JP2013188230A - 半減期が延長された改変凝固第VIIa因子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、介在するペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによって結合させ得るヒト血清アルブミンをコードするcDNAに遺伝子工学的に融合させたヒト第VII因子および第VIIa因子および誘導体をコードするcDNA配列、増加した安定性および延長された有効血漿半減期を示すそのようにコードされた誘導体、そのようなcDNA配列を含む組み換え発現ベクター、そのような組み換え発現ベクターで形質転換させた宿主細胞、未改変の野生型タンパク質の生物活性を有するが、安定性が向上し、半減期が延長した組み換えポリペプチドおよび誘導体、そのような組換え型タンパク質、ならびにそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、ヒト遺伝子治療で使用される、そのような改変DNA配列を含むトランスファーベクターを包含する。
【選択図】なし
Description
血友病Aは遺伝性の出血性疾患である。X染色体の血液凝固第VIII因子のX染色体連結欠損に起因し、殆ど男性に発症し、その発病率は10,000人に1人〜2人である。X
染色体欠損は、自身は血友病患者でない女性保因者によって遺伝する。血友病Aの臨床症状は出血傾向の増加である。第VIII因子濃縮物による治療が導入される前、重篤な血友病患者の平均寿命は20歳に満たなかった。まず、血漿由来の第VIII因子の濃縮物を使用し、さらにその後第VIII因子の組換え型の濃縮物を使用することで、血友病患者の状況は相当に改善され、平均寿命も大幅に伸び、殆どの患者が、程度の差はあるものの、普通の生活を送ることが可能になった。血友病Bは、有病率は血友病Aの5分の1であり、第IX因子の欠損または機能低下によって引き起こされ、血漿由来の第IX因子濃縮物または第IX因子の組換え型で治療する。血友病Aと血友病Bのいずれにおいても、この疾患の治療における最も深刻な医学的問題は、補充された因子に対する同種抗体の発生である。血友病A患者全体の30%までに第VIII因子に対する抗体が生じる。第IX因子に対する抗体は、発生率はより低いが、免疫学的寛容導入療法に対する感受性が低下すればするほどより重篤な結果をもたらす。
不活性なチモーゲンとして、肝細胞によって血流中に分泌されている。FVIIは、このタ
ンパク質のN末端Glaドメインに局在するγ−カルボキシ−グルタミン酸残基10個(第6、7、14、16、19、20、25、26、29、および35番目)を含む。Gla残基を生合成するためには、ビタミンKが必要である。C末端側からGlaドメインに向かって、2個の表皮増殖因子ドメイン、続いてトリプシンタイプのセリンプロテアーゼドメインが局在する。FVIIの翻訳後修飾にはさらに、ヒドロキシル化(Asp63)、
ならびにN型糖鎖付加(Asn145とAsn322)およびO型糖鎖付加(Ser52とSer60)がある。
ことにより、その活性型第VIIa因子に変換され、その結果、2個のポリペプチド鎖、N
末端軽鎖(24kDa)とC末端重鎖(28kDa)が形成され、これらは1個のジスルフィド架橋により結合している。他のビタミンK依存性凝固因子とは対照的に、FVIIに
ついては、これらの他のビタミンK依存性凝固因子が活性化する間に切断される活性化ペプチドについて説明されていない。Arg152−Ile153切断部位および下流の数個のアミノ酸は、他のビタミンK依存性ポリペプチドの活性化切断部位に対する相同性を示す。
る切断後、Ile153とAsp343との間に塩架橋が形成されることである。第VII
因子の活性化による切断は、in vitroで、第Xa因子、第XIIa因子、第IXa因子、第VIIa因子、血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼ、およびトロンビンにより達成される。Mollerupら(Biotechnol. Bioeng. (1995)48: 501-505)は、一定量の切断が重鎖のArg290および/またはArg315でも生じると報告している。
することが期待されている。Ballanceらは、潜在能力のある融合パートナーの長いリストを提供し(これらのタンパク質のほとんどすべての実験データは示されていないが)、個々のアルブミン融合ポリペプチドが、実際に治療用タンパク質融合パートナーの生物活性を保持し、その特性も改良されているということを示している。さらに国際公開第01/79271号によれば、その治療用タンパク質のリストの各メンバーは、様々な配向にアルブミンと融合させることができる。例えば、ある治療用タンパク質の2個分子の片方を、アルブミンのN末端に、また一方をC末端に融合させる。または、ある治療用タンパク質の1個の分子を、アルブミンのN末端もしくはC末端に融合させる、あるいは、別のタンパク質の複数の領域を、他のタンパク質の複数の領域に融合させる、などである。潜在
能力を有するアルブミン融合パートナーとして、国際公開第01/79271号にリストされている多くの治療用タンパク質の中に、第IX因子およびFVII/FVIIaが含まれているが、これらのタンパク質のいずれについても、実験による原理の検証は行われていない。
合ポリペプチドを発現させ、ウサギの第IX因子アルブミン融合ポリペプチドのクリアランス挙動が、アルブミンよりも第IX因子にきわめて類似しており、終末相半減期が僅かに長くなる(2倍未満)のみであることを薬物動態学実験で示した(Sheffield WP et al. (2004 Br. J. Haematol. 126: 565-573)。
した有効半減期を示す、機能的なFVIIaアルブミン融合タンパク質を開発することであ
った。
漿に注入された後の、生物活性の半減期を意味する。好ましくは、血漿はヒト血漿である。
への融合とは対照的に、第VII/VIIa因子のヒト血清アルブミンN末端へのアルブミン融合の結果、第VII/VIIa因子融合タンパク質がもたらされ、それは第VII/VIIa因子の生物活性を保持するばかりでなく、第VII/VIIa因子のin vivoでの有効血漿半減期の有意
な延長を示すことが明らかとなった。
FVIIa部分がリンカーによってアルブミンから分離されているFVII/FVIIaアルブミ
ン融合ポリペプチドは、第VII/VIIa因子の生物活性がリンカーの長さに依存して増加することを見出した。第VII因子または第VIIa因子のペプチド部分を、ペプチドリンカーによってアルブミン部分と結合させると、融合分子は、コンフォメーションをとることができ、その結果、そのようなリンカー配列を有しない融合分子と比較して、モル特異的活性がより高くなるという効果がある。
/VIIa因子アルブミン融合ポリペプチドである。この生物活性は、例えば、そのような
リンカーを有しない第VII/VIIa因子融合タンパク質と比較したモル特異的活性として測定される。第VII/VIIa因子部分がペプチドリンカーによってアルブミンのN末端に融合した融合タンパク質のモル特異的活性の増加率は、そのようなリンカーを有しない対応する融合タンパク質と比較して、少なくとも25%、好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも100%である。また、このリンカーを有する第VII/VIIa因子アルブミン融合ポリペプチドは、野生型FVIIaと比較して、増加したin vivoでの有効半減期を示す。しかし、ほぼ同等の距離が第VII/VIIa因子部分とアルブミン部分とのに間に導入される限り、化学的リンカーまたはアビジン・ビオチン(これに限らず無限にあるが)のようなリンカーシステムも同様に機能すると思われる。以下、「リンカーペプチド」又は類似する用語は、このような他の機能的なリンカー手段を適宜含むものとする。
(a)哺乳動物細胞内で発現させることができる第VII/VIIa因子結合アルブミンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供すること、
(b)この生体内で前記核酸を発現させて第VII/VIIa因子結合アルブミンポリペプチドを生成させること、および
(c)この第VII/VIIa因子結合アルブミンポリペプチドを精製することを特徴とする。
結される核酸の翻訳により生成され、このリンカー配列が第VII/VIIa因子部分とアルブミン部分との間にリンカーペプチドを導入する)などにより互いに関係している、第VII
/VIIa因子の少なくとも1つの断片または変異体、およびヒト血清アルブミンの少なく
とも1つの断片または変異体を含有する。
物学的に活性なおよび/または治療的に活性な第VII/VIIa因子を含有する、またはこれからなる第VII/VIIa因子アルブミン融合ポリペプチドを提供する。
もしくは変異体のN末端に融合させた、ヒト第VII因子およびヒト第VIIa因子またはその断片もしくは変異体を提供することである。本発明のまた別の目的は、増加したモル特異的活性を有する、ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体のN末端に融合させたヒト第VII因子およびヒト第VIIa因子またはその断片もしくは変異体を提供することである。この目標を達成するため、場合により、FVII/FVIIaとアルブミンとの間に介在するペプチドリンカーを有する、第VII因子または第VIIa因子の血清アルブミンN末端への融合体を提供する。
書中に記載する第VII因子ポリペプチドの変異体であってよい。「変異体」という用語は
、保存性または非保存性の挿入、欠失、および置換を包含するが、この場合そのような変化が生じても、第VII因子ポリペプチドの治療活性を付与する活性部位(すなわち活性な
ドメイン)は実質的に変化しない。
ブミンの例としては、ニワトリおよびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本アルブミン結合ポリペプチドのアルブミン部分は、FVII/FVIIa部分が由来している動物とはまた別の動物由来でもよい。
期を有するように、あるいは、介在するペプチドリンカーを有するアルブミン融合FVII
/FVIIaのモル特異的活性が、介在するペプチドリンカーを有しないアルブミンに融合
FVII/FVIIaのモル特異的活性より高くなるように、結合させる。
くは活性化された形態(第VIIa因子)のどちらか、またはそれらの混合物からなる、治
療用ポリペプチドを意味する。上記の定義に含まれる「第VII/VIIa因子」としては、天然のヒト第VII/VIIa因子のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、これらのポリペプチドが実質的に第VIIa因子の生物活性を保持している限り、末端アミノ酸の欠失または付加な
ど、改変されたN末端またはC末端を有するポリペプチドも包含される。上記の定義に含まれる「VII因子」としては、個体ごとに存在し、発生する可能性がある天然の対立遺伝
子変異も挙げられる。上記の定義に含まれる「VII因子」としてはさらに、FVII/FVII
aの変異体も挙げられる。このような変異体は、野生型配列とは1またはそれ以上のアミノ酸残基が異なっている。このような差異の例としては、1またはそれ以上のアミノ酸残基(例えば1〜10個のアミノ酸残基)によるN末端および/またはC末端のトランケーション、または、N末端および/またはC末端での1またはそれ以上の余分な残基の付加のほか、保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を有するアミノ酸群、例えば(1)小さいアミノ酸、(2)酸性アミノ酸、(3)極性アミノ酸、(4)塩基性アミノ酸、(5)疎水性アミノ酸、および(6)芳香族アミノ酸の範囲内で行われる置換が挙げられる。このような保存的置換の例を、以下の表に示す。
/FVIIa断片もしくは変異体のモル特異的活性の、少なくとも25%超、好ましくは4
0%超、さらに好ましくは70%超、最も好ましくは90%超を示す。
本発明中で使用されるモル特異的活性とは、ELISAによって測定されるような、第VII/VIIa因子抗原の100国際単位(IU)毎のIUで表される、FVII結合アルブミン
融合タンパク質の活性化の後にSTACLOT(登録商標)アッセイにおいて測定される活性を意味する。
リペプチドの非結合形態と比較して、通常少なくとも100%、好ましくは少なくとも200%、より好ましくは少なくとも500%増加している。
間、好ましくは少なくとも約12時間、より好ましくは少なくとも約24時間である。
4時間、好ましくは少なくとも約6時間、より好ましくは少なくとも約12時間である。
に結合する。リンカーは好ましくは可撓性で、かつ非免疫原性である。リンカーを用いることにより、ヒトアルブミンとFVII/FVIIaとの間にある距離が生じるため、この2つの融合パートナーの潜在的干渉をできるだけ小さくすることができ、その結果、本融合タンパク質のFVII/FVIIa活性が増加する。典型的なリンカーとしては、(GGGGS)Nま
たは(GGGS)Nまたは(GGS)Nが挙げられ、ここでNは1以上の整数であり、Gはグリシンを、またSはセリンを表わす。これらのアミノ酸は天然のアミノ酸に属し、そして全ての天然のアミノ酸の例として選ばれた。
インC、エラスターゼ、またはカリクレインからなる群から選ばれる。これらのセリンプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列は、当業者には既知である(例えば、“Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice”, Fourth Edition, Colman et al. 2001 に記載の通り)。第IIa因子:p34〜35およびp176、第IXa因子:p40〜41、第Xa因子:p34〜35、第XIa因子:p128〜129、第XIIa因子:p194、aPC:p34〜35およびp159、カリクレイン:
p103〜104またはエラスターゼ(O'Reilly et al., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science 285: 1926-1928).
第VII/VIIa因子アルブミン融合ポリペプチドに関する。
た次のパラグラフでも説明する。
ク質と密接に関連している。これらは、N末端Glaドメイン、それ続いて2個の上皮増殖因子(EGF)ドメイン、それに続いてトリプシン様セリンプロテアーゼドメインからなる。
FVII 2〜4時間
プロテインC 6〜8時間
FIX 18〜30時間
FX 20〜42時間
ヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖DNAでもよいし、一本鎖または二本鎖RNAでもよい。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、1またはそれ以上の修飾塩基および/または通常ではない塩基(例えばイノシン)を含むDNAまたはRNAも含む。当業者に既知の多くの有用な目的に役立つ様々な改変をDNAおよびRNAに施してもよいことは理解されよう。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、このような化学的、酵素的、または代謝的に改変されたポリヌクレオチドの形態のほか、ウイルスおよび細胞(例えば単細胞および複雑型細胞など)に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。
この方法は、
−第VII/VIIa因子アルブミン融合ポリペプチドが発現されるような条件下で本発明の宿主細胞を培養し、さらに
−場合により、その培地から第VII/VIIa因子アルブミン融合ポリペプチドを回収することを含む。
適切な宿主細胞中で組換えタンパク質を大量生産するには、当業者に既知の方法に従い、上述の改変されたcDNAを、様々な発現系で増殖が可能な組換え発現ベクター中に、適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築する必要がある。効率的な転写調節因子は、動物細胞を天然の宿主とするウイルス、または動物細胞の染色体DNAから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくは、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導した、プロモーター−エンハンサーの組み合わせ、または、ベータ−アクチンもしくはGRP78のような動物細胞中で強く構成的に転写された遺伝子を含む、プロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることができる。安定な高レベルのcDNAからのmRNAの転写を達成するためには、転写単位は、その3'近位部分に、転写終
結のためのポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含む必要がある。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス40初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、また
は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から誘導される。
の形態の固体支持体、または、様々なセラミック材料である。細胞懸濁培養またはマイクロキャリアーで増殖させる場合、上記の細胞系培養は、バッチ培養として、または、長期間にわたり調整培地の連続的な供給を伴う潅流培養のどちらかとして行うことができる。したがって、本発明によれば、上記の細胞系は、所望の組換えタンパク質の生産のための工業的プロセスの開発にきわめて適している。
に感染性の物質や発熱性の物質を含まないことが好ましい。単離された、または、精製された本発明の第VII/VIIa因子結合アルブミンポリペプチドは、他のポリペプチドを実質的に含まないことが好ましい。
応、製剤、および投与方法などの多くの要因に左右され、個々の適応症の前臨床および臨床試験において決定する必要がある。
「二次止血の改善」、「感染症またはビタミンK欠乏症や重篤な肝臓病などの疾患に罹患中に生じた止血障害(hemostasis deficits)」、「肝臓切除術」、「蛇咬症の結果とし
て生じる止血障害(hemostasis deficits)」、「胃腸出血」。また好ましい適応症は「
外傷」、「大量輸血の結果(希釈性凝固障害)」、「FVIIIおよびFIX以外の凝固因子欠乏症」、「VWD」、「Fl欠乏症」、「FV欠乏症」、「FVII欠乏症」、「FX欠乏
症」、「FXIII欠乏症」、「HUS」、「血小板減少症のような遺伝性または後天性の血小板疾患および障害、ITP、TTP、HELLP症候群、ベルナール・スリエ症候群、グランツマン血小板無力症、HIT」、「チェディアック・東症候群」、「ヘルマンスキー・パドラック症候群」、「ランデュ・オスラー症候群」、「ヘノッホ・シェーンライン紫斑病」、および「創傷治癒」である。本方法は、有効量の本明細書中に記載されている第VII/VIIa因子結合アルブミンポリペプチドを、前記個体に投与することを含む。別の実施形態では、本方法はこの個体に、有効量の本発明のポリヌクレオチド、または本発明のプラスミドもしくはベクターを投与することを含む。あるいは、本方法は、この個体に有効量の本明細書中に記載されている本発明の宿主細胞を投与することを含んでもよい。
プライマーWe1303およびWe1304(配列番号1および2)を用いて、第VII
因子コード配列を、ヒト肝臓cDNAライブラリー(ProQuest、インビトロジェン)からPCRにより増幅した。プライマーWe1286およびWe1287(配列番号3および4)を用いた2回目のPCRの後、得られた断片をpCR4TOPO(インビトロジェン)にクローニングした。そこから、FVII cDNAを、すでに内部のXhoI
部位を削除したpIRESpuro3(BDバイオサイエンシーズ)のEcoRI部位に、EcoRI断片としてトランスファーした。得られたプラスミドをpFVII−659と命名した。
続いて、オリゴヌクレオチドWe1643およびWe1644(配列番号5および6)を用いて、標準プロトコール(QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キ
ット、ストラタジーン)による部位特異的突然変異誘発法により、XhoI制限部位を、pFVII−659の天然FVII停止コドン(図1)の部位に導入した。得られたプラスミドをpFVII−700と命名した。
他のリンカーを挿入した。そのために、プライマー対We2148およびWe2149(配列番号9および10)、We2148およびWe2150(配列番号9および11)、We2148およびWe2151(配列番号9および12)、We2152およびWe2153(配列番号13および14)、We2152およびWe2154(配列番号13および15)、We2152および2155(配列番号13および16)、ならびにWe2156およびWe2157(配列番号17および18)をそれぞれ、上述の通り、アニールし増幅した。それぞれのPCR断片は制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamH1で消化し、同酵素により消化したpFVII−733に挿入した。成熟ヒトアルブミンのcDNAを含むBamH1断片を、得られたプラスミドおよびpFVII−733のBamH1部位に挿入した。この断片は、標準条件下で、プライマーWe1862およびWe1902(配列番号19および20)を用いて、アルブミンcDNA配列に対してPCRを行い、作製しておいたものである。最終プラスミドを、それぞれpFVII−935、pFVII−936、pFVII−937、pFVII−938、pFVII−939、pFVII−940、pFVII−941、およびpFVII−834と命名した。それらのリンカー配列ならびにC末端FVIIおよびN末端アルブミン配列の概要を図2に示す。
そのために、突然変異誘発プライマーWe2247およびWe2248(配列番号23および24)、We2249およびWe2250(配列番号25および26)、We2251およびWe2252(配列番号27および28)、ならびにWe2253およびWe2254(配列番号29および30)を用いて、標準突然変異誘発プロトコール(QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キット、ストラタジーン)で用いて、プラスミドpFVII−1014、pFVII−1015、およびpFVII−1016、およびpFVII−1370をそれぞれ作製した。
2181およびWe2182(配列番号31および32)を用いて、上記の通り、プラスミドpFVII−935に対し欠失突然変異誘発を行った。得られたプラスミドをpFVII−974と命名した。
なるリンカーを作製した。そのため、突然変異誘発プライマーWe2432およびWe2433(配列番号33および34)、We2434およびWe2435(配列番号35および36)、ならびに We2436およびWe2437(配列番号37および38)を用いて、標準突然変異誘発プロトコール(QuickChange XL部位特異的突然変異誘発キット、ストラタジーン)により、プラスミドpFVII−1158、pFVII−1
159、およびpFVII−1160をそれぞれ作製した。
14(配列番号39および40)を、プラスミドpFVII−1370を元にWe2715
およびWe2716(配列番号41および42)を、プラスミドpFVII−1016を元
にWe2717およびWe2718(配列番号43および44)を、ならびにプラスミドpFVII−935を元にWe2756およびWe2757(配列番号45および46)を
用いて、プラスミドpFVII−1361、pFVII−1362、pFVII−1363、およ
びpFVII−1382をそれぞれ作製した。
リンカー配列、ならびに上述の各プラスミドのC末端FVIIおよびN末端アルブミン配
列の概要を図2に示す。
プラスミドを大腸菌TOP10(インビトロジェン)中で増殖させ、標準的なプロトコール(キアゲン)で精製した。HEK293細胞をリポフェクトアミン2000試薬(インビトロジェン)を用いてトランスフェクトし、無血清培地(インビトロジェン293 Express)中で、50ng/mlビタミンK、および4μg/mlビューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクトした細胞集団をT−フラスコを介してローラーボトルに拡散させ、そこから精製のために上清を回収した。
FVIIまたはFVIIアルブミン融合ポリペプチドを含む細胞培養回収物を、20mM Hepes(pH7.4)バッファーで平衡化した2.06mLのQ−セファロースFFカラムに適用した。続いて、カラムを10倍量の指定されたHepesバッファーで洗浄した。結合したFVII分子を、20カラム容積以内の20のmM Hepesバッファー中で
、塩化ナトリウム濃度0〜1.0Mまで直線濃度勾配により溶出させた。溶出液には、適
用したFVII抗原の約85〜90%が、タンパク濃度0.5〜1g/Lで含まれていた。
別の方法として、FVIIを、欧州特許出願公開第0770625B1号に記載されてい
るように、固定した組織因子を用い、クロマトグラフィーにより精製した。
実施例4に記載の通りに、FVII抗原および活性を測定した。
FVII活性を、 Seligsohn et al. Blood (1978) 52: 978-988に記載されている方法に
基づき、標準ヒト血清(デイド・ベーリング)を標準として、市販の比色試験キット(Chromogenix Coaset FVII)を用い測定した。
FVIIa活性は、Morissey et al. (1993) Blood 81: 734-744に記載された方法に基づ
いて、市販の試験キット(STACLOT(登録商標))VIIa−rTF(ダイアグノテ
ィカ・スターゴ)を用い測定した。
FVII抗原を、当業者に性能が既知のELISAによって測定した。簡潔に述べると、
マイクロプレートを、ウェルあたり120μLの捕捉抗体(ヒツジ抗ヒトFVII IgG
、セダレーンCL20030AP、バッファーA(シグマC3041)で1000倍に希釈)と共に、周囲温度で一晩インキュベートした。プレートをバッファーB(シグマP3563)で3回洗浄した後、各ウェルを、バッファーC(シグマP3688)200μLと共に、周囲温度で1時間インキュベートした。バッファーBでさらに3回洗浄工程を行った後、試験サンプルのバッファーBでの連続希釈液、および、標準ヒト血漿(デイド・ベーリング;50〜0.5mU/mL)のバッファーB(ウェルあたりの共に:100μL)での連続希釈液を、周囲温度で2時間インキュベートした。バッファーBでの3回の洗浄工程の後、検出抗体(ヒツジ抗ヒトFVII IgG,セダレーンCL20030K,ペルオキシダーゼ標識)のバッファーBでの5000倍希釈液100μLを各ウェルに添
加し、周囲温度でさらに2時間インキュベートした。バッファーBでの3回の洗浄工程の後、基質溶液(TMB,デイド・ベーリング,OUVF)をウェルあたり100μLで添加し、暗所で周囲温度で30分間インキュベートした。希釈していない停止溶液(デイド・ベーリング,OSFA)100μLを添加して、適切なマイクロプレートリーダーで波長450nmで読み取るためのサンプルを製造した。次に、参照として標準ヒト血漿を用いた標準曲線を用いて、試験サンプルの濃度を計算した。
実施例3に記載の通りに精製したFVIIポリペプチドを、20mM HEPES、15
0mM NaCl、1mM クエン酸ナトリウム、1g/l カプリル酸ナトリウム pH8.5から成るバッファーに対して透析した。このバッファー環境内でFVIIをFXa(市販の調合物、100IU/mL、ERL)、リン脂質(Phosphorlipon 25P、1g/l、ローヌ・プーランク−ナターマン、ケルン)、およびCa++(塩化カルシウムをAqua destに溶解させたもの、1M)と共に、37℃で様々な時間間隔でインキュベートすることにより、FVIIaに活性化した。比色アッセイによって測定した最終濃度は、約30〜65IU/mL FVIIであった。よって、FVIIに対して0.5%FXa、すなわち1IU FXa、200IU FVII、0.02g/lリン脂質、5mM CaCl2であった。
活性化は、20mM HEPES、150mM NaCl、200mM クエン酸ナトリウム、1g/lカプリル酸ナトリウム pH5.0からなる10%(v/v)のバッフ
ァーを添加することにより終了させた。
簡潔に述べると、サンプルを還元してSDS−PAGE(8〜16%グラジエント、ポリアクリルアミド、Novex(登録商標)トリス・グリシン・ゲル、インビトロジェン;メーカーの使用説明書に従う)に供し、クマシーブルーG−250で染色した。得られたバンドをスキャンし(Versa DOC(登録商標)、バイオラッド)、相対的タンパク質濃度を、Image Quantソフトウェア(V4.20(アマシャム))を用いて計算した。
上述のように、リンカーの長さが0〜31アミノ酸のFVIIアルブミン融合タンパク質
を活性化し、FVIIa活性をSTACLOT(登録商標)アッセイにより測定した。融合
ポリペプチドは、リンカーの長さにかかわらず、同程度のFXa切断を示したが、活性アッセイにより測定したアルブミン融合タンパク質のFVIIa活性は、驚くべき結果を示した。すなわち、FVIIとアルブミン部分間のリンカーが長くなるほど、測定されたモル特異的FVIIa活性は高くなり(図3および表5)、リンカーを有しない構築物(974)は、19以上のアミノ酸長からなるアミノ酸構築物と比較して、FVIIa活性が半分未満になることが示された。1アミノ酸増加しただけのリンカー(pFVII−1158)でさえ、リンカーを有しない融合タンパク質(pFVII−974)と比較して、融合タンパク質のモル特異的活性が31%増加した。このことは、FVIIとアルブミン配列とを直接融合させると、アルブミン部分が、そのFVIIa部分の立体配座またはその基質とのその相互作用のいずれかに干渉する立体配座の立場に導く可能性があることを強く示唆している。この干渉は、第VII/VIIa因子とアルブミンとの間に介在するペプチドリンカーを導入した構築物では、有意に減少すると考えられる。
Claims (24)
- アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合させた、少なくとも1つの第VII因子
もしくは第VIIa因子ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含有し、少なくとも
1つのそのような第VII因子もしくは第VIIa因子ポリペプチドが該融合タンパク質のN末端側に位置し、該融合タンパク質が第VII/VIIa因子の生物活性を有し、そしてペプチドリンカーが、アルブミン部分から第VII因子または第VIIa因子部分を該融合タンパク質のN末端側で分離し、該ペプチドリンカーが、少なくとも7個のアミノ酸を含む、
アルブミン融合ポリペプチド。 - 融合タンパク質が、融合していない野生型第VII因子もしくは第VIIa因子のそれぞれと比較して、少なくとも25%のモル特異的第VII/VIIa因子生物活性を有する、請求項1に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- 融合タンパク質が、融合していない第VII因子または第VIIa因子と比較して、増加したin vivoでの有効血漿半減期を有する、請求項1または2に記載の、第VII因子または第VIIa因子ポリペプチドを含有するアルブミン融合ポリペプチド。
- 融合タンパク質が、融合していない第VII因子または第VIIa因子と比較して、少なくとも100%増加したin vivoでの有効半減期を有する、請求項3に記載の、第VII因子または第VIIa因子ポリペプチドを含有するアルブミン融合ポリペプチド。
- リンカーがプロテアーゼ切断部位を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- 切断部位が、第IIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、第XIIa因子、活性
化プロテインC、エラスターゼおよびカリクレインからなる群から選択される凝固プロテアーゼによって切断されることが可能である、請求項5に記載のアルブミン融合ポリペプチド。 - リンカーが、翻訳後修飾部位の挿入によって改変される、請求項5または6に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- 翻訳後修飾が、Asn−X−Ser/Thr構造の1個またはそれ以上のN型糖鎖付加部位を含み、Xが、プロリン以外の任意のアミノ酸を表す、請求項7に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- ペプチドリンカーが配列番号47〜55を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- ペプチドリンカーが、少なくとも25個のアミノ酸を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- アルブミン融合ポリペプチドが改変され、該改変が、異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドの少なくとも一部を挿入により付加すること、または、該異なるビタミンK依存性ポリペプチドの活性化ペプチドのアナログを挿入により付加することを含むように行われる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- 第VII因子または第VIIa因子ポリペプチド部分が凝固促進活性を有する、請求項1〜1
1のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。 - 薬剤として使用される、請求項1〜12のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド。
- 薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、請求項1〜12のいずれか1項に記載の、有効量のアルブミン融合ポリペプチドを含む、医薬組成物。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、該ポリヌクレオチド配列が、第VII/VIIa因子融合部分のγ−カルボキシル化を仲介するプロペプチドをコードするヌクレオチド配列の3'末端に位置
する、核酸分子。 - 請求項15に記載の核酸分子を含む、プラスミドまたはベクター。
- 発現ベクターである、請求項16に記載のプラスミドまたはベクター。
- ヒト遺伝子治療で使用される遺伝子導入ベクターである、請求項17に記載のベクター。
- 請求項15に記載の核酸分子または請求項16〜18のいずれか1項に記載のプラスミドもしくはベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチドを製造する方法であって、
a.生体内で発現させることができるアルブミン融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供すること、
b.上記生体内で、上記核酸を発現させてアルブミン融合ポリペプチドを形成させること、および、
c.上記アルブミン融合ポリペプチドを精製すること
を含む上記方法。 - 請求項16〜18のいずれか1項に記載のプラスミドまたはベクターを含有する、医薬組成物。
- 血液凝固障害の治療用または予防用薬剤を製造するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド、請求項15に記載の核酸分子、請求項16〜18のいずれか1項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項19に記載の宿主細胞の使用。
- 以下の適応症:血友病A、血友病B、外科手術に関係する出血エピソード、血液凝固障害をもたらす肝障害、「凝固因子(FVIIIまたはFIX)のインヒビターによる、遺伝性または後天性血友病患者の出血エピソードおよび外科手術」、「抗血小板医薬品または抗凝固医薬品などの薬物療法の結果として発生した止血障害の回復」、「二次止血の改善」、「感染症またはビタミンK欠乏症もしくは重篤な肝臓病などの疾患に罹患中に生じた止血障害」、「肝臓切除術」、「蛇咬症の結果として生じる止血障害」、「胃腸出血」、「外傷」、「大量輸血の結果(希釈性凝固障害)」、「FVIIIおよびFIX以外の凝固因子欠乏症」、「VWD」、「Fl欠乏症」、「FV欠乏症」、「FVII欠乏症」、「FX欠乏症
」、「FXIII欠乏症」、「HUS」、「血小板減少症のような遺伝性または後天性の血小板疾患および障害、ITP、TTP、HELLP症候群、ベルナール・スリエ症候群、グ
ランツマン血小板無力症、「HIT」、「チェディアック・東症候群」、「ヘルマンスキー・パドラック症候群」、「ランデュ・オスラー症候群」、「ヘノッホ・シェーンライン紫斑病」、および「創傷治癒」;
のうち、1つまたはそれ以上を治療するための薬剤を製造するための、請求項1〜12のいずれか1項に記載のアルブミン融合ポリペプチド、請求項15に記載の核酸分子、請求項16〜18のいずれか1項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項19に記載の宿主細胞、の使用。 - 治療が、ヒト遺伝子治療を含む、請求項22または23に記載の使用。
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