DE3630352A1 - Vorrichtung und verfahren zur durchfuehrung von fluoreszenz-immun-untersuchungen - Google Patents
Vorrichtung und verfahren zur durchfuehrung von fluoreszenz-immun-untersuchungenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf Immununtersuchungen
und insbesondere auf Fluoreszenz-Immun-Untersuchungen,
wobei die abklingende Welle, die durch
totale innere Refexion erzeugt wird, benutzt wird
um das beobachtete Volumen auf eine Schicht zu begrenzen,
wodurch eine Abtrennung oder eine Waschstufe
vermieden wird und die Störungen mit immunlogisch
nicht reagierenden Hintergrundsubstanzen
der Probe reduziert werden.
Die Anwendung der Technik totaler innerer Reflexion
auf die Verminderung der Wirkungen von immunlogisch
nicht reaktiven Substanzen bei Immun-Untersuchungen
ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen gewesen.
Die US-PS 39 39 350 beschreibt die Erzeugung der abklingenden
Welle durch totale innere Reflexion an der
Zwischenfläche zwischen einem innen total reflektierenden
Substrat, beispielsweise einer Platte und der
Probe zwecks Induzierung von Fluoreszenz in einem
fluoreszenzmarkierten Abschnitt der Probe, die immunlogisch
an die Platte gebunden ist, wobei der Teil der
Probe hinter der Abklingzone nicht erregt wird. Auf
diese Weise kann eine Untersuchung durchgeführt werden
ohne daß es notwendig wäre, die nicht reagierenden
Proben und Reagenzien zu entfernen. Tatsächlich wirkt
die abklingende Welle als Trennmechanismus.
In der US-Patentanmeldung 4 06 324 vom 9. August 1982
ist beschrieben, daß ein größerer optischer Wirkungsgrad
erreicht werden kann, wenn man die Fluoreszenz,
die durch die abklingende Welle erregt ist, bei Rückkehr
durch ein optisch dichteres Mittel über
Totalreflexion beobachtet. Eine verbesserte Vorrichtung
dieser Art und das entsprechende Verfahren zur
Immun-Untersuchung sind in der US-PS 44 47 546 beschrieben.
Hier ist gezeigt, daß sowohl die Menge
der Probe als auch der Reaktionsendpunkt automatisch
gesteuert werden können, indem eine bestimmte Fläche
des immunlogisch aktivierten total reflektierenden
Elementes (z.B. eine bekannte Länge einer optischen
Faser bekannten Durchmessers) mit einem Kapillarrohr
bekannter Dimensionen umschlossen wird. Auf diese
Weise können schnelle einfache und genaue nicht-ballistische
Untersuchungen durchgeführt werden.
Die Meßzeit, die erforderlich ist für eine Inkubation
in der Kapillare, die die Faser umgibt, ist proportional
zum Quadrat der mittleren Diffusionsentfernung.
Letztere liegt in der Größenordnung des Abstandes
zwischen der Faser und der Kapillarwand. Wenn man
diesen Abstand kleiner macht, dann kann die Zeit,
die erforderlich ist, den Reaktionsendpunkt zu erlangen
und demgemäß die Geschwindigkeit einer nicht-
ballistischen Untersuchung erheblich verbessert werden.
Jedoch wird durch eine solche Verminderung auch das
Probenvolumen verringert und demgemäß das Gesamtsignal
pro Längeneinheit der Faser, und hierdurch wird die
Empfindlichkeit schwerwiegend beeinträchtigt. Dieser
Empfindlichkeitsverlust kann nur teilweise ausgeglichen
werden, indem die Faserlänge vergrößert wird,
weil sich eine Signalabschwächung in einer nicht überzogenen
Faser ergibt, wie dies bei der Erfindung erforderlich
ist.
Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde,
eine Vorrichtung und Verfahren zu schaffen, um
schneller Fluoreszenz-Immun-Untersuchungen mit
umschlossener Faser durchführen zu können, wobei
die Empfindlichkeit der Untersuchung durch die erhöhte
Geschwindigkeit nicht schädlich beeinträchtigt
wird.
Gelöst wird die gestellte Aufgabe erfindungsgemäß
bei einem Fluoreszenz-Immun-Untersuchungsverfahren
mit totaler innerer Reflexion dadurch, daß die Probe
verursacht wird, längs des innen total reflektierenden
Substrats zu strömen, wobei das Substrat einen aktiven
Oberflächenbereich besitzt, der von einer Umhüllung
umschlossen und im Abstand zu dieser angeordnet ist,
um ein festes Volumen zu definieren. Die Strömungsrate
der Probe wird so eingestellt, daß die Verweilzeit
der Probe gegenüber dem aktiven Bereich gleich
wird der Zeit die erforderlich ist, um das Volumen
zwischen Substrat und Umhüllung zu spülen. Gemäß
einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Substrat
eine optische Faser dar, und die Umhüllung ist ein
Rohr, welches so dimensioniert ist, daß der Abstand
zwischen der Innenwand des Rohres und der Faseroberfläche
kapillare Abmessungen aufweist.
Mit einem solchen Aufbau kann ein großes Probenvolumen
in relativ kurzer Zeit untersucht werden, wobei jedoch
ein kleiner Teil der Probe durch die abklingende Welle
jederzeit beleuchtet wird. Die Bindung an dem aktivierten
Abschnitt der Faser ist kumulativ, je nach der
Titrierung und der Probe und dem Spülvolumen.
Weitere Einzelheiten und zweckmäßige Ausgestaltungen
ergeben sich aus den Patentansprüchen und der folgenden
Beschreibung.
Die Erfindung umfaßt demgemäß eine Vorrichtung und
die Kombination von Elementen sowie ein Verfahren,
welches verschiedene Stufen umfaßt, wie sie in der
Beschreibung erläutert sind.
Nachstehend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung
anhand der Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung
zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der
erfindungsgemäßen Vorrichtung in Verbindung
mit einem bekannten Gerät;
Fig. 2 einen Längsschnitt der Immun-Untersuchungsvorrichtung,
die ein bevorzugtes
Ausführungsbeispiek eines Teils
der erfindungsgemäßen Vorrichtung
bildet;
Fig. 3 eine stilisierte Ansicht eines Teils
der Vorrichtung nach Fig. 2, wobei eine
typische immuno-chemische Reaktion bei
der Verwirklichung vorliegender Erfindung
veranschaulicht ist.
In der Zeichnung bezeichnen gleiche Bezugszeichen
entsprechende Teile. Die Darstellung in den Figuren
ist schematisch und es wurde kein Versuch unternommen,
tatsächliche Maße oder Verhältnisse darzustellen.
In bezug auf die gewählte Terminologie bei der Beschreibung
der Vorrichtung werden "obere" und "untere"
Schnitte erwähnt. Dies geschieht aus Zweckmäßigkeitsgründen
unter Bezugnahme auf die Anordnung in den
Zeichnungen. Es ist jedoch klar, daß die Vorrichtung
in jeder Lage oder Orientierung im Raum arbeitsfähig
ist, so daß die Angaben nicht beschränkend sind.
Die vorliegende Erfindung arbeitet mit Totalreflexion-
Fluoreszenz gekuppelt mit einer Tunnelführung der
Strahlung, wie dies in der US-Patentanmeldung 4 06 324
vom 9. August 1982 beschrieben ist. Darin sind Einzelheiten
der optischen Arbeitsweise des Gerätes beschrieben.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Vorrichtung
gemäß der Erfindung, welche ein Arbeitsgerät
6, ein Fluorimeter 7, eine Spritze 8, eine Einspritzpumpe
9 und einen Behälter 10 umfaßt.
Fig. 2 zeigt einen Längsschnitt eines Immuno-Versuchs-
Arbeitsgerätes 6, welches gemäß den Prinzipien der
Erfindung aufgebaut ist. Das Arbeitsgerät 6 umfaßt
eine optische Faser 12, ein Kapillarrohr 14 und einen
Stopfen 16.
Die Faser 12 besteht aus einem langgestreckten
zylindrischen, optisch transparenten Körper, in
dem über die Länge durch Mehrfach-Totalreflexion
im Inneren optische Strahlung geführt wird, die
an einem Ende der Faser unter einem festen Winkel
eintritt, der im wesentlichen rotationssymmetrisch
um die Faserachse verläuft. Wie allgemein auf dem
Gebiet der Faseroptik bekannt, wird der maximale
Akzeptanzwinkel in bezug auf die Faserachse B für
die in die Faser eintretende Strahlung und für die
in der Faser fortschreitende Strahlung durch die
Brechungsindizes von Faser und umgebenden Medien
bestimmt. Für eine Strahlung, die anfänglich durch
ein Medium mit dem Brechungsindex n 0 fortschreitet
und auf eine Faser mit dem Brechungsindex n 1 auftrifft,
die im übrigen von einem Material mit dem
Brechungsindex n 2 umgeben ist, ergibt sich der maximale
Akzeptanzwinkel aus der Gleichung
dabei ist N.A. die sogenannte numerische Apertur der
Faser. Beispielsweise kann die Faser 12 aus irgendeinem
optisch transparenten Material bestehen, beispielsweise
Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin,
Nylon oder dergleichen, wobei das Material so gewählt
wird, daß es einen Brechungsindex besitzt, der
größer ist als der Brechungsindex der zu untersuchenden
flüssigen Probe. Letztere ist im typischen Fall eine
wässrige Lösung mit einem Brechungsindex von etwa 1,33
oder eine Serumprobe mit einem Brechungsindex von
etwa 1,35. Die Faser wird außerdem aus einem
solchen Material gewählt, das sie unlöslich in
der Probenflüssigkeit ist und mit dieser nicht
reagiert. Es hat sich gezeigt, daß 200 µm einen
zufriedenstellenden Faserdurchmesser darstellen.
Es sind jedoch auch noch andere Faserdurchmesser
möglich. Bei den meisten Untersuchungen erweist
sich eine Faser von 25 mm Länge als ausreichend.
Es ist jedoch klar, daß die Länge der Faser an die
durchzuführenden Untersuchungen angepaßt werden kann.
Die Empfindlichkeit verbessert sich mit ansteigender
Faserlänge bis die Signalabschwächung über die Faserlänge
1/e überschreitet.
Wie im folgenden im einzelnen beschrieben, ist die
Faser 12 mit einem Oberflächenüberzug versehen, der
Mittel aufweist, um ausgewählte Teile eines Antigen-
Antikörper-Komplexes anhaften zu lassen. Der hierbei
benutzte Ausdruck "Antigen-Antikörper-Komplex" umschließt
Komplexe nicht nur von vollständigen Antikörpern
und Antigenen, sondern auch Komplexe, die
immunologisch reaktive Fragmente von einem Komplex
oder von beiden enthalten.
Das Kapillarrohr 14 ist vorzugsweise ein optisch
transparentes Rohr und das Konstruktionsmaterial
hierfür ist ebenfalls so gewählt, daß es relativ
unlöslich in der zu untersuchenden Probenflüssigkeit
ist und mit dieser nicht reagiert. So besteht
das Kapillarrohr 14 vorzugsweise aus Glas, Quarz,
Polypropylen, Polyolefin oder dergleichen.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel hat
das Kapillarrohr 14 eine gerade kreisförmige
zylindrische Bohrung mit einem inneren Durchmesser,
der etwas größer ist als der Durchmesser der Faser
(beispielsweise hat bei einem Faserdurchmesser von
200 µm das Kapillarrohr 14 einen Innendurchmesser
von etwa 240 µm). Die Erfindung kann jedoch auch
in Verbindung mit Kapillarrohren Anwendung finden,
die einen beträchtlich größeren Innendurchmesser als
die Faser aufweisen.
Der Stopfen 16 ist so ausgebildet und dimensioniert,
daß er in das Ende des Kapillarrohres 14 einpaßt
und einen Endabschnitt 18 der Faser 12 mit wesentlichen
koaxial im Abstand zu dem Kapillarrohr trägt. Außerdem
bietet der Stopfen 16 eine harte Lagerfläche, um
das Arbeitsgerät 6 in einem Fluorimeter festzulegen,
wie dies weiter unten beschrieben wird. Zu diesem
Zweck ist der Stopfen 16 vorzugsweise mit einem
Flansch 20 versehen, dessen Gesamtdurchmesser etwa
dem Außendurchmesser des Kapillarrohres 14 entspricht,
während ein zentral angeordneter endringartiger Fortsatz
21 koaxial zu einer zentralen Bohrung 22 verläuft.
Die Bohrung 22 ist durch den Stopfen 16 hindurchgeführt
und so bemessen, daß ein Endabschnitt 18 der
Faser 12 festgelegt werden kann. Gemäß einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel ist der Stopfen 16 an Ort
und Stelle um die Faser 12 herumgeformt und der Stopfen
ist vorzugsweise aus einem Material mit geringem
Brechungsindex, beispielsweise Siloxan hergestellt.
Die Faser 12 ist durch den Stopfen 16 geführt und
wird von diesem getragen, so daß im wesentlichen
die gesamte Faser mit Ausnahme des Endabschnittes
18 dem Inneren des Kapillarrohres 14 ausgesetzt
ist, wobei eine Stirnfläche 24 des Endabschnittes
18 frei liegt, die mit dem stirnseitigen Ende der
Bohrung 22 außerhalb des Kapillarrohres fluchtet.
Die Stirnfläche 24 ist vorzugsweise eben und liegt
normal zur Achse der Faser 12. Vorzugsweise ist die
Stirnfläche 24 hoch transparent und frei von Fehlern,
die das auf die Stirnfläche einfallende Licht zerstreuen
könnten. Zu diesem Zweck kann die Stirnfläche
24 optisch poliert sein, obgleich es sich gezeigt
hat, daß eine gegossene Quarzfaser auch einfach geschnitten
werden kann, um eine geeignete optische
Oberfläche darzubieten.
Wahlweise kann die Stirnfläche 26 der Faser, die
von der Stirnfläche 24 entfernt liegt, auch flach
poliert oder geschnitten sein und sie kann mit einem
Spiegelüberzug 28 oder einem getrennten Spiegel versehen
sein, der im wesentlichen normal zur Faserachse
verläuft, wodurch die Strahlung, die in der Faser eingeschlossen,
ist, veranlaßt wird, die Faser zweifach
zu durchlaufen.
Die Gesamtabmessungen von Faser 12, Kapillarrohr 14
und Stopfen 16 sind vorzugsweise so gewählt, daß gewährleistet
wird, daß die Stirnfläche 26 der Faser
innerhalb des Kapillarrohres liegt.
Das Arbeitsgerät 10 als solches entspricht im
wesentlichen jenem, wie es in der US-PS 44 47 546
beschrieben ist. Wichtig ist jedoch, daß erfindungsgemäß
das Rohr 14 mit einer Öffnung 30 versehen ist,
die in Strömungsverbindung mit dem Inneren des Rohres
14 steht und distal zum offenen Ende des Rohres angeordnet
ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
hat die Öffnung 30 die Form eines Rohrabschnitts,
der mit einer Scheidewand 34 versehen ist. Der Rohrabschnitt
32 liegt in der Nähe des Stopfens 16 und
steht radial von dem Rohr 14 vor. Die Scheidewand 34
dient in bekannter Weise dazu, von einer Injektionsnadel
(nicht dargestellt) durchstochen zu werden und
das Innere des Rohrabschnitts 32 ist so bemessen, daß
es der Nadel angepaßt ist, die in Verbindung mit dem
System benutzt wird. Die Öffnung 30 kann in gleicher
Weise als Kupplung zur Festlegung einer Luer-Spritze
oder einer äquivalenten Vorrichtung ausgerüstet sein.
Vor dem Einbau in das Arbeitsgerät 10 wird die Faser
12 mit einem Überzug versehen, wodurch ein Bereich 36
der zylindrischen Oberfläche der Faser für den durchzuführenden
Versuch aktiviert wird. Gemäß einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der
aktivierte Bereich 36 auf eine vorbestimmte Länge der
Faser 12 durch einen chemisch und optisch inerten Überzug
38 begrenzt, beispielsweise aus Silikon mit niedrigem
optischen Brechungsindex, wobei dieser Überzug 38
über beide Enden der Faser verläuft. Es ist jedoch
klar, daß die Dimensionen des aktivierten Bereichs
36 auch durch andere Mittel (beispielsweise durch
Maskierung der Faser während des Überziehens) eingestellt
werden kann, oder daß stattdessen die gesamte
Länge der Faser 12 aktiviert werden kann
und die Länge der Faser innerhalb des Kapillarrohres
sorgfältig eingestellt werden kann.
Im folgenden wird auf Fig. 3 der Zeichnung Bezug
genommen. Diese stellt eine stilisierte Wiedergabe
eines Schnittes des Arbeitsgerätes 2 innerhalb
des aktivierten bereichs 36 der Faser 12 dar,
gefüllt mit einer zu untersuchenden Probe 43. Die
Oberfläche der Faser 12 innerhalb des Bereiches 34
ist mit einer Vielzahl von Koppelstellen 44 versehen,
und ein Teil von diesen wird durch Teilchen
46 von Antikörper-Antigen-Komplexen gebunden. Der
Ausdruck "Teilchen eines Antikörper-Antigen-Komplexes"
bezieht sich auf einen immunologisch reaktiven Teil
eines solchen Komplexes und schließt Hapten sowie
vollständige Antigene und antigenreaktive Antikörperfragmente
[Fab] und vollständige Antikörper bzw.
Immunkörper ein. Die Koppelsitze 44 sind so gewählt,
daß die Teilchen 46 stillgesetzt werden, ohne merklich
die Reaktivität, d.h. die Affinität und Avidität
der Teilchen für den komplimentären Anteil des Komplexes
beeinträchtigen. Gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel
besteht die Faser 12 aus Glas oder
Quarz und die Koppelsitze 44 sind reaktive Gruppen
einer Silyl-Verbindung, beispielsweise 3-Aminopropyl-
trimethoxysilan und die Teilchen 46 bestehen aus einem
Antikörper, d.h. einem Immunkörper wie beispielsweise
Immunoglobulin G (IgG). Diese spezielle Kombination
der festen Phase der Koppelsitze 44 und der Teilchen
46 kann durch Antikörper-Carboxylendungen gebunden
werden, wodurch die Antikörper-Antigen reaktiven
Aminoenden frei werden.
Die Verfahren zur Aufbereitung der Glasoberfläche
der Faser 12 zur Aufbringung der Silyl-Verbindung
darauf und zur kovalenten Bindung eines Antikörpers
auf dem Glas durch die Silyl-Kupplung wird auf die
US-PS 36 52 761 Bezug genommen. Hier findet sich auch
eine Beschreibung der anderen Silyl-Verbindungen und
der Verfahren, durch die Carboxyl-Amino und andere
reaktive Gruppen von Antikörpern oder Antigenen
(oder ihrer Fragmente) kovalent mit verschiedenen
anorganischen Materialien verbunden werden können.
Es ist klar, daß es auch eine andere Möglichkeit zur
Stillsetzung von Antigenen oder Antikörpern auf
Polymeren gibt und die Fachwelt weiß, daß die Kopplungssitze
44 für Antigene oder Antikörper auch auf
Polymerfasern angebracht werden können. Beispielsweise
kann, wenn die Faser 12 aus Nylon (Polyamid) besteht,
die Kopplung in Form einer Substitution eines geeigneten
Radicals anstelle einer Hydrogenbindung mit den
Aminogruppen des Polymers sein. Die Kopplungssitze 44
können auch Abstandsgruppen enthalten, wie dies bekannt
ist. Um eine genügende Trennung zwischen der Faser 12
und den Teilchen 46 zu erlangen, um das Sterik-Hindernis
des Antikörper-Antigenbindeprozesses zu vermindern.
Beispielsweise könnten die Kopplungssitze 44 eine
Polyäthylenkette aufweisen, beispielsweise im Falle
einer 1,6 Diaminohexan oder 6 Aminohexanoik-Säurebindung
mit der Faser 12 über eine Peptide Bindung,
und indem jeweils eine freie primäre Aminogruppe
und eine freie Carboxylgruppe für eine kovalente
Bindung mit dem Carboxylrest oder dem Aminorest der
Proteinteilchen 46 erlangt wird. Alle diese Koppelmaterialien
liefern eine 6-Kohlenstoffkette zwischen
den Resten, und dadurch werden die Teilchen 46 von
der Faser 12 in einem entsprechenden Abstand distanziert.
Ähnliche geeignete Koppel- und Abstandsmaterialien
sind sowohl in der Immunoversuchs- als
auch in der Affinität-Chromotographie bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
ist die Faser 12 mit Teilchen 46 versehen, welche
Bindungssitze aufweisen, wie durch das Bezugszeichen
46 C angedeutet. Die Teilchen sind zum Teil mit markierten
Komponenten 50 ausgestattet, um Immunoversuche
berechnen zu können. Demgemäß ist bei einem Ausführungsbeispiel
als Teilchen 46 ein Immunkörper vorgesehen,
der mit markierten Antigen oder Hapten beschickt
ist, was im Überzug der Faser 12 enthalten
ist. Jede markierte Komponente 50 ist mit einer vorbestimmten
Menge von Fluorophor 52 versehen, wodurch
eine Markierung geschaffen wird. Die spezielle fluoreszierende
Verbindung, die zur Markierung benutzt
werden kann, besteht aus Fluoreszein, Tetramethylrhodamin,
seltenen Erden, Chelat und dergleichen. Verfahren zur
Bindung von Fluoreszent-Markierungen an Proteinen sind
bekannt, und zahlreiche, der kommerziell verfügbaren
fluoreszierenden Verbindungen haben Gruppen, die
eine Verbindung mit Proteinen ermöglichen. Vorzugsweise
wird für Vergleichsversuche ein fester Anteil
von Kopplungssitzen 44 mit einem immunologisch inerten
Protein 56, beispielsweise Albumin, versehen. Der
Überzug kann so gestaltet sein, daß er eine feste
Oberflächenzusammensetzung hat, in dem die Absorptionsphänomene
wie folgt benutzt werden. Für eine Überzugslösung,
die mit der geeigneten Konzentration der Bestandteile
hergestellt wurde, erzeugt das bloße Eintauchen
der Faser, die aktiviert ist mit einer entsprechenden
Bindungsgruppe 44 eine Oberflächen-Monoschicht
aus chemisch gebundenem Protein. Der Anteil
von Immunglobulin zu inertem Protein in dieser Schicht
ergibt sich durch ihren Anteil in der Lösung, was
jedoch nicht identisch ist. Eine partielle Anfüllung
der bezüglich immunoglobulinaktiven Sitze mit markierten
Antigen wird natürlich auf diesem Pegel in
der Lösung aufrecht erhalten. Nach dem Eintauchen
wird die Faser aus der Überzugslösung entfernt. Um
zu verhindern, daß die anhaftende flüssige Schicht
zusätzliche Reagenzien aufnimmt, wird die Faser dann
schnell gewaschen, bevor eine Verdampfung erfolgen
kann. Die Proteinschicht, die kovalent gebunden ist,
wird durch dieses Verfahren nicht entfernt. Um zu
verhindern, daß mehr als eine Proteinschicht gebunden
wird, braucht das bifunktionale Reagenz nicht die
Gesamtladung des Proteins zu ändern (dies kann gesteuert
werden durch Einstellung des pH-Wertes der
Überzugslösung), wobei ein nicht zu langer Abstandsarm
vorhanden ist.
Das Arbeitsgerät 6 wird in Verbindung mit einem
Fluorimeter 7 (Fig. 1) benutzt, welches die markierten
Komponenten des Reagenzmittels erregt und
eine Fluoreszenz von diesem aufnimmt. Ein geeignetes
Fluorimeter ist in der US-PS 44 47 546 beschrieben.
Es ist wichtig, daß das Fluorimeter
vorzugsweise die Fluoreszenzemission mißt, die nach
dem Ende der Faser zurückwandert, von welchem aus
die Erregerstrahlung eingeführt wurde.
Das Arbeitsgerät 6 gemäß der Erfindung kann bei
jeder Vorrichtung gemäß den erwähnten Patentanmeldungen
Anwendung finden. Jedoch ist das Volumen von Proben,
die zur Bestimmung benutzt werden, nicht notwendigerweise
durch das Zwischenraumvolumen zwischen Faser
12 und Rohr 14 beschränkt.
Bei der Benutzung erfordert das bevorzugte Ausführungsbeispiel
der erfindungsgemäßen Vorrichtung zunächst,
daß eine Probe in eine Spritze 8 eingesaugt wird,
die dann beispielsweise über eine Luer-Verbindung
mit dem Arbeitsgerät 10, wie aus Fig. 1 ersichtlich,
verbunden wird, d.h. die Injektionsspritze 8 wird
in einer Injektionspumpe 9 angeordnet und das Arbeitsgerät
6 wird mit einem Fluorimeter 7 verbunden.
Nunmehr wird die Injektionspumpe 9 aktiviert und
diese drückt die Probe in der Spritze 8 durch das
Arbeitsgerät 6 mit einer Strömungsrate, wie dies
beschrieben wird. Die Pumpe 9 bildet demgemäß Mittel,
um die Strömungsrate so zu steuern, daß die Verweilzeit
der Probe 43 gegenüber dem aktivierten Bereich
36 ähnlich der Zeit ist die erforderlich ist, um
das Volumen zwischen Faser 12 und Rohr 14 gründlich
zu spülen. Größere Strömungsraten erhöhen die
Empfindlichkeit des Systems, aber es besteht die
Gefahr, daß die Wirksamkeit der Probe wegen einer
unvollkommenen Spülung abnimmt. Die Probenströmung
durch den Zwischenraum zwischen Faser 12 und Rohr 14
sollte kontinuierlich den Zwischenraum füllen und
vorzugsweise während des gesamten Versuchs gefüllt
halten. Wie in der US-PS 44 47 546 beschrieben, ist
das Fluorimeter 7 so ausgebildet, daß die Stirnfläche
24 der Faser 12 mit einem Konuswinkel beleuchtet
wird, der durch die numerische Apertur der Faser
definiert ist. Diese Strahlung breitet sich infolgedessen
längs der Faser 12 mit oder über dem kritischen
Winkel aus (wie durch den Strahl 54 in Fig. 3 angedeutet)
und es erfolgt eine mehrfache totale innere
Reflexion über die Länge der Faser. Infolgedessen
wird eine abklingende Welle in der Flüssigkeit 43
benachbart zur Faser erzeugt, während der Strömung
des Probenteils in dem aktivierten Bereich 36 erzeugt.
Eine kompetitive Bindung der markierten Komponenten
50 und der markierten Komponenten 54 an den
Teilchen 46, die an der Faser anhaften, führt zu
fluoreszierenden markierten Komplexen 46 C proportional
zu der relativen Konzentration von markierten zu unmarkierten
Komponenten. Die markierten Komplexe 46 C
fluoreszieren, wenn sie von der abklingenden Welle
erregt werden. Ein Teil der fluoreszierenden
Emission wird in die Faser eingeleitet und wandert
in dieser längs Pfaden zurück, die den kritischen
Winkel überschreiten, wie dies beispielsweise
durch den Strahl 56 in Fig. 3 angedeutet ist. Die
Hälfte oder mehr der total reflektierten Fluoreszenzemission
tritt aus der Faser an der Stirnfläche
24 aus, wo die Strahlung durch das Fluorimeter 7
gesammelt wird.
Wenn der Zwischenraum zwischen der Faser und dem
Rohr völlig mit der Probenflüssigkeit wenigstens
in der Nähe des aktivierten Bereichs 36 angefüllt
ist, dann ergibt sich das Volumen der Probe, das
augenblicklich gegenüber einem aktiven Bereich 34
der Faser liegt, durch die folgende Gleichung:
dabei ist L die Länge des aktiven Bereichs der
Faser 12, D ist derInnendurchmesser der Kapillare
und d ist der Durchmesser der Faser. Das beobachtete
Volumen ergibt sich durch eine ähnliche Beziehung,
wobei die Größe (D - d) durch die wirksame Dicke
der beobachteten Zone zu ersetzen ist. Die Inkubationszeit,
die notwendig ist ein statisches Volumen zu
spülen, ergibt sich aus der Gleichung (2) wie folgt:
dabei ist k eine dimensionslose chemische
Reaktionskonstante (abhängig z.B. von der Dichte
der Bindesitze der Faser, der Wahrscheinlichkeit,
daß die Reaktion in der Probe einen Bindesitz betrifft,
u.s.w.) und s ist die Brown'sche Bewegung.
Wenn D und d in cm und s in cm sec-1/2 gemessen
werden, dann ergibt sich t in Sekunden. Der Wert
von k liegt zwischen etwa 1 und 10 für alle
praktischen Fälle.
Wenn die Probe an dem aktiven Bereich derart vorbeiströmen
kann, daß sie über die Länge des aktiven
Bereiches während einer Zeitdauer verbleibt, die
gleich ist der statischen Inkubationszeit, dann
ergibt sich aus der Gleichung (3) die folgende
Gleichung:
dabei ist v die Strömungsgeschwindigkeit.
Indem die Gleichungen (2) und (3) kombiniert werden,
ergibt sich das Volumen, welches pro Inkubationszeit
gespült wird (V/t) wie folgt:
Die Gleichung 5 definiert die tatsächliche wirksame
Probenvolumenströmung pro Zeiteinheit. Eine größere
Strömungsrate ermöglicht keine vollständige Spülung
der Probe, während eine kleinere Volumenströmungsrate
dazu führt, daß die Probe während einer längeren
Zeit als nötig gegenüber dem aktiven Bereich verbleibt.
Aus der Gleichung (5) ist ersichtlich, daß der
Wert von V/t dadurch maximiert werden kann, daß
die Länge des aktiven Bereiches vergrößert wird
und daß die Differenz zwischen D und d so klein
als möglich gemacht wird. Es ist jedoch nicht erforderlich,
eine Beschränkung physikalisch auf den
Kapillardurchmesser vorzunehmen. Das Volumen infolge
des zusätzlichen Durchmessers wird dann nicht
überprüft, aber es ist gewöhnlich zulässig, einen
Teil der Probe zu vergeuden und vorzugsweise wird
man eine Vorrichtung mit extrem kleinen Toleranzerfordernissen
bevorzugen.
Ein großes Kapillarvolumen kann mit einer Probenströmungsgeschwindigkeit
benutzt werden, die größer
ist als durch die Gleichung (4) angegeben, so daß
ein wirksamer Kapillardurchmesser D eff erzeugt wird,
der durch die folgende Gleichung bestimmt ist:
Bei einer solchen Anordnung wird k kleiner und
daher wird das optimale Verhältnis Volumen zu Zeit
(V/t) größer wegen der Spülung der Probe außerhalb
des effektiven Durchmessers D eff sowie wegen des
Fehlens der Notwendigkeit eine vollständige Spülung
der Probe abzuwarten.
Als Beispiel wird für D = 4d, (D + d)/(D - d)=1.66,
während für D = 1.1 d, (D + d)/(D - d) = 21 resultiert.
Letzteres stellt eine 12,6-fache Verbesserung
dar.
Es ist auch klar, die Faser 12 und das Rohr 14
auch anders als von kreiszylindrischer Gestalt
ausgebildet sein können, und daß das Rohr beispielsweise
durch zwei parallele Platten ersetzt
werden kann, die einen kapillaren Abstand dazwischen
aufweisen.
Da diese und gewisse andere Änderungen getroffen
werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu
verlassen, sollen die beschriebenen Ausführungsbeispiele
nicht im beschränkenden Sinne gelten.
Claims (11)
1. Verfahren zur Durchführung von Untersuchungen,
welche die Messung einer Fluoreszenz umfassen,
die in einer Probenflüssigkeit durch eine abklingende
Welle im Oberflächenbereich eines
innen total reflektierenden Substrats erregt
wird,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzerregung
stattfindet während die Flüssigkeit
durch eine Umhüllung fester Dimensionen strömt,
die teilweise durch den Oberflächenbereich begrenzt
sind, und daß ein ausreichendes Volumen
der Probe zugeführt wird, um die Umhüllung mit
der strömenden Probe angefüllt zu halten.
2 Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß der Oberflächenbereich
mit einem Überzug versehen ist, der
eine Vielzahl von Sitzen aufweist, wobei jeder
Sitz in der Lage ist, daran gewählte
Teilchen eines chemischen Komplexes festzuhalten,
und daß der Komplex in der Lage
ist zu fluoreszieren, wenn er durch die
abklingende Welle erregt wird, und daß die
Rate (v) der Strömung des Probenvolumens auf
wenigstens L/t gehalten wird,
wobei L die Länge der Oberflächenbereichs gemessen
in Strömungsrichtung der Sonde an dem
Bereich vorbei ist, und
t die Zeit, die erforderlich ist, um den Überzug
mit einem statischen Volumen der Probenflüssigkeit
zu spülen, welche die Umhüllung
ausfüllt.
3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens die
Dimension kleinsten Querschnitts der Umhüllung
Kapillarabmessungen im Hinblick auf die Probenflüssigkeit
hat.
4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
zur Untersuchung einer Flüssigkeitsprobe mit
einem innen total reflektierenden Substrat,
welches durchlässig ist für Strahlung, welche
in einem fluoreszierenden Material Fluoreszenz
erregen kann, wobei dieses Material wenigstens
auf einem Teil der Oberfläche des Substrats
angeordnet ist, wobei das Substrat auch für die
Fluoreszenzstrahlung durchlässig ist und Mittel
im Abstand zu der Oberfläche des Substrats
derart angeordnet sind, daß eine Umhüllung
geschaffen wird, die zum Teil durch den Abschnitt
begrenzt ist,
dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen
sind, um im wesentlichen kontinuierlich die
Probenflüssigkeit über den Oberflächenabschnitt
strömen zu lassen, und zwar in einem Volumen,
welches ausreicht, die Umhüllung zu umschließen
während die Fluoreszenz erregt wird.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine
optische Faser ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Umhüllung
ein Rohr ist, welches koaxial im Abstand zu
der Faser diese umgebend angeordnet ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, daß der Zwischenraum
zwischen dem Rohr und der Faser Kapillarabmessungen
besitzt.
8. Vorrichtung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Fluorimeter
vorgesehen ist, welches die Fluoreszenz mißt,
die durch die abklingende Welle erregt wurde.
9. Vorrichtung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen
sind, um wenigstens die Strömungsrate
der Probenflüssigkeit zu steuern.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur
Steuerung der Rate der Probenflüssigkeit eine
Flüssigkeitspumpe umfassen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt
mit einem Überzug versehen ist, der eine Vielzahl
von Sitzen aufweist, wobei jeder Sitz in
der Lage ist, ein gewähltes Teilchen aus einem
chemischen Komplex anhaften zu lassen, der in
der Lage ist, bei Erregung durch die Strahlung
zu fluoreszieren, und daß die Mittel zur
Steuerung der Strömungsrate eine Strömungsrate
(v) dieses Volumens von im wesentlichen L/t
liefern, wobei L die Länge gemessen in Richtung
der Strömung der Probe entlang dem Bereich ist
und t die Zeit, die erforderlich ist, für das
Material ein statisches Volumen der Probenflüssigkeit,
die die Umhüllung füllt, eine
Spülung durchzuführen.
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