. E. Rohr u. a., "Immuno assay employing surface-enhanced Raman spectroscopy" in Analytical Biochemistry, Band 182, Nr. 2, November 1989, S. 388-398, ist eine Immunoanalyse offenbart, die eine oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie verwendet. Ein Laser bestrahlt eine Probe, und Raman-gestreutes Licht, das durch die Probe emittiert wird, wird durch eine Quarzlinse gesammelt. Das Licht wird durch ein Spektrometer gemessen, und eine Erhöhung der Intensität der Raman-Lichtstreuung wird beobachtet, wenn Moleküle in eine enge Nähe zu bestimmten Metalloberflächen gebracht werden. Aktive Moleküle, die mit Antigenen oder Antikörpern konjugiert bzw. gepaart sind, dienen als Berichterstattermoleküle bei der Immunoanalyse.
In dem Artikel von M. Pezolet, "Thermoelectrically regulated sample holder for Raman spectroscopy" in Review of Scientific Instruments, Band 54, Nr. 10, Oktober 1983, S. 1.364 - 1.367, ist ein Zellhalter gezeigt, der thermoelektrisch durch einen Computer geregelt und gesteuert wird. Ein Temperatursensor und eine Temperatursteuerung zum Beibehalten der Zelle auf einer konstanten Temperatur sind vorgesehen, und die Probe ist in einer Kapillarzelle aufgenommen, zu der ein Laserstrahl geht. Das emittierte Licht wird mit einem Spektrometer gemessen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Bestimmen eines Antigen- oder Antikörper-Bindungspartners eines Immunokomplexes in einer Probe und einen Immunitätsanalysator, der die Immunität mit einer hohen Empfindlichkeit ohne die Erfordernis einer komplizierten chemischen Behandlung für die Markierung messen kann, und der ferner eine homogene Immunoanalyse implementieren kann, zu schaffen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und durch einen Immunitätsanalysator gemäß Anspruch 7 gelöst.
Gemäß einer durch die Erfinder durchgeführten Untersuchung kann ein Raman-Signal, das bei einem Zustand des Adsorbierens eines Antikörpers oder eines Antigens auf einer Oberfläche eines Edelmetallkolloids erhalten wird, von einem Raman-Streuung-Signal unterschieden werden, das in einem Zustand erhalten wird, bei dem ein Antigen oder ein Antikörper hinzugefügt wird, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu bewirken und um einen Immunokomplex auf der Kolloidoberfläche zu adsorbieren. Die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieser Erkenntnis vorgeschlagen und ist angepaßt, um mindestens entweder eine qualitative oder quantitative Analyse eines Antigens oder eines Antikörpers durch eine Messung der Raman-Streuung zu ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung ist ferner auf eine inhomogene Immunoanalyse anwendbar, bei der ein Antikörper oder ein Antigen auf Oberflächen von Partikeln, die ein Edelmetallkolloid bilden, vorher adsorbiert wird, ein Antigen oder ein Antikörper eines Meßobjekts, das mit dem Antikörper oder dem Antigen antigen-antikörper-reagiert ist, hinzugefügt wird, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu verursachen, und danach das Kolloid mit einem Anregungslicht ohne eine B-F- Trennung bestrahlt wird, um eine homogene Immunoanalyse bei einem bevorzugten Modus der vorliegenden Erfindung durchzuführen.
Ein Kolloid aus Gold, Silber oder Kupfer kann als Edelmetallkolloid verwendet werden. Ein ordnungsgemäßer Partikeldurchmesser für das Kolloid ist 5 bis 50 nm.
Ein Antigen eines Meßobjektmaterials wird zu einem Edelmetallkolloid hinzugefügt, das durch vorhergehendes Adsorbieren eines Antikörpers auf Oberflächen der Partikel desselben, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion zu verursachen, vorbereitet wird, so daß ein Immunokomplex, der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird, auf der Kolloidoberfläche adsorbiert wird. In diesem Zustand wird das Kolloid mit einem Anregungslicht bestrahlt, um eine oberflächensensibilisierte Raman-Streuung zu verursachen. Die Wellenlänge des Raman-gestreuten Lichts wird bezüglich derselben des Anregungslichts um eine Frequenz verschoben, die durch eine innere Schwingung des Immunokomplexmaterials verursacht wird, das auf der Kolloidoberfläche adsorbiert wird. Es ist möglich den Immunokomplex, wie er durch das Raman- Spektrum dargestellt wird, durch spektroskopisches Erfassen des Raman-Streulichts zu identifizieren, während das Objektmaterial aus der Intensität des Raman-Streulichts als hinzugefügt bestimmt wird.
Wenn eine Probe mit Anregungslicht bestrahlt wird, wird die Probentemperatur erhöht. Da die oberflächensensibilisierte Raman-Streuung durch die Temperatur beeinflußt wird, ist es möglich, eine Erhöhung der Probentemperatur, die durch die Bestrahlung mit dem Anregungslicht verursacht wird, zu vermeiden, indem die Zelle auf einer konstanten Temperatur durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gehalten wird.
Die vorliegende Erfindung ist angepaßt, um die Immunität auf der Basis der Tatsache zu analysieren, daß eine oberflächensensibilisierte Raman-Streuung verursacht wird, wenn ein Immunokomplex auf Oberflächen von Partikeln adsorbiert wird, die ein Edelmetallkolloid bilden, und eine Analyse kann mit einer hohen Empfindlichkeit durchgeführt werden, da die Raman-Streuung durch die Sensibilisierung um 10&sup7; bis 10&sup8; mal verstärkt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Betrieb vereinfacht, da es möglich ist, eine homogene Immunoanalyse zu implementieren, die weder eine B-F-Trennung noch eine Waschhandlung erfordert.
Es ist möglich, eine Analyse einer kleinen Menge einer Probe zu ermöglichen, während der Einfluß vermieden wird, der durch eine Temperaturänderung der Probe verursacht wird, indem die Zelle zum Messen der Probe auf einer konstanten Temperatur mittels eines elektronischen Kühl/Heiz-Elements gehalten wird.
Die vorhergehenden und weitere Ziele, Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung offensichtlicher werden, wenn dieselbe in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen vorgenommen wird.
Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das schematisch optische Systeme zum Ausführen der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm, das optische Systeme gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung detailliert zeigt;
Fig. 3 ist ein Signalformdiagramm, das Raman-Spektren vor und nach der Immunitätsreaktion bei dem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt;
Fig. 4 ist eine vertikale Schnittansicht, die ein Beispiel einer bevorzugten Zelle zeigt;
Fig. 5 ist ein Blockdiagramm, das ein Temperatursteuersystem für die in Fig. 4 gezeigte Zelle zeigt; und
Fig. 6 ist eine teilfragmentierte vertikale Schnittansicht, die ein weiteres Beispiel einer bevorzugten Zelle zeigt.
Fig. 1 zeigt einen Immunitätsanalysator gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
Eine Zelle 15 nimmt eine Kolloidprobe auf, die durch Adsorbieren eines Immunokomplexes vorbereitet wurde, der durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion auf einer Oberfläche eines Edelmetallkolloids, wie z. B. ein Goldkolloid, als ein Immunitätstestmaterial gebildet wird. Die Ziffer 1 bezeichnet eine Anregungslichtquelle, die durch eine Lasereinheit gebildet ist, zum Messen des Raman-Streulichts. Die Lasereinheit kann aus Lasern mit breiten Wellenlängenbereichen über Regionen des nahen Ultravioletts bis Regionen des nahen Infrarot, wie z. B. ein kontinuierlich schwingender Ar-Ionen- Laser, ein Kr-Ionen-Laser, ein He-Ne-Laser und ein He-Cd- Laser und ein Pulslaser, wie z. B. ein Nd : YAG-Laser, ausgewählt werden. Wenn ein spontan emittiertes Licht der Lasereinheit abgeschirmt wird, so daß lediglich ein Schwingungsstrahl als das Anregungslicht verwendet wird, kann die Lasereinheit mit einem Interferenzfilter oder einem Spektroskop kombiniert sein. Alternativ kann ferner das Spontanemissionslicht gleichzeitig angewendet werden, um eine Wellenlängenkalibrierung eines Spektrums durchzuführen.
Das Anregungslicht, das durch die Lichtquelle 1 erzeugt wird, wird durch ein optisches System 10 in einen Meßstrahl und einen Referenzstrahl getrennt, so daß der Meßstrahl durch das optische System 10 eingestellt wird und an die Probe, die in der Zelle 15 aufgenommen ist, angelegt wird. Das Raman-Streulicht, das von der Probe erzeugt wird, wird in einer Richtung entnommen, die in einem Winkel von 90º bezüglich der Einfallsrichtung des Meßstrahls liegt, und durch einen spektralen Detektor 30, der ein Spektroskop umfaßt, durch ein optisches System 20 zum Einstellen des Lichtstroms erfaßt.
Auf der anderen Seite wird der Referenzstrahl durch einen Detektor 26 durch ein optisches System 40 zur Lichtstromeinstellung erfaßt, um eine Schwankung der Anregungslichtintensität zu korrigieren. Eine signalverarbeitende Arithmetikeinheit 50 korrigiert das Raman-Streulicht, das durch den spektralen Detektor 30 mit einem Ausgangssignal des Detektors 26, das die Lichtquellenintensität anzeigt, erfaßt wird, um ein Raman-Spektrum zu erhalten, wodurch das Meßobjektmaterial identifiziert oder bestimmt wird. Die Bezugsziffer 35 bezeichnet eine Ausgabeeinheit, wie z. B. einen Drucker oder eine CRT.
Fig. 2 zeigt detailliert die optischen Systeme. Ein Strahlteiler 2 zum Trennen des Lichtstroms des Anregungslichts, das von der Laserlichtquelle 1 empfangen wird, in den Meßstrahl und den Bezugsstrahl, eine konvexe Linse 3 zum Konzentrieren des Meßstrahls, der durch den Strahlteiler 2 getrennt wird, konvexe Linsen 6 und 7 zum Einstellen des Lichtstroms und ein Strahlteiler 8 zum Reflektieren des Meßstrahls und zum Führen desselben zu der Probe, die in der Zelle 15 aufgenommen ist, sind entlang des optischen Wegs des Meßstrahls angeordnet, wodurch das optische System 10 zum Bestrahlen der Probe mit dem Lichtstrom, der als der Meßstrahl dient, gebildet wird. In dem optischen Weg des Meßstrahls ist ferner ein Filter 4 zwischen den konvexen Linsen 3 und 6 zum Auswählen eines Laserstrahls einer Wellenlänge aus einer Mehrzahl von Schwingungsstrahlen, die von der Laserlichtquelle 1 empfangen werden, vorgesehen.
Auf der anderen Seite sind eine konvexe Linse 9 zum Konzentrieren des Raman-gestreuten Lichts und des Meßstrahls, der durch den Strahlteiler 8 übertragen wird, und konvexe Linsen 12 und 13 zum Einstellen des Lichtstroms entlang des optischen Wegs des Raman-gestreuten Strahls, der von der Probe erzeugt wird, die in der Zelle 15 aufgenommen ist, angeordnet, wodurch das optische System 20 zum Extrahieren des Raman-gestreuten Lichts in einer Richtung, die in einem Winkel von 180º bezüglich der Einfallsrichtung des Meßstrahls liegt, gebildet wird. Ein Filter 11 zum Entfernen einer Anregungslichtkomponente ist zwischen den konvexen Linsen 9 und 12 vorgesehen.
Auf einer Referenzstrahlseite sind reflektierende Spiegel 21 und 22 zum Biegen des optischen Wegs und konvexe Linsen 24 und 25 zum Einstellen des Lichtstroms entlang des optischen Wegs angeordnet, um den Kontraststrahl zu dem Detektor 26 zu führen. Ein Filter 23 mit den gleichen Wellenlängencharakteristika wie das Filter 4, das auf der Meßstrahlseite vorgesehen ist, ist zwischen dem reflektierenden Spiegel 2 und der konvexen Linse 24 vorgesehen.
Fig. 3 zeigt ein Raman-Spektrum (vor der Immunoreaktion) A, das von einem IgG-Antikörper erhalten wird, der auf Oberflächen von Goldkolloidpartikeln adsorbiert ist, und ein Raman-Spektrum (nach der Immunoreaktion) B, das im Gegensatz dazu nach dem Hinzufügen eines Antigens IgG zu der Probe erhalten wird, als Beispiel-Raman-Spektren. Die Ordinate zeigt die relative Streulichtintensität, die relativ Mengen des empfangenen Lichts bezüglich eines Pegels 0 anzeigt, bei dem kein Licht auf der Meßvorrichtung empfangen wird, und die Abszisse zeigt die Wellenzahlen.
Das Goldkolloid, das den IgG-Antikörper auf Partikeloberflächen adsorbiert, und das zum Ausführen dieser Messung verwendet wird, wird durch Verdünnen einer ANTI-MAUS-IgG(H)- (Ziege-) GOLD-VERBINDUNG, EM (Erzeugnis von BioCell, USA) mit einem Partikeldurchmesser von 30 nm und einer Konzentration von 15 ug/ml 100 mal mit 0,01 M PBS (pH 7,4), das 1% BSA enthält, vorbereitet. Bezugnehmend auf Fig. 3 zeigt das Symbol A das Raman-Spektrum, das aus dem Goldkolloid, das den Antikörper selbst adsorbiert, erhalten wird. Auf der anderen Seite zeigt das Symbol B das Raman-Spektrum, das erhalten wird, nachdem die Probe zu dem Goldkolloid hinzugefügt wurde, das den Antikörper adsorbiert, um 0,1 ng/ml eines Maus-IgG zu enthalten, und eine Antigen-Antikörper-Reaktion verursacht. Die Lichtquelle 1 wird durch einen YAG- Laser mit einem Ausgangssignal von 300 mw gebildet.
Wenn man die Spektren A und B vor und nach der Immunoreaktion, die in Fig. 3 gezeigt ist, miteinander vergleicht, erscheinen charakteristische Bänder in der Nähe von 1.460 cm&supmin;¹, 1.058 cm&supmin;¹, 835 cm&supmin;¹ etc. in dem Spektrum B nach der Immunoreaktion. Diese charakteristische Raman-Streuung wird durch einen Immunokomplex verursacht, der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird, die auf der Goldkolloidoberfläche verursacht wird.
Das Spektrum B, das in Fig. 3 gezeigt ist, wird durch das Durchführen der Messung ohne das Trennen (BF-Trennen) eines nicht-reagierten freien Antigens nach der Antigen-Antikörper-Reaktion erhalten. Folglich kann ein charakteristisches Raman-Spektrum erhalten werden, ohne die BF-Trennung durchzuführen, wodurch eine homogene Immunoanalyse aufgebaut werden kann.
Ein Immunokomplex, der durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion gebildet wird, wird allgemein durch Anregungslicht beeinflußt, derart, daß derselbe durch eine Temperaturänderung, die durch Wärme verursacht wird, die in einer Probe bei einer Bestrahlung mit einem Laserstrahl absorbiert wird, zerlegt oder verdampft wird oder durch das Licht verändert wird. Insbesondere wird ein Problem bei der Messung einer farbigen oder gefärbten Probe oder einer stark wärmeabsorbierenden Probe verursacht. Daher ist es vorzuziehen, eine Probe bei einer konstanten Temperatur zu halten, indem eine Temperatursteuerung durchgeführt wird, um die Raman-Streuung über lange Zeit zu messen.
Allgemein wird eine Messung, während eine Probe fluktuiert wird, durchgeführt, wobei zum Halten der Probe auf einer stabilen Temperatur gekühlte Luft zu einer Probe zum Streuen von Wärme geblasen wird, eine Probe in einem Stickstoffgasstrahl plaziert wird, oder eine Drehzelle mit einer hohen Geschwindigkeit gedreht wird, um die Messung durchzuführen, während dieselbe ähnlich zu einer Zentrifuge bewegt wird. Es ist folglich denkbar, ein derartiges Verfahren auf die erfindungsgemäße Raman-Spektralmessung anzuwenden.
Es ist jedoch schwer, eines dieser Verfahren auf die vorliegende Erfindung anzuwenden. Beispielsweise ist eine beträchtliche Probenmenge zum Messen einer Probe erforderlich, während dieselbe fluktuiert wird, und dieses Verfahren kann nicht zur Messung einer kleinen Probenmenge verwendet werden. Bei dem Verfahren des Plazierens der Probe in der kalten Luft oder in einem Stickstoffgasstrahl ist ein Kaltgasgenerator erforderlich, und daher wird der Analysator bezüglich der Größe vergrößert, was zu einem unpraktischen Betrieb und zu Schwierigkeiten bei der Anwendung führt. Die Drehzelle wurde in der Erwartung entwickelt, den Einfluß durch eine hohe Wärme über eine lange Zeit durch Bewegen der Probe mit einer ausreichend hohen Geschwindigkeit zu verhindern, während schwebende Substanzen an einer äußeren Wand der Zelle haften können oder Proben durch die Wirkung einer spezifischen Schwerkrafttrennung, die durch die Hochgeschwindigkeitsdrehung verursacht wird, kaum miteinander gemischt werden, da die Zelle, die mit einer hohen Geschwindigkeit gedreht wird, ähnlich wie eine Zentrifuge wirkt. Die Drehzelle erfordert bis zu einem bestimmten Grad ferner eine überschüssige Probenmenge.
Fig. 4 zeigt eine Beispielszelle zum Lösen dieser Probleme.
Bezugnehmend auf Fig. 4 bezeichnet die Ziffer 63 eine Aluminiumzelle, die einen Aluminiummetallblock mit einem Loch aufweist, das in dem oberen Ende desselben hin zu dem Inneren desselben zum Aufnehmen einer Probe vorgesehen ist. Eine innere Oberfläche dieses Lochs ist spiegelpoliert und wird einem Goldplattieren ausgesetzt, um das Infrarotreflexionsvermögen zu erhöhen. Ein Fenster 65 ist in einem unteren Abschnitt des Lochs zum Anlegen von Anregungslicht an eine Probe 64 von außen und zum Entnehmen des Raman-Streulichts aus der Probe 64 nach außen vorgesehen, wobei eine Quarzglasfensterplatte 68 in dieses Fenster 65 gepaßt ist. In dem Metallblock, der die Zelle 63 bildet, sind Peltier-Elemente 62, 62, die als elektronische Kühl/Heiz-Elemente dienen, an seitlichen bzw. unteren Abschnitten des Lochs vorgesehen. Die Zelle 63 ist in einer Berührung mit den Wärmeabsorptionsseiten der Peltier-Elemente 62, 62, während die Diffusionsplatten 61 in Berührung mit den Wärmestrahlungsseiten der Peltier-Elemente 62, 62 sind. Ein Temperatursensor 67 ist in dem Metallblock untergebracht, der die Zelle 63 bildet. In der Zelle 63, die in Fig. 4 gezeigt ist, liegt die Einfallsrichtung des Anregungslichts in einem Winkel von 180º bezüglich der Richtung zum Entnehmen des Raman-Streulichts.
Um diese Zelle 63 auf einer konstanten Temperatur zu halten, ist eine Temperatursteuerung 70 vorgesehen, wie es in Fig. 5 gezeigt ist, um ein Erfassungssignal des Temperatursensors 67 zu empfangen, und um die Strommengen, die zu den Peltier-Elementen 62, 62 gespeist werden sollen, zu steuern. Wenn die Temperatur der Probe 64, die mit dem Anregungslicht bestrahlt wird, erhöht wird, steuert die Temperatursteuerung 70 die Erregungsmengen der Peltier-Elemente 62, 62 zum Reduzieren der Temperatur der Zelle 63 auf eine anfangs eingestellte Temperatur.
Fig. 6 zeigt eine weitere Beispielzelle. Im Vergleich zu der Zelle 63, die in Fig. 4 gezeigt ist, und die einstückig durch Aushöhlen des Metallblocks gebildet ist, wird eine Quarzglaszelle 66 in Fig. 6 verwendet. Ein Aluminiummetallblock ist in zwei Abschnitte 63a und 63b geteilt, während Hohlräume zum Aufnehmen der Zelle 66 in gegenüberliegenden Teilen dieser Abschnitte 63a und 63b gebildet sind, so daß die Abschnitte 63a und 63b des Metallblocks miteinander kombiniert werden, um die Zelle 66 mit den Hohlräumen zu umfassen. Die Zelle 66 befindet sich in Berührung mit dem Metallblock, der durch die Abschnitte 63a und 63b gebildet ist, die miteinander kombiniert werden. Ein Fenster 65 ist in einer Position des Metallblockabschnitts 63a gebildet, die einem unteren Abschnitt der Zelle 66 entspricht, um ein Anregungslicht anzulegen und um ein Raman-Streulicht zu entnehmen. Peltier-Elemente 62, 62 zum Steuern der Temperatur sind derart angebracht, daß sich die Wärmeabsorptionsseiten derselben in einer Berührung mit dem Metallblockabschnitt 63b befinden, während die Diffusionsplatten 61 auf Wärmestrahlungsseiten der Peltier-Elemente 62, 62 vorgesehen sind, und ein Temperatursensor 67 in dem Metallblockabschnitt 63a aufgenommen ist.
Wenn die in Fig. 4 oder Fig. 6 gezeigte Zelle verwendet wird, ist es möglich, den Einfluß einer Temperaturänderung, wie z. B. eine Probenzerlegung oder eine Probenverdampfung durch Licht oder Wärme des Anregungslichts für eine Raman- Spektralmessung oder die Destabilisierung des Spektrums, zu verhindern. Diese Zelle ermöglicht ferner die Analyse einer feinen Probenmenge.

Claims

1. Ein Verfahren zum qualitativen oder quantitativen Bestimmen eines Antigen- oder Antikörper-Bindungspartners eines Immunokomplexes in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Adsorbieren eines Antigens oder eines Antikörpers auf Oberflächen von Partikeln, die ein Edelmetallkolloid bilden;

(b) Bestrahlen des Kolloids, auf dem das Antigen oder der Antikörper adsorbiert ist, mit einem monochromatischen Anregungslicht einer vorbestimmten Wellenlänge und spektroskopisches Analysieren des Raman-Streulichts, das durch das Antigen oder den Antikörper gestreut wird;

(c) Kombinieren einer Probe, die einen Antikörper- oder einen Antigen-Bindungspartner enthält, mit einer Flüssigkeit, um einen Immunokomplex zwischen dem Antigen oder dem Antikörper und dem Antikörper- oder Antigen-Bindungspartner zu bilden;

(d) Bestrahlen des Kolloids, das den darauf adsorbierten Immunokomplex aufweist, mit dem monochromatischen Anregungslicht der vorbestimmten Wellenlänge und spektroskopisches Analysieren des Raman-Streulichts, das durch den Immunokomplex gestreut wird; und

(e) Vergleichen des Raman-Streulichts von den Schritten (b) und (d), um qualitativ oder quantitativ den Antikörper- oder Antigen-Bindungspartner zu bestimmen.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Edelmetallkolloid aus einem Metall vorbereitet wird, das aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Gold, Silber und Kupfer besteht, und das Kolloid einen Durchmesser von 5 bis 50 nm aufweist.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt des Analysierens in den Schritten (b) und (d) das Erhalten einer Menge einer Wellenlängenverschiebung von der vorbestimmten Wellenlänge des Anregungslichts aufweist, und der Antikörper- oder Antigen-Bindungspartner aus der Menge der Wellenlängenverschiebung bestimmt wird.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Schritt des Analysierens in den Schritten (b) und (d) das Erfassen der Intensität des Raman-Streulichts aufweist.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Flüssigkeit auf einer konstanten Temperatur während der Schritte (b) und (d) gehalten wird.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem keine Trennung von gebundenen und freien Antigen- oder Antikörper- Bindungspartnern durchgeführt wird.

7. Ein Immunitätsanalysator gekennzeichnet durch:

eine Probenzelle (155) zum Aufnehmen einer Probe, die durch Adsorbieren eines Antigens oder Antikörpers auf Oberflächen von Partikeln, die ein Edelmetallkolloid bilden, vorbereitet wird;

einen Lichtquellenteil (1) zum Bestrahlen der Probe, die in der Probenzelle (15) aufgenommen ist, mit Anregungslicht;

einen Spektralerfassungsteil (30) zum spektroskopischen Erfassen des Raman-Streulichts von der Probe, die in der Probenzelle (15) aufgenommen ist;

ein optisches System (10) zum Trennen des Anregungslichts von dem Lichtquellenteil (1) in einen Meßstrahl und einen Referenzstrahl; und

eine Korrektureinrichtung (50) zum Korrigieren eines Ausgangssignals des Spektralerfassungsteils (30) durch den Meßstrahl durch die Intensität des Referenzstrahles;

wobei die Probenzelle (15) ein elektronisches Kühl/Heiz-Element (62), einen Temperatursensor (67) und eine Temperatursteuerung (70) zum Steuern einer Erregung des elektronischen Kühl/Heiz-Elements (62) durch ein Ausgangssignal des Temperatursensors (67) liefert, wodurch die Zelle (15) auf einer konstanten Temperatur gehalten wird.

8. Ein Immunitätsanalysator gemäß Anspruch 7, bei dem der Lichtquellenteil (1) eine Lasereinheit aufweist.

9. Ein Immunitätsanalysator gemäß Anspruch 8, bei dem der Lichtquellenteil (1) ferner eine Spektraleinrichtung zum Auswählen eines Schwingungsstrahls einer spezifischen Wellenlänge aus Licht, das durch die Lasereinheit erzeugt wird, aufweist.

10. Ein Immunitätsanalysator gemäß Anspruch 7, bei dem die Probenzelle (15) durch einen wärmeleitfähigen Metallblock (63) gebildet ist, der ein Loch, das in dem oberen Ende desselben hin zu dem Inneren desselben zum Aufnehmen der Probe vorgesehen ist, wobei das Loch mit einer spiegelpolierten inneren Oberfläche versehen ist, die einem Goldplattieren ausgesetzt wurde, und einen unteren Abschnitt mit einem Fenster (65) zum Empfangen des Anregungslichts und zum Emittieren des Raman-Streulichts mit einer Quarzglasfensterplatte (68), die in dasselbe gepaßt ist, aufweist.

11. Ein Immunitätsanalysator gemäß Anspruch 7, bei dem die Probenzelle folgende Merkmale aufweist:

eine Quarzglaszelle (66); und

einen wärmeleitfähigen Metallblock (63a, 63b), der ein Loch in dem oberen Ende desselben hin zu dem Inneren desselben zum Aufnehmen der Quarzglaszelle aufweist, wobei das Loch in dem unteren Abschnitt desselben mit einem Fenster (65) zum Empfangen des Anregungslichts und zum Emittieren des Raman-Streulichts versehen ist;

wobei das elektronische Kühl/Heiz-Element (62) und der Temperatursensor (67) in dem Metallblock (63a, 63b) vorgesehen sind.

12. Ein Immunitätsanalysator gemäß Anspruch 11, bei dem der Metallblock aus zwei Abschnitten (63a, 63b) besteht, die miteinander zum Definieren des Lochs zum Aufnehmen der Quarzglaszelle (66) kombiniert sind.