CN1122181C

CN1122181C - 用于免疫分析的方法及装置

Info

Publication number: CN1122181C
Application number: CN96105967A
Authority: CN
Inventors: 窦晓鸣; 山口佳则; 上野山晴三
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1996-03-11
Filing date: 1996-03-11
Publication date: 2003-09-24
Anticipated expiration: 2016-03-11
Also published as: CN1161453A

Abstract

一种至少在其一个表面上具有全反射棱镜的全反射池，将含有金溶胶标记的吸附到金溶胶上的抗体的混合液贮存到该全反射池中，然后将含有能与抗体发生抗原-抗体反应的抗原的样品液加入到其中以形成金溶胶标记的免疫复合物。将测定光束从入射光学系统以能够产生全反射的θ角引入到全反射棱镜中并且来自全反射棱镜的出射光束被测定光学系统接收，借此测定金溶胶标记的免疫复合物的吸收并对抗原进行定性和测定。

Description

用于免疫分析的方法及装置

技术领域

本发明涉及一种在临床检验、生化样品测定、药物质量控制等领域中用于免疫分析测定目标的方法和装置。

背景技术

利用抗原-抗体反应的免疫分析方法包括荧光免疫测定法和发光免疫测定法。在这两者的任何一种方法中，都是使利用光物质或化学发光物质标记的抗原与带有在竞争中作测定目标的抗原的抗体反应，以便通过抗原-抗体反应形成一个免疫复合物(即分子配合物)，从而可测定来自标记物的荧光和发光，借此定量分析靶物质。

另一方面，将作为测定目标的抗原或抗体加入到抗体或抗原中并测定通过抗原-抗体反应形成的免疫复合物对光的吸收或散射，借此进行定量分析的方法被称为一种既不利用荧光也不利用发光的光学测定法。利用光散射现象的定量分析方法包括比浊法和浊度测定法。前者适于测定被吸收和散射衰减的透射光，而后者适于测定散射光强度。利用光散射的方法适于测定与测定粒子大小相对应的瑞利(Rayleigh)散射和米(mie)散射。

有人提议将属于荧光免疫测定法的荧光免疫测定装置作为采用全反射池的免疫测定装置(参见日本专利公报No.5-203574(1993))。在这种荧光免疫测定法中，将抗体固定在全反射棱镜的表面上，然后通过抗原-抗体反应使样品中所含的抗原结合到抗体上，再通过抗原-抗体反应使一种利用荧光物质标记的抗体再结合到这个抗原上。其后进行B-F分离以除去利用荧光物质标记的未反应的抗体，然后将激发光束导入全反射棱镜中以激发束缚在全反射棱镜表面上的被标记的抗原-抗体免疫复合物，从而测定由荧光物质所产生的荧光。

利用光散射的方法(即单相免疫测定法)是一种既不需要B-F分离也不需要洗涤的简单方法。然而，利用瑞利散射或米散射的方法在测定低浓度的物质时具有检测灵敏度低和测定准确度差的缺陷。

另一方面，荧光或发光免疫测定法需要利用荧光或发光物质来标记抗原或抗体的复杂的化学处理过程。而且，多数是多相免疫测定法，该测定法必然需要B-F分离，以便通过大量的分析步骤使发生抗原-抗体反应的免疫复合物(B)与未发生抗原-抗体反应的抗原或抗体(F)分离并进行洗涤。

为了通过免疫复合物的吸收测定定性和定量分析免疫复合物，发明人进行了深入研究，发现虽然从免疫复合物本身得不到具有适于测定的灵敏度的吸收，但是当免疫复合物处于被贵金属溶胶粒子吸附的状态时能够在相当好的灵敏度下测定免疫复合物的吸收。

发明内容

本发明的一个目的是使得利用免疫复合物的吸收测定来定性或进一步测定免疫物质这样一种方法能够比荧光或发光免疫测定法更易于进行。

按照本发明的一种测定样品中所含的抗原或抗体的免疫分析方法，包括如下步骤：使含有用粒度为5-50nm的金、银或铜的贵金属溶胶粒子标记的抗体或抗原的溶液与样品溶液混合以形成样品混合液，从而使所述样品溶液中含有的抗原或抗体与被标记的所述抗体或抗原反应，借此形成一个贵金属溶胶标记的免疫复合物；将波长在从近红外到红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角导入一个构成全反射池的全反射棱镜中，所述样品混合液存在于所述全反射池中；以及测定在所述全反射棱镜与所述样品混合液之间的界面处产生的所述测定光束的吸收。这样，就可定性或进一步测定样品中所含的抗原或抗体。

可用金、银或铜溶胶制备贵金属溶胶，并且其合适的粒径为5-50nm。

按照本发明，不分离用贵金属溶胶标记的抗体或抗原或者样品溶液中所含的抗原或抗体中的未反应的那一个也能够利用测定光束进行吸收测定，借此实施单相免疫测定分析。除此之外，通过利用贵金属溶胶还能进行高灵敏的测定。

按照本发明适于实施上述方法的一种免疫测定装置，包括：一个在其限定出一个容纳所述样品混合液的空间的壁面的至少一面上具有一个全反射棱镜的全反射池，所述全反射棱镜由折射率比含有用贵金属溶胶标记的免疫复合物的样品混合液的折射率大的材料制成；一个用于将波长在从近红外至红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角导入所述全反射棱镜中的入射光学系统；以及一个用于接收来自所述全反射棱镜的出射光束以便测定所述样品混合液的吸收度的测定光学系统。

可用一个容器型池或一个流动池来制成全反射池，所述容器型池只有一个开口以便在池中发生抗原-抗体反应形成贵金属溶胶标记的免疫复合物或在另一容器中进行抗原-抗体反应形成贵金属溶胶标记的免疫复合物，然后在这个容器型池中贮存含有贵金属溶胶标记的免疫复合物的样品混合液，所述流动池具有一个溶液入口和一个溶液出口以便在形成贵金属溶胶标记的免疫复合物之后将样品混合液加入其中。

可用发射连续波长的光束的光源或用单波长光源(例如发射单波长光束的激光单元)形成包括在入射光学系统中的光源。当光源发射连续波长的光束时，虽然入射或测定光学系统必须包括一个分光镜，但是也可实施分光光度测定法。另一方面，如果采用单波长光源，则可只在光源的单一波长处进行吸收测定，而无需分光镜。

当存在于全反射池中的样品混合液只包含用贵金属溶胶标记的抗体或抗原时，未能识别具有适于测定的灵敏度的吸收。当不用贵金属溶胶标记免疫复合物时，也未能识别出具有适于测定的灵敏度的吸收。只有当用贵金属溶胶标记的免疫复合物存在时才在一个特定的波长处识别出具有适于测定的灵敏度的吸收。本发明的特点就在于这一点，由此能够进行单相免疫测定分析。

假设n₂代表含有免疫复合物的样品混合液的折射率，n₁(n₂＜n₁)代表全反射棱镜的折射率，产生全反射的临界角θ_c则表示如下：

θ_c＝Sin^-1(n₂/n₁)当将来自入射光学系统的测定光束导入全反射棱镜中时，全反射棱镜与样品混合液之间界面处的入射角θ(参见图1)应满意下述条件：

θ＞θ_c

当进行单相免疫测定分析时，被吸收测定的样品混合液是含有贵金属溶胶标记的抗体(或抗原)、贵金属溶胶标记的免疫复合物、未反应的抗原(或抗体)、生物聚合物以及类似物质的混合溶液。

测定光束是在近红外、中红外以及远红外区域中的适当区域中包括一连续波长光束的光束，或者是一单波长光束。

可用吸收度A如下表示全反射棱镜的吸收：

A＝N·α·de·loge在此处，N代表全反射棱镜中的全反射次数，α代表样品混合液的吸收系数，de代表在一次全反射中测定光束射入样品混合液所通过的光路长度。

按照本发明，利用一全反射池高灵敏地测定存在于样品混合液中的贵金属溶胶标记的免疫复合物的吸收。只有在利用贵金属溶胶标记的免疫复合物中才能够测定到具有适于测定的灵敏度的吸收，而只在利用贵金属溶胶标记的抗体或抗原中或者在没有用贵金属溶胶标记状态的免疫复合物中测不到具有适于测定的灵敏度的吸收，由此利用由全反射测定的吸收而无需B-F分离即可进行免疫物质的定性和测定，同时通过简单的操作并利用简单的测定装置就可完成免疫测定。

附图说明

通过以下结合附图对本发明的详细描述，本发明的上述和其它目的、特征、情况及优点将变得更加显而易见。

图1是本发明的一个实施例的示意图；

图2是按照这个实施例的测定装置的方框图；

图3是本发明中的金溶胶标记的免疫复合物和金溶胶标记的抗体的光谱图；

图4是本发明中的金溶胶标记的免疫复合物和没有用金溶胶标记的免疫复合物的光谱图；

图5是基于图3所示光谱描绘的本发明金溶胶标记的免疫复合物的全反射吸收光谱的差光谱；

图6示出了在按照本发明的免疫测定法中，在2942.5cm^-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依从关系；

图7示出了在按照本发明的免疫测定方法中，在2888.1cm^-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依从关系；

图8示出了在按照本发明的免疫测定法中，在1112.4cm^-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依以关系；

图9示出了在按照本发明的免疫测定法中，在1043.3cm^-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依从关系；

图10示出了在按照本发免疫测定方法中，在993.8cm^-1处的吸收度对抗体IgG浓度的依从关系；

图11A是只有一个开口的典型的全反射池的前视图，图11B是只有一个开口的另一全反射池的前视图和平面图；以及

图12A是一个典型的废弃的全反射池的透视图和前视图，而图12B至12E分别是另几种典型的全反射流动池的透视图和前视图。

具体实施方式

图1示意性地示出了本发明的一个实施例。全反射池2在其至少一个表面上具有全反射棱镜4。将含有金溶胶标记的抗体6(被吸附到用作典型的贵金属溶胶的金溶胶上)的混合液8贮存到全反射池2中，其次将含有能与抗体6发生抗原-抗体反应的抗原10的样品液12加入到其中，以使抗体6和抗原10在贮存于全反射池2内的混合液8中进行抗原-抗体反应，借此形成金溶胶标记的免疫复合物14。将测定光束从入射光学系统16中以一个能够产生全反射的入射角θ引入全反射棱镜4中，由此，测定光束穿过全反射棱镜4同时被全反射，并穿过全反射棱镜4与混合液8之间的交界面稍稍入射到混合液8中，从而被混合液8中的金溶胶标记的免疫复合物14吸收。来自全反射棱镜4的出射光束被测定光学系统18接收以便测定其吸收度，由此可以定性并测定样品液12中含有的抗原10。

图2示意性地示了这个实施例的测定装置。入射光学系统16包括发射测定光束的光源16a和调节光束的光学系统16b。调节光束的光学系统16b包括一个用于将来自光源16a的光束转变成平行光束的光学系统、一个用于将光束分成测定光束20s和参考光束20r的光束分离器以及一个用于将测定光束20s以能够产生全反射的入射角度导入全反射池2的全反射棱镜4中的光学系统。将用于调节测定光束20s(被全反射并穿过全反射池2的全反射棱镜4)的光通量的光学系统22和用于接收被光学系统22调节的测定光束20s并将接收到的测定光束分成光谱成分的分光镜23安置在测定光束20s的光路上，以便使已分成光谱成分的测定光束20s传导到检测部件26，并被检测部件26检测。图1所示的测定光学系统18包括光学系统22、分光镜23和检测部件26。

另一方面，用于调节参考光束20r的光通量的光学系统24被安置在用于校正测定光束20s的波动的参考光束20r的光路上，以便使已调节的参考光束20r传导到检测部件26，并被检测部件26检测。应如此形成检测部件26，即：使其利用代表光源强度的参考光束20r的强度校正测定光束20s，借此计算吸收度，所述的测定光束20s穿过全反射棱镜4并通过分光镜23被分成光谱成分。

数字28表示控制分光镜23的光谱操作的控制器，用于将来自检测部件26的检测输出传送到数据处理器30。数字32表示输出数据处理器30中的处理结果的输出单元，例如记录器或CRT(阴极射线管)。

光源16a可由荧光灯、氙灯、黑体辐射源、气体激光器、固体激光器或半导体激光器形成。

可用ZnSe、Ge、Si、Al₂O₃或MgO制备用来制作全反射棱镜4的材料。只有全反射棱镜4由这种材料制成或者全反射池2的包括全反射棱镜4在内的全部壁面都用这种材料制成。

可由FTIR(傅里叶变换红外分光光度计)(利用IR闪耀光栅和IR灵敏检测器的系统)或类似装置形成分光镜23。分光镜23可包括在入射光学系统16中。当发射单波长光束的单波长光源用作光源16a时，分光镜23和控制分光镜23的控制器28不是必需的。

采用图1所示的池2，由FTIR形成图2所示的测定装置的分光镜23，ZnSe光学晶体用作池2的全反射棱镜4，吸附在粒径为30nm金溶胶上的抗小鼠IgG(由Biocell(U.S.A)制备)用作贵金属溶胶标记的抗体6，0.01M吐温21和PBS(磷酸盐缓冲的盐溶液)的混合液(pH7.65)用作含有抗体6的混合液的溶剂。在一个2分钟的测定时间内完成10次检测，并评估检测结果。分光镜23的光谱范围在800-3200cm^-1之间，分辨率为2cm^-1。

图3和图4示出了测定结果的全反射光谱。参考图3，光谱②是只含有上述的30nm金溶胶标记的抗小鼠IgG的混合液的光谱。水的吸收大，而同时再设有其它特征性的吸收。另一方面，参考图4，光谱③是只含有2mg/ml浓度的没有用贵金属溶胶标记的IgG免疫复合物的混合液的光谱。在光谱③中除了水之外也没有特征性吸收。另一方面，图3和图4中都示出的光谱①是含有金溶胶标记的免疫复合物的混合液的光谱，所述复合物是通过使7.3Mg/ml的上述30nm金溶胶标记的抗小鼠IgG抗体与62.5μg/ml的小鼠IgG抗原反应而形成的，并且除了水的吸收之外还有特征性吸收。

图5示出的是从作为本底的光谱①中减去光谱②所得到的光谱，以便清楚地表示吸收。该光谱是由7.5μg/ml 30nm的金溶胶标记的抗小鼠IgG抗体与62.5μg/ml的小鼠IgG抗原反应所形成的金溶胶标记的免疫复合物的全反射吸收光谱的差光谱。在这个光谱中，特征性吸收带出现在2900cm^-1附近的2888cm^-1和2942cm^-1处，以及900cm^-1附近与1500cm^-1之间的993cm^-1、1043cm^-1、和1112cm^-1处，而且这是由IgG免疫复合物的内振动产生的吸收。

图6至图10示出了分别在2942.5cm^-1、2881.1cm^-1、1112.4cm^-1、1043.3cm^-1以及993.8cm^-1波数处对应于分别同7.5μg/ml的30nm金溶胶标记的抗小鼠IgG抗体反应的各个浓度值的小鼠IgG抗原的吸收值对浓度的依从关系。其中横轴表示IgG浓度值，纵轴表示吸收值。每条曲线在IgG的高浓度区域是饱和的，而在低浓度区域则呈直线关系，这表明利用本发明的方法可以进行定量分析。

图11A和图11B示出了只有一个开口的典型的全反射池。图11A示出了在其底面具有全反射棱镜4的图1所示的池2。

图11B示出了在其侧面具有全反射棱镜4的池40的前视图和顶部平面图。

图12A至图12E分别示出了具有其它形状的反射池的透视图和前视图。

图12A示出了一个单面的废弃池，该池配有一个用于通过毛细现象吸入样品混合液的窄间隙42和一个沿间隙42形成的全反射棱镜4。数字15表示被吸入间隙42中的样品混合液。

图12B示出了一个典型的双面全反射流动池，该池在其上下表面配有穿过容纳样品混合液的空间的全反射棱镜4，4′。数字44表示该池的样品混合液的入口，数字46表示该池的样品混合液的出口。

图12C示出了一个典型的圆柱形全反射流动池，该池围绕圆柱形全反射棱镜4的一个侧面而形成。样品混合液15沿全反射棱镜4的这个圆柱形表面进入该池中。

图12D示出了另一个典型的双面全反射流动池，应如此形成该池，即：使样品混合液15分钟沿全反射棱镜4的两个相对表面进入池中。

图12E示出了一个典型的单面全反射流动池，该池在限定出容纳样品混合液15的空间的一个表面上具有全反射棱镜4。

虽然已经对本发明进行了详细描述和说明，但是应该清楚地认识到此处只是借助说明和例子对本发明进行描述而不是对其进行限定，只有后面所附的权利要求书才能对本发明的精髓和范围进行限定。

Claims

1.一种测定样品中所含的抗原或抗体的免疫分析方法，包括如下步骤：

使含有用粒度为5-50nm的金、银或铜的贵金属溶胶粒子标记的抗体或抗原的溶液与样品溶液混合以形成样品混合液，从而使所述样品溶液中含有的抗原或抗体与被标记的所述抗体或抗原反应，借此形成一个贵金属溶胶标记的免疫复合物；

将波长在从近红外到红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角导入一个构成全反射池的全反射棱镜中，所述样品混合液存在于所述全反射池中；以及

测定在所述全反射棱镜与所述样品混合液之间的界面处产生的所述测定光束的吸收。

2.根据权利要求1的免疫分析方法，其特征在于对于单相免疫测定分析不用将未发生抗原-抗体反应的用所述贵金属溶胶标记的所述抗体或抗原以及所述样品溶液中含有的未发生抗原-抗体反应的所述抗原或抗体从所述被标记的免疫复合物中分离出来即可测定所述测定光束的吸收。

3.根据权利要求2的免疫分析方法，其特征在于所述抗原-抗体反应是在所述全反射池中进行的，以便接着测定所述测定光束的吸收。

4.根据权利要求2的免疫分析方法，其特征在于将用于在另一容器中引起所述抗原-抗体反应的所述样品混合液贮存到或导入所述全反射池中以便测定所述测定光束的吸收。

5.一种免疫测定装置，包括：

一个在其限定出一个容纳所述样品混合液的空间的壁面的至少一面上具有一个全反射棱镜的全反射池，所述全反射棱镜由折射率比含有用贵金属溶胶标记的免疫复合物的样品混合液的折射率大的材料制成；

一个用于将波长在从近红外至红外区域范围内的测定光束以一个能够产生全反射的入射角导入所述全反射棱镜中的入射光学系统；以及

一个用于接收来自所述全反射棱镜的出射光束以便测定所述样品混合液的吸收度的测定光学系统。

6.根据权利要求5的免疫测定装置，其特征在于所述全反射池是一种只有一个开口的容器型池。

7.根据权利要求5的免疫测定装置，其特征在于所述全反射池是一种具有一个溶液入口和一个溶液出口的流动池，在用所述贵金属溶胶标记的所述免疫复合物形成之后，所述样品混合液被引入该流动池。

8.根据权利要求5的免疫测定装置，其特征在于所述入射光学系统包括一个发射连续波长光束的光源，并且所述入射或测定光学系统包括一个用于进行分光光度测定的分光镜。

9.根据权利要求5的免疫测定装置，其特征在于所述入射光学系统包括一个发射单波长光束的单波长光源，并且所述入射和测定光学系统不包括分光镜，从而只有在所述光源的所述单波长处才能进行吸收测定。