DE3630352C2

DE3630352C2 - Verfahren zur Durchführung einer Immununtersuchung an einer Probeflüssigkeit in einer Durchflußzelle und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE3630352C2
Application number: DE3630352A
Authority: DE
Inventors: Myron J Block; Tomas B Hirschfeld
Original assignee: Ord Inc
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1985-09-09
Filing date: 1986-09-05
Publication date: 1996-07-18
Anticipated expiration: 2006-09-06
Also published as: GB2180338A; FR2587120B1; JP2568517B2; CA1277506C; GB2180338B; GB8620794D0; US4716121A; JPS6279334A; DE3630352A1; FR2587120A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vor richtung zur Durchführung einer Immununtersuchung an einer Probenflüssigkeit in einer Durchflußzelle. Bei solchen Immun untersuchungen wird die abklingende Welle, die durch totale innere Refexion in einer optischen Faser erzeugt wird, dazu benutzt, das beobachtete Volumen auf eine Schicht zu begrenzen, wodurch die Störungen durch immunologisch nicht reagierende Hintergrundsubstanzen der Probe vermindert werden.

Die Anwendung der Technik totaler innerer Reflexion auf die Verminderung der Wirkungen von immunologisch nicht reaktiven Substanzen bei Immununtersuchungen ist Gegenstand zahlreicher Versuche gewesen.

US 4 447 546 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung einer Immununtersuchung, wobei eine kurze Länge eines Kapillarrohres mit einem präzisen Durchmesser und einer axial darin angeordneten optischen Faser benutzt wird. Die Abmessungen von Faser und Kapillarrohr sind so ge wählt, daß sich das Rohr selbst durch Kapillarwirkung füllt, nachdem ein Ende des Rohres in die Probenflüssigkeit eingetaucht wird. Eine präzise Zeitgebung und ballistische Messungen sollen dadurch vermieden werden, daß gewährleistet wird, daß die Inkubationszeit größer ist als die Diffusionszeit, die notwendig ist, um das Volumen zwischen Faser und Kapillarrohr zu spülen. Die fluorimetrischen Messungen werden durch eine Fluoreszenztechnik durch totale Reflexion bewirkt. Hierbei handelt es sich um ein passives Eindringen der Probenflüssigkeit in den Ringraum zwischen Kapillarrohr und Faser.

US 3 939 350 beschreibt die Erzeugung der abklingenden Welle durch totale innere Reflexion an der Zwischenfläche zwischen einem innen total reflektierenden Substrat, bei spielsweise einer Platte, und der Probe zwecks Induzierung von Fluoreszenz in einem fluoreszenzmarkierten Abschnitt der Probe, die immunologisch an die Platte gebunden ist, wobei der Teil der Probe hinter der Abklingzone nicht erregt wird. Auf diese Weise kann eine Untersuchung durchgeführt werden, ohne daß es notwendig wäre, die nicht reagierenden Proben und Reagenzien zu entfernen. Tatsächlich wirkt die abklingende Welle als Trennmechanismus. Hierbei wird die Probenflüssigkeit durch aktives Einspritzen vorgenommen. Zu diesem Zweck ist ein Kanal vorgesehen, der mit der geschlossenen Meßkammer in Verbindung steht und zur Füllung oder Evakuierung der Kammer dient.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Immununtersuchung zu schaffen, wobei die Meßgeschwindigkeit vergrößert und die erforderliche Meßzeit verringert wird, ohne daß die Meßgenauigkeit darunter leidet.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe durch die Kombination der im Anspruch 1 angegebenen Merkmale, soweit das Verfahren be troffen ist, und durch die Gesamtheit der im Patentanspruch 2 angegebenen Merkmale, soweit es sich um die Untersuchungsvor richtung handelt.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Meßzeit, die erforderlich ist für eine Inkubation in der Kapillare, die die Faser umgibt, proportional ist zum Quadrat der mittleren Diffusionsentfernung. Letztere liegt in der Größenordnung des Abstandes zwischen der Faser und der Kapillarwand. Wenn dieser Abstand kleiner wird, kann die Zeit, die erforderlich ist, den Reaktionsendpunkt zu erlangen, und demgemäß die Geschwindigkeit einer nicht-ballistischen Untersuchung, erheblich verbessert werden. Jedoch wird durch eine solche Verminderung auch das Probenvolumen verringert, und demgemäß das Gesamtsignal pro Längeneinheit der Faser, was eine Beeinträchtigung der Empfindlichkeit zur Folge hätte. Dieser Empfindlichkeitsverlust kann nur teilweise ausgeglichen werden, indem die Faserlänge vergrößert wird, weil sich eine Signalabschwächung in einer nicht überzogenen Faser ergibt.

Dadurch, daß erfindungsgemäß die Strömungsgeschwindigkeit nach bestimmten Dimensionskriterien gemäß der in Anspruch 1 angegebenen Formel eingestellt wird, kann erreicht werden, daß die Verweilzeit der Probe gegenüber dem aktiven Bereich gleich wird der Zeit, die erforderlich ist, um das Volumen zwischen Substrat und Umhüllung zu spülen.

Durch die Erfindung wird es möglich, ein großes Probenvolumen in relativ kurzer Zeit zu untersuchen, wobei jedoch ein kleiner Teil der Probe durch die abklingende Welle ständig beleuchtet wird. Die Bindung an dem aktiven Abschnitt der Faser ist kumulativ, je nach der Titrierung und der Probe und dem Spülvolumen.

Nachstehend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Aufbaus einer Vorrichtung zur Immununtersuchung unter Benutzung eines an sich bekannten Fluorimeters;

Fig. 2 einen Längsschnitt des von der Proben flüssigkeit durchströmten und von einer optischen Faser axial durchsetzten Kapillarrohres;

Fig. 3 eine schematische Ansicht des Raums zwischen Kapillarrohrwandung und aktivem Bereich der optischen Faser, der von der Probenflüssigkeit durchströmt wird.

In der Zeichnung bezeichnen gleiche Bezugszeichen entsprechende Teile. Die Darstellung in den Figuren ist schematisch und es wurde kein Versuch unternommen, tatsächliche Maße oder Verhältnisse darzustellen.

In bezug auf die gewählte Terminologie bei der Be schreibung der Vorrichtung werden "obere" und "untere" Schnitte erwähnt. Dies geschieht aus Zweckmäßigkeitsgründen unter Bezugnahme auf die Anordnung in den Zeichnungen. Es ist jedoch klar, daß die Vorrichtung in jeder Lage oder Orientierung im Raum arbeitsfähig ist.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Vor richtung, welche ein Immununtersuchungsgerät 6, ein Fluorimeter 7, eine Einspritzvorrichtung 8 und eine Einspritzpumpe 9 umfaßt.

Fig. 2 zeigt einen Längsschnitt eines Immununter suchungsgeräts 6. Das Immununtersuchungsgerät 6 umfaßt eine optische Faser 12, ein die optische Faser 12 um schließendes Kapillarrohr 14 und einen Stopfen 16.

Die optische Faser 12 besteht aus einem langgestreckten zylindrischen, optisch transparenten Körper, in dem über die Länge durch Mehrfach-Totalreflexion im Inneren optische Strahlung geführt wird, die an einem Ende der Faser unter einem festen Winkel eintritt, der im wesentlichen rotationssymmetrisch um die Faserachse verläuft. Wie allgemein auf dem Gebiet der Faseroptik bekannt, wird der maximale Akzeptanzwinkel in bezug auf die Faserachse für die in die Faser eintretende Strahlung und für die in der Faser fortschreitende Strahlung durch die Brechungsindizes von Faser und umgebenden Medien bestimmt. Für eine Strahlung, die anfänglich durch ein Medium mit dem Brechungsindex n₀ fortschreitet und auf eine Faser mit dem Brechungsindex n₁ auftrifft, die im übrigen von einem Material mit dem Brechungsindex n₂ umgeben ist, ergibt sich der maximale Akzeptanzwinkel aus der Gleichung

N.A. = n₀sinB = (n₁² - n₂²)^½ (1)

Dabei ist N.A. die sogenannte numerische Apertur der Faser. Beispielsweise kann die optische Faser 12 aus irgendeinem optisch transparenten Material bestehen, beispielsweise Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin, Nylon oder dergleichen, wobei das Material so gewählt wird, daß es einen Brechungsindex besitzt, der größer ist als der Brechungsindex der zu untersuchenden flüssigen Probe. Letztere ist im typischen Fall eine wäßrige Lösung mit einem Brechungsindex von etwa 1,33 oder eine Serumprobe mit einem Brechungsindex von etwa 1,35. Die Faser wird außerdem aus einem solchen Material gewählt, daß sie unlöslich in der Probenflüssigkeit ist und mit dieser nicht reagiert. Es hat sich gezeigt, daß 200 µm einen zufriedenstellenden Faserdurchmesser darstellen. Es sind jedoch auch noch andere Faserdurchmesser möglich. Bei den meisten Untersuchungen erweist sich eine Faser von 25 mm Länge als ausreichend. Es ist jedoch klar, daß die Länge der Faser an die durchzuführenden Untersuchungen angepaßt werden kann. Die Empfindlichkeit verbessert sich mit ansteigender Faserlänge bis die Signalabschwächung über die Faserlänge 1/e überschreitet.

Wie im folgenden im einzelnen beschrieben, ist die optische Faser 12 mit einem Oberflächenüberzug versehen, der Mittel aufweist, um ausgewählte Teile eines Antigen- Antikörper-Komplexes anhaften zu lassen. Der hierbei benutzte Ausdruck "Antigen-Antikörper-Komplex" umschließt Komplexe nicht nur von vollständigen Antikörpern und Antigenen, sondern auch Komplexe, die immunologisch reaktive Fragmente von einem Komplex oder von beiden enthalten.

Das Kapillarrohr 14 ist ein optisch transparentes Rohr und das Konstruktionsmaterial hierfür ist ebenfalls so gewählt, daß es relativ unlöslich in der zu untersuchenden Probenflüssigkeit ist und mit dieser nicht reagiert. So besteht das Kapillarrohr 14 beispielsweise aus Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin oder dergleichen.

Das Kapillarrohr 14 hat einen Innendurchmesser, der etwas größer ist als der Durchmesser der optischen Faser 12 (beispielsweise hat bei einem Faserdurchmesser von 200 µm das Kapillarrohr 14 einen Innendurchmesser von etwa 240 µm).

Der Stopfen 16 paßt in das Ende des Kapillarrohres 14. Er trägt einen Endabschnitt 18 der optischen Faser 12 im wesentlichen koaxial im Abstand zu dem Kapillarrohr. Außerdem bietet der Stopfen 16 eine harte Lagerfläche, um das Immununtersuchungsgerät 6 in einem Fluorimeter festzulegen, wie dies weiter unten beschrieben wird. Zu diesem Zweck ist der Stopfen 16 mit einem Flansch 20 versehen, dessen Gesamtdurchmesser etwa dem Außendurchmesser des Kapillarrohres 14 entspricht, während ein zentral angeordneter Fortsatz 21 koaxial zu einer zentralen Bohrung 22 verläuft. Die Bohrung 22 ist durch den Stopfen 16 hindurchgeführt und so bemessen, daß ein Endabschnitt 18 der optischen Faser 12 festgelegt werden kann. Gemäß einem Ausführungsbeispiel ist der Stopfen 16 an Ort und Stelle um die optische Faser 12 herumgeformt und der Stopfen ist aus einem Material mit geringem Brechungsindex, beispielsweise Siloxan hergestellt.

Die optische Faser 12 ist durch den Stopfen 16 geführt und wird von diesem getragen, so daß im wesentlichen die gesamte Faser mit Ausnahme des Endabschnittes 18 dem Inneren des Kapillarrohres 14 ausgesetzt ist, wobei eine Stirnfläche 24 des Endabschnittes 18 frei liegt, die mit dem stirnseitigen Ende der Bohrung 22 außerhalb des Kapillarrohres fluchtet.

Die Stirnfläche 24 liegt normal zur Achse der optischen Faser 12.

Die Stirnfläche 26 der Faser, die von der Stirnfläche 24 entfernt liegt, ist flach poliert oder geschnitten, und sie ist mit einem verspiegelten Ende 28 oder einem getrennten Spiegel ver sehen, der normal zur Faserachse verläuft, wodurch die Strahlung, die in die optische Faser eingeleitet ist, veranlaßt wird, die Faser zweifach zu durchlaufen.

Die Gesamtabmessungen von optischer Faser 12, Kapillarrohr 14 und Stopfen 16 sind so gewählt, daß gewährleistet wird, daß die Stirnfläche 26 der Faser innerhalb des Kapillarrohres liegt.

Das Immununtersuchungsgerät 6 entspricht im wesentlichen jenem, wie es in oben erwähnter US 4 447 546 beschrieben ist. Wichtig ist jedoch, daß das Kapillarrohr 14 mit einer seitlichen Einspritzöffnung 30 versehen ist, die in Strömungsverbindung mit dem Inneren des Kapillarrohres 14 steht und distal zum offenen Ende des Kapillarrohres an geordnet ist. Die seitliche Einspritzöffnung 30 hat die Form eines Rohrabschnitts 32, der mit einer Scheidewand 34 versehen ist. Der Rohrabschnitt 32 liegt in der Nähe des Stopfens 16 und steht radial von dem Kapillarrohr 14 vor. Die Scheidewand 34 dient in bekannter Weise dazu, von einer Injektionsnadel (nicht dargestellt) durchstochen zu werden und das Innere des Rohrabschnitts 32 ist so bemessen, daß es der Nadel angepaßt ist, die in Verbindung mit dem System benutzt wird. Die seitliche Einspritzöffnung 30 kann in gleicher Weise als Kupplung zur Festlegung einer Luer-Spritze oder einer äquivalenten Vorrichtung ausgerüstet sein.

Vor dem Einbau in das Immununtersuchungsgerät 6 wird die optische Faser 12 mit einem Überzug versehen, wodurch ein aktiver, nicht ummantelter Bereich 36 gebildet wird. Der aktive Bereich 36 liegt zwischen zwei ummantelten Bereichen 38.

Im folgenden wird auf Fig. 3 der Zeichnung Bezug genommen. Diese stellt eine stilisierte Wiedergabe eines Schnittes des aktivierten Bereichs 36 der optischen Faser 12 dar, gefüllt mit einer zu untersuchenden Probe 43. Die Oberfläche der optischen Faser 12 innerhalb des Bereiches 36 ist mit einer Vielzahl von Koppelstellen 44 versehen, und ein Teil von diesen wird durch Teilchen 46 von Antikörper-Antigen-Komplexen gebunden. Der Ausdruck "Teilchen eines Antikörper-Antigen-Komplexes" bezieht sich auf einen immunologisch reaktiven Teil eines solchen Komplexes und schließt Hapten sowie vollständige Antigene und antigenreaktive Antikörperfragmente [Fab] und vollständige Antikörper bzw. Immunkörper ein. Die Koppelstellen 44 sind so gewählt, daß die Teilchen 46 stillgesetzt werden, ohne merklich die Reaktivität, d.h. die Affinität und Avidität der Teilchen für den komplimenteren Anteil des Komplexes zu beeinträchtigen. Gemäß dem Ausführungsbeispiel besteht die optische Faser 12 aus Glas oder Quarz und die Koppelstellen 44 sind reaktive Gruppen einer Silyl-Verbindung, beispielsweise 3-Aminopropyl- trimethoxysilan und die Teilchen 46 bestehen aus einem Antikörper, d. h. einem Immunkörper wie beispielsweise Immunoglobulin G (IgG). Diese spezielle Kombination der festen Phase der Koppelstellen 44 und der Teilchen 46 kann durch Antikörper-Carboxylendungen gebunden werden, wodurch die Antikörper-Antigen reaktiven Aminoenden frei werden.

Für die Aufbereitung der Glasoberfläche der optischen Faser 12 zur Aufbringung der Silyl-Verbindung darauf und zur kovalenten Bindung eines Antikörpers auf dem Glas durch die Silyl-Kupplung wird auf die US 3 652 761 Bezug genommen. Hier findet sich auch eine Beschreibung der anderen Silyl-Verbindungen und der Verfahren, durch die Carboxyl-Amino und andere reaktive Gruppen von Antikörpern oder Antigenen (oder ihrer Fragmente) kovalent mit verschiedenen anorganischen Materialien verbunden werden können. Es ist klar, daß es auch eine andere Möglichkeit zur Stillsetzung von Antigenen oder Antikörpern auf Polymeren gibt und daß die Koppelstellen 44 für Antigene oder Antikörper auch auf Polymerfasern angebracht werden können. Beispielsweise kann, wenn die optische Faser 12 aus Nylon (Polyamid) besteht, die Kopplung in Form einer Substitution eines geeigneten Radikals anstelle einer Hydrogenbindung mit den Aminogruppen des Polymers sein. Die Koppelstellen 44 können auch Abstandsgruppen enthalten, wie dies bekannt ist, um eine genügende Trennung zwischen der optischen Faser 12 und den Teilchen 46 zu erlangen, um das Sterik-Hindernis des Antikörper-Antigenbindeprozesses zu vermindern. Beispielsweise könnten die Koppelstellen 44 eine Polyäthylenkette aufweisen, beispielsweise im Falle einer 1,6 Diaminohexan oder 6 Aminohexanoik-Säurebindung mit der optischen Faser 12 über eine Peptid-Bindung, und indem jeweils eine freie primäre Aminogruppe und eine freie Carboxylgruppe für eine kovalente Bindung mit dem Carboxylrest oder dem Aminorest der Teilchen 46 erlangt wird. Alle diese Koppelmaterialien liefern eine 6-Kohlenstoffkette zwischen den Resten, und dadurch werden die Teilchen 46 von der optischen Faser 12 in einem entsprechenden Abstand gehalten. Ähnliche geeignete Koppel- und Abstandsmaterialien sind sowohl in der Immunoversuchs- als auch in der Affinität-Chromotographie bekannt.

Die optische Faser 12 ist mit Teilchen 46 versehen, welche Bindungssitze aufweisen, wie durch das Bezugszeichen 46C angedeutet. Die Teilchen sind zum Teil mit markierten Komponenten 50 ausgestattet, um Immunoversuche berechnen zu können. Demgemäß ist bei einem Ausführungsbeispiel als Teilchen 46 ein Immunkörper vorgesehen, der mit markierten Antigenen oder Hapten beschickt ist, was im Überzug der optischen Faser 12 enthalten ist. Jede markierte Komponente 50 ist mit einer vorbestimmten Menge von Fluorophor 52 versehen, wodurch eine Markierung geschaffen wird. Die spezielle fluoreszierende Verbindung, die zur Markierung benutzt werden kann, besteht aus Fluoreszein, Tetramethylrhodamin, seltenen Erden, Chelat und dergleichen. Verfahren zur Bindung von Fluoreszenz-Markierungen an Proteinen sind bekannt, und zahlreiche, der kommerziell verfügbaren fluoreszierenden Verbindungen haben Gruppen, die eine Verbindung mit Proteinen ermöglichen. Es wird für Vergleichsversuche ein fester Anteil von Koppelstellen 44 mit einem immunologisch inerten Protein 56, beispielsweise Albumin, versehen. Der Überzug kann so gestaltet sein, daß er eine feste Oberflächenzusammensetzung hat, in dem die Absorptionsphänomene wie folgt benutzt werden. Für eine Überzugslösung, die mit der geeigneten Konzentration der Bestandteile hergestellt wurde, erzeugt das bloße Eintauchen der Faser, die aktiviert ist mit einer entsprechenden Koppelstelle 44 eine Oberflächen-Monoschicht aus chemisch gebundenem Protein. Der Anteil von Immunglobulin zu inertem Protein in dieser Schicht ergibt sich durch ihren Anteil in der Lösung, was jedoch nicht identisch ist. Eine partielle Anfüllung der bezüglich immunoglobulinaktiven Sitze mit markierten Antigenen wird natürlich auf diesem Pegel in der Lösung aufrechterhalten. Nach dem Eintauchen wird die Faser aus der Überzugslösung entfernt. Um zu verhindern, daß die anhaftende flüssige Schicht zusätzliche Reagenzien aufnimmt, wird die Faser dann schnell gewaschen, bevor eine Verdampfung erfolgen kann. Die Proteinschicht, die kovalent gebunden ist, wird dadurch nicht entfernt. Um zu verhindern, daß mehr als eine Proteinschicht gebunden wird, braucht das bifunktionale Reagenz nicht die Gesamtladung des Proteins zu ändern (dies kann gesteuert werden durch Einstellung des pH-Wertes der Überzugslösung), wobei ein nicht zu langer Abstandsarm vorhanden ist.

Das Immununtersuchungsgerät 6 wird in Verbindung mit einem Fluorimeter 7 (Fig. 1) benutzt, welches die markierten Komponenten des Reagenzmittels erregt und eine Fluoreszenz von diesem aufnimmt. Ein geeignetes Fluorimeter ist in der US 4 447 546 beschrieben. Das Fluorimeter mißt die Fluoreszenzemission, die nach dem Ende der Faser zurückwandert, von welchem aus die Erregerstrahlung eingeführt wurde.

Eine Probe wird in die Einspritzvorrichtung 8 eingesaugt, die dann beispielsweise über eine Luer-Verbindung mit dem Immununtersuchungsgerät 6, wie aus Fig. 1 ersichtlich, verbunden wird, d. h. die Einspritzvorrichtung 8 wird in einer Einspritzpumpe 9 angeordnet und das Immununter suchungsgerät 6 wird mit einem Fluorimeter 7 verbunden. Nunmehr wird die Einspritzpumpe 9 aktiviert und diese drückt die Probe in der Einspritzvorrichtung 8 durch das Immununtersuchungsgerät 6. Die Einspritzpumpe 9 bildet demgemäß Mittel, um die Strömungsrate so zu steuern, daß die Verweilzeit der Probe 43 gegenüber dem aktivierten Bereich 36 ähnlich der Zeit ist die erforderlich ist, um das Volumen zwischen optischer Faser 12 und Kapillarrohr 14 gründlich zu spülen. Größere Strömungsraten erhöhen die Empfindlichkeit des Systems, aber es besteht die Gefahr, daß die Wirksamkeit der Probe wegen einer unvollkommenen Spülung abnimmt. Die Probenströmung durch den Zwischenraum zwischen optischer Faser 12 und Kapillar rohr 14 sollte kontinuierlich den Zwischenraum füllen und während des gesamten Versuchs gefüllt halten. Wie in US 4 447 546 beschrieben, ist das Fluorimeter 7 so ausgebildet, daß die Stirnfläche 24 der optischen Faser 12 mit einem Konuswinkel beleuchtet wird, der durch die numerische Apertur der Faser definiert ist. Diese Strahlung breitet sich infolgedessen längs der optischen Faser 12 mit oder über dem kritischen Winkel aus (wie durch den Strahl 54A in Fig. 3 angedeutet), und es erfolgt eine mehrfache totale innere Reflexion über die Länge der Faser. Infolgedessen wird eine abklingende Welle in der Flüssigkeit 43 benachbart zur Faser während der Strömung des Probenteils in dem aktivierten Bereich 36 erzeugt.

Eine kompetitive Bindung der markierten Komponenten 50 und der markierten Komponenten 54 an den Teilchen 46, die an der Faser anhaften, führt zu fluoreszierenden markierten Komplexen 46C proportional zu der relativen Konzentration von markierten zu unmarkierten Komponenten. Die markierten Komplexe 46C fluoreszieren, wenn sie von der abklingenden Welle erregt werden. Ein Teil der fluoreszierenden Emission wird in die Faser eingeleitet und wandert in dieser längs Pfaden zurück, die den kritischen Winkel überschreiten, wie dies beispielsweise durch den Strahl 56A in Fig. 3 angedeutet ist. Die Hälfte oder mehr der total reflektierten Fluoreszenzemission tritt aus der optischen Faser an der Stirnfläche 24 aus, wo die Strahlung durch das Fluorimeter 7 gesammelt wird.

Wenn der Zwischenraum zwischen der optischen Faser und dem Kapillarrohr völlig mit der Probenflüssigkeit wenigstens in der Nähe des aktiven Bereichs 36 angefüllt ist, dann ergibt sich das Volumen der Probe, das augenblicklich gegenüber einem aktiven Bereich 36 der Faser liegt, durch die folgende Gleichung:

V = L π (D² - d²) / 4 (2)

Dabei ist L die Länge des aktiven Bereichs der optischen Faser 12, D ist der Innendurchmesser der Kapillare und d ist der Durchmesser der optischen Faser. Das beobachtete Volumen ergibt sich durch eine ähnliche Beziehung, wobei die Größe (D - d) durch die wirksame Dicke der beobachteten Zone zu ersetzen ist. Die Inkubationszeit, die notwendig ist ein statisches Volumen zu spülen, ergibt sich aus der Gleichung (2) wie folgt:

t = k [(D - d) / (2s)]² (3)

Dabei ist k eine dimensionslose chemische Reaktionskonstante (abhängig z.B. von der Dichte der Bindesitze der Faser oder der Wahrscheinlichkeit, daß die Reaktion in der Probe einen Bindesitz betrifft) und s ist die Brown'sche Bewegung. Wenn D und d in cm und s in cm sec^½ gemessen werden, dann ergibt sich t in Sekunden. Der Wert von k liegt zwischen etwa 1 und 10 für alle praktischen Fälle.

Wenn die Probe an dem aktiven Bereich 36 derart vor beiströmen kann, daß sie über die Länge des aktiven Bereiches 36 während einer Zeitdauer verbleibt, die gleich ist der statischen Inkubationszeit, dann ergibt sich aus der Gleichung (3) die folgende Gleichung:

v = L/t = 4 Ls² / [k (D - d)²] (4)

Dabei ist v die Strömungsgeschwindigkeit.

Indem die Gleichungen (2) und (3) kombiniert werden, ergibt sich das Volumen, welches pro Inkubationszeit gespült wird (V/t) wie folgt:

V/t = π L s² (D + d) / [k (D - d)] (5)

Die Gleichung 5 definiert die tatsächliche wirksame Probenvolumenströmung pro Zeiteinheit. Eine größere Strömungsrate ermöglicht keine vollständige Spülung der Probe, während eine kleinere Volumenströmungsrate dazu führt, daß die Probe während einer längeren Zeit als nötig gegenüber dem aktiven Bereich verbleibt.

Aus der Gleichung (5) ist ersichtlich, daß der Wert von V/t dadurch maximiert werden kann, daß die Länge des aktiven Bereiches 36 vergrößert wird und daß die Differenz zwischen D und d so klein als möglich gemacht wird. Andernfalls wird das Volumen in folge des zusätzlichen Durchmessers dann nicht überprüft.

Ein großes Kapillarvolumen kann mit einer Proben strömungsgeschwindigkeit benutzt werden, die größer ist, als durch die Gleichung (4) angegeben, so daß ein wirksamer Kapillardurchmesser D_eff erzeugt wird, der durch die folgende Gleichung bestimmt ist:

D_eff = d + s · (L(kv)^½ (6)

Bei einer solchen Anordnung wird k kleiner und daher wird das optimale Verhältnis Volumen zu Zeit (V/t) größer wegen der Spülung der Probe außerhalb des effektiven Durchmessers D_eff sowie wegen des Fehlens der Notwendigkeit eine vollständige Spülung der Probe abzuwarten.

Als Beispiel wird für D = 4d, (D+d)/(D-d) = 1.66, während für D = 1.1d (D+d)/(D-d) = 21 resultiert. Letzteres stellt eine 12,6fache Verbesserung dar.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung einer Immununtersuchung an einer Probenflüssigkeit in einer Durchflußzelle, die eine zentrale, mit einer auf einer aktiven Länge vorhandenen Reaktionsschicht zum Festhalten der Immunkomplexe versehene optische Faser und ein diese umschließendes, den Durchfluß ermöglichendes Kapillarrohr aufweist, bei dem die Strömungs geschwindigkeit der Probenflüssigkeit nach der folgenden Formel eingestellt wird, wobei gilt:v = Strömungsgeschwindigkeit [cm/sec]
L = aktive Länge [cm]
t = Zeit zum Durchlaufen der aktiven Länge [sec]
s = Brownsche Bewegung [cm/sec^½]
k = dimensionslose chemische Reaktionskonstante (zwischen 1 und 10)
D = Innendurchmesser des Kapillarrohres [cm]
d = Außendurchmesser der optischen Faser [cm]

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit:

- einer optischen Faser (12) mit einer Stirnfläche (24) und einem aktiven, nicht ummantelten Bereich (36) zwischen zwei ummantelten Bereichen (38);
- einem die optische Faser (12) umschließenden Kapillarrohr (14);
- einem Stopfen (16) an einem ersten Ende zur Ab dichtung des Kapillarrohres (14) gegen die optische Faser (12);
- einem dem Stopfen gegenüberliegenden verspiegelten Ende (28) der optischen Faser (12);
- einem dem ersten Ende gegenüberliegenden, zwischen optischer Faser (12) und Kapillarrohr (14) angeordneten offenen zweiten Ende;
- einer Anordnung zum Einleiten einer Strahlung in die Stirnfläche (24) und zum Ausleiten der Fluoreszenz emission aus der flüssigen Probe in ein Fluorimeter (7);
- einer am ersten Ende des Kapillarrohres (14) an geordneten Einspritzöffnung (30) in Gestalt eines Rohrabschnittes (32), der radial vorsteht, zum kontinuierlichen Einspritzen der Probenflüssigkeit während des Meßvorgangs.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zum Steuern der Strömungs geschwindigkeit vorgesehen sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einspritzpumpe (9) vor gesehen ist.