SU1497577A1 - Способ определени тестостерона в биологической жидкости - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к иммунологическому анализу и представл ет собой способ количественного определени  тестостерона. Цель изобретени  - увеличение чувствительности ускорение и упрощение способа. Дл  этого полимерный носитель перед сорбцией антител обрабатывают белком A S.AUREUS до насыщени . Полученный иммуносорбент используют дл  твердофазного иммуноферментного анализа тестостерона. Чувствительность определени  8 пг/мл. Врем  анализа 2 ч 40 мин.

Description

Изобретение относитс  к иммунохимии и иммунологическому анализу и к им- мунохимическому анализу гормонов

Цель изобретени  - увеличение чувствительности, ускорение и упрощение способа

Способ определени  тестостерона (тс) осуществл етс  следующим образом

В лунках планщетов из полистирола сорбируют белок А из раствора,содержащего 5-15 мкг/мл этого белка, в течение 16-20 ч при 4°С или не менее 2 ч при 37°С, после этого инкубируют в лунках сыворотку к ТС. После удалени  избытка антител внос т смесь исследуемой пробы с конъюгатом ТС и фермента пероксидазы (ПХ)о Далее внос т хромогенный субстрат дл  ПХ и измер ют оптическую платность продукта пероксидазной реакции, величина которой пропорциональна концентрации ТС,

Пример 1 о Получение конъюга- тов ТС с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и с ПХ.

Предварительно готов т ТС-3-(о- карбоксиметилоксим) (ТС-ЗСМО) следующим образом, К 250 мл ТС и 230 мг аминоуксусной кислоты добавл ют 30 мл 20% (об/об) водного раствора метанола и 20 мл 0,1М водного раствора ацетата натри о Суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавл ют еще 2,4 г- ацетата натри  до концентрации 1М и перемешивают суспензию при нагревании до 1 ч о Добавл ют дважды по 5 мл метанола при 60 С до получени  прозрачного раствора и перемешивают 30 мин о Смесь оставл ют при комнатной температуре на ночь, затем упаривают под вакуумом вдвое. Образовавшуюс  суспензию разбавл ют во- дои до 100 мл, подщелачивают до рН 8-9 0,1н. гидроксидом кали  до растворени  осадка. Трижды экстрагируют

(Л

и со

СП VI vj

314

30 мл этилацетатас, Экстракт упариваЙт досуха.

Конъюгат ТС-ЗСМО-БСА получают ме- смешени  ангидридов „ 19 мг Т1С-ЗСМО раствор ют в 2 мл диоксана. Добавл ют 20 мкл трет-бутнламина и 10 мкл изо-бутилхлоркарбоната и перевешивают в течение 1 ч при 12-15 °С, При помешивании добавл ют к этому pjacTBOpy раствор, содержащий 29 мг БСА, 3 мл дистиллированной воды, 2Э мкл 1н. гидроксида кали  по капл м в течение 2.0 мин, перемешивают 3 ч при 0-4 с и диализируют против дистиллированной воды в течение ночи при 12-15 Со Образовавшуюс  смесь п|одщелачивают бикарбонатом натри  д|о рН 8-9, осадок отфильтровывают, д|овод т рН фильтрата до 3 концентри- рЬванной сол ной кислотой, образовав шЦйс  осадок отбрасывают, использу- ю|г надосадочную жидкость „ Мол рное соотношение ТС - БСА в конъюгате составл ет

Дл  получени  конъюгата ТС-ПХ ис- пЬлъзуют метод смешени  ангидридов 2 мг ТС-ЗСМО раствор ют в 1 мл без- вЬдного диоксана, содержащего 2 мкл 3-1-н-бутиламинао При охлаждении до прибавл ют 0,5 мл диоксана,. сЬдержащего 1 мкл изобутилхлоркарбон та , и перемешивают при температу- р замерзани  диоксана 1 ч 15 мин. раствор медленно добавл ют пор- по 50 мкл к охлажденному до 4 С раствору 10 мг ПХ в. 3 мл 0,5%-но раствора бикарбонату натри  „Пос- л перемешивани  2,5 ч при 4 С про- вдд т дважды диализ против 1л OjOlHo калий фосфатного буфера,содер 0,1 Не хлорид натри , рН 7,2 () в течение 2 ч и ночи при 4 - 1,И С„Мол рное соотношение ТС-ПХ в кфнъюгате составл ет 6;I,

Получение гетероиммунной анти- Тф-сыворотки,

Крольчих иммунизируют конъюгатом ТФ-ЗСМО - БСА трижды (раз в 2 неде- Л1(г) внутримышечно по 1 мг (в смеси с полным адъювантом Фрейнда (1:1)) и трижды (раз в 6 недель) внутри- по 0,8 мг на кролика (вес кроликов 2,5-3 кг), Реиммунизацию про- В0ДЯТ через 9 мес цев путем двукрат- ного внутривенного введени  0,8 мг тфго же конъюгата. Кровь дл  получени  сыворотки берут через 7-10 дней пдсле последней иммунизации.

л 5 0 5

0 с 0

5

0

Получение иммуносорбента Иммуносорбентом служит гаммагло- булинова  фракци  кроличьей гетероиммунной сыворотки к ТС, св занна  с белком А, адсорбированным на план- шетео

Иммуносорбент готов т сорбцией белка А стафилококка (5 мкг/мл белка А в ФБ) в лунках 96-луночных планшетов по 100 мкл на лунку в течение 18 ч при 4 Со Эта и все последующие операции ИФА сопровождаютс  про- мьщкой планшетов дважды водопроводной водой И дважды ФБ, содержащим 0,05% детергента тритон Х-100 или

твин-20 (ТФБ)О

Затем в лунки планшетов добавл ют по 100 мкл анти-ТС-сыворотки в разведении 1:1000 в ТФБ, инкубируют в течение 2 ч при З7 с и отмьгаают ТФБ.

Полученный Иммуносорбент может хранитьс  до использовани  при 4°С в течение как минимум 4 мес (срок наблюдени ), поэтому врем  его приготовлени  не лимитирует врем  анализа ТС „

Проведение ИФА,

Аликвоты плазмы человека,(О,1 мл) экстрагируют встр хиванием с 1 мл диэтилового эфира 10-15 мин, замораживают при (-10) - () С, эфирную фракцию сливают и упаривают досуха нагреванием в вод ной бане до 38-42 с« Сухой остаток раствор ют в 0,1 мл ТФБо

В каждую лунку планшета с иммуно- сорбентом внос т 100 мкл образца (экстракта плазмы крови) или стандарта (разведени  ТС в ТФБ с концентрацией от 50 нг/мл до 4 пг/мл) дл  построени  калибровочной кривой и 100 мкл раствора конъюгата ТС-ПХ в ТФБ (концентраци  10 нг/мл по ПХ) и инкубируют 2 ч при 37°С,

По окончании инкубации добавл ют субстратную смесь (0,04%-ный раствор о-фенилендиамина в.бидистиллированной воде, содержащей 0,008% перекиси водорода ) по 100 мкл на лункуо Через 30 мин (температура комнатна ) останавливают реакцию добавлением 100 мкл 2М серной кислоты и регистрируют оптическую плотность продукта фермен- . тативной реакции при 490 нм,Пересчет оптической плотности продукта перек- сидазной реакции в концентрацию ТС провод т по калибровочному графику.

полученному при анализе стандартного препарата ТС о . .

Пример 2о Способ осуществл ют согласно примеру 1, но концентраци  белка А составл ет 15 мкг/мл„ Чувствительность и продолжительность анализа та же, что и в примере 1.

Предложенный способ иммунофермент- ного определени  ТС обладает высокой чувствительностью 8 пг/мп (0,26 х X ), что в 8 раз вьте чувствительности , указанной в прототипе о Обща  продолжительность анализа составл ет 2 ч АО мин, что меньше вре- мени проведени  всех известных способов иммуноферментного определени  ТС о

Положительным отличием предлагае- мого способа  вл етс  выделение гам- маглобулинов из :ыворотки аити-ТС непосредственно в лунках планшета с помощью аффинной адсорбции на белке А Положительный зффект за счет использовани  белка А предположи- тельно обусловлен как пространственным разделением антител с носителем, так и энергетически выгодной дп  взаимодействи  с ТС ориентацией несущих активные центры FaЪ-фpaг eь тoв антител, св занных с белком А черС Fc-фрагменты и имеющих большую подвижность , чем при многоточечном контакте молекул с поверхностью косите- л  при пр мой адсорбции, Ланный подход удобен методически и позвол ет избегать вьщелени  иммуноглобулинов путем осаждени , что, как правило, приводит к потере части антител.

Врем  анализа 2 ч 40 мин. Чувствительность определени  8 пг/мл

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  тестостерона в биологической жидкости путем обработки полимерного носител  антителами , инкубации исследуемой жидкости с конъюгатом тестостерона и фермента с последующим добавлением субстрата фермента и регистрацией содержани  продукта ферментативной реакции по оптической плотности, отличающийс  тем, что, с , целью повышени  чувствительности,ускорени  и упрощени  способа, полимерный носитель предварительно обрабатывают белком А до насыщени .