DE3630352A1 - Vorrichtung und verfahren zur durchfuehrung von fluoreszenz-immun-untersuchungen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Immununtersuchungen und insbesondere auf Fluoreszenz-Immun-Untersuchungen, wobei die abklingende Welle, die durch totale innere Refexion erzeugt wird, benutzt wird um das beobachtete Volumen auf eine Schicht zu begrenzen, wodurch eine Abtrennung oder eine Waschstufe vermieden wird und die Störungen mit immunlogisch nicht reagierenden Hintergrundsubstanzen der Probe reduziert werden.

Die Anwendung der Technik totaler innerer Reflexion auf die Verminderung der Wirkungen von immunlogisch nicht reaktiven Substanzen bei Immun-Untersuchungen ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen gewesen. Die US-PS 39 39 350 beschreibt die Erzeugung der abklingenden Welle durch totale innere Reflexion an der Zwischenfläche zwischen einem innen total reflektierenden Substrat, beispielsweise einer Platte und der Probe zwecks Induzierung von Fluoreszenz in einem fluoreszenzmarkierten Abschnitt der Probe, die immunlogisch an die Platte gebunden ist, wobei der Teil der Probe hinter der Abklingzone nicht erregt wird. Auf diese Weise kann eine Untersuchung durchgeführt werden ohne daß es notwendig wäre, die nicht reagierenden Proben und Reagenzien zu entfernen. Tatsächlich wirkt die abklingende Welle als Trennmechanismus.

In der US-Patentanmeldung 4 06 324 vom 9. August 1982 ist beschrieben, daß ein größerer optischer Wirkungsgrad erreicht werden kann, wenn man die Fluoreszenz, die durch die abklingende Welle erregt ist, bei Rückkehr durch ein optisch dichteres Mittel über Totalreflexion beobachtet. Eine verbesserte Vorrichtung dieser Art und das entsprechende Verfahren zur Immun-Untersuchung sind in der US-PS 44 47 546 beschrieben. Hier ist gezeigt, daß sowohl die Menge der Probe als auch der Reaktionsendpunkt automatisch gesteuert werden können, indem eine bestimmte Fläche des immunlogisch aktivierten total reflektierenden Elementes (z.B. eine bekannte Länge einer optischen Faser bekannten Durchmessers) mit einem Kapillarrohr bekannter Dimensionen umschlossen wird. Auf diese Weise können schnelle einfache und genaue nicht-ballistische Untersuchungen durchgeführt werden.

Die Meßzeit, die erforderlich ist für eine Inkubation in der Kapillare, die die Faser umgibt, ist proportional zum Quadrat der mittleren Diffusionsentfernung. Letztere liegt in der Größenordnung des Abstandes zwischen der Faser und der Kapillarwand. Wenn man diesen Abstand kleiner macht, dann kann die Zeit, die erforderlich ist, den Reaktionsendpunkt zu erlangen und demgemäß die Geschwindigkeit einer nicht- ballistischen Untersuchung erheblich verbessert werden. Jedoch wird durch eine solche Verminderung auch das Probenvolumen verringert und demgemäß das Gesamtsignal pro Längeneinheit der Faser, und hierdurch wird die Empfindlichkeit schwerwiegend beeinträchtigt. Dieser Empfindlichkeitsverlust kann nur teilweise ausgeglichen werden, indem die Faserlänge vergrößert wird, weil sich eine Signalabschwächung in einer nicht überzogenen Faser ergibt, wie dies bei der Erfindung erforderlich ist.

Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und Verfahren zu schaffen, um schneller Fluoreszenz-Immun-Untersuchungen mit umschlossener Faser durchführen zu können, wobei die Empfindlichkeit der Untersuchung durch die erhöhte Geschwindigkeit nicht schädlich beeinträchtigt wird.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe erfindungsgemäß bei einem Fluoreszenz-Immun-Untersuchungsverfahren mit totaler innerer Reflexion dadurch, daß die Probe verursacht wird, längs des innen total reflektierenden Substrats zu strömen, wobei das Substrat einen aktiven Oberflächenbereich besitzt, der von einer Umhüllung umschlossen und im Abstand zu dieser angeordnet ist, um ein festes Volumen zu definieren. Die Strömungsrate der Probe wird so eingestellt, daß die Verweilzeit der Probe gegenüber dem aktiven Bereich gleich wird der Zeit die erforderlich ist, um das Volumen zwischen Substrat und Umhüllung zu spülen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt das Substrat eine optische Faser dar, und die Umhüllung ist ein Rohr, welches so dimensioniert ist, daß der Abstand zwischen der Innenwand des Rohres und der Faseroberfläche kapillare Abmessungen aufweist.

Mit einem solchen Aufbau kann ein großes Probenvolumen in relativ kurzer Zeit untersucht werden, wobei jedoch ein kleiner Teil der Probe durch die abklingende Welle jederzeit beleuchtet wird. Die Bindung an dem aktivierten Abschnitt der Faser ist kumulativ, je nach der Titrierung und der Probe und dem Spülvolumen.

Weitere Einzelheiten und zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Patentansprüchen und der folgenden Beschreibung.

Die Erfindung umfaßt demgemäß eine Vorrichtung und die Kombination von Elementen sowie ein Verfahren, welches verschiedene Stufen umfaßt, wie sie in der Beschreibung erläutert sind.

Nachstehend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Verbindung mit einem bekannten Gerät;

Fig. 2 einen Längsschnitt der Immun-Untersuchungsvorrichtung, die ein bevorzugtes Ausführungsbeispiek eines Teils der erfindungsgemäßen Vorrichtung bildet;

Fig. 3 eine stilisierte Ansicht eines Teils der Vorrichtung nach Fig. 2, wobei eine typische immuno-chemische Reaktion bei der Verwirklichung vorliegender Erfindung veranschaulicht ist.

In der Zeichnung bezeichnen gleiche Bezugszeichen entsprechende Teile. Die Darstellung in den Figuren ist schematisch und es wurde kein Versuch unternommen, tatsächliche Maße oder Verhältnisse darzustellen.

In bezug auf die gewählte Terminologie bei der Beschreibung der Vorrichtung werden "obere" und "untere" Schnitte erwähnt. Dies geschieht aus Zweckmäßigkeitsgründen unter Bezugnahme auf die Anordnung in den Zeichnungen. Es ist jedoch klar, daß die Vorrichtung in jeder Lage oder Orientierung im Raum arbeitsfähig ist, so daß die Angaben nicht beschränkend sind.

Die vorliegende Erfindung arbeitet mit Totalreflexion- Fluoreszenz gekuppelt mit einer Tunnelführung der Strahlung, wie dies in der US-Patentanmeldung 4 06 324 vom 9. August 1982 beschrieben ist. Darin sind Einzelheiten der optischen Arbeitsweise des Gerätes beschrieben.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Vorrichtung gemäß der Erfindung, welche ein Arbeitsgerät 6, ein Fluorimeter 7, eine Spritze 8, eine Einspritzpumpe 9 und einen Behälter 10 umfaßt.

Fig. 2 zeigt einen Längsschnitt eines Immuno-Versuchs- Arbeitsgerätes 6, welches gemäß den Prinzipien der Erfindung aufgebaut ist. Das Arbeitsgerät 6 umfaßt eine optische Faser 12, ein Kapillarrohr 14 und einen Stopfen 16.

Die Faser 12 besteht aus einem langgestreckten zylindrischen, optisch transparenten Körper, in dem über die Länge durch Mehrfach-Totalreflexion im Inneren optische Strahlung geführt wird, die an einem Ende der Faser unter einem festen Winkel eintritt, der im wesentlichen rotationssymmetrisch um die Faserachse verläuft. Wie allgemein auf dem Gebiet der Faseroptik bekannt, wird der maximale Akzeptanzwinkel in bezug auf die Faserachse B für die in die Faser eintretende Strahlung und für die in der Faser fortschreitende Strahlung durch die Brechungsindizes von Faser und umgebenden Medien bestimmt. Für eine Strahlung, die anfänglich durch ein Medium mit dem Brechungsindex n ₀ fortschreitet und auf eine Faser mit dem Brechungsindex n ₁ auftrifft, die im übrigen von einem Material mit dem Brechungsindex n ₂ umgeben ist, ergibt sich der maximale Akzeptanzwinkel aus der Gleichung

dabei ist N.A. die sogenannte numerische Apertur der Faser. Beispielsweise kann die Faser 12 aus irgendeinem optisch transparenten Material bestehen, beispielsweise Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin, Nylon oder dergleichen, wobei das Material so gewählt wird, daß es einen Brechungsindex besitzt, der größer ist als der Brechungsindex der zu untersuchenden flüssigen Probe. Letztere ist im typischen Fall eine wässrige Lösung mit einem Brechungsindex von etwa 1,33 oder eine Serumprobe mit einem Brechungsindex von etwa 1,35. Die Faser wird außerdem aus einem solchen Material gewählt, das sie unlöslich in der Probenflüssigkeit ist und mit dieser nicht reagiert. Es hat sich gezeigt, daß 200 µm einen zufriedenstellenden Faserdurchmesser darstellen. Es sind jedoch auch noch andere Faserdurchmesser möglich. Bei den meisten Untersuchungen erweist sich eine Faser von 25 mm Länge als ausreichend. Es ist jedoch klar, daß die Länge der Faser an die durchzuführenden Untersuchungen angepaßt werden kann. Die Empfindlichkeit verbessert sich mit ansteigender Faserlänge bis die Signalabschwächung über die Faserlänge 1/e überschreitet.

Wie im folgenden im einzelnen beschrieben, ist die Faser 12 mit einem Oberflächenüberzug versehen, der Mittel aufweist, um ausgewählte Teile eines Antigen- Antikörper-Komplexes anhaften zu lassen. Der hierbei benutzte Ausdruck "Antigen-Antikörper-Komplex" umschließt Komplexe nicht nur von vollständigen Antikörpern und Antigenen, sondern auch Komplexe, die immunologisch reaktive Fragmente von einem Komplex oder von beiden enthalten.

Das Kapillarrohr 14 ist vorzugsweise ein optisch transparentes Rohr und das Konstruktionsmaterial hierfür ist ebenfalls so gewählt, daß es relativ unlöslich in der zu untersuchenden Probenflüssigkeit ist und mit dieser nicht reagiert. So besteht das Kapillarrohr 14 vorzugsweise aus Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin oder dergleichen.

Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel hat das Kapillarrohr 14 eine gerade kreisförmige zylindrische Bohrung mit einem inneren Durchmesser, der etwas größer ist als der Durchmesser der Faser (beispielsweise hat bei einem Faserdurchmesser von 200 µm das Kapillarrohr 14 einen Innendurchmesser von etwa 240 µm). Die Erfindung kann jedoch auch in Verbindung mit Kapillarrohren Anwendung finden, die einen beträchtlich größeren Innendurchmesser als die Faser aufweisen.

Der Stopfen 16 ist so ausgebildet und dimensioniert, daß er in das Ende des Kapillarrohres 14 einpaßt und einen Endabschnitt 18 der Faser 12 mit wesentlichen koaxial im Abstand zu dem Kapillarrohr trägt. Außerdem bietet der Stopfen 16 eine harte Lagerfläche, um das Arbeitsgerät 6 in einem Fluorimeter festzulegen, wie dies weiter unten beschrieben wird. Zu diesem Zweck ist der Stopfen 16 vorzugsweise mit einem Flansch 20 versehen, dessen Gesamtdurchmesser etwa dem Außendurchmesser des Kapillarrohres 14 entspricht, während ein zentral angeordneter endringartiger Fortsatz 21 koaxial zu einer zentralen Bohrung 22 verläuft. Die Bohrung 22 ist durch den Stopfen 16 hindurchgeführt und so bemessen, daß ein Endabschnitt 18 der Faser 12 festgelegt werden kann. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der Stopfen 16 an Ort und Stelle um die Faser 12 herumgeformt und der Stopfen ist vorzugsweise aus einem Material mit geringem Brechungsindex, beispielsweise Siloxan hergestellt.

Die Faser 12 ist durch den Stopfen 16 geführt und wird von diesem getragen, so daß im wesentlichen die gesamte Faser mit Ausnahme des Endabschnittes 18 dem Inneren des Kapillarrohres 14 ausgesetzt ist, wobei eine Stirnfläche 24 des Endabschnittes 18 frei liegt, die mit dem stirnseitigen Ende der Bohrung 22 außerhalb des Kapillarrohres fluchtet.

Die Stirnfläche 24 ist vorzugsweise eben und liegt normal zur Achse der Faser 12. Vorzugsweise ist die Stirnfläche 24 hoch transparent und frei von Fehlern, die das auf die Stirnfläche einfallende Licht zerstreuen könnten. Zu diesem Zweck kann die Stirnfläche 24 optisch poliert sein, obgleich es sich gezeigt hat, daß eine gegossene Quarzfaser auch einfach geschnitten werden kann, um eine geeignete optische Oberfläche darzubieten.

Wahlweise kann die Stirnfläche 26 der Faser, die von der Stirnfläche 24 entfernt liegt, auch flach poliert oder geschnitten sein und sie kann mit einem Spiegelüberzug 28 oder einem getrennten Spiegel versehen sein, der im wesentlichen normal zur Faserachse verläuft, wodurch die Strahlung, die in der Faser eingeschlossen, ist, veranlaßt wird, die Faser zweifach zu durchlaufen.

Die Gesamtabmessungen von Faser 12, Kapillarrohr 14 und Stopfen 16 sind vorzugsweise so gewählt, daß gewährleistet wird, daß die Stirnfläche 26 der Faser innerhalb des Kapillarrohres liegt.

Das Arbeitsgerät 10 als solches entspricht im wesentlichen jenem, wie es in der US-PS 44 47 546 beschrieben ist. Wichtig ist jedoch, daß erfindungsgemäß das Rohr 14 mit einer Öffnung 30 versehen ist, die in Strömungsverbindung mit dem Inneren des Rohres 14 steht und distal zum offenen Ende des Rohres angeordnet ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hat die Öffnung 30 die Form eines Rohrabschnitts, der mit einer Scheidewand 34 versehen ist. Der Rohrabschnitt 32 liegt in der Nähe des Stopfens 16 und steht radial von dem Rohr 14 vor. Die Scheidewand 34 dient in bekannter Weise dazu, von einer Injektionsnadel (nicht dargestellt) durchstochen zu werden und das Innere des Rohrabschnitts 32 ist so bemessen, daß es der Nadel angepaßt ist, die in Verbindung mit dem System benutzt wird. Die Öffnung 30 kann in gleicher Weise als Kupplung zur Festlegung einer Luer-Spritze oder einer äquivalenten Vorrichtung ausgerüstet sein.

Vor dem Einbau in das Arbeitsgerät 10 wird die Faser 12 mit einem Überzug versehen, wodurch ein Bereich 36 der zylindrischen Oberfläche der Faser für den durchzuführenden Versuch aktiviert wird. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist der aktivierte Bereich 36 auf eine vorbestimmte Länge der Faser 12 durch einen chemisch und optisch inerten Überzug 38 begrenzt, beispielsweise aus Silikon mit niedrigem optischen Brechungsindex, wobei dieser Überzug 38 über beide Enden der Faser verläuft. Es ist jedoch klar, daß die Dimensionen des aktivierten Bereichs 36 auch durch andere Mittel (beispielsweise durch Maskierung der Faser während des Überziehens) eingestellt werden kann, oder daß stattdessen die gesamte Länge der Faser 12 aktiviert werden kann und die Länge der Faser innerhalb des Kapillarrohres sorgfältig eingestellt werden kann.

Im folgenden wird auf Fig. 3 der Zeichnung Bezug genommen. Diese stellt eine stilisierte Wiedergabe eines Schnittes des Arbeitsgerätes 2 innerhalb des aktivierten bereichs 36 der Faser 12 dar, gefüllt mit einer zu untersuchenden Probe 43. Die Oberfläche der Faser 12 innerhalb des Bereiches 34 ist mit einer Vielzahl von Koppelstellen 44 versehen, und ein Teil von diesen wird durch Teilchen 46 von Antikörper-Antigen-Komplexen gebunden. Der Ausdruck "Teilchen eines Antikörper-Antigen-Komplexes" bezieht sich auf einen immunologisch reaktiven Teil eines solchen Komplexes und schließt Hapten sowie vollständige Antigene und antigenreaktive Antikörperfragmente [Fab] und vollständige Antikörper bzw. Immunkörper ein. Die Koppelsitze 44 sind so gewählt, daß die Teilchen 46 stillgesetzt werden, ohne merklich die Reaktivität, d.h. die Affinität und Avidität der Teilchen für den komplimentären Anteil des Komplexes beeinträchtigen. Gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht die Faser 12 aus Glas oder Quarz und die Koppelsitze 44 sind reaktive Gruppen einer Silyl-Verbindung, beispielsweise 3-Aminopropyl- trimethoxysilan und die Teilchen 46 bestehen aus einem Antikörper, d.h. einem Immunkörper wie beispielsweise Immunoglobulin G (IgG). Diese spezielle Kombination der festen Phase der Koppelsitze 44 und der Teilchen 46 kann durch Antikörper-Carboxylendungen gebunden werden, wodurch die Antikörper-Antigen reaktiven Aminoenden frei werden.

Die Verfahren zur Aufbereitung der Glasoberfläche der Faser 12 zur Aufbringung der Silyl-Verbindung darauf und zur kovalenten Bindung eines Antikörpers auf dem Glas durch die Silyl-Kupplung wird auf die US-PS 36 52 761 Bezug genommen. Hier findet sich auch eine Beschreibung der anderen Silyl-Verbindungen und der Verfahren, durch die Carboxyl-Amino und andere reaktive Gruppen von Antikörpern oder Antigenen (oder ihrer Fragmente) kovalent mit verschiedenen anorganischen Materialien verbunden werden können. Es ist klar, daß es auch eine andere Möglichkeit zur Stillsetzung von Antigenen oder Antikörpern auf Polymeren gibt und die Fachwelt weiß, daß die Kopplungssitze 44 für Antigene oder Antikörper auch auf Polymerfasern angebracht werden können. Beispielsweise kann, wenn die Faser 12 aus Nylon (Polyamid) besteht, die Kopplung in Form einer Substitution eines geeigneten Radicals anstelle einer Hydrogenbindung mit den Aminogruppen des Polymers sein. Die Kopplungssitze 44 können auch Abstandsgruppen enthalten, wie dies bekannt ist. Um eine genügende Trennung zwischen der Faser 12 und den Teilchen 46 zu erlangen, um das Sterik-Hindernis des Antikörper-Antigenbindeprozesses zu vermindern. Beispielsweise könnten die Kopplungssitze 44 eine Polyäthylenkette aufweisen, beispielsweise im Falle einer 1,6 Diaminohexan oder 6 Aminohexanoik-Säurebindung mit der Faser 12 über eine Peptide Bindung, und indem jeweils eine freie primäre Aminogruppe und eine freie Carboxylgruppe für eine kovalente Bindung mit dem Carboxylrest oder dem Aminorest der Proteinteilchen 46 erlangt wird. Alle diese Koppelmaterialien liefern eine 6-Kohlenstoffkette zwischen den Resten, und dadurch werden die Teilchen 46 von der Faser 12 in einem entsprechenden Abstand distanziert. Ähnliche geeignete Koppel- und Abstandsmaterialien sind sowohl in der Immunoversuchs- als auch in der Affinität-Chromotographie bekannt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Faser 12 mit Teilchen 46 versehen, welche Bindungssitze aufweisen, wie durch das Bezugszeichen 46 C angedeutet. Die Teilchen sind zum Teil mit markierten Komponenten 50 ausgestattet, um Immunoversuche berechnen zu können. Demgemäß ist bei einem Ausführungsbeispiel als Teilchen 46 ein Immunkörper vorgesehen, der mit markierten Antigen oder Hapten beschickt ist, was im Überzug der Faser 12 enthalten ist. Jede markierte Komponente 50 ist mit einer vorbestimmten Menge von Fluorophor 52 versehen, wodurch eine Markierung geschaffen wird. Die spezielle fluoreszierende Verbindung, die zur Markierung benutzt werden kann, besteht aus Fluoreszein, Tetramethylrhodamin, seltenen Erden, Chelat und dergleichen. Verfahren zur Bindung von Fluoreszent-Markierungen an Proteinen sind bekannt, und zahlreiche, der kommerziell verfügbaren fluoreszierenden Verbindungen haben Gruppen, die eine Verbindung mit Proteinen ermöglichen. Vorzugsweise wird für Vergleichsversuche ein fester Anteil von Kopplungssitzen 44 mit einem immunologisch inerten Protein 56, beispielsweise Albumin, versehen. Der Überzug kann so gestaltet sein, daß er eine feste Oberflächenzusammensetzung hat, in dem die Absorptionsphänomene wie folgt benutzt werden. Für eine Überzugslösung, die mit der geeigneten Konzentration der Bestandteile hergestellt wurde, erzeugt das bloße Eintauchen der Faser, die aktiviert ist mit einer entsprechenden Bindungsgruppe 44 eine Oberflächen-Monoschicht aus chemisch gebundenem Protein. Der Anteil von Immunglobulin zu inertem Protein in dieser Schicht ergibt sich durch ihren Anteil in der Lösung, was jedoch nicht identisch ist. Eine partielle Anfüllung der bezüglich immunoglobulinaktiven Sitze mit markierten Antigen wird natürlich auf diesem Pegel in der Lösung aufrecht erhalten. Nach dem Eintauchen wird die Faser aus der Überzugslösung entfernt. Um zu verhindern, daß die anhaftende flüssige Schicht zusätzliche Reagenzien aufnimmt, wird die Faser dann schnell gewaschen, bevor eine Verdampfung erfolgen kann. Die Proteinschicht, die kovalent gebunden ist, wird durch dieses Verfahren nicht entfernt. Um zu verhindern, daß mehr als eine Proteinschicht gebunden wird, braucht das bifunktionale Reagenz nicht die Gesamtladung des Proteins zu ändern (dies kann gesteuert werden durch Einstellung des pH-Wertes der Überzugslösung), wobei ein nicht zu langer Abstandsarm vorhanden ist.

Das Arbeitsgerät 6 wird in Verbindung mit einem Fluorimeter 7 (Fig. 1) benutzt, welches die markierten Komponenten des Reagenzmittels erregt und eine Fluoreszenz von diesem aufnimmt. Ein geeignetes Fluorimeter ist in der US-PS 44 47 546 beschrieben. Es ist wichtig, daß das Fluorimeter vorzugsweise die Fluoreszenzemission mißt, die nach dem Ende der Faser zurückwandert, von welchem aus die Erregerstrahlung eingeführt wurde.

Das Arbeitsgerät 6 gemäß der Erfindung kann bei jeder Vorrichtung gemäß den erwähnten Patentanmeldungen Anwendung finden. Jedoch ist das Volumen von Proben, die zur Bestimmung benutzt werden, nicht notwendigerweise durch das Zwischenraumvolumen zwischen Faser 12 und Rohr 14 beschränkt.

Bei der Benutzung erfordert das bevorzugte Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung zunächst, daß eine Probe in eine Spritze 8 eingesaugt wird, die dann beispielsweise über eine Luer-Verbindung mit dem Arbeitsgerät 10, wie aus Fig. 1 ersichtlich, verbunden wird, d.h. die Injektionsspritze 8 wird in einer Injektionspumpe 9 angeordnet und das Arbeitsgerät 6 wird mit einem Fluorimeter 7 verbunden. Nunmehr wird die Injektionspumpe 9 aktiviert und diese drückt die Probe in der Spritze 8 durch das Arbeitsgerät 6 mit einer Strömungsrate, wie dies beschrieben wird. Die Pumpe 9 bildet demgemäß Mittel, um die Strömungsrate so zu steuern, daß die Verweilzeit der Probe 43 gegenüber dem aktivierten Bereich 36 ähnlich der Zeit ist die erforderlich ist, um das Volumen zwischen Faser 12 und Rohr 14 gründlich zu spülen. Größere Strömungsraten erhöhen die Empfindlichkeit des Systems, aber es besteht die Gefahr, daß die Wirksamkeit der Probe wegen einer unvollkommenen Spülung abnimmt. Die Probenströmung durch den Zwischenraum zwischen Faser 12 und Rohr 14 sollte kontinuierlich den Zwischenraum füllen und vorzugsweise während des gesamten Versuchs gefüllt halten. Wie in der US-PS 44 47 546 beschrieben, ist das Fluorimeter 7 so ausgebildet, daß die Stirnfläche 24 der Faser 12 mit einem Konuswinkel beleuchtet wird, der durch die numerische Apertur der Faser definiert ist. Diese Strahlung breitet sich infolgedessen längs der Faser 12 mit oder über dem kritischen Winkel aus (wie durch den Strahl 54 in Fig. 3 angedeutet) und es erfolgt eine mehrfache totale innere Reflexion über die Länge der Faser. Infolgedessen wird eine abklingende Welle in der Flüssigkeit 43 benachbart zur Faser erzeugt, während der Strömung des Probenteils in dem aktivierten Bereich 36 erzeugt.

Eine kompetitive Bindung der markierten Komponenten 50 und der markierten Komponenten 54 an den Teilchen 46, die an der Faser anhaften, führt zu fluoreszierenden markierten Komplexen 46 C proportional zu der relativen Konzentration von markierten zu unmarkierten Komponenten. Die markierten Komplexe 46 C fluoreszieren, wenn sie von der abklingenden Welle erregt werden. Ein Teil der fluoreszierenden Emission wird in die Faser eingeleitet und wandert in dieser längs Pfaden zurück, die den kritischen Winkel überschreiten, wie dies beispielsweise durch den Strahl 56 in Fig. 3 angedeutet ist. Die Hälfte oder mehr der total reflektierten Fluoreszenzemission tritt aus der Faser an der Stirnfläche 24 aus, wo die Strahlung durch das Fluorimeter 7 gesammelt wird.

Wenn der Zwischenraum zwischen der Faser und dem Rohr völlig mit der Probenflüssigkeit wenigstens in der Nähe des aktivierten Bereichs 36 angefüllt ist, dann ergibt sich das Volumen der Probe, das augenblicklich gegenüber einem aktiven Bereich 34 der Faser liegt, durch die folgende Gleichung:

dabei ist L die Länge des aktiven Bereichs der Faser 12, D ist derInnendurchmesser der Kapillare und d ist der Durchmesser der Faser. Das beobachtete Volumen ergibt sich durch eine ähnliche Beziehung, wobei die Größe (D - d) durch die wirksame Dicke der beobachteten Zone zu ersetzen ist. Die Inkubationszeit, die notwendig ist ein statisches Volumen zu spülen, ergibt sich aus der Gleichung (2) wie folgt:

dabei ist k eine dimensionslose chemische Reaktionskonstante (abhängig z.B. von der Dichte der Bindesitze der Faser, der Wahrscheinlichkeit, daß die Reaktion in der Probe einen Bindesitz betrifft, u.s.w.) und s ist die Brown'sche Bewegung. Wenn D und d in cm und s in cm sec^-1/2 gemessen werden, dann ergibt sich t in Sekunden. Der Wert von k liegt zwischen etwa 1 und 10 für alle praktischen Fälle.

Wenn die Probe an dem aktiven Bereich derart vorbeiströmen kann, daß sie über die Länge des aktiven Bereiches während einer Zeitdauer verbleibt, die gleich ist der statischen Inkubationszeit, dann ergibt sich aus der Gleichung (3) die folgende Gleichung:

dabei ist v die Strömungsgeschwindigkeit.

Indem die Gleichungen (2) und (3) kombiniert werden, ergibt sich das Volumen, welches pro Inkubationszeit gespült wird (V/t) wie folgt:

Die Gleichung 5 definiert die tatsächliche wirksame Probenvolumenströmung pro Zeiteinheit. Eine größere Strömungsrate ermöglicht keine vollständige Spülung der Probe, während eine kleinere Volumenströmungsrate dazu führt, daß die Probe während einer längeren Zeit als nötig gegenüber dem aktiven Bereich verbleibt.

Aus der Gleichung (5) ist ersichtlich, daß der Wert von V/t dadurch maximiert werden kann, daß die Länge des aktiven Bereiches vergrößert wird und daß die Differenz zwischen D und d so klein als möglich gemacht wird. Es ist jedoch nicht erforderlich, eine Beschränkung physikalisch auf den Kapillardurchmesser vorzunehmen. Das Volumen infolge des zusätzlichen Durchmessers wird dann nicht überprüft, aber es ist gewöhnlich zulässig, einen Teil der Probe zu vergeuden und vorzugsweise wird man eine Vorrichtung mit extrem kleinen Toleranzerfordernissen bevorzugen.

Ein großes Kapillarvolumen kann mit einer Probenströmungsgeschwindigkeit benutzt werden, die größer ist als durch die Gleichung (4) angegeben, so daß ein wirksamer Kapillardurchmesser D _eff erzeugt wird, der durch die folgende Gleichung bestimmt ist:

Bei einer solchen Anordnung wird k kleiner und daher wird das optimale Verhältnis Volumen zu Zeit (V/t) größer wegen der Spülung der Probe außerhalb des effektiven Durchmessers D _eff sowie wegen des Fehlens der Notwendigkeit eine vollständige Spülung der Probe abzuwarten.

Als Beispiel wird für D = 4d, (D + d)/(D - d)=1.66, während für D = 1.1 d, (D + d)/(D - d) = 21 resultiert. Letzteres stellt eine 12,6-fache Verbesserung dar.

Es ist auch klar, die Faser 12 und das Rohr 14 auch anders als von kreiszylindrischer Gestalt ausgebildet sein können, und daß das Rohr beispielsweise durch zwei parallele Platten ersetzt werden kann, die einen kapillaren Abstand dazwischen aufweisen.

Da diese und gewisse andere Änderungen getroffen werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen, sollen die beschriebenen Ausführungsbeispiele nicht im beschränkenden Sinne gelten.

Claims (11)

1. Verfahren zur Durchführung von Untersuchungen, welche die Messung einer Fluoreszenz umfassen, die in einer Probenflüssigkeit durch eine abklingende Welle im Oberflächenbereich eines innen total reflektierenden Substrats erregt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzerregung stattfindet während die Flüssigkeit durch eine Umhüllung fester Dimensionen strömt, die teilweise durch den Oberflächenbereich begrenzt sind, und daß ein ausreichendes Volumen der Probe zugeführt wird, um die Umhüllung mit der strömenden Probe angefüllt zu halten.

2 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Oberflächenbereich mit einem Überzug versehen ist, der eine Vielzahl von Sitzen aufweist, wobei jeder Sitz in der Lage ist, daran gewählte Teilchen eines chemischen Komplexes festzuhalten, und daß der Komplex in der Lage ist zu fluoreszieren, wenn er durch die abklingende Welle erregt wird, und daß die Rate (v) der Strömung des Probenvolumens auf wenigstens L/t gehalten wird, wobei L die Länge der Oberflächenbereichs gemessen in Strömungsrichtung der Sonde an dem Bereich vorbei ist, und t die Zeit, die erforderlich ist, um den Überzug mit einem statischen Volumen der Probenflüssigkeit zu spülen, welche die Umhüllung ausfüllt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens die Dimension kleinsten Querschnitts der Umhüllung Kapillarabmessungen im Hinblick auf die Probenflüssigkeit hat.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Untersuchung einer Flüssigkeitsprobe mit einem innen total reflektierenden Substrat, welches durchlässig ist für Strahlung, welche in einem fluoreszierenden Material Fluoreszenz erregen kann, wobei dieses Material wenigstens auf einem Teil der Oberfläche des Substrats angeordnet ist, wobei das Substrat auch für die Fluoreszenzstrahlung durchlässig ist und Mittel im Abstand zu der Oberfläche des Substrats derart angeordnet sind, daß eine Umhüllung geschaffen wird, die zum Teil durch den Abschnitt begrenzt ist, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um im wesentlichen kontinuierlich die Probenflüssigkeit über den Oberflächenabschnitt strömen zu lassen, und zwar in einem Volumen, welches ausreicht, die Umhüllung zu umschließen während die Fluoreszenz erregt wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine optische Faser ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umhüllung ein Rohr ist, welches koaxial im Abstand zu der Faser diese umgebend angeordnet ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Zwischenraum zwischen dem Rohr und der Faser Kapillarabmessungen besitzt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fluorimeter vorgesehen ist, welches die Fluoreszenz mißt, die durch die abklingende Welle erregt wurde.

9. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel vorgesehen sind, um wenigstens die Strömungsrate der Probenflüssigkeit zu steuern.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Steuerung der Rate der Probenflüssigkeit eine Flüssigkeitspumpe umfassen.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt mit einem Überzug versehen ist, der eine Vielzahl von Sitzen aufweist, wobei jeder Sitz in der Lage ist, ein gewähltes Teilchen aus einem chemischen Komplex anhaften zu lassen, der in der Lage ist, bei Erregung durch die Strahlung zu fluoreszieren, und daß die Mittel zur Steuerung der Strömungsrate eine Strömungsrate (v) dieses Volumens von im wesentlichen L/t liefern, wobei L die Länge gemessen in Richtung der Strömung der Probe entlang dem Bereich ist und t die Zeit, die erforderlich ist, für das Material ein statisches Volumen der Probenflüssigkeit, die die Umhüllung füllt, eine Spülung durchzuführen.