JP2024504822A - 出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法 - Google Patents

出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2024504822A
JP2024504822A JP2023546211A JP2023546211A JP2024504822A JP 2024504822 A JP2024504822 A JP 2024504822A JP 2023546211 A JP2023546211 A JP 2023546211A JP 2023546211 A JP2023546211 A JP 2023546211A JP 2024504822 A JP2024504822 A JP 2024504822A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
csf
subject
cell
free
amount
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023546211A
Other languages
English (en)
Inventor
ケヴィン・アカレット
トーマス・ジェンティネッタ
ラファエル・ブッツィ
ミヒャエル・ヒューゲルソファー
ドミニク・シャー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CSL Behring AG
Original Assignee
ZLB Bioplasma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZLB Bioplasma AG filed Critical ZLB Bioplasma AG
Publication of JP2024504822A publication Critical patent/JP2024504822A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本開示は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、ヘモペキシン（Ｈｘ）が無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｘに曝露する工程、および場合により、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む方法と一般的に関連する。

Description

本発明は、脳脊髄液（ＣＳＦ）コンパートメント中への出血性脳卒中後、特にクモ膜下出血（ＳＡＨ）後の対象における、有害な二次神経学的転帰を処置および／または予防するための方法および組成物と一般的に関連する。
本明細書で引用されたすべての参照は、あらゆる特許または特許出願を含め、本発明の完全なる理解を可能にするために、参照によって本明細書により組み入れる。それにもかかわらず、そのような参照は、それらの文書のいずれかが、オーストラリアまたは任意のその他の国において、当技術分野における共通一般的知識の一部を形成する、という承認を構成するものと読み取られるものではない。
出血性脳卒中は、周辺組織中への出血を伴う、脳内またはその表面における血管の破裂と関係する。出血性脳卒中の例として、ｉ）脳内血管の破裂と関係する脳内出血（本明細書ではＩＣＨと呼ばれる）；ｉｉ）脳室系中への出血である脳室内出血（本明細書ではＩＶＨと呼ばれる）；およびｉｉｉ）脳と脳を覆う組織との間の腔（クモ膜下腔として知られている）における出血と関係するクモ膜下出血（本明細書ではＳＡＨと呼ばれる）が挙げられる。最も高頻度のＳＡＨは、動脈瘤破裂（本明細書ではａＳＡＨと呼ばれる）により引き起こされる。ＳＡＨのその他の原因として、頭部傷害、出血障害、および血液希釈剤の使用が挙げられる。
動脈瘤性クモ膜下出血（ａＳＡＨ）は、ＳＡＨの最も一般的な原因であり、また最高死亡率および長期神経学的身体障害と関連している。動脈瘤修復および神経集中医療における進歩にもかかわらず、欧州における院内致死率中央値は、４４．４％であり、また米国では３２．２％である。生存者の３５％が、出血イベントから１年後に、全体的な生活の質の不良を報告しており、８３～９４％が仕事に復帰することができない。米国内の頭蓋内動脈瘤破裂に起因するａＳＡＨの推定発生率は、１０，０００人当たり１症例であり、毎年およそ２７，０００件の新規症例が生ずる。
さらに、ａＳＡＨは、男性よりも女性において一般的である（２：１）；発生率のピークは５５～６０歳である。
最初の７２時間以内の初期脳損傷（Ｓｅｈｂａら、２０１２年）に加え、ａＳＡＨ後の患者転帰は、動脈瘤破裂の後の４～１０日目の間に生ずる遅発性二次脳損傷により決定される（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、２０１４年）。遅発性二次脳損傷は、脳の大血管および微小血管機能障害、神経炎、ニューロンアポトーシス、および病理学的電気活動度が関係する多因子性と考えられる（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ、２０１４）。ａＳＡＨ後の患者の３分の２が大脳動脈の血管造影血管攣縮（ａＶＳＰ）を発症する（ＤｏｒｓｃｈおよびＫｉｎｇ、１９９４年）。虚血性脳領域の放射線学的境界を有する遅発性脳虚血（ＤＣＩ）および臨床的に明白な遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）が患者の３分の１において見出されている（Ｒｏｗｌａｎｄら、２０１２年）。これら二次的症状のうちの少なくとも１つが発生すれば、クモ膜下出血に関連する二次脳損傷（ＳＡＨ－ＳＢＩ）と定義される。
動脈瘤破裂とＳＡＨ－ＳＢＩの発現との間のラグタイムは、予防的および治療的介入のための絶好の機会を提供し、ＳＡＨ－ＳＢＩに対して高リスクに晒されている患者、ならびに新規薬物標的を特定するための未だ対処されていない必要性を定義する。これまで、ａＳＡＨ後の神経学的転帰を中程度に改善することが明らかにされている唯一の予防介入は、経口ニモジピンである（クラスＩ、レベルＡ）（Ｄｉｒｉｎｇｅｒら、２０１１年；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、２０１２年）。症候性の患者において、治療オプションは、現在のところ全身的動脈高血圧の誘発によるレスキュー療法、また選択された患者においては、ａＶＳＰを消散させるための機械的または化学的血管形成術に限定される（Ｄｉｒｉｎｇｅｒら、２０１１年；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、２０１２年）。したがって、ａＳＡＨ後の患者を対象とした、ＳＡＨ－ＳＢＩを処置および／または予防するための特別な療法に対する緊急かつ未だ対処されていない必要性が存在する。
多大な研究努力にもかかわらず、ＳＡＨ－ＳＢＩを信頼性をもってモニタリングするための臨床的に確立されたバイオマーカーはなおも存在しない。幅広く使用されているものの、臨床スコア（ＨｕｎｔおよびＨｅｓｓ、１９６８年；Ｔｅａｓｄａｌｅら、１９８８年）、放射線学スコア（Ｆｉｓｈｅｒら、１９８０年；Ｆｒｏｎｔｅｒａら、２００６年；Ｗｉｌｓｏｎら、２０１２年）、および経頭蓋ドップラー超音波検査法（ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｄｏｐｐｌｅｒ ｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ；ＴＣＤ）による日常アセスメント（Ｄｉｒｉｎｇｅｒら、２０１１；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、２０１２）は、リスクに晒されている患者の検出において限定された正確性しか示さない（ｄｅ Ｒｏｏｉｊら、２０１３年）。
無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）は患者ＣＳＦ内に蓄積し、そしてＳＡＨ－ＳＢＩの上流に位置する駆動因子とみなされてきた（Ｐｌｕｔａら、２００９年；Ｈｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒら、２０１９年；Ｂｕｅｈｌｅｒら、２０２０年）。患者１８例を対象とする、毎日のＣＳＦ分光光度測定を用いた小規模パイロット試験から得られたデータより、動脈瘤破裂後に２週間にわたり、高度に累積したＣＳＦ－Ｈｂに曝露された患者では、ＳＡＨ－ＳＢＩ発症に対するリスクが増加し得ることが示唆された（Ｈｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒら、２０１８年）。しかしながら、これまでのところ、患者ＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの濃度（ＣＳＦ－Ｈｂ）とクモ膜下出血に関連する二次脳損傷（ＳＡＨ－ＳＢＩ）の発生との間の相関関係は臨床的に実証されていない。特に、ＳＡＨ－ＳＢＩの関連するバイオマーカーとして使用し得る臨床的に重要なＣＳＦ－Ｈｂ濃度は不明である。
全体として、ＳＡＨ－ＳＢＩを予測およびモニターするための診断ツール、ならびにＳＡＨ－ＳＢＩを予防および処置するための標的を定めた治療アプローチに対する喫緊の臨床的必要性が存在する。
本発明者らは、ａＳＡＨを有する患者コホートを対象にプロスペクティブ試験を行い、そしてこの患者のＣＳＦ内無細胞Ｈｂ（ＣＳＦ－Ｈｂ）の濃度とクモ膜下出血（ＳＡＨ－ＳＢＩ）に関連する二次脳損傷の発生との間に有意な相関性を思いがけず見出した。ＣＳＦ－ＨｂとＳＡＨ－ＳＢＩとの相関性の診断正確性が、臨床的に重要なＣＳＦ－Ｈｂ濃度の狭い範囲内において特定され、そしてそれはａＳＡＨのその他の生理学的および生化学的バイオマーカー、ならびに放射線学スコアおよび臨床スコアを顕著に凌駕することが判明した。注目すべきことに、ＳＡＨ－ＳＢＩの３つの症状；すなわち大脳動脈の血管造影血管攣縮（ａＶＳＰ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、および遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）のすべてについて、ＣＳＦ－ＨｂとＳＡＨ－ＳＢＩの発生率との間に有意な相関性が観察された。本発明者らは、詳細なＣＳＦプロテオミクス分析、ならびにＣＳＦ－Ｈｂを病態生理学的駆動因子および治療標的として特定するｅｘ ｖｉｖｏ機能的アッセイも行った。
本発明者らは、ヘモペキシン（Ｈｘ）は、機能的および放射線学的神経学的障害を含む、無細胞ヘム媒介式の有害な二次神経学的転帰（例えば、酸化性組織傷害、神経炎）を低下させ、さもなければ防止することができることも、驚くべきことに見出した。ＣＳＦ－Ｈｂが本明細書において特定された臨床的に重要な濃度範囲内にあるとき、Ｈｘは患者ＣＳＦ－Ｈｂの脂質酸化活性を選択的に中和する能力を有することが判明した。本発明者らは、ハプトグロビン（Ｈｐ）は、本明細書において特定された臨床的に重要なＣＳＦ－Ｈｂ濃度範囲内で、その抗血管攣縮効果および抗酸化効果を発揮することをさらに驚くべきことに見出した。それに加えて、本発明者らは、ハプトグロビン（Ｈｐ）およびヘモペキシン（Ｈｘ）は、その保護的機能を相乗的に発揮し得ることをさらに驚くべきことに見出した。
したがって、本発明の１つの態様では、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、ヘモペキシン（Ｈｘ）が無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｘに曝露する工程を含む方法が提供される。一実施形態では、方法は、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程をさらに含む。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬組成物であって、治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、組成物は治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）をさらに含む。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、組成物は治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）をさらに含む。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬を製造する際の、治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）の使用が提供される。一実施形態では、治療有効量のＨｘは、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）と併用投与するために製剤化される。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載する方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）が提供される。一実施形態では、治療有効量のＨｘは、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）と併用投与するために製剤化される。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載されるように、Ｈｘ、および場合によりＨｐを含む人工ＣＳＦが提供される。本開示は、本明細書に記載されるような人工ＣＳＦまたは組成物を含むキットにも拡張される。
本明細書で開示される別の態様では、対象は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するかどうか判定する方法であって、（ｉ）出血脳卒中後の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクは、工程（ｉｉｉ）における比較に基づき決定される方法が提供される。
いくつかの実施形態では、方法は、有害な二次神経学的転帰のリスクを有するものと判定された対象を処置する工程であって、前記処置が、対象のＣＳＦを、（ｉ）本明細書に記載されるように、ヘモペキシン（Ｈｘ）が無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、治療有効量のＨｘに曝露すること；および／または（ｉｉ）本明細書に記載されるように、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）に曝露することを含む工程をさらに含む。したがって、本明細書で開示される別の態様では、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰の処置に対して対象を階層化する方法であって、（ａ）本明細書に記載されるように、対象が有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するかどうか判定する工程、および（ｂ）本明細書に記載される方法に基づき、有害な二次神経学的転帰のリスクを有するものと判定された対象を処置する工程を含む方法が提供される。
動脈瘤性クモ膜下出血後の脳脊髄液プロテオームの変化を示す図である；Ａ．脳脊髄液（ＣＳＦ）オキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ）、ビリルビン、ビリベルジン、およびメトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の時間的プロファイル。Ａ．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる、ａＳＡＨ後のＣＳＦにおいて同定されたタンパク質のｋ平均クラスタリング。Ｂ．全体的な倍率変化およびＣＳＦプロテオームにおける組合せｐ値を含むＶｏｌｃａｎｏプロット。色はクラスターを表し、そしてドットのサイズはタンパク質の生の平均強度を表す（非標準化）。Ｃ．ａＳＡＨ後のＣＳＦプロテオームのＧＳＥＡにおいて特定された負に富化されたトップホールマーク遺伝子セット（凝固）の富化プロット。Ｄ．ａＳＡＨ後のＣＳＦにおけるハプトグロビン（ＨＰ）、ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、およびアルブミン（ＡＬＢ）の標準化されたタンパク質強度の時間的経過。Ｅ．ａＳＡＨ後のＣＳＦプロテオームのＧＳＥＡにおいて特定された正に富化されたトップホールマーク遺伝子セット（解糖）の富化プロット。Ｆ．ａＳＡＨの後のＣＳＦプロテオームのＧＳＥＡにおいて特定されたホールマーク遺伝子セット（ヘム代謝）の富化プロット。Ｇ．ＣＳＦ内カルボアンヒドラーゼ１（ＣＡ１）、カルボアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびアルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）の標準化されたタンパク質強度の時間的経過。Ｈ．ＣＳＦにおけるＣＤ１６３、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、ＣＤ１４、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ）の標準化されたタンパク質強度の時間的経過。 図１－１の続き。 図１－２の続き。 図１－３の続き。 図１－４の続き。 図１－５の続き。 ＣＳＦ－Ｈｂの決定因子を示す図である。Ａ．３Ｄ表現のクモ膜下血腫の例。Ｂ．一般加法モデル基づく、動脈瘤サイズ、動脈瘤の場所、血腫容積、脳室内出血（ＩＶＨ）の存在、およびａＳＡＨ後の日数に対するＣＳＦ Ｈｂレベルの部分的依存性。Ｃ．ＩＶＨの存在について階層化されたａＳＡＨ後のＣＳＦヘモグロビンの時間的経過。Ｄ．ＩＶＨが存在しない状況（青色の挿入図）または存在する状況（赤色の挿入図）を比較しながら、前交通動脈の動脈瘤の破裂に由来するクモ膜下出血を示す概略図。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図２－３の続き。 図２－４の続き。 脳脊髄液ヘモグロビンと動脈瘤性クモ膜下出血後の二次的脳障害との関連性を示す図である；Ａ．血管造影血管攣縮（ａＶＳＰ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、および複合転帰である１日当たりの二次脳損傷（ＳＡＨ－ＳＢＩ））により階層化された動脈瘤性クモ膜下出血後の患者における脳脊髄液ヘモグロビン（Ｈｂ）。Ｂ．一般加法モデルに基づく、ＣＳＦ－Ｈｂ（対数スケール）およびａＳＡＨ後の日数に対するＳＡＨ－ＳＢＩの部分的依存性。Ｃ．ＤＩＮＤ、ＤＣＩ、およびａＶＳＰが存在する場合のＨｂの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）（左側）。ＳＡＨ－ＳＢＩの発生について各値を含むＨｂのＲＯＣ曲線。Ｄ．３ヶ月フォローアップ時点におけるＧＯＳＥにより階層化されたＣＳＦ Ｈｂの時間的経過（良好／不良）。 図３－１の続き。 図３－２の続き。 図３－３の続き。 ヘモグロビンの血管収縮能力および酸化能力を示す図である；Ａ．ヘモグロビン（Ｈｂ）に対する血管張力用量応答性。Ｂ．患者において測定された経頭蓋ドップラー（ＴＣＤ）速度（最大ＴＣＤでスケール化）はＣＳＦ Ｈｂレベルと相関関係を有した。ａＶＳＰの存在はカラーオーバーレイとして示す。Ｃ．ＴＢＡＲＳアッセイにおいてＨｂの異なる濃度に応答して生じたマロンジアルデヒドの形成。Ｄ．二次脳損傷（ＳＢＩ）の発生に対するＣＳＦ内Ｈｂ測定濃度の相関性。 血管性および酸化性Ｈｂ効果に対するハプトグロビンの保護効果を示す図である；Ａ．Ｈｐアフィニティーカラムを使用したＣＳＦのＨｂ枯渇。Ｂ．Ｈｂ枯渇ＣＳＦおよびＨｂ含有ＣＳＦ中に浸漬した血管から得られた血管張力。Ｃ．ハプトグロビン（Ｈｐ）有り（図４Ａのデータ）またはＨｂ無しに対する用量応答性。Ｄ．チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイ法を用いてマロンジアルデヒドにより評価した、Ｈｐまたはヘモペキシン（Ｈｐｘ）添加有り／無しの場合の、ａＳＡＨ後患者ＣＳＦの酸化能力の時間的経過。 動脈瘤性クモ膜下出血後の脳脊髄液ヘモグロビンおよびヘム代謝物の病態生理学を示す図である；Ａ．動脈瘤性クモ膜下出血後のクモ膜下微環境における病態生理プロセスの概略図。赤血球貪食ならびにヘモグロビン変性およびヘム代謝の連続した細胞内プロセスを下部に示す。ビリベルジンレダクターゼおよび赤血球貪食の飽和を赤色のバーで示す。クモ膜下ＣＳＦ腔内での溶血を概略図上部に示す。放出されたオキシヘモグロビンがメトヘモグロビンに酸化された後、ヘムが放出される。Ｂ．経時的なＨｂ、ビリルビン、ビリベルジン、およびｍｅｔＨｂのＣＳＦ濃度。ビリベルジンレダクターゼおよび貪食が飽和した推定時刻を縦方向のバーで示す。 図７Ａは臨床観察試験のフロー図を示す図である。図７Ｂは、ＥＶＤによる毎日のＣＳＦサンプリング、ＣＳＦの遠心分離、ならびに光学分光法およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用する上清のプロテオーム分析の概略図を示す図である。図７Ｃは容量分析のためのクモ膜下出血セグメンテーションの各工程を示す図である。図７Ｄはタンパク質クラスターの最適数を決定するためのエルボープロットを示す図である。図７Ｅは神経血管機能実験装置の概略図を示す図である。図７Ｆは、記録された血管張力を各血管の個々のＮＯ予備容量に対して標準化する方法を示す図である。図７Ｇは、ＴＢＡＲＳアッセイ法における各工程の概略図を示す図である。 図７－１の続き。 図７－２の続き。 図７－３の続き。 図７－４の続き。 ＣＳＦ－Ｈｂおよびヘム代謝物の個々のプロファイルを示す図である；Ａ．オキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ）の個々の時間的プロファイル。Ｂ．ビリルビンの個々の時間的プロファイル。Ｃ．ビリベルジンの個々の時間的プロファイル。Ｄ．メトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）の個々の時間的プロファイル。 図８－１の続き。 血管造影血管攣縮（ａＶＳＰ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、および遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）により階層化されたオキシヘモグロビンの時間的プロファイルを示す図である；Ａ．ａＶＳＰにより階層化されたオキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ）の時間的経過。Ｂ．ＤＣＩにより階層化されたｏｘｙＨｂの時間的経過。Ｃ．ＤＩＮＤにより階層化されたｏｘｙＨｂの時間的経過。 脳脊髄液ヘモグロビン、臨床スコアおよび放射線学スコアと動脈瘤性クモ膜下出血後の二次脳損傷との関連性を示す図である；Ａ～Ｃ．各値を含む、血管造影血管攣縮（ａＶＳＰ、Ａ）、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ、Ｂ）、および遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ、Ｃ）の発生に関するＣＳＦ－Ｈｂの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）。最適なＹｏｕｄｅｎ－Ｉｎｄｅｘおよびその９５％信頼区間を赤色で示す。Ｄ．高リスク期間（４～１４日目）に限定されたデータを含む、ａＶＳＰ、ＤＣＩ、ＤＩＮＤ、およびＳＡＨ－ＳＢＩの発生に関するＣＳＦ－ＨｂのＲＯＣ曲線およびＡＵＣ。Ｅ～Ｇ．ａＶＳＰ、ＤＣＩ、ＤＩＮＤ、およびＳＡＨ－ＳＢＩの発生に関する、ＣＳＦ－ビリルビン（Ｅ）、ＣＳＦ－ビリベルジン（Ｆ）、およびＣＳＦ－メトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ）（Ｇ）のＲＯＣ曲線およびＡＵＣ。Ｈ～Ｋ．ａＶＳＰ、ＤＣＩ、ＤＩＮＤ、およびＳＡＨ－ＳＢＩの発生に関する、ＷＦＮＳ（Ｈ）、ＨｕｎｔおよびＨｅｓｓ（Ｉ）、ＢＮＩ（Ｊ）、およびＦｉｓｈｅｒ（Ｋ）グレードのＲＯＣ曲線およびＡＵＣ。Ｌ．３ヶ月フォローアップ時点における修正ランキンスケール（ｍＲＳ）によりＣ階層化されたＣＳＦ－Ｈｂの時間的経過（良好／不良）。 図１０－１の続き。 図１０－２の続き。 図１０－３の続き。 患者ＣＳＦサンプル中のヘモグロビンおよびヘムスカベンジャータンパク質の定量を示す図である。上段パネルは、左から右の順で、週単位で表す各収集時点において得られた患者ＣＳＦ内の無細胞Ｈｂ、ハプトグロビン、ヘモペキシン、およびアルブミンの定量を、健常対照者サンプル（ｃｔｒｌ）と比較して示す。下段パネルは、左から右の順で、ヘモグロビンと複合体化した（Ｈｂ：Ｈｐ複合体）、またはヘムと複合体化した（ヘム：ヘモペキシンまたはヘム結合タンパク質；ヘムタンパク質）スカベンジャータンパク質を示す。データを、個々のデータポイントを含む（重ねてプロット）、平均値±最小値～最大値を表す箱ひげ図として示す。破線は対応するアッセイ法の定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。 図１１－１の続き。 図１１－２の続き。 ハプトグロビン、ヘム、またはヘム：ヘモペキシンの線条体内注射から２４時間後の神経学的機能を示す図である。ハプトグロビン（５ｍＭのＨｐ、タンパク質コントロール）（黒色）、１ｍＭのヘム（暗灰色）、または１ｍＭのヘム：１Ｈｘ（明灰色）それぞれ１０μＬを注射した後のオープンフィールドテスト（Ａ）、ロータロッドテスト（Ｂ）、およびビーム歩行テスト（Ｃ）のスコアリング（１群当たりｎ＝６）。ヘム：Ｈｘではなくヘムを注射した後のマウスは、２４時間後に神経行動学的機能障害を示す。 図１２－１の続き。 図１２－２の続き。 ヘムまたはヘム：ヘモペキシンの線条体内注射から２４時間後の放射線学的変化を示す図である。ヘム（Ａ）またはヘム：Ｈｐｘ（Ｂ）をそれぞれ線条体内注射してから２４時間後に認められた放射線学的変化に関する例証的事例。ヘムの注射後に、Ｔ２強調シーケンスにおいて（左）病変周囲の浮腫が指摘されるが、これにはＡＤＣマップ（中央）における拡散制限、および動脈スピンラベル標識（ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｐｉｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ；ＡＳＬ）画像上の限局性潅流障害（右）が随伴する。ヘム：Ｈｐｘを注射した後には、軽微な放射線学的変化のみが、３つすべてのシーケンスにおいて認められる。 ヘムまたはヘム：ヘモペキシンの線条体内注射から２４、４８、および７２時間後の浮腫サイズおよび潅流の定量を示す図である。（Ａ）ヘム（黒色）およびヘム：Ｈｐｘ（暗灰色）それぞれを注射してから２４、４８、および７２時間後のＴ２強調画像上での浮腫サイズの半自動化された定量。ｎｓ：ｐ＞０．０５；＊：ｐ≦０．０５、＊＊：ｐ≦０．０１；＊＊＊：ｐ≦０．００１、＊＊＊＊：ｐ≦０．０００１。（Ｂ）ヘム（〇）およびヘム：Ｈｐｘ（■）の注射から２４、４８、および７２時間後の動脈スピンラベル標識画像上での標準化後の潅流（１群当たりｎ＝４）。ヘムの線条体内注射は、脳浮腫の形成および潅流の局所的減少（ヘム：Ｈｐｘを注射した後には存在しない）と関連する。
本明細書全体を通じて、文脈から別途必要とされない限り、言葉「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変化形は、記載された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の組入れを意味するが、しかし任意のその他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外しないものと理解される。
本明細書において、任意の先行する公開資料（またはそれに由来する情報）、または公知である任意の事案を参照したからといって、先行する公開資料（もしくはそれに由来する情報）または公知の事案が、本明細書と関連する試みの範囲（ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｅｎｄｅａｖｏｕｒ）における共通一般知識の一部分を形成するという容認もしくは承認、またはその任意の形態の示唆と受け取られるものではなく、またそうすべきでない。
対象とする明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈より別途明確に指示されない限り、複数形の側面を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「ある薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」という場合、それは単一の樹脂、ならびに２つまたはそれより多くの薬剤を含む；「その組成物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という場合、それは単一の組成物、ならびに２つまたはそれより多くの組成物を含む；以下同様。
相反する何らかの示唆が存在しない場合、「％」含有量というのは、本明細書全体を通じて、％ｗ／ｗ（重量／重量）を意味するものと解釈される。例えば、総タンパク質の少なくとも８０％を占めるハプトグロビン含有量を含む溶液は、総タンパク質の少なくとも８０％ｗ／ｗを占めるハプトグロビン含有量を含む組成物を意味するものと解釈される。
本発明は、ヘモペキシン（Ｈｘ）は無細胞ヘム媒介式の有害な二次神経学的転帰、例えば脳血管攣縮等をｉｎ ｖｉｖｏで低下させるか、さもなければ防止することができるという、本発明者らの驚くべき発見に少なくとも一部基づく。したがって、本明細書で開示される１つの態様では、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）内への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、それを必要としている対象のＣＳＦを、Ｈｘが無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）に曝露する工程を含む方法が提供される。
出血性脳卒中
出血性脳卒中またはＣＳＦコンパートメント中への出血は、本明細書では、脳内出血、脳溢血、または頭蓋内出血とも交換可能に呼ばれる。そのような出血は、局所的出血を引き起こす脳内の血管破裂により一般的に特徴づけられる。出血の場所は変化し得る。例えば、ＣＳＦコンパートメント中への出血は、脳室内出血、実質内出血、および／またはクモ膜下出血に起因し得る。
出血性脳卒中は、当業者にとってなじみ深いように、異なる自然経過、評価、およびマネジメントを伴う一連の病理学からなる。出血性脳卒中は、病因論に応じて一次または二次として一般的に分類される。
一実施形態では、出血性脳卒中は、脳室内出血（ＩＶＨ）またはクモ膜下出血（ＳＡＨ）である。一実施形態では、血性脳卒中は、動脈瘤性クモ膜下出血（ａＳＡＨ）である。
対象における出血性脳卒中、特にＳＡＨを診断する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、脳血管造影法、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、ならびに対象のＣＳＦ内ｏｘｙＨｂおよびビリルビンの分光光度分析が挙げられる（例えば、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．，２００１，ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ １６６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，５４（１１）：８２７－８３０を参照）。
出血性脳卒中は、天然に生じる出血（例えば、動脈瘤破裂の結果としての）または外傷性出血（例えば、頭部に対する外傷の結果としての）であり得るものと当業者により理解される。一実施形態では、出血性脳卒中は、非外傷性出血としても知られている天然に生じる出血である。一実施形態では、出血性脳卒中は外傷性出血である。
用語「脳脊髄液」またはＣＳＦは、脳室、ならびに頭蓋および脊髄クモ膜下腔内の液体を意味するものと理解される。脳室、頭蓋および脊髄クモ膜下腔は、本明細書では、まとめて「ＣＳＦコンパートメント」と呼ばれる。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む。
ＣＳＦは、主として、ただしこれに限らず脈絡叢により分泌されるが、脈絡叢は、脳室腔（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｕｍｅｎ）中に突き出た髄膜の粒状突起から構成され、その上皮表面は脳室上皮に連なる。試験より、脳間質液、脳室上皮、および毛細血管は、ＣＳＦ分泌においてもやはり役割を演じ得ることが示唆されている。ＣＳＦ容積は、ヒト成人において約１５０ｍＬであると見積もられ、個人間で顕著に異なるものの、頭蓋と脊髄クモ膜下腔内に１２５ｍＬおよび脳室内に２５ｍＬというように、両者間において一般的に分布している。ヒト成人におけるＣＳＦ分泌量は、１日当たり４００～６００ｍＬの間で変化し得、ＣＳＦの約６０～７５％は、側脳室の脈絡叢、ならびに第三および第四脳室の脈絡膜により生成される。ＣＳＦの脈絡膜分泌は、２つの工程：（ｉ）圧力勾配による、脈絡膜毛細血管から脈絡膜間質コンパートメントへの血漿の受動的濾過、ならびに（ｉｉ）カルボニックアンヒドラーゼおよび膜イオンキャリアタンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）が関与する、脈絡膜上皮を横断する間質コンパートメントから脳室腔への能動輸送を一般的に含む。ＣＳＦは、電解質バランスの制御、活性分子の循環、およびカタボライトの除去により、脳間質液およびニューロン環境のホメオスタシスにおいて必要不可欠な役割を演ずる。ＣＳＦは、脈絡叢分泌生成物をその作用部位に移送し、そうすることで含浸による脳の特定領域の活性を調節する一方、シナプス伝達は、より迅速な活性変化を生み出す。脳代謝の老廃物である過酸化生成物およびグリコシル化されたタンパク質は、加齢に関連するＣＳＦターンオーバーの減少と共に蓄積する（Ｓａｋｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１２８（６）：３０９－３１６）。
クモ膜下出血関連の二次脳損傷（ＳＡＨ－ＳＢＩ）
最初の７２時間以内に生ずる初期の脳損傷に加えて、ａＳＡＨの患者転帰は、動脈瘤破裂後の４～１０日目の間に一般的に生ずる遅発性二次脳損傷により決定されることがある。遅発性二次脳損傷は、大血管および微小血管機能障害、神経炎、ニューロンアポトーシス、および脳の病理学的電気活動を含む多因子性であると推定される。ａＳＡＨ後の患者の約３分の２は、大脳動脈の血管造影血管攣縮（ａＶＳＰ）を発症する。虚血性脳領域の放射線学的境界を有する遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、および臨床的に明白な遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）は、ａＳＡＨ後の患者の約３分の１において多くの場合見出される。これらの二次的症状の少なくとも１つの発生が、本明細書に記載される試験におけるクモ膜下出血関連の二次脳損傷を定義する（ＳＡＨ－ＳＢＩ）。
有害な二次神経学的転帰
ＳＡＨのような出血性脳卒中から生き延びても、そのような患者は、１つまたはそれ以上の有害な二次神経学的転帰または合併症を発症する有意なリスクに晒されている。用語「有害な二次神経学的転帰」とは、本明細書で使用される場合、出血性脳卒中に後続する有害な神経学的イベント（脳組織に対する二次傷害）を指す。出血性脳卒中後の二次傷害は、一次傷害（例えば、質量効果および物理的破綻）により、血腫に対する生理学的応答（例えば、炎症）により、ならびに／または血液および血液成分の放出により開始されるイベントのカスケードにより引き起こされると考えられる。有害な二次神経学的転帰は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、アポトーシス、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性、浮腫、および広汎性脱分極（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｄｅｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）が挙げられる（例えば、Ａｌ－Ｔａｍｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，７３（６）：６５４－６６７（２０１０）；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ，１３：４１６－４２４（２０１０）；およびＭａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９９：６４４－６５２（２００３）を参照）。
用語「～を処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「～を処置する（ｔｒｅａｔ）」などは、本明細書に記載されるように、有害な二次神経学的転帰（１つまたはそれ以上のその症状を含む）を緩和し、最小限に抑え、低下させ、軽減、改善し、さもなければ阻害することを意味するように、本明細書では交換可能に使用される。用語「～を処置すること」、「処置」などは、有害な二次神経学的転帰を発症しやすい、またはそのリスクを有するおそれがあるが、しかしそれを有するとはまだ診断されていない対象において、有害な二次神経学的転帰が生ずるのを阻止し、または有害な二次神経学的転帰の発現もしくは後続する進行を遅延させることを意味するように、本明細書においてやはり交換可能に使用される。その文脈において、用語「～を処置すること」、「処置」などは、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」、「予防上（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」、および「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）」のような用語と交換可能に使用される。しかしながら、本明細書に開示される方法は、有害な二次神経学的転帰が処置される対象において生ずるのを完全に防止する必要はないものと理解される。本明細書に開示される方法は、処置が存在しない場合に観察されるはずであった有害な二次神経学的転帰よりもその数が少なくなり、その重症度が低くなりさえすれば、対象内の有害な二次神経学的転帰を単に緩和し、低下させ、軽減、改善し、さもなければ阻害するだけで十分であり得る。したがって、明細書に記載される方法は、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させることができる。
本明細書で対象と呼ぶ場合、それは対象が出血性脳卒中を有したことがあることを意図するものではなく、出血性脳卒中のリスクを有する対象も含まれるものと理解される。一実施形態では、対象は、出血性脳卒中またはその症状を有する（すなわち、経験している）。別の実施形態では、対象は、処置時に出血性脳卒中をすでに有するものではないが、しかし出血性脳卒中のリスクを有する。例証的事例として、対象は、まだ破裂していないが、しかし破裂のリスクを有する動脈瘤を有する。この事例において、対象は、動脈瘤が破裂するリスクを最小限に抑えるために、外科的介入（例えば、クリッピング術または血管内コイリング（ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｉｌｉｎｇ）により）を受ける可能性がある。したがって、外科的介入の前、その期間中または後に動脈瘤が破裂するような場合には、本明細書に記載される方法が、有害な二次神経学的転帰を最小限に抑え、低下させ、無効にし、さもなければ阻害するために、対象に対して予防上の措置として好適に指定される可能性がある。その文脈において、本明細書に記載される方法は外科的介入の前、その期間中または後に行われる予防上の措置として採用される場合もある。
本明細書に開示される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度において、主観的、定性的、および／または定量的な低下をもたらす程度は、ＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する前の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度と比較したとき、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下として表すことができる。
有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度において、出血性脳卒中後に、主観的、定性的、および／または定量的低下が測定可能である好適な方法は、当業者にとってなじみ深く、また測定される有害な二次神経学的転帰の性質に概ね依存する。例証的事例は本明細書に別途記載される。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性低下、浮腫、および広汎性脱分極からなる群から選択される。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）である。ＳＡＨ後のＤＩＮＤは、頭痛、髄膜症の増悪、および／または体温上昇により特徴づけられ、その後に意識の変動性の衰退および限局的神経学的症状の出現が一般的に後続する脳虚血の重篤な症候群であり、その理解は十分でない。ＤＩＮＤは、出血性発作後、少なくとも３～４日に認められる神経学的機能の劣化として特徴的に定義される。ＤＩＮＤは、臨床的／症候性血管攣縮とも呼ばれる。ＤＩＮＤは、初期出血からの生存者における疾病率および死亡率の主要原因として存続する。ＤＩＮＤの報告された有病率は約２０％～３５％であるが、血液負荷がより高い者であっても、有病率は高くて４０％であり得る。ＤＩＮＤは、患者のおよそ２０％において脳梗塞に、またａＳＡＨ後に生じたすべての死亡および身体障害のうちの約１３％にその原因がある。ＤＩＮＤを判定する、適する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００６；１２９（１２）：３２２４－３２３７に記載されており、その内容は、参照によって本明細書にそのまま組み入れる。一実施形態では、ＤＩＮＤは、例えば、皮質脳波検査法による広汎性陰性低速電圧変化（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｌｏｗ ｖｏｌｔａｇｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）によって証明されるように、広汎性マス脱分極（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｍａｓｓ ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）により判定される。一実施形態では、ＤＩＮＤは、少なくとも２ＧＣＳレベルの遅発性意識低下および／または新たな限局的神経障害と関連する。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は脳血管攣縮である。脳血管攣縮またはＣＶ（「血管造影脳血管攣縮」とも呼ばれる）は、出血性脳卒中後の限局性虚血の最も一般的な原因の１つであり、またＳＡＨ関連の身体障害および死亡の最大約２３％を占める可能性がある。ＣＶは、クモ膜下腔中への出血性脳卒中後の、特に脳の基底部にある大キャパシタンス動脈（ｌａｒｇｅ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ａｒｔｅｒｙ）（すなわち、大脳動脈）における持続的血管収縮により引き起こされる血管の狭窄により一般的に特徴づけられる。用語「血管攣縮」は、したがって、血管造影的に決定される動脈の狭窄との関連で一般的に使用される。血管の持続的収縮は、遠位脳領域の潅流を低下させ、そして脳血管抵抗を高める。未処置のまま放置すると、ＣＶは、脳組織に対する血液供給量が限定されることに主に起因して、脳虚血および脳梗塞の形態の神経毒性（脳細胞損傷）を最終的に引き起こすおそれがある。ＣＶは、当業者にとって公知の任意の適する手段により検出可能であり、その例証的事例として、デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）血管造影法（ＣＴＡ）、磁気共鳴（ＭＲ）血管造影法（ＭＲＡ）、経頭蓋ドップラー超音波法、およびカテーテル（脳）血管造影法（ＣＡ）が挙げられる。一実施形態では、ＣＶはデジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）により検出される。理論または特定の適用様式に拘泥するものではないが、大脳動脈の血管攣縮は、ＳＡＨ後の約３日目に一般的に開始し、約７～８日間後にピークに達し、そして約１４日目までに消散するが（例えば、Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，４８：１７３－１７８（１９７８）を参照）、ただしＳＡＨ後４～１２日において血管造影を有する患者の少なくとも２／３に、ある程度の血管造影狭窄が生ずる。
ＣＶの発生率は、ＳＡＨ後の時間に依存する。本明細書において別途指摘するように、発生率のピークは、ＳＡＨ後の約７～８日（３～１２日の範囲）に一般的に生ずる。ＳＡＨ後の時間に付加して、血管攣縮の有病率に影響を及ぼすその他の主要因子は、クモ膜下血液の容積、密度、時間的持続性、および分布である。ＣＶに対する予後因子として、ＣＴスキャン上でのクモ膜下血液の量、高血圧症、解剖学的および全身的要因、臨床グレード、および患者に対する抗線維素溶解薬投与の有無を挙げることができる。
ＣＶの症状は、亜急性的に発現するのが一般的であり、また変動する可能性があり、そして過剰の眠気、傾眠、昏睡、片側不全麻痺または片麻痺、意志欠乏、言語障害、視野欠損、視線障害（ｇａｚｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、および脳神経麻痺を挙げることができる。いくつかの症状は局所的であるものの、何らかの特定の病理学的プロセスの診断には役立たないのが一般的である。脳血管造影法が、大脳動脈を可視化および試験するためのゴールドスタンダードとして一般的に利用されるが、ただし経頭蓋ドップラー超音波法も使用可能である。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）である。ＤＣＩは、ａＳＡＨを有する患者の約１／３において一般的に生じ、そしてこの患者の半数において死または永久的な身体障害を引き起こす（Ｄｏｒｓｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１：１９－２６（１９９４））。ＤＣＩは、ａＳＡＨを有する患者における、その他の特定可能な理由（例えば、手術後の介入）を有さない、放射線学的に検出された脳の梗塞として一般的に定義される。
Ｖｅｒｇｏｕｗｅｎらにより報告されたように（Ｓｔｒｏｋｅ．２０１０；４１：２３９１－２３９５）、「遅発性脳虚血により引き起こされた臨床的退行」および「脳梗塞」を統一的に定義することで、その病因について仮説を設けずに、形態学的および臨床的特性に関して最も意義のある要素が把握されるはずである。ＣＴ／ＭＲＩ上の脳梗塞は、ＳＡＨから３ヶ月後の機能的転帰と強い相関関係を有するので、またそれ（ＣＴ／ＭＲＩ上の脳梗塞）は観察者間で合意形成される割合が高いと期待されること、鎮静化され昏睡状態にある患者においてＤＣＩを検出できること、およびＤＣＩの結果を客観的に定量化できることを前提とすれば、ニューロイメージングにおける脳梗塞の方が、ＤＣＩ単独で引き起こされた臨床的退行よりも良好な転帰指標であると思われる。ＤＣＩのこれまでの定義では、ＤＣＩの臨床特性と、血管造影法／経頭蓋ドップラー法の所見、またはニューロイメージングもしくは検死における脳梗塞とが多くの場合統合されたが、著者らは、これらは個別に報告されるべきであることを提案する。著者らは、観察者間での合意形成の割合が低いと疑われることから、ＤＣＩにより引き起こされた臨床的退行を、転帰の二次的指標以上に重視すべきでないことも提案する。Ｖｅｒｇｏｕｗｅｎらによれば、ＤＣＩにより引き起こされた臨床的退行の提案された定義は、「限局性の神経学的障害（例えば、片側不全麻痺、失語症、失行症、半盲、または等閑など）の発生、またはグラスゴーコーマスケールにおける少なくとも２ポイントの減少（総スコアまたはその個別のコンポーネント［眼、いずれかの側の動き、言葉］のうちの１つにおける）」である。これは、少なくとも１時間継続するはずであり、動脈瘤閉塞直後には出現せず、また臨床的評価、脳のＣＴまたはＭＲＩスキャニング、および該当する検査室試験によってその他の原因に帰属させることはできない。
ＳＡＨを含む、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰は、免疫細胞活性化、および／またはＣＳＦコンパートメント中への浸潤、および炎症性サイトカインの放出を含め、炎症と関連することが明らかにされた。Ｍｉｌｌｅｒら（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：３８４３４２）が考察するように、試験から、炎症はＳＡＨ後の神経学的傷害の直接的なメディエーターであり、またＳＡＨ後血管攣縮の原因因子であることが明らかとなった。ＳＡＨの病態生理学と関わる主要な炎症性分子は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、セレクチン（Ｌ－セレクチンおよびＰ－セレクチン）、インテグリン（例えば、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）およびＭａｃ－１インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８））、ＴＮＦα、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）、炎症促進性インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－８）、およびエンドセリン１（ＥＴ－１）が挙げられる。本明細書で開示される一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、セレクチン（例えば、Ｌ－セレクチンおよびＰ－セレクチン）、インテグリン（例えば、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）およびＭａｃ－１インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８））、ＴＮＦα、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）、炎症促進性インターロイキン、およびエンドセリン１（ＥＴ－１）からなる群から選択される１つまたはそれ以上の炎症マーカーの差次的発現と関連する。一実施形態では、炎症促進性インターロイキンは、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１Ｂ、およびＩＬ－８からなる群から選択される。
Ｎｉｓｓｅｎらは、ＤＩＮＤを有する患者におけるＰ－セレクチンの血清濃度は、ＤＩＮＤを有さない患者と比較したとき、それよりも有意に高いことをこれまでに明らかにした（Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００１；７１：３２９－３３３）。また著者らは、ＤＩＮＤを有する患者におけるＬ－セレクチンの血清濃度が、ＤＩＮＤを有さない患者と比較したとき、それよりも有意に低いことも明らかにした。したがって、一実施形態では、本明細書に記載される方法が出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象におけるＰ－セレクチンの濃度と比較したとき、対象の血清またはＣＳＦ中のＰ－セレクチン濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下により決定される。別の実施形態では、本明細書に記載される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象におけるＬ－セレクチンの濃度と比較したとき、対象の血清またはＣＳＦ中のＬ－セレクチン濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の増加により決定される。Ｐ－セレクチンおよびＬ－セレクチンの濃度が測定可能である方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｎｉｓｓｅｎら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００１；７１：３２９－３３３）に記載されており、その内容は参照によって本明細書においてそのまま組み入れる。
炎症促進性サイトカインＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、およびＭＣＰ－１、ならびにエンドセリン－１のレベルもまた、ＳＡＨ後の患者において上昇していることが明らかにされた（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：３８４３４２）。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、本明細書に記載される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象における炎症促進性サイトカインの濃度と比較したとき、対象の血清またはＣＳＦ中の炎症促進性サイトカインの濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下により決定されるが、ただし炎症促進性分子は、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、およびエンドセリン－１からなる群から選択される。炎症性メディエーターの濃度が測定可能である方法は、本明細書に記載されるように、当業者にとってなじみ深い。
ＣＳＦにおける一酸化窒素（ＮＯ）枯渇が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の病因に寄与することも明らかにされている（Ｐｌｕｔａ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ．２００５；２９３（１２）：１４７７－１４８４を参照）。ＮＯレベルは、（１）動脈の外膜における、ニューロン型一酸化窒素シンターゼ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＮＯＳ）を含有するニューロンに対するオキシヘモグロビンの毒性；（２）内皮ＮＯＳの内因性阻害；および（３）クモ膜下の血塊から放出されたオキシヘモグロビンによる一酸化窒素の除去に起因して、ＳＡＨ後のＣＳＦにおいて減少している。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、本明細書に記載される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象のＣＳＦ中のＮＯの濃度と比較したとき、対象のＣＳＦにおけるＮＯの濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の増加により決定される。ＣＳＦ中のＮＯ濃度が測定可能である方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｐｌｕｔａらの（ＪＡＭＡ．２００５；２９３（１２）：１４７７－１４８４）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は酸化性組織傷害である。本明細書において別途指摘するように、本発明者らは、治療有効量のＨｘはＣＳＦ内無細胞ヘムの酸化能力を低下させることができることを初めて明らかにした。したがって、一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｘに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、酸化性組織傷害を低下させる。酸化性組織傷害を決定するための好適な方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、脂質過酸化の最終生成物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベル測定を含め、Ｋａｔｅｒｊｉら（２０１９年；Ｏｘｉｄ．Ｍｅｄ．Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｙ；１２７９２５０）に記載されている。一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｘに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、脂質過酸化を低下させる。
いくつかの実施形態では、治療的Ｈｘは、無細胞ヘムがＣＳＦコンパートメントから脳の間質腔内に浸透するのを防止し、これにより大脳血管系および脳実質に対する無細胞ヘムの毒性効果を阻害し得る。したがって、一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、脳実質内の有害な二次神経学的転帰である。
ヘモペキシン
ヘモペキシンは、２つの４枚羽根β－プロペラドメイン（９０°の角度で共に固定され、そしてドメイン間リンカーペプチドにより結びついた２枚の肥厚ディスクに類似する）により形成される、アミノ酸長さが４３９個の単鎖ペプチド鎖から構成される６１ｋＤａ血漿β－１Ｂ－糖タンパク質である。血管内および血管外溶血の結果として血液中に放出されるヘムは、ドメイン間リンカーペプチドにより形成されたポケット内の２つの４枚羽根β－プロペラドメイン間に結合する。残基Ｈｉｓ２１３およびＨｉｓ２６６はヘム鉄原子の位置を決定し、ヘモグロビンと同様に安定なビス－ヒスチジル複合体をもたらす。
ヘモペキシンは、シアル酸、マンノース、ガラクトース、およびグルコサミンを含む炭水化物を約２０％含有する。１２個のシステイン残基がタンパク質配列内に見出され、おそらくは６個のジスルフィド架橋に該当する。ヘモペキシンは、高い親和性（Ｋｄ＜１ｐＭ）を有してヘムに結合し、また血流から肝臓へのヘム特異的担体として機能するその能力により、ヘム毒性に対する第一防御線を代表する。ヘモペキシンは等モル比でヘムに結合するが、しかしヘムがタンパク質と共有結合する証拠は存在しない。
ヘム結合に付加して、ヘモペキシン調製物は、セリンプロテアーゼ活性（Ｌｉｎ ｅｔ．ａｌ．，２０１６年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２：２２－３１）、ならびにいくつかのその他の機能、例えば抗炎症活性および炎症促進活性の発揮、細胞接着およびある特定の２価金属イオン結合の阻害等を保持することも報告されている。
内因性ヘモペキシンは、生理学的定常状態において遊離ヘムの副作用をコントロールすることができるが、病態生理学的な条件下での定常的ヘムレベルの維持において効果（例えば溶血と関連する効果等）をほとんど有さず、高レベルのヘムは内因性ヘモペキシンの枯渇を引き起こし、ヘム媒介式の酸化性組織障害の原因となる。
無細胞ヘムと複合体を形成し、これにより無細胞ヘムの生物学的活性を中和する能力を有する限り、Ｈｘの天然に存在する形態および組換え型が、本明細書に記載される方法に適するものと理解される。Ｈｘの天然に存在する形態のうち好適な形態は当業者にとって公知であり、その例証的事例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０２７９０．Ｋｏｃｈら（２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：１３７７－１３８２）、およびＴａｋａｈａｓｈｉら（ＰＮＡＳ、１９８５、８２（１）：７３－７７）に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。
一実施形態では、Ｈｘは、血漿由来のＨｘを含み、それから構成または実質的に構成される。一実施形態では、ＨｘはヒトＨｘである。ヒトＨｘの例証的事例は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０２７９０に記載されており、下記に再現する：
ＭＡＲＶＬＧＡＰＶＡ ＬＧＬＷＳＬＣＷＳＬ ＡＩＡＴＰＬＰＰＴＳ ＡＨＧＮＶＡＥＧＥＴ
ＫＰＤＰＤＶＴＥＲＣ ＳＤＧＷＳＦＤＡＴＴ ＬＤＤＮＧＴＭＬＦＦ ＫＧＥＦＶＷＫＳＨＫ
ＷＤＲＥＬＩＳＥＲＷ ＫＮＦＰＳＰＶＤＡＡ ＦＲＱＧＨＮＳＶＦＬ ＩＫＧＤＫＶＷＶＹＰ
ＰＥＫＫＥＫＧＹＰＫ ＬＬＱＤＥＦＰＧＩＰ ＳＰＬＤＡＡＶＥＣＨ ＲＧＥＣＱＡＥＧＶＬ
ＦＦＱＧＤＲＥＷＦＷ ＤＬＡＴＧＴＭＫＥＲ ＳＷＰＡＶＧＮＣＳＳ ＡＬＲＷＬＧＲＹＹＣ
ＦＱＧＮＱＦＬＲＦＤ ＰＶＲＧＥＶＰＰＲＹ ＰＲＤＶＲＤＹＦＭＰ ＣＰＧＲＧＨＧＨＲＮ
ＧＴＧＨＧＮＳＴＨＨ ＧＰＥＹＭＲＣＳＰＨ ＬＶＬＳＡＬＴＳＤＮ ＨＧＡＴＹＡＦＳＧＴ
ＨＹＷＲＬＤＴＳＲＤ ＧＷＨＳＷＰＩＡＨＱ ＷＰＱＧＰＳＡＶＤＡ ＡＦＳＷＥＥＫＬＹＬ
ＶＱＧＴＱＶＹＶＦＬ ＴＫＧＧＹＴＬＶＳＧ ＹＰＫＲＬＥＫＥＶＧ ＴＰＨＧＩＩＬＤＳＶ
ＤＡＡＦＩＣＰＧＳＳ ＲＬＨＩＭＡＧＲＲＬ ＷＷＬＤＬＫＳＧＡＱ ＡＴＷＴＥＬＰＷＰＨ
ＥＫＶＤＧＡＬＣＭＥ ＫＳＬＧＰＮＳＣＳＡ ＮＧＰＧＬＹＬＩＨＧ ＰＮＬＹＣＹＳＤＶＥ
ＫＬＮＡＡＫＡＬＰＱ ＰＱＮＶＴＳＬＬＧＣ ＴＨ
一実施形態では、Ｈｘは、これまでに記載したようなヒトＨｘの配列を含み、それから構成または実質的に構成される。
Ｈｘの天然起源（例えば、血漿）からＨｘを単離するための様々なプロトコールが当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は国際公開第２０１４／０５５５５２号および国際公開第２０１９／０３０２６２号に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。
用語「ヘモペキシン」（Ｈｘ）は、本明細書で使用される場合、Ｈｘのすべての表現型（すべてのアイソフォームを含め）を含むものと理解される。Ｈｘは、均質（同一アイソフォームのＨｘから実質的に構成される場合）、または不均質（Ｈｘのヒトおよびヒト以外のアイソフォームを含む、異なるＨｘアイソフォームの組合せを含む場合）であり得る。単離物中に存在するＨｘアイソフォームを決定するための適する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例には、高性能粒径排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣアッセイ）およびＨｘ ＥＬＩＳＡが含まれる。
Ｈｘは天然に存在するＨｘ（例えば、血漿由来）である場合もあれば、また組換えタンパク質として生成される場合もある。一実施形態では、Ｈｘは血漿由来である。一実施形態では、Ｈｘは、組換えＨｘを含み、それから構成または実質的に構成される。
別途記載しない限り、用語Ｈｘには、本明細書で使用される場合、天然の、または天然に存在するＨｘの機能的類似体が含まれる。用語「機能的類似体」とは、天然に存在する（天然型の）Ｈｘの生物学的活性と実質的に同一の生物学的活性を共有する物質（ただし、生物学的活性が、少なくとも無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその生物学的活性を中和する類似体の能力である限りにおいて）を意味するものと理解される。「実質的に同一の生物学的活性」とは、機能的類似体が、天然に存在するＨｘアイソフォーム（例えば、ヒトおよび／またはヒト以外のＨｘのアイソフォーム）を含む、天然に存在するＨｘの結合親和性の少なくとも４０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％等）である結合親和性を、無細胞ヘムに対して有することを一般的に意味する。物質がＨｘの機能的類似体であるか決定するための適する方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例（例えば、無細胞ヘム誘発性の脳血管攣縮を低下させる機能的類似体の能力）は本明細書に別途記載される。
本明細書で開示される一実施形態では、Ｈｘの機能的類似体は、天然型Ｈｘの機能的断片である。天然型Ｈｘの機能的断片は、断片が無細胞ヘムと複合体を形成する能力を保持し、これによりその生物学的活性を中和する限り、任意の適する長さであり得る。
別の実施形態では、機能的類似体は、天然に存在する（天然型の）Ｈｘ分子とは異なるアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、コンパレーター）である。機能的類似体は、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、またはそれより多くの）アミノ酸置換により、天然型Ｈｘのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する分子を含み得るが、ただし、前記差異は、類似体が無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその生物学的活性を中和する能力を無効化しない、または完全には無効化しない。いくつかの実施形態では、機能的類似体は、天然型Ｈｘと比較して、類似体が無細胞ヘムと複合体を形成する能力を強化するアミノ酸置換を含む。一実施形態では、機能的類似体は、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換により、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、所与の位置において、アミノ酸の同一性を変化させて、それをほぼ等価なサイズ、電荷、および／または極性のアミノ酸に置き換えることを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例として、下記の８つの置換群（慣習的な１文字コードで表す）：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；（７）、Ｄ；および（８）Ｃ、Ｓが挙げられる。
一実施形態では、機能的類似体は、天然型Ｈｘのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。「少なくとも８５％」という場合、それには、例えば、最適なアライメントまたは最良適合分析を行った後の、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性が含まれる。したがって、一実施形態では、配列は、例えば最適なアライメントまたは最良適合分析を行った後に、本明細書において識別された配列と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、または好ましくは１００％の配列同一性または配列相同性を有する。
用語「同一性」、「類似性」、「配列同一性」、「配列類似性」、「相同性」、「配列相同性」などは、本明細書で使用される場合、アライメント済みの配列内の任意の特定のアミノ酸残基位置において、アミノ酸残基が、アライメント後の配列の間で同一であることを意味する。用語「類似性」または「配列類似性」は、本明細書で使用される場合、アライメント済みの配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基のタイプが配列間で類似することを表す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリン残基について置換することができる。本明細書において別途指摘するように、これは保存的置換と呼ばれる場合もある。一実施形態では、アミノ酸配列は、改変が、非改変（天然型）Ｈｘポリペプチドと比較したとき、改変後のポリペプチドの結合特異性または機能的活性に対して影響を及ぼさないように、その中に含まれるアミノ酸残基のいずれかを保存的に置換することによって改変され得る。
いくつかの実施形態では、ペプチド配列における配列同一性は、相同性の割合（％）が最大となるように、ただし配列同一性の一環として保存的置換を一切考慮しないで配列をアライメントし、そして必要な場合にはギャップを導入した後、対応するペプチド配列の残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基の割合（％）と関係する。ＮまたはＣ末端延長部も、また挿入も、配列同一性または相同性を低下させるものとみなしてはならない。２つまたはそれより多くのアミノ酸配列のアライメントを実施し、そしてその配列同一性または相同性を決定するための方法およびコンピュータープログラムは、当業者に周知されている。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性または類似性の割合（％）は、アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して容易に計算できる。
アミノ酸配列の「類似性」を決定するための技術は当業者に周知されている。一般的に、「類似性」とは、アミノ酸が同一である、または類似した化学および／もしくは物理特性（電荷もしくは疎水性などのような）を有する、２つもしくはそれより多くのペプチド配列の、または好適な場所におけるアミノ酸対アミノ酸の正確な比較を意味する。いわゆる「類似性の割合（％）」が、次に比較されるペプチド配列の間で決定可能である。一般的に、「同一性」とは、２つのペプチド配列のアミノ酸対アミノ酸の正確な対応を指す。
２つまたはそれより多くのペプチド配列は、その「同一性の割合（％）」を決定することによっても比較可能である。２つの配列の同一性の割合（％）は、２つのアライメントされた配列間の正確な一致数を、より短い配列の長さで割り算して１００倍することとして記載することができる。核酸配列に対する近似的アライメント法が、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）により開発されたスコアリングマトリックスを使用して、ペプチド配列についても使用されるように拡張することができ、またＧｒｉｂｓｋｏｖ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３，１９８６）により標準化される。配列間の同一性または類似性の割合（％）を計算するための好適なプログラムは、当技術分野において一般的に公知である。
比較ウィンドウをアライメントするための最適配列アライメント法が、アルゴリズムのコンピューターによる導入（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０に含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、米国）、または選択された様々な方法のいずれかにより生み出された検査法および最良アライメント法（すなわち、比較ウィンドウにおいて相同性の割合（％）が最高となる）により実施することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９）により開示されるようなＢＬＡＳＴプログラムファミリーについても参考にすることができる。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５）のユニット１９．３に見出すことが可能である。
一実施形態では、機能的類似体は、類似体の安定性を増加させ、または類似体の溶解度を増加させるために、天然型Ｈｘと比較して、アミノ酸置換および／またはその他の改変を含む。
機能的類似体は、天然に存在する化合物／ペプチドであり得る、または当業者にとって公知の方法を使用して、化学合成により合成的に製造することができる。
Ｈｘは、単離可能、そして所望の場合にはさらに精製可能である組換えタンパク質として、微生物内で好適に生成されることがある。組換えＨｘを生成するための適する微生物は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例には、細菌、酵母菌、または菌類、真核細胞（例えば、哺乳動物または昆虫の細胞）が含まれ、または組換えウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、またはセンダイウイルス）の形態である。組換えペプチドを製造するための適する細菌は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはペプチド配列を発現する能力を有する任意のその他のバクテリアが含まれる。組換えペプチドを製造するための適する酵母菌種の例証的事例には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはペプチドを発現する能力を有する任意のその他の酵母菌が含まれる。対応する方法は当技術分野において周知されている。組換えにより生成したペプチド配列を単離および精製するための方法も当技術分野において周知されており、例えば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
組換えＨｘの単離を円滑化するために、本明細書に記載されるように、融合ポリペプチド（Ｈｘまたはその機能的類似体のペプチド配列が、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする異種ポリペプチドに翻訳において融合している（共有結合的にリンクしている））が作製されることがある。適する異種ポリペプチドの例証的事例は、Ｈｉｓ－タグ（例えば、（Ｈｉｓ）６－６個のヒスチジン残基）、ＧＳＴ－タグ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）等である。
組換えＨｘを調製する場合、例えば、コンビナトリアルケミストリーによって製造されるか、または最も多様な構造についてはハイスループットスクリーニング技術により取得されるファージライブラリーおよび／またはペプチドライブラリーもやはり適する（例えば、Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ（Ｅｄｉｔｏｒ），ｅｔ ａｌ．；およびＷｉｌｌａｔｓ ＷＧ Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５０（６）：８３７－５４を参照）。
組換えＨｘの例証的事例として、受託番号ＮＰ＿００５１３４（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、２０１８，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４８７，８４－８９により記載される）、および受託番号Ｐ００７３８を有するペプチドが挙げられる。
Ｈｘは、融合タンパク質の一部として、１つまたはそれ以上の異種部分に融合、カップリング、さもなければ連結し得る。１つまたはそれ以上の異種部分は、Ｈｘの活性または安定性を改善、強化し、さもなければ拡張し得る。一実施形態では、Ｈｘは、本明細書に記載されるように、Ｈｘのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するために、異種部分に好適に連結する。好適な半減期延長性の異種部分は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、およびヒアルロン酸が挙げられる。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、およびヒアルロン酸からなる群から選択される。その他の実施形態では、異種部分は、Ｈｘに融合した異種アミノ酸配列であり得る。
代替的または付加的に、異種部分は、Ｈｘに化学的にコンジュゲートする場合があり、例えば共有結であり得る。半減期延長性の異種部分は、当業者にとって公知の任意の適する手段により、Ｈｘに融合、コンジュゲート、さもなければ連結可能であり、その例証的事例は化学的リンカーによる。このコンジュゲーション技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ ＬＬＣ（例えば、米国特許第７、２５６、２５３号を参照）により事例的に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。
その他の実施形態では、異種部分は、半減期強化タンパク質（ＨＬＥＰ）である。好適な半減期強化タンパク質は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、アルブミンまたはその断片が挙げられる。したがって、一実施形態では、ＨＬＥＰはアルブミンまたはその断片である。アルブミンまたはその断片のＮ末端は、Ｈｘのα鎖および／またはβ鎖のＣ末端に融合し得る。代替的または付加的に、アルブミンまたはその断片のＣ末端は、Ｈｘのα鎖および／またはβ鎖のＮ末端に融合し得る。１つまたはそれ以上のＨＬＥＰは、そのようなＨＬＥＰが無細胞ヘムに対するＨｘの結合を無効化しないことを前提として、Ｈｘのα鎖および／またはβ鎖のＮまたはＣ末端部分（複数可）に融合し得る。しかしながら、融合タンパク質のＨｘコンポーネントが無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりそれを中和する能力をなおも有する限り、無細胞ヘムに対するＨｘの結合性の若干の低下は許容することができるものと理解される。
融合タンパク質は、Ｈｘと異種部分の間に配置された化学結合またはリンカー配列をさらに含み得る。リンカー配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸、特に１～５０個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～５個、またはより好ましくは１～３個（例えば、１、２、または３個）のアミノ酸からなるペプチドリンカーであり得るが、ただしリンカー配列は、相互に等しい場合もあれば、また異なる場合もある。好ましくは、リンカー配列は、野生型Ｈｘ内の対応する位置に存在しない。前記リンカー配列中に存在する好ましいアミノ酸はＧｌｙおよびＳｅｒを含む。好ましい実施形態では、リンカー配列は、本明細書に開示される方法に基づき処置される対象に対して実質的に非免疫原性である。実質的に非免疫原性とは、リンカー配列が、それが投与される対象において、リンカー配列に対する検出可能な抗体応答を生じさせないことを意味する。好ましいリンカーは、グリシンおよびセリン残基の交互反復から構成されると考えられる。好適なリンカーは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は国際公開第２００７／０９０５８４号に記載されている。一実施形態では、Ｈｘと異種部分の間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質において天然のドメイン間リンカーとして働くペプチド配列を含み、それから構成または実質的に構成される。そのようなペプチド配列は、その天然の環境において、タンパク質表面に接近して位置し得るが、またこの配列に対する天然の忍容性が想定可能なように、免疫系に対してアクセス可能である。例証的事例は、国際公開第２００７／０９０５８４号に提示されている。好適な切断可能リンカー配列は、例えば国際公開第２０１３／１２０９３９Ａ１号に記載されている。
好適なＨＬＥＰ配列の例証的事例は下記記載されている。各ＨＬＥＰのまさに「Ｎ末端アミノ酸」、もしくはまさに「Ｃ末端アミノ酸」に対する融合、または各ＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」もしくは「Ｃ末端部分」に対する融合が本明細書において同様に開示され、これにはＨＬＥＰの１つまたはそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠損が含まれる。融合タンパク質は、２つ以上のＨＬＥＰ配列、例えば２または３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のＣ末端部分に、タンデムに、例えば連続的な反復しとして融合し得る。
一実施形態では、異種部分は半減期延長性ポリペプチドである。一実施形態では、半減期延長性ポリペプチドは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバーもしくはその断片、流体力学的容積が大きい溶媒和したランダム鎖（例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６－１１９０を参照）、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、またはプロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、αフェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリンもしくはそのバリアントもしくは断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン－βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する能力を有するポリペプチド、特に免疫グロブリン定常領域およびその一部分、例えばＦｃ断片、生理的条件下でアルブミンに対して、アルブミンファミリーのメンバーもしくはその断片に対して、または免疫グロブリン定常領域もしくはその一部分に対して結合する能力を有するポリペプチドもしくは脂質からなる群から選択される。免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、好ましくは免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ断片、免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）のＦｃ断片、または免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）のＦｃ断片である。半減期強化ポリペプチドは、本明細書で使用される場合、Ｈｘの治療活性または生物学的活性を安定化または延長する能力、特にＨｐのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させる能力を有する完全長半減期強化タンパク質、または１つもしくはそれ以上のその断片であり得る。ＨＬＥＰが存在しない各Ｈｘと比較して、ＨＬＥＰ断片が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、またはより好ましくは少なくとも２５％の機能的な半減期延長をもたらす限り、そのような断片は、長さが１０個もしくはそれより多くのアミノ酸であり得、またはＨＬＥＰ配列に由来する少なくとも約１５個、好ましくは少なくとも約２０個、好ましくは少なくとも約２５個、好ましくは少なくとも約３０個、好ましくは少なくとも約５０個、もしくはより好ましくは少なくとも約１００個、もしくはそれより多くの近接したアミノ酸を含み得る、または各ＨＬＥＰの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。異種部分が機能的な半減期延長を（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）Ｈｘに対してもたらすか判定する方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は本明細書において別途記載される。
融合タンパク質のＨＬＥＰ部分は、本明細書に記載されるように、野生型ＨＥＬＰのバリアントであり得る。用語「バリアント」には、挿入、欠損および／または置換（保存的また非保存的を問わない）が含まれるが、そのような変化は、Ｈｘが無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりそれを中和する能力を実質的に変化させない。ＨＬＥＰは、好適には、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来する可能性がある。非哺乳動物のＨＬＥＰとしてメンドリおよびサケが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、ＨｘおよびＨＬＥＰなどのような異種部分をコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列をインフレーム接合により作り出すことができる。当業者は、融合タンパク質ＤＮＡ配列が翻訳されると、単一のタンパク質配列がもたらされることを理解する。本明細書で開示される一実施形態に従い、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列をインフレーム挿入した結果として、Ｈｐ、好適なリンカー、および異種部分を含む融合タンパク質が取得可能である。
本明細書で開示される一実施形態では、Ｈｘは異種部分に融合している。一実施形態では、異種部分は、アルブミンまたはその断片、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、αフェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下で、アルブミンに対して、または免疫グロブリン定常領域に対して結合する能力を有するポリペプチド、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する能力を有するポリペプチド、特に免疫グロブリン定常領域およびその一部分、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ部分、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含み、それから構成または実質的に構成される。別の実施形態では、異種部分は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される。
用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）および「アルブミン」（ＡＬＢ）は、本明細書では交換可能に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」はより広範囲にわたり、またヒト血清アルブミン（ならびにその断片およびバリアント）、ならびにその他の種に由来するアルブミン（ならびにその断片およびバリアント）を包含する。
本明細書で使用される場合、「アルブミン」とは、アルブミンの１つまたはそれ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくはバリアントをまとめて指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンもしくはその他の脊椎動物由来のアルブミンの成熟した形態、もしくはその断片、またはこのような分子もしくはその断片の類似体もしくはバリアントを含む、ヒトアルブミンまたはその断片を指す。本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、代替的用語「ＦＰ」は、ＨＬＥＰを特定するため、特にＨＬＥＰとしてアルブミンを定義するために使用される。
本明細書に記載される融合タンパク質は、ヒトアルブミンおよび／またはヒトアルブミンの断片の天然に存在する多型変異体を好適に含む場合もある。一般的に言うと、アルブミン断片またはバリアントは、長さが少なくとも１０個、好ましくは少なくとも４０個、または最も好ましくは７０個を超えるアミノ酸である。
一実施形態では、ＨＬＥＰは、ＦｃＲｎ受容体に対する結合性が強化されたアルブミンバリアントである。そのようなアルブミンバリアントは、野生型アルブミンに融合したＨｘまたはその機能的断片と比較して、Ｈｘまたはその機能的類似体に対してより長い血漿半減期をもたらす可能性がある。本明細書に記載される融合タンパク質のアルブミン部分は、ヒトアルブミンの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的な改変を好適に含む可能性がある。
一実施形態では、異種部分は、免疫グロブリン分子またはその機能的断片である。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療用タンパク質の半減期を増加させることが当技術分野において公知である（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ．２００６．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０：１５１－１６０を参照）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１～ＣＨ３）およびヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、任意の哺乳動物、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のそれぞれに由来し得る。抗原結合ドメインを有さないＩｇＧおよびＩｇＧ断片も、ＨＬＥＰを含め、異種部分として使用することができる。Ｈｐまたはその機能的類似体は、抗体のヒンジ領域またはペプチドリンカー（切断可能であってもよい）を介してＩｇＧまたはＩｇＧ断片と好適に接続してもよい。いくつかの特許および特許出願が、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を強化するために、治療用タンパク質を免疫グロブリン定常領域と融合させることを記載する。例えば、米国特許第２００４／００８７７７８号および国際公開第２００５／００１０２５号は、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分と、生物学的に活性なペプチド（ペプチドの半減期を増加させ、さもなければｉｎ ｖｉｖｏで迅速に取り除かれる）からなる融合タンパク質について記載する。生物学的活性の強化、循環半減期の延長、および溶解度の向上を実現したＦｃ－ＩＦＮ－β融合タンパク質が記載された（国際公開第２００６／０００４４８Ａ２号）。血清半減期が延長され、そしてｉｎ ｖｉｖｏでの効力が高まったＦｃ－ＥＰＯタンパク質（国際公開第２００５／０６３８０８Ａ１号）、ならびにＧ－ＣＳＦ（国際公開第２００３／０７６５６７Ａ２号）、グルカゴン様ペプチド－１（国際公開第２００５／０００８９２Ａ２号）、凝固因子（国際公開第２００４／１０１７４０Ａ２号）、およびインターロイキン－１０（米国特許第６、４０３、０７７号）（いずれも半減期強化特性を有する）とのＦｃ融合体が開示された。
本発明に基づき使用可能である好適なＨＬＥＰの例証的事例は、国際公開第２０１３／１２０９３９Ａ１号においても記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、ＨｘがＣＳＦ中に存在する無細胞ヘムと結合し、そしてそれと複合体を形成し、これにより無細胞ヘムのそうでなければ有害な生物学的効果を中和することを可能にするのに十分な、ＣＳＦ内のＨｘの量または濃度を意味する。治療有効量のペプチドは、いくつかの因子に依存して変化し得ることが当業者により理解されるが、その例証的事例として、Ｈｘが対象に直接投与されるか、その投与法（例えば、髄腔内、頭蓋内、または脳室内）、処置される対象の健康および身体状態、処置される対象の分類群、出血の重症度（例えば、出血の範囲）、投与経路、ＣＳＦコンパートメント内の無細胞ヘムの濃度および／または量、ならびに上記のいずれかの組合せが挙げられる。
Ｈｘの治療有効量は、当業者により決定可能な比較的幅広い範囲に及ぶ。Ｈｘの好適な治療有効量の例証的事例として、約２μＭ～約１ｍＭ、好ましくは約２μＭ～約４００ｍＭ、好ましくは約５μＭ～約４００μＭ、好ましくは約５μＭ～約２００μＭ、またはより好ましくは約１０μＭ～約２００μＭが挙げられる。
一実施形態では、Ｈｘの治療有効量は約２μＭ～約１ｍＭである。一実施形態では、Ｈｘの治療有効量は、約２μＭ～約４００μＭである。一実施形態では、Ｈｘの治療有効量は、約５μＭ～約２００ｍＭである。一実施形態では、Ｈｘの治療有効量は、約１０μＭ～約２００μＭである。
一実施形態では、Ｈｘの治療有効量は、出血後の対象のＣＳＦ内無細胞ヘム濃度に対して、少なくとも等モル量である。別の実施形態では、Ｈｘの治療有効量は、約３μＭ～約１，２００μＭのＣＳＦ内の無細胞Ｈｂと複合体形成するのに十分な量である。一実施形態では、Ｈｘの治療有効量は、出血後の対象のＣＳＦ内に存在する無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の量の少なくとも４倍である。ＣＳＦ中の無細胞Ｈｂおよびヘムの濃度を測定する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｎｙａｋｕｎｄｉら（２０２０，Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ，２０２０，８９２９０２０）、Ｒｉｇｈｙら（２０１８，Ｒｅｖ Ｂｒａｓ Ｔｅｒ Ｉｎｔｅｓｔｉｖａ，３０（１）：２１－２７）、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．（２００１，ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ １６６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，５４（１１）：８２７－８３０）、Ｈｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒ Ｍ．ら（２０１８．Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．；１２０：ｅ６６０－ｅ６６６）、およびＨｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒ Ｍ．ら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９；１２９（１２）：５２１９－５２３５）に記載されており、それらの内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
治療有効量のＨｘの実現は、本明細書に記載されるように、Ｈｘまたはその機能的類似体が曝露されるＣＳＦの最終容積に依存し得るものと理解される。例えば、Ｈｘが成人ヒト対象に投与される（例えば、髄腔内に）場合、成人ヒト対象におけるＣＳＦの平均容積が約１５０ｍＬであることを考慮すると、約３１０μＭのＨｘ溶液、５ｍＬを対象に投与することで、約１０μＭのＨｘの治療有効量が実現可能である。別の例証的事例では、本明細書に記載される方法は、５０ｍＬの対象由来のＣＳＦを除去すること、および約３０μＭのＨｘを含む５０ｍＬの人工ＣＳＦを用いてそれと置換し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて約１０μＭのＨｘの治療有効量を実現することを含む。
Ｈｘの投与量は、最適な治療応答を実現するように調整される場合もある。例えば、いくつかの分割された用量が、毎日、毎週、またはその他の適する時間間隔で投与される場合があり、または投与量は、状況の緊急性の示唆に従い、比例的に減じられる可能性がある。
用語「～を曝露すること（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、ＨｘがＣＳＦ中に存在する無細胞ヘムと結合し、そしてそれと複合体を形成し、これによりヘム：Ｈｘ複合体の形成が、無細胞ヘムの脳組織に対する、そうでなければ有害な生物学的効果を実質的に中和することが可能となるように、ＣＳＦをＨｘと接触させることを意味する。「実質的に中和する」とは、治療的Ｈｘが存在しない場合に無細胞ヘムが脳組織に及ぼす生物学的効果と比較して、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％を含む、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下として主観的または定性的に表されるような、無細胞ヘムが脳組織に及ぼす有害な生物学的効果の低下を意味する。無細胞Ｈｘの有害な生物学的効果の低下が測定可能または決定可能である（定性的または定量的に）方法は、当業者によってなじみ深く、その例証的事例は本明細書において別途記載される。
本明細書においてやはり明記されるように、本発明者らは、治療有効量のＨｘを、チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイ法を用いたマロンジアルデヒドにより評価したときに、それがＣＳＦ内の無細胞ヘムの酸化能力を阻止し、低下させることができることも初めて明らかにした。
それを必要としている対象のＣＳＦが、本明細書に記載されるように、治療有効量のＨｘに曝露される方式は、例えば、前記曝露が、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントにおいて実施されるか（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）、または対象から得られたＣＳＦにおいて体外的に実施されるか（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ）に応じて変化し得るものと理解される。前記曝露が、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントにおいて実施される場合（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）、Ｈｘの投与経路は、ＣＳＦコンパートメント内でＨｘが無細胞ヘムと接触するのが可能となるように選択される。好適な投与経路は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、髄腔内、頭蓋骨内、および脳室内が挙げられる。一実施形態では、治療有効量のＨｘは、例えば、出血性脳卒中後の対象内に、ＣＳＦを一時的に流出させ、そして頭蓋内圧を下げるために配置される外部脳室ドレイン経由で投与される。
一実施形態では、Ｈｘは対象に対して頭蓋内投与される。
一実施形態では、Ｈｘは、対象に対して髄腔内投与される。
一実施形態では、Ｈｘは、脊椎管中に髄腔内投与される。
一実施形態では、Ｈｘは、クモ膜下腔中に髄腔内投与される。
一実施形態では、Ｈｘは、対象に対して脳室内投与される。
一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｘを、対象に対して髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｘを、対象に対して、その脊椎管中に髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｘを、対象に対して、そのクモ膜下腔中に髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｘを、対象に対して脳室内投与する工程を含む。
代替的にまたは付加的に、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象からＣＳＦを取り出す工程、ＣＳＦ内でＨｘが無細胞ヘムと複合体を形成し、これにより無細胞ヘムの中和を可能にするのに十分な期間、ＣＳＦを治療有効量のＨｘに曝露する工程、ＣＳＦ内に形成されたヘム：Ｈｘ複合体を除去してヘム減少ＣＳＦを生成する工程、およびヘム減少ＣＳＦを対象に投与する工程（例えば、髄腔内または脳室内）を含む。ＣＳＦをＣＳＦコンパートメントから除去しても、ＣＳＦのまったく存在しないＣＳＦコンパートメントが一般的にもたらされるわけではないものと理解され、少なくとも若干のＣＳＦがＣＳＦコンパートメント内に存続することに留意されたい。場合により、ＣＳＦコンパートメント内に存在し得る少なくとも若干量の残留Ｈｘを取り除くために、ＣＳＦが取り出されたら、ＣＳＦコンパートメントを、薬学的に許容される洗浄溶液でリンスすることができる。さらに複合体を形成させ、これによりＣＳＦコンパートメント内に存在し得る少なくとも若干量の残留無細胞ヘムを中和するために、洗浄溶液は、場合によりＨｘを含み得る。一実施形態では、洗浄溶液は、本明細書において別途記載されるような人工ＣＳＦである。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取り出す工程、ＨｘをＣＳＦサンプルに添加して、Ｈｘ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程、Ｈｘ富化ＣＳＦサンプルを対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程、それによって、ＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｘに、ある期間（Ｈｘが無細胞ヘムと複合体を形成し、これにより対象のＣＳＦにおいて無細胞ヘムを中和することを可能にするのに十分な期間）曝露する工程、および場合により、上記工程を反復する工程を含む。好ましくは、ＣＳＦサンプルに添加されるＨｘの量は、対象に投与すると、対象のＣＳＦ内に治療有効量のＨｘをもたらすように決定される。したがって、ＣＳＦサンプル内に添加されるＨｘの量は、取り出され、そして対象に再投与されるＣＳＦサンプルの容積に依存する。
一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｘを添加して、Ｈｘ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｘ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これにより、対象のＣＳＦコンパートメントにおいてＨｘが無細胞ヘムと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｘに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む。
取り出され、そして対象に再投与されるＣＳＦの容積は、実質的に同一であるのが望ましい。例えば、５０ｍＬのＣＳＦサンプルが対象のＣＳＦコンパートメントから取り出される場合、Ｈｘを含むＣＳＦの全５０ｍＬの容積が対象に再投与される。しかしながら、容積に違いが生じたとしても、そのいずれもが有意な有害臨床転帰を惹起しない限り、容積は異なってもよいものと理解される。いくつかの実施形態では、対象に再投与されるＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積よりも少ない。その他の実施形態では、対象に再投与されるＣＳＦの容積は、Ｈｘを単独で、または任意のその他の治療薬と組み合わせて添加することで余分の容積が生まれることから、対象から除去されたＣＳＦの容積を上回る。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程、対象から取り出されたＣＳＦの容積を、Ｈｘを含むある容積の人工ＣＳＦと置換する工程、これによりＨｘが無細胞ヘムと複合体を形成し、これにより対象のＣＳＦ内の無細胞ヘムを中和することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦを治療有効量のＨｘに曝露する工程を含む。好ましくは、人工ＣＳＦ内のＨｘの量は、対象に投与されたら、対象のＣＳＦ内に治療有効量のＨｘをもたらすように決定される。したがって、人工ＣＳＦに添加されるＨｘの量は、対象に投与される人工ＣＳＦの容積に依存する。
一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）Ｈｘを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、Ｈｘが無細胞ヘムと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｘに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む。
対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されるＣＳＦの容積と実質的に同一であるのが望ましい。例えば、５０ｍＬのＣＳＦサンプルが対象のＣＳＦコンパートメントから取り出される場合、治療有効量のＨｘを含む、約５０ｍＬの容積の人工ＣＳＦが、取り出されたＣＳＦの容積と置換するのに使用される。しかしながら、容積に違いが生じたとしても、そのいずれもが有意な有害臨床転帰を惹起しない限り、容積は異なってもよいものと理解される。いくつかの実施形態では、対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積よりも少ない。その他の実施形態では、対象に投与される人口ＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積を上回る。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後の約２１日以内にＨｘに曝露する工程を含む。本明細書で開示される別の実施形態では、方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後、約２日間～約４日間、Ｈｘに曝露する工程を含む。なおも別の実施形態では、方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後、約５日間～約１４日間、Ｈｘに曝露する工程を含む。
本発明者らは、クモ膜下腔内の無細胞ヘムを、治療有効量のＨｘに、少なくとも約２分間曝露することが、ＣＳＦにおいて検出可能なヘム：Ｈｘ複合体を形成するのに十分であることを驚くべきことに明らかにした。したがって、一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｘに曝露される期間は、少なくとも約２分（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４分など）である。一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｘに曝露される期間は、少なくとも約４分である。別の実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｘに曝露される期間は、少なくとも約５分である。なおも別の実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｘに曝露される期間は、少なくとも約１０分である。一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｘに曝露される期間は、約２分～約４５分、好ましくは約２分～約２０分、またはより好ましくは約４分～約１０分である。
用語「対象」とは、本明細書で使用される場合、処置または予防が望まれる哺乳動物の対象を指す。好適な対象の例証的事例として、霊長類、特にヒト、ネコやイヌなどのようなコンパニオン動物、ウマ、ロバなどのような使役動物、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなどのような家畜動物、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのような研究テスト用動物、および動物園や野生動物公園内の動物、シカ、ディンゴなどのような野生捕獲動物が挙げられる。一実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、対象は、（ｉ）出生～約２歳、（ｉｉ）約２～約１２歳、または（ｉｉｉ）約１２～約２１歳の小児患者である。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＳＦを治療有効量のＨｘに体外的に曝露する工程を含む。
ＣＳＦがＨｘに体外的に（ｅｘ ｖｉｖｏ）曝露される場合、治療有効量は、Ｈｘに曝露されるＣＳＦの容積に依存すると考えられ、ＣＳＦが、溶液の状態にあるまたは基材上に固定化されたＨｘ（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）、および上記のいずれかの組合せに曝露されるかを問わない。例えば、無細胞ヘムと複合体を形成させ、そしてアフィニティークロマトグラフィーにより無細胞ヘムを除去するために、ＣＳＦがＨｘに曝露される場合、基材上に固定化されるＨｘの量は、初回通過期間中に無細胞ヘムの完全な複合体形成を引き起こす必要はなく、複合体を形成させるために基材上を複数回通過させることが必要となり得、これにより実質的にすべての無細胞ヘムがＣＳＦから取り除かれるものと考えられる。
一実施形態では、方法は、（ｉ）出血性脳卒中後およびＣＳＦをＨｘに曝露する前の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂまたは無細胞ヘムの量を測定する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた無細胞Ｈｂまたは無細胞ヘムの濃度に基づき、Ｈｘの少なくとも等モル量を決定する工程を含む。ＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂおよび無細胞ヘムの量を測定する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例は本明細書に別途記載されている。
本明細書において別途指摘するように、ＣＳＦ内での無細胞ヘムとＨｘとの複合体形成は、脳組織上において、無細胞ヘムのそうでなければ有害な生物学的活性を中和する。本明細書に開示される方法に基づき形成された無細胞ヘム：Ｈｘ複合体を抽出するか、または取り除くことは一般的に不要であるが、いくつかの事例では、前記複合体を取り除くことが望ましい場合もある。例えば、本明細書に記載される方法が、対象に由来するＣＳＦを取り出し、そしてその後ＣＳＦをＨｘに体外的に曝露する工程を含む場合、ＣＳＦ内で形成された無細胞ヘム：Ｈｘ複合体を、ＣＳＦを対象に再投与するに前に取り除くことが望ましい場合もある。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、ＣＳＦ内に形成されたＨｘ：無細胞ヘム複合体を取り除く工程を含む。
一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
（ｉｉ）ＣＳＦ内でＨｘが無細胞ヘムと複合体を形成することを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｘに曝露する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に、ＣＳＦからＨｘ：無細胞ヘム複合体を抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより低い量の無細胞ヘムを有するヘム減少ＣＳＦを取得する工程；
（ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞ヘムを実質的に含まないヘム減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
（ｖ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたヘム減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
を含む。
本明細書で使用される場合、「ヘム減少ＣＳＦ」とは、工程（ｉｉｉ）の前の無細胞ヘムの量と比較したときに、ＣＳＦがそれよりも低い量の無細胞ヘム有するように、ある量の無細胞ヘムが除去されているＣＳＦを意味する。用語「ヘム減少ＣＳＦ」は、無細胞ヘムのすべてが、ＣＳＦから除去されていることを示唆するように意図するものではなく、したがって少なくとも若干の無細胞ヘムが存在する実施形態を含むものと理解される。一実施形態では、ヘム減少ＣＳＦは、ＣＳＦからＨｘ：無細胞ヘム複合体を抽出する前の、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞ヘムの量と比較したとき、それよりも少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、またはより好ましくは少なくとも約９５％少ない無細胞ヘムを含む。一実施形態では、ヘム減少ＣＳＦは、ＣＳＦからＨｘ：無細胞ヘム複合体を抽出する前の、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞ヘムの量と比較したとき、それよりも約５％～約１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約８０％～約９０％、またはより好ましくは約９０％～約９９％少ない無細胞ヘムを含む。
本明細書に別途記載されるように、ヘム減少ＣＳＦは、場合により、ＣＳＦから追加の無細胞ヘムを取り除くために、好ましくは無細胞ヘムを実質的に含まないヘム減少ＣＳＦを取得するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復することによりさらに処置されることがある。「無細胞ヘムを実質的に含まない」とは、Ｈｂ減少ＣＳＦが、ＣＳＦからＨｘ：無細胞ヘム複合体を抽出する前の対象から得られたＣＳＦ内無細胞ヘムの量と比較したとき、それよりも約７０％～約８０％、好ましくは約８０％～約９０％、またはより好ましくは約９０％～約９９％少ない無細胞ヘムを含むことを意味する。
一実施形態では、方法は、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１回など）反復する工程を含む。一実施形態では、方法は、無細胞ヘムを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、必要に応じて、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を少なくとも１回、好ましくは２回、好ましくは３回、好ましくは４回、好ましくは５回、好ましくは６回、好ましくは７回、好ましくは８回、好ましくは９回、またはより好ましくは１０回反復する工程を含む。
無細胞ヘムを実質的に含まないヘム減少ＣＳＦを取得するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が反復される必要がある回数は、対象に由来するＣＳＦ中の無細胞ヘムの濃度、採用されるヘムの濃度、抽出方法等を含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの因子に依存し得るものと理解される。いくつかの事例では、特に工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の反復が、ＣＳＦを細菌、酵母菌、菌類、およびウイルスなどのような汚染物質に曝露させてしまうおそれがある場合、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を１回のみ実施するのが望ましい場合もある。
Ｈｘ：無細胞ヘム複合体をＣＳＦから抽出する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例として、粒径排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。粒径排除クロマトグラフィーは、遊離ヘムおよびＨｘに対して複合体のサイズが相対的に大きいことから、Ｈｘ：無細胞ヘム複合体の同定、およびＣＳＦにおけるその他のコンポーネントからの分離を可能にする。アフィニティークロマトグラフィーは、ヘム：Ｈｘ複合体と特異的に結合し、遊離ヘムとの結合は無視し得る結合剤を使用することにより、Ｈｘ：無細胞ヘム複合体の同定、およびＣＳＦにおけるその他のコンポーネントからの分離を可能にする。好適な結合剤として、当業者にとってなじみ深いように、抗体またはその抗結合性断片が挙げられる。
一実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｘが固定された基材上を通過させる工程を含む。これは、有利には、ＣＳＦ中の無細胞ヘムがＨｘと結合し、これにより無細胞ヘムを基材に固定化し、そしてヘム減少ＣＳＦが基材から好都合に溶出するのを可能にする。したがって、一実施形態では、工程（ｉｉ）におけるＨｘは基材上に固定されている。好適な基材は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、粒径排除クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、フィルター、またはメンブレンが挙げられる。一実施形態では、基材は、粒径排除クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、フィルター、およびメンブレンからなる群から選択される。
一実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）から得られたＣＳＦを、ＣＳＦ中の無細胞ヘムが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、アフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含む；その場合、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）を経た樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含む；およびその場合、工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む。
工程（ｖｉ）において、工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたヘム減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する前に、本明細書に別途記載されるように、対象のＣＳＦコンパートメント内に存在し有害な二次神経学的転帰を惹起するおそれのある残留無細胞Ｈｂを除去するために、ヘム減少ＣＳＦに治療有効量のＨｐを添加するのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は、本明細書に別途記載されるように、工程（ｖ）の前のヘム減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｘを添加する工程を含む。
ＣＳＦが出血性脳卒中後の対象のＣＳＦコンパートメントから除去されたとしても、ＣＳＦコンパートメント内に残留無細胞Ｈｂが存在し得ることを、当業者は理解する。したがって、少なくとも若干の残留無細胞Ｈｂを取り除くために、ＣＳＦコンパートメントをリンスし（ＣＳＦが上記工程（ｉ）に基づき取り出されたら）、これにより、そのような残留無細胞ヘムが惹起し得る有害な二次神経学的転帰を取り除き、さもなければ低下させるのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は、工程（ｉ）の後に、洗浄溶液を用いてＣＳＦコンパートメントを洗浄する工程をさらに含む。
好適な洗浄溶液は当業者にとってなじみ深い。一実施形態では、洗浄溶液は人工ＣＳＦである。
人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）は、塩含有量を含め、一般的に天然のＣＳＦを模倣する液体である。ＣＳＦの好適な組成は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、米国特許第２００６００５７０６５号、およびＭａｔｚｎｅｌｌｅｒら（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１６；９７（５－６）：２３３－４４）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＣｌを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＣｌの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＨＣＯ３を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＨＣＯ３の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＫＣｌを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＫＣｌの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＨ２ＰＯ４を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＨ２ＰＯ４の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＭｇＣｌ２を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＭｇＣｌ２の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でグルコースを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のグルコースの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。あるいは、人工ＣＳＦは、ａＣＳＦを対象に投与するのに使用される任意のカテーテル内で細菌が増殖する可能性を低減するために、グルコースを省略する場合もある。
一実施形態では、人工ＣＳＦ／洗浄溶液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ６・Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、およびグルコースを含む。
一実施形態では、洗浄溶液はＨｘを含む。
一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約１００μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約５μＭ～約２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約１０μＭ～約１２０μＭのＨｘを含む。
一実施形態では、洗浄溶液は、出血後の対象のＣＦＳ中の無細胞ヘムの濃度に対して少なくとも等モル量のＨｘを含む。別の実施形態では、洗浄溶液は約３μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、対象のＣＳＦから無細胞ヘムを体外的に取り出す工程をなくし、むしろ本明細書に別途記載されるように、対象のＣＳＦを人工ＣＳＦと置換するのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の後に、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｘを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）を反復する工程；および
（ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）の後に、対象のＣＳＦコンパートメントに人工ＣＳＦを投与する工程
を含む。
治療有効量のＨｘを洗浄溶液中に組み込むことにより、ＣＳＦコンパートメント内の残留無細胞ヘムは、Ｈｘと複合体形成し、これにより脳組織に対する無細胞ヘムの有害な生物学的効果を中和し得る。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ６・Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、およびグルコースを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦはＨｘを含む。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１００μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約５μＭ～約２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１０μＭ～約１２０μＭのＨｘを含む。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、出血後の対象のＣＦＳ中の無細胞ヘムの濃度に対して少なくとも等モル量のＨｘを含む。別の実施形態では、人工ＣＳＦは約３μＭ～約１，３００μＭのＨｘを含む。
補助療法
出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法は、本明細書に記載されるように、出血性脳卒中後の対象における１つまたはそれ以上の有害な二次神経学的転帰を低下させ、阻害、防止し、さもなければ軽減するように設計された、１つまたはそれ以上の別の処置戦略と共に、連続して、またはそれと組み合わせて（例えば、同時に）好適に実施される可能性がある。したがって、一実施形態では、方法は、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための第２の薬剤を対象に対して投与する工程をさらに含む。出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための好適なその他の処置戦略または第２の薬剤は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として：
（ｉ）凝固障害の是正－例えば、ビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ）、新規の経口抗凝固剤（ダビガトラン、リバーロキサバン、およびアピキサバンなどのようなＮＯＡＣ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）および活性化組換え第ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、活性炭、抗血小板療法（ＡＰＴ）、およびアスピリン単剤療法を使用する；
（ｉｉ）血圧降下－例えば抗高血圧剤、その例証的事例として、（ｉ）クロルタリドン、クロルチアジド、ジクロロフェナミド（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎａｍｉｄｅ）、ヒドロフルメチアジド、インダパミド、およびヒドロクロロチアジドを含むチアジド化合物のような利尿薬；ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、およびトルセミドなどのようなループ利尿薬；アミロライドおよびトリアムテレンなどのようなカリウム保持性利尿剤；ならびにスピロノラクトン、エピレノン（ｅｐｉｒｅｎｏｎｅ）などのようなアルドステロンアンタゴニスト；（ｉｉ）アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、エスモロール、インデノロール、メタプロロール（ｍｅｔａｐｒｏｌｏｌ）、ナドロール、ネビボロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、ソタロール、テルタトロール、チリソロール、およびチモロールなどのようなβ－アドレナリン受容体遮断薬；（ｉｉｉ）アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、ベプリジル、シナルジピン（ｃｉｎａｌｄｉｐｉｎｅ）、クレビジピン、ジルチアゼム、エホニジピン、フェロジピン、ガロパミル、イスラジピン、ラシジピン、レミルジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモデピン（ｎｉｍｏｄｅｐｉｎｅ）、ニソルジピン、ニトレンジピン、マニジピン、プラニジピン、およびベラパミルなどのようなカルシウムチャネル遮断薬；（ｉｖ）ベナゼプリル；カプトプリル；シラザプリル；デラプリル；エナラプリル；ホシノプリル；イミダプリル；ロシノプリル（ｌｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）；モエキシプリル；キナプリル；キナプリラート；ラミプリル；ペリンドプリル；ペリンドロプリル（ｐｅｒｉｎｄｒｏｐｒｉｌ）；クアニプリル（ｑｕａｎｉｐｒｉｌ）；スピラプリル；テノカプリル（ｔｅｎｏｃａｐｒｉｌ）；トランドラプリル、およびゾフェノプリルなどのようなアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；（ｖ）オマパトリラート、カドキサトリル（ｃａｄｏｘａｔｒｉｌ）、およびエカドトリル、フォシドトリル（ｆｏｓｉｄｏｔｒｉｌ）、サンパトリラット、ＡＶＥ７６８８、ＥＲ４０３０などのような中性エンドペプチダーゼ阻害剤；（ｖｉ）テゾセンタン、Ａ３０８１６５、およびＹＭ６２８９９などのようなエンドセリンアンタゴニスト；（ｖｉｉ）ヒドララジン、クロニジン、ミノキシジル、およびニコチニルアルコールなどのような血管拡張薬；（ｖｉｉｉ）カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、プラトサルタン、タソサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、およびＥＸＰ－３１３７、ＦＩ６８２８Ｋ、およびＲＮＨ６２７０などのようなアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト；（ｉｘ）ニプラジロール、アロチノロール、およびアモスラロールなどのようなα／βアドレナリン受容体遮断薬；（ｘ）テラゾシン、ウラピジル、プラゾシン、ブナゾシン、トリマゾシン、ドキサゾシン、ナフトピジル、インドラミン、ＷＨＩＰ１６４、およびＸＥＮＯＩＯのようなα１遮断薬；ならびに（ｘｉ）ロフェキシジン、チアメニジン、モクソニジン、リルメニジン、およびグアノベンズ（ｇｕａｎｏｂｅｎｚ）などのようなα２アゴニストが挙げられる。
（ｉｉ－ｂ）血管拡張薬－例えば、ヒドララジン（アプレゾリン）、クロニジン（カタプレス）、ミノキシジル（ロニテン）、ニコチニルアルコール（ロニアコール）、シドノン、およびニトロプルシドナトリウム。
（ｉｉｉ）発作、グルコース、および体温の管理－例えば、抗てんかん薬、血中グルコースレベルを制御するためのインスリン輸注、正常体温の維持および治療的冷却；
（ｉｖ）外科的処置－例えば、血腫除去（外科的血栓除去）、減圧開頭術（ＤＣ）、低侵襲手術（ＭＩＳ；基底核出血の針穿刺吸引などのような）、組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔＰＡ）を用いたＭＩＳ；
（ｖ）手術の時期－例えば、症状発現後の４～９６時間；
（ｖｉ）トロンビン阻害－例えば、ヒルジン、アルガトロバン、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、メシル酸ナファモスタット）；
（ｖｉｉ）ヘムおよび鉄毒性の予防－例えば、スズ－メソポルフィリンなどのような非特異的ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）阻害剤、デフェロキサミンなどのような鉄キレート剤；
（ｖｉｉｉ）ＰＰＡＲｇアンタゴニストおよびアゴニスト－例えば、ロシグリタゾン、１５ｄ－ＰＧＪ２、およびピオグリタゾン；
（ｉｘ）ミクログリア活性化の阻害－例えば、タフトシン断片１～３（ミクログリア／マクロファージ阻害因子）またはミノサイクリン（テトラサイクリンクラス抗生物質）；
（ｘ）ＮＦ赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）の上方制御；
（ｘｉ）シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害－例えば、セレコキシブ（選択的ＣＯＸ２阻害剤）；
（ｘｉｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ；
（ｘｉｉｉ）ＴＮＦαモジュレーター－例えば、ＣＧＳ２１６８０などのようなアデノシン受容体アゴニスト、ＯＲＦ４－ＰＥなどのようなＴＮＦα特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；
（ｘｉｖ）血圧上昇－例えば、カテコールアミン；ならびに
（ｘｖ）ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害剤－例えば、抗体Ｍｔｓ５１０およびＴＡＫ－２４２（シクロヘキセン誘導体）；
が挙げられる。
一実施形態では、第２の薬剤は血管拡張薬である。好適な血管拡張薬は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、シドノンやニトロプルシドナトリウムが挙げられる。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、第２の薬剤は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムからなる群から選択される。
第２の薬剤はハプトグロビン（Ｈｐ）を含み得る。本明細書に別途記載されるように、本発明者らは、外因性ハプトグロビンは、臨床的に重要なＣＳＦ－Ｈｂ濃度範囲内において、抗血管攣縮および抗酸化効果を提供するのに使用可能であることを実証したが、これにより、ａＳＡＨの文脈において、ハプトグロビンおよびヘモペキシンを治療併用することで、無細胞Ｈｂおよび無細胞ヘムの血管攣縮および酸化効果に対する相乗的保護の実現が可能となると仮説を立てる。したがって、一実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象のＣＳＦを、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、治療有効量のＨｐに曝露する工程をさらに含む。
本明細書において別途指摘するように、本発明者らは、Ｈｐは、無細胞Ｈｂ媒介式のＣＶをｉｎ ｖｉｖｏで低下させ、さもなければ防止することができることを見出した。本明細書に開示される方法がヘム媒介式のＣＶを低下させ、さもなければ防止する程度は、いくつかの因子、例えば出血性脳卒中後の無細胞Ｈｂにより誘発される血管収縮（血管の狭小化）の程度、出血性脳卒中後の対象のＣＳＦ内無細胞Ｈｂ濃度、ＣＳＦがＨｐに曝露される期間、および何らかの持続性出血の有無等に依存し得るものと理解される。本明細書に開示の方法が対象におけるＣＶを低下させ、さもなければ防止したか評価する手段は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）血管造影法（ＣＴＡ）、磁気共鳴（ＭＲ）血管造影法（ＭＲＡ）、およびカテーテル血管造影法（ＣＡ）が挙げられる。
一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ＤＳＡにより決定される場合、６０分間の曝露後に、収縮した脳血管の管腔の平均直径を、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。
一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ＤＳＡにより決定される場合、６０分間の曝露後に、収縮した前大脳動脈の管腔の平均直径を、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。
一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ＤＳＡにより決定される場合、６０分間の曝露後に、収縮した内頸動脈の管腔の平均直径を、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。
一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ＤＳＡにより決定される場合、６０分間の曝露後に、収縮した中大脳動脈の管腔の平均直径を、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。
一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ＤＳＡにより決定される場合、６０分間の曝露後に、収縮した脳底動脈の管腔の平均直径を、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。
一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでの潅流画像化法（例えば、ＭＲＩ灌流法、ＣＴ灌流法）により決定される場合、６０分間の曝露後に、収縮した細い実質管腔（ｓｍａｌｌ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｖｅｓｓｅｌ）（例えば、脳細動脈）の管腔の平均直径を、少なくとも１０％、好ましくは約２０％、好ましくは約２５％、好ましくは約３０％、好ましくは約３５％、好ましくは約４０％、好ましくは約４５％、好ましくは約５５％、好ましくは約６０％、好ましくは約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約７５％、またはより好ましくは約８０％増加させる。一実施形態では、細い実質管腔は脳細動脈である。一実施形態では、それを必要とする対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでの潅流画像化法（例えば、ＭＲＩ灌流法、ＣＴ灌流法）により決定される場合、６０分間の曝露後に、細い実質管腔の収縮を防止することにより、脳微小潅流を、少なくとも１０％、好ましくは約２０％、好ましくは約２５％、好ましくは約３０％、好ましくは約３５％、好ましくは約４０％、好ましくは約４５％、好ましくは約５５％、好ましくは約６０％、好ましくは約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約７５％、またはより好ましくは約８０％回復させる。一実施形態では、細い実質管腔は脳細動脈である。
本明細書において別途指摘するように、本発明者らは、治療有効量のＨｐはＣＳＦ内無細胞Ｈｂの酸化能力を低下させることができることを初めて明らかにした。したがって、一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露すれば、本明細書に記載されるように、酸化性組織傷害が低下する。酸化性組織傷害を決定するための好適な方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、脂質過酸化の最終生成物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベルを測定することを含め、Ｋａｔｅｒｊｉら（２０１９；Ｏｘｉｄ．Ｍｅｄ．Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｙ；１２７９２５０）に記載されている。したがって、一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露すれば、本明細書に記載されるように、脂質過酸化が低下する。
ハプトグロビン
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、ジスルフィド結合によりリンクした２本のα鎖および２本のβ鎖を含む四量体構造を有する。β鎖（アミノ酸２４５個）は約４０ｋＤａ（そのおよそ３０％ｗ／ｗは炭水化物である）の質量を有し、そしてすべての表現型により共有されている。α鎖は、少なくとも２つの形態：α１（アミノ酸８３個、９ｋＤａ）およびα２（アミノ酸１４２個、１７．３ｋＤａ）で存在する。したがって、ＨｐはＨｐ１－１、Ｈｐ２－１、およびＨｐ２－２と呼ばれる３つの表現型として生ずる。Ｈｐ１－１は２つのα１鎖を含有し、Ｈｐ２－２は２つのα２鎖を含有し、ならびにＨｐ２－１は１つのα１鎖および１つのα２鎖を含有する。Ｈｐ１－１は１００ｋＤａ、またはＨｂと複合体化したときには１６５ｋＤａの分子質量を有する。Ｈｐ１－１は単一のアイソフォームとして存在し、そしてＨｐダイマーとも呼ばれる。Ｈｐ２－１は平均分子質量２２０ｋＤａを有し、そして線状ポリマーを形成する。Ｈｐ２－２は平均分子質量４００ｋＤａを有し、そして環状ポリマーを形成する。異なる各ポリマー形態は、異なるアイソフォームである。ＰＣＲ法が、Ｈｐ多型を研究するために考案された（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：１３７７－１３８２）。
２つ重要な対立遺伝子、Ｈｐ１およびＨｐ２が、第１６染色体上に見出されるＨｐ遺伝子について存在する。２つの対立遺伝子が、構造的多型：ホモ接合型（１－１または２－２）およびヘテロ接合型２－１といった、考え得る３つの異なる遺伝子型に関与している。欧米の集団において、Ｈｐ１－１の分布は約１６％であり、Ｈｐ２－１は約４８％であり、そしてＨｐ２－２は約３６％であると見積もられている。Ｈｐは、２つサブユニットα鎖およびβ鎖（ジスルフィド結合により結びついている）に切断される。両対立遺伝子は同一のβ鎖を共有する。β鎖はＨｂとの結合に関わり、したがって両遺伝子型は類似したＨｂ結合親和性を有する。
無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより無細胞Ｈｂの生物学的活性を中和する能力を有する限り、天然に存在する、および組換え型Ｈｐが、本明細書に記載される方法に適するものと理解される。Ｈｐの適する天然に存在する形態は当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｋｏｃｈら（２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：１３７７－１３８２）、およびＫａｓｖｏｓｖｅら（２０１０，Ｃｈａｐｔｅｒ ２－Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０：２３－４６）に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。
一実施形態では、Ｈｐは、血漿由来のＨｐを含み、それから構成または実質的に構成される。Ｈｐは好ましくはヒトＨｐである。天然起源のＨｐ（例えば、血漿）からＨｐを単離するための様々なプロトコールは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、米国特許第４、０６１、７３５号および同第４、１３７、３０７号（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら）、ならびに米国特許公報第２０１４００９４４１１号（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。天然起源のＨｐからＨｐを単離するためのその他の適する方法は、ＫａｔｎｉｋおよびＪａｄａｃｈ（１９９３，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｚ）４１：３０３－３０８）、Ｔｓｅｎｇら（２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３３：２６５－２７３）、Ｋａｔｎｉｋら（１９９５，Ｅｕｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７２７－７３２）、ＹａｎｇおよびＭａｏ（１９９９，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，７３１：３９５－４０２）、ならびにＢａｓｌｅｒおよびＢｕｒｒｅｌ（１９８３ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ７（４）：３８７－４００）に記載されている。
用語「ハプトグロビン」は、本明細書で使用される場合、Ｈｐのすべての表現型を含む（すべてのアイソフォームを含む）ものと理解される。Ｈｐは、均質（同一アイソフォームのＨｐから実質的に構成される場合）、または不均質（Ｈｐ１－１、Ｈｐ１－２、およびＨｐ２－２を含む、異なるＨｐアイソフォームの組合せを含む場合）であり得る。Ｈｐの組成は、元となるＨｐの表現型に最終的に依存するものと理解される。例えば、プールされた血漿サンプルがＨｐを抽出／精製するのに使用される場合には、Ｈｐの２つ以上のアイソフォームが単離される可能性がある。単離物中に存在するＨｐアイソフォームを決定するための適する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｓｈｉｈら（２０１４，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，８９（４）：４４３－４４７）で議論されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。単離物中に存在するＨｐアイソフォームを決定するその他の適する方法として、高性能粒径排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣアッセイ）、Ｈｐ ＥＬＩＳＡ、および比濁測定法（ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅａｄｉｎｇ）が挙げられ、Ｈｐの異なるアイソフォームが異なるアッセイにおいて異なるシグナルを一般的にもたらす。
一実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体を含み、それから構成または実質的に構成される。Ｈｐは天然に存在するＨｐ（例えば、血漿由来）であり得るか、または組換えタンパク質として生成し得るが、その例証的事例は本明細書に別途記載されている。一実施形態では、血漿由来のＨｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体を含み、それから構成または実質的に構成される。一実施形態では、Ｈｐは、組換えＨｐを含み、それから構成または実質的に構成される。
別途記載しない限り、用語Ｈｐには、本明細書で使用される場合、天然の、または天然に存在するＨｐの機能的類似体が含まれる。用語「機能的類似体」とは、天然に存在する（天然型の）Ｈｐの生物学的活性と実質的に同一の生物学的活性を共有する物質（ただし生物学的活性が、少なくとも無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその生物学的活性を中和する類似体の能力である限りにおいて）を意味するものと理解される。「実質的に同一の生物学的活性」とは、機能的類似体は、天然に存在するＨｐアイソフォーム（例えば、Ｈｐ１－１、Ｈｐ１－２、およびＨｐ２－２）を含む、天然に存在するＨｐの結合親和性の少なくとも４０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％等）である結合親和性を、無細胞Ｈｂに対して有することを一般的に意味する。物質がＨｐの機能的類似体であるか決定するための適する方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例（例えば、無細胞Ｈｂ誘発性の脳血管攣縮を低下させる機能的類似体の能力）は本明細書に別途記載される。
本明細書で開示される一実施形態では、Ｈｐの機能的類似体は、天然型Ｈｐの機能的断片である。天然型Ｈｐの機能的断片は、断片が無細胞Ｈｂと複合体を形成する能力を保持し、これによりその生物学的活性を中和する限り、任意の適する長さであり得る。
別の実施形態では、機能的類似体は、天然に存在する（天然型の）Ｈｐ分子とは異なるアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、コンパレーター）である。機能的類似体は、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、またはそれより多くの）アミノ酸置換により、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する分子を含み得るが、ただし、前記差異は、類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその生物学的活性を中和する能力を無効化しない、または完全には無効化しない。いくつかの実施形態では、機能的類似体は、天然型Ｈｐと比較して、類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成する能力を強化するアミノ酸置換を含む。一実施形態では、機能的類似体は、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換により、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、所与の位置において、アミノ酸の同一性を変化させて、それをほぼ等価なサイズ、電荷、および／または極性のアミノ酸に置き換えることを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例として、下記の８つの置換群（慣習的な１文字コードで表す）：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；（７）Ｅ、Ｄ；および（８）Ｃ、Ｓが挙げられる。
一実施形態では、機能的類似体は、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。「少なくとも８５％」という場合、それには、例えば、最適なアライメントまたは最良適合分析を行った後の、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性が含まれる。したがって、一実施形態では、配列は、例えば最適なアライメントまたは最良適合分析を行った後に、本明細書において識別された配列と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、または好ましくは１００％の配列同一性または配列相同性を有する。
用語「同一性」、「類似性」、「配列同一性」、「配列類似性」、「相同性」、「配列相同性」などは、本明細書で使用される場合、本明細書において別途記載されるように、アライメント済みの配列内の任意の特定のアミノ酸残基位置において、アミノ酸残基が、アライメント後の配列の間で同一であることを意味する。用語「類似性」または「配列類似性」は、本明細書で使用される場合、本明細書において別途記載されるように、アライメント済みの配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基のタイプが配列間で類似することを表す。一実施形態では、アミノ酸配列は、改変が、非改変（天然型）Ｈｐポリペプチドと比較したとき、改変後のポリペプチドの結合特異性または機能的活性に対して影響を及ぼさないように、その中に含まれるアミノ酸残基のいずれかを保存的に置換することによって改変される。
一実施形態では、機能的類似体は、類似体の安定性を増加させるか、または類似体の溶解度を増加させるために、天然型Ｈｐと比較して、アミノ酸置換および／またはその他の改変を含む。機能的類似体は、天然に存在する化合物／ペプチドであり得るか、または当業者にとって公知の方法を使用して、化学合成により合成的に製造することができる。
Ｈｐは、微生物内で、組換えタンパク質として好適に生成される場合もあり、それは単離可能、および所望の場合にはさらに精製可能である。組換えＨｐを産生させるための好適な微生物は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、細菌、酵母菌、もしくは菌類、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）、または組換えウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、またはセンダイウイルス）が挙げられる。組換えペプチドを生成するための好適な細菌は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはペプチド配列を発現する能力を有する任意のその他のバクテリアが挙げられる。組換えペプチドを生成するための好適な酵母菌タイプの例証的事例として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ属、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはペプチドを発現する能力を有する任意のその他の酵母菌が挙げられる。対応する方法は、当技術分野において周知されている。組換えにより生成されたペプチド配列を単離および精製するための方法も当技術分野において周知されており、例えばゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
本明細書に記載されるように、組換えＨｐの単離を促進するために、融合ポリペプチドを作製することができ、その場合、Ｈｐのペプチド配列またはその機能的類似体は、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする異種ポリペプチドと翻訳において融合している（共有結合的にリンクする）。好適な異種ポリペプチドの例証的事例は、Ｈｉｓ－Ｔａｇ（例えば、Ｈｉｓ６。６個のヒスチジン残基）、ＧＳＴ－Ｔａｇ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）などである。
組換えＨｐを製造する場合、例えばコンビナトリアル化学の手段により製造するのに、またはきわめて変動性の構造についてハイスループットスクリーニング技術によって取得するのに、ファージライブラリーおよび／またはペプチドライブラリーも適する（例えば、Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ（Ｅｄｉｔｏｒ），ｅｔ ａｌ．；およびＷｉｌｌａｔｓ ＷＧ Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５０（６）：８３７－５４を参照）。
組換えＨｐの例証的事例として、受託番号ＮＰ＿００５１３４（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、２０１８，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４８７，８４－８９により記載される）、および受託番号Ｐ００７３８を有するペプチドが挙げられる。
Ｈｐは、融合タンパク質の一部として、Ｈｘの文脈において本明細書に別途記載されるものを含む、１つまたはそれ以上の異種部分に融合、カップリング、さもなければ連結し得る。
Ｈｐの文脈において、用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、それを必要としている対象に投与されたとき、Ｈｐが、対象のＣＳＦ中に存在する無細胞Ｈｂと結合し、そしてそれと複合体を形成し、これにより無細胞Ｈｂのそうでなければ有害な生物学的効果を中和することを可能にするのに十分であるＨｐの量または濃度を意味する。治療有効量のペプチドは、いくつかの因子に依存して変化し得ることが当業者により理解されるが、その例証的事例として、Ｈｐが対象に直接投与されるか、その投与法（例えば、髄腔内、頭蓋内、または脳室内）、処置される対象の健康および身体状態、処置される対象の分類群、出血の重症度（例えば、出血の範囲）、投与経路、ＣＳＦコンパートメント内の無細胞Ｈｂの濃度および／または量、ならびに上記のいずれかの組合せが挙げられる。
Ｈｐの治療有効量は、当業者により決定可能な比較的幅広い範囲に及ぶ。Ｈｐの好適な治療有効量の例証的事例として、約２μＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約２μＭ～約５ｍＭ、好ましくは約１００μＭ～約５ｍＭ、好ましくは約２μＭ～約３００μＭ、好ましくは約５μＭ～約１００μＭ、好ましくは約５μＭ～約５０μＭ、またはより好ましくは約１０μＭ～約３０μＭが挙げられる。
一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約２０ｍＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約５ｍＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約１００μＭ～約５ｍＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約３００μＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約５μＭ～約５０μＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約１０μＭ～約３０μＭである。
一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、出血後の対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂ濃度に対して、少なくとも等モル量である。別の実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約３μＭ～約３００μＭのＣＳＦ内無細胞Ｈｂと複合体形成するのに十分な量である。ＣＳＦ内無細胞Ｈｂの濃度を測定する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．，２００１，ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ１６６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，５４（１１）：８２７－８３０）、およびＨｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．；１２０：ｅ６６０－ｅ６６６）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
治療有効量のＨｐの実現は、本明細書に記載されるように、Ｈｐまたはその機能的類似体が曝露されるＣＳＦの最終容積に依存し得るものと理解される。例えば、Ｈｐが成人ヒト対象に投与される（例えば、髄腔内に）場合、成人ヒト対象におけるＣＳＦの平均容積が約１５０ｍＬであることを考慮すると、約３１０μＭのＨｐ溶液、５ｍＬを対象に投与することで、約１０μＭのＨｐの治療有効量が実現可能である。別の例証的事例では、本明細書に記載される方法は、５０ｍＬの対象由来のＣＳＦを除去すること、および約３０μＭのＨｐを含む５０ｍＬの人工ＣＳＦを用いてそれと置換し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて約１０μＭのＨｐの治療有効量を実現することを含む。
Ｈｐの投与量は、最適な治療応答を実現するように調整される場合もある。例えば、いくつかの分割された用量が、毎日、毎週、またはその他の適する時間間隔で投与される場合があり、または投与量は、状況の緊急性の示唆に従い比例的に減じられることがある。
Ｈｐの文脈において、用語「治療有効量」は、それを必要としている対象に投与されるとき、対象のＣＳＦ中に存在するすべての無細胞Ｈｂと複合体を形成し、そしてそれを中和するＨｐの量または濃度を意味するものではないものと理解される。いくつかの実施形態では、治療有効量のＨｐが、それを必要としている対象に投与されたときに、対象のＣＳＦ中への出血性脳卒中後に無細胞Ｈｂにより媒介される、対象内の有害な二次神経学的転帰を最小限に抑え、無効にするか、さもなければ低下させるように、対象のＣＳＦ中に存在する十分量の無細胞Ｈｂと複合体を形成し、そしてそれを中和することで十分である。対象のＣＳＦ中への出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を最小限に抑え、それを無効にするか、さもなければ低下させるのに必要とされる、処置後の対象のＣＳＦにおける無細胞Ｈｂ濃度の低下は、本明細書に記載されるように、当業者にとってなじみ深い。一実施形態では、治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内無細胞Ｈｂの量を、約８μＭ以下、好ましくは約７μＭ以下、好ましくは約６μＭ以下、好ましくは約５μＭ以下、好ましくは約４μＭ以下、好ましくは約３μＭ以下、好ましくは約２μＭ以下、またはより好ましくは約１μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である。一実施形態では、治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内無細胞Ｈｂの量を、約７μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である。一実施形態では、治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内無細胞Ｈｂの量を、約６μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である。
Ｈｐの文脈において、用語「～を曝露すること（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」とは、本明細書で使用される場合、ＨｐがＣＳＦ中に存在する無細胞Ｈｂ（その主要な形態はｏｘｙＨｂである）と結合し、そしてそれと複合体を形成し、これによりＨｂ：Ｈｐ複合体の形成が、無細胞Ｈｂの脳組織に対する、そうでなければ有害な生物学的効果を実質的に中和することが可能となるように、ＣＳＦをＨｐと接触させることを意味する。「実質的に中和する」とは、治療的Ｈｐが存在しない場合に無細胞Ｈｂが脳組織に及ぼす生物学的効果と比較して、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％を含む、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下として主観的または定性的に表されるような、無細胞Ｈｂが脳組織に及ぼす有害な生物学的効果の低下を意味する。無細胞Ｈｂの有害な生物学的効果の低下が測定可能または決定可能である（定性的または定量的に）方法は、当業者によってなじみ深く、その例証的事例は本明細書において別途記載される。
それを必要としている対象のＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される方式は、本明細書に記載されるように、例えば、前記曝露がそれを必要としている対象のＣＳＦコンパートメント内で実施されるか（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）、または対象から得られたＣＳＦにおいて体外的に実施されるか（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ）に応じて変化し得るものと理解される。前記曝露が、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメント内で実施される（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）場合、Ｈｐの投与経路は、ＣＳＦコンパートメント内でＨｐが無細胞Ｈｂと接触するのが可能となるように選択される。好適な投与経路は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、髄腔内、頭蓋骨内、および脳室内が挙げられる。一実施形態では、治療有効量のＨｐは、例えば、出血性脳卒中後の対象内に、ＣＳＦを一時的に流出させ、そして頭蓋内圧を下げるために配置される外部脳室ドレイン経由で投与される。
一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを対象に頭蓋内投与する工程を含む。
一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、その脊椎管中に髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、そのクモ膜下腔中に髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、脳室内投与する工程を含む。
代替的にまたは付加的に、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象からＣＳＦを取り出す工程、ＣＳＦ内でＨｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、ＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程、ＣＳＦ内に形成されたＨｂ：Ｈｐ複合体を除去してＨｂ減少ＣＳＦを生成する工程、およびＨｂ減少ＣＳＦを対象に投与する工程（例えば、髄腔内または脳室内）を含む。ＣＳＦをＣＳＦコンパートメントから除去しても、ＣＳＦのまったく存在しないＣＳＦコンパートメントが一般的にもたらされるわけではないものと理解され、少なくとも若干のＣＳＦがＣＳＦコンパートメント内に存続することに留意されたい。場合により、ＣＳＦコンパートメント内に存在し得る少なくとも若干量の残留Ｈｂを取り除くために、ＣＳＦが取り出されたら、ＣＳＦコンパートメントを、薬学的に許容される洗浄溶液でリンスすることができる。さらに複合体形成させ、これによりＣＳＦコンパートメント内に存在し得る少なくとも若干量の残留無細胞Ｈｂを中和するために、洗浄溶液は、場合によりＨｐを含み得る。一実施形態では、洗浄溶液は、本明細書において別途記載されるような人工ＣＳＦである。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取り出す工程、ＨｐをＣＳＦサンプルに添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象のＣＳＦコンパートメントに投与し、これによって、Ｈｐが対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂを中和することを可能にするのに十分な期間、ＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程、および場合により、上記工程を反復する工程を含む。好ましくは、ＣＳＦサンプルに添加されるＨｐの量は、対象に投与すると、対象のＣＳＦ内に治療有効量のＨｐをもたらすように決定される。したがって、ＣＳＦサンプル中に添加されるＨｐの量は、取り出され、そして対象に再投与されるＣＳＦサンプルの容積に依存する。
一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｐを添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これにより、対象のＣＳＦコンパートメントにおいてＨｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む。
取り出され、そして対象に再投与されるＣＳＦの容積は、実質的に同一であるのが望ましい。例えば、５０ｍＬのＣＳＦサンプルが対象のＣＳＦコンパートメントから取り出される場合、Ｈｐを含むＣＳＦの全５０ｍＬの容積が対象に再投与される。しかしながら、容積に違いが生じたとしても、そのいずれもが有意な有害臨床転帰を惹起しない限り、容積は異なってもよいものと理解される。いくつかの実施形態では、対象に再投与されるＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積よりも少ない。その他の実施形態では、対象に再投与されるＣＳＦの容積は、Ｈｐを単独で、または任意のその他の治療薬と組み合わせて添加することで余分の容積が生まれることから、対象から除去されたＣＳＦの容積を上回る。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程、対象から取り出されたＣＳＦの容積を、Ｈｐを含むある容積の人工ＣＳＦと置換し、これにより、Ｈｐが対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂを中和することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む。好ましくは、人工ＣＳＦ内のＨｐの量は、対象に投与されたら、対象のＣＳＦ内に治療有効量のＨｐをもたらすように決定される。したがって、人工ＣＳＦに添加されるＨｐの量は、対象に投与される人工ＣＳＦの容積に依存する。
一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）Ｈｐを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む。
対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されるＣＳＦの容積と実質的に同一であるのが望ましい。例えば、５０ｍＬのＣＳＦサンプルが対象のＣＳＦコンパートメントから取り出される場合、治療有効量のＨｐを含む、約５０ｍＬの容積の人工ＣＳＦが、取り出されたＣＳＦの容積と置換するのに使用される。しかしながら、容積に違いが生じたとしても、そのいずれもが有意な有害臨床転帰を惹起しない限り、容積は異なってもよいものと理解される。いくつかの実施形態では、対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積よりも少ない。その他の実施形態では、対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積を上回る。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後の約２１日以内にＨｐに曝露する工程を含む。本明細書で開示される別の実施形態では、方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後、約２日間～約４日間、Ｈｐに曝露する工程を含む。なおも別の実施形態では、方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後、約５日間～約１４日間、Ｈｐに曝露する工程を含む。
一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約２分（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４分など）である。一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約４分である。別の実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約５分である。なおも別の実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約１０分である。一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約２分～約４５分、好ましくは約２分～約２０分、またはより好ましくは約４分～約１０分である。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＳＦを治療有効量のＨｐに体外的に曝露する工程をさらに含む。
ＣＳＦがＨｐに体外的に（ｅｘ ｖｉｖｏ）曝露される場合、治療有効量は、Ｈｐに曝露されるＣＳＦの容積に依存すると考えられ、ＣＳＦが、溶液の状態にあるかまたは基材上に固定化されたＨｐ（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）、および上記のいずれかの組合せに曝露されるかを問わない。例えば、無細胞Ｈｂと複合体を形成させ、そしてアフィニティークロマトグラフィーにより無細胞Ｈｂを除去するために、ＣＳＦがＨｐに曝露される場合、基材上に固定化されるＨｐの量は、初回通過期間中に無細胞Ｈｂの完全な複合体形成を引き起こす必要はなく、複合体を形成させるために基材上を複数回通過させることが必要となり得、これにより実質的にすべての無細胞ＨｂがＣＳＦから取り除かれるものと考えられる。
一実施形態では、方法は、（ｉ）出血性脳卒中後およびＣＳＦをＨｐに曝露する前の、対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた無細胞Ｈｂの濃度に基づき、Ｈｐの少なくとも等モル量を決定する工程を含む。ＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する好適な方法は、当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｏｈら（２０１６，Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：１６７－１７７）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
本明細書において別途指摘するように、ＣＳＦ内でのＨｂと無細胞Ｈｂとの複合体形成は、脳組織上において、無細胞Ｈｂのそうでなければ有害な生物学的活性を中和する。本明細書に開示される方法に基づき形成された無細胞Ｈｂ：Ｈｐ複合体を抽出し、または取り除くことは一般的に不必要であるが、いくつかの事例では、前記複合体を取り除くことが望ましい場合もある。例えば、本明細書に記載される方法が、対象に由来するＣＳＦを取り出し、そしてその後ＣＳＦをＨｐに体外的に曝露する工程を含む場合、ＣＳＦ内で形成された無細胞Ｈｂ：Ｈｐ複合体を、ＣＳＦを対象に再投与するに前に取り除くことが望ましい場合もある。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、ＣＳＦ内に形成されたＨｐ：無細胞Ｈｂ複合体を取り除く工程を含む。
一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
（ｉｉ）ＣＳＦにおいて、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐに曝露する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体を、工程（ｉｉ）の後のＣＳＦから抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより少ない量の無細胞Ｈｂを有するＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；
（ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
（ｖ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「Ｈｂ減少ＣＳＦ」とは、工程（ｉｉｉ）の前の無細胞Ｈｂの量と比較したときに、ＣＳＦがそれよりも低い量の無細胞Ｈｂ有するように、ある量の無細胞Ｈｂが除去されているＣＳＦを意味する。用語「Ｈｂ減少ＣＳＦ」は、無細胞Ｈｂのすべてが、ＣＳＦから除去されていることを示唆するように意図するものではなく、したがって少なくとも若干の無細胞Ｈｂが存在する実施形態を含むものと理解される。一実施形態では、Ｈｂ減少ＣＳＦは、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの量と比較したとき、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、またはより好ましくは少なくとも約９５％少ない無細胞Ｈｂを含む。一実施形態では、Ｈｂ減少ＣＳＦは、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの量と比較したとき、約５％～約１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約８０％～約９０％、またはより好ましくは約９０％～約９９％少ない無細胞Ｈｂを含む。
本明細書に別途記載されるように、Ｈｂ減少ＣＳＦは、場合により、ＣＳＦから追加の無細胞Ｈｂを取り除くために、好ましくは無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復する工程によりさらに処置されてもよい。「無細胞Ｈｂを実質的に含まない」とは、Ｈｂ減少ＣＳＦが、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの量と比較したときに、約７０％～約８０％、好ましくは約８０％～約９０％、またはより好ましくは約９０％～約９９％少ない無細胞Ｈｂを含むことを意味する。
一実施形態では、方法は、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１回など）反復する工程を含む。一実施形態では、方法は、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、必要に応じて、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を少なくとも１回、好ましくは２回、好ましくは３回、好ましくは４回、好ましくは５回、好ましくは６回、好ましくは７回、好ましくは８回、好ましくは９回、またはより好ましくは１０回反復する工程を含む。
無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が反復される必要がある回数は、対象に由来するＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの濃度、採用されるＨｂの濃度、抽出方法などを含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの因子に依存し得るものと理解される。いくつかの事例では、特に工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の反復が、ＣＳＦを細菌、酵母菌、菌類、およびウイルスなどのような汚染物質に曝露させてしまうおそれがある場合、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を１回のみ実施するのが望ましい場合もある。
Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体をＣＳＦから抽出する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例として、粒径排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。粒径排除クロマトグラフィーは、遊離ＨｂおよびＨｐに対して複合体のサイズが相対的に大きいことから、Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体の同定、およびＣＳＦにおけるその他のコンポーネントからの分離を可能にする。アフィニティークロマトグラフィーは、Ｈｂ：Ｈｐ複合体と特異的に結合し、遊離Ｈｂとの結合は無視し得る結合剤を使用することにより、Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体の同定、およびＣＳＦにおけるその他のコンポーネントからの分離を可能にする。好適な結合剤として、当業者にとってなじみ深いように、抗体またはその抗結合性断片が挙げられる。
一実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐが固定化された基材上を通過させる工程を含む。これは、有利には、ＣＳＦ中の無細胞ＨｂがＨｐと結合し、これにより無細胞Ｈｂを基材に固定化し、そしてＨｂ減少ＣＳＦが基材から好都合に溶出するのを可能にする。したがって、一実施形態では、工程（ｉｉ）におけるＨｐは基材上に固定化されている。好適な基材は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、粒径排除クロマトグラフィー樹脂およびアフィニティークロマトグラフィー樹脂が挙げられる。一実施形態では、基材はアフィニティークロマトグラフィー樹脂である。
一実施形態では、工程（ｉｉ）は、ＣＳＦ中の無細胞Ｈｂが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをアフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含み、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）後に樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含み、および工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む。
工程（ｖｉ）において、工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する前に、本明細書に別途記載されるように、対象のＣＳＦコンパートメント内に存在し、有害な二次神経学的転帰を惹起するおそれのある残留無細胞Ｈｂを除去するために、Ｈｂ減少ＣＳＦに治療有効量のＨｐを添加するのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は、本明細書に別途記載されるように、工程（ｖ）の前のＨｂ減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｐを添加する工程を含む。
ＣＳＦが出血性脳卒中後の対象のＣＳＦコンパートメントから除去されたとしても、ＣＳＦコンパートメント内に残留無細胞Ｈｂが存在し得ることを、当業者は理解する。したがって、少なくとも若干の残留無細胞Ｈｂを取り除くために、ＣＳＦコンパートメントをリンスし（ＣＳＦが上記工程（ｉ）に基づき取り出されたら）、これにより、そのような残留無細胞Ｈｂが惹起し得る有害な二次神経学的転帰を取り除き、さもなければ低下させるのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は、工程（ｉ）の後に、洗浄溶液を用いてＣＳＦコンパートメントを洗浄する工程をさらに含む。
好適な洗浄溶液は当業者にとってなじみ深い。一実施形態では、洗浄溶液は、本明細書に別途記載されるように人工ＣＳＦである。
一実施形態では、洗浄溶液はＨｐをさらに含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。
一実施形態では、洗浄溶液は、出血後の対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの濃度に対して少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、洗浄溶液は約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、対象のＣＳＦから無細胞Ｈｂを体外的に取り出す工程をなくし、むしろ本明細書に別途記載されるように、対象のＣＳＦを人工ＣＳＦと置換するのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の後に、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）を反復する工程；および
（ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）の後に、対象のＣＳＦコンパートメントに人工ＣＳＦを投与する工程
を含む。
治療有効量のＨｐを洗浄溶液中に組み込むことにより、ＣＳＦコンパートメント内の残留無細胞Ｈｂは、Ｈｐと複合体形成し、これにより脳組織に対する無細胞Ｈｂの有害な生物学的効果を中和し得る。
人工ＣＳＦ
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載されるように、Ｈｘを含む人工脳脊髄液（ＣＳＦ）が提供される。
人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）は、一般的に、塩含有物を含めることにより天然のＣＳＦを模倣する液体である。ａＣＳＦの好適な組成物は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、米国特許第２００６００５７０６５号、およびＭａｔｚｎｅｌｌｅｒら（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１６；９７（５－６）：２３３－４４、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる）に記載されている。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度に類似した濃度でＮａＣｌを含み得、そして天然のＣＳＦ内のＮａＣｌの濃度から約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度に類似した濃度でＮａＨＣＯ３を含み得、そして天然のＣＳＦ内のＮａＨＣＯ３の濃度から約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度に類似した濃度でＫＣｌを含み得、そして天然のＣＳＦ内のＫＣｌの濃度から約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度に類似した濃度でＮａＨ２ＰＯ４を含み得、そして天然のＣＳＦ内のＮａＨ２ＰＯ４の濃度から約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度に類似した濃度でＭｇＣｌ２を含み得、そして天然のＣＳＦ内のＭｇＣｌ２の濃度から約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度に類似した濃度でグルコースを含み得、そして天然のＣＳＦ内のグルコースの濃度から約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。代替的に、人工ＣＳＦは、ａＣＳＦを対象に投与するのに使用される任意のカテーテル内でバクテリアが増殖する可能性を低下させるためにグルコースを省略することができる。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１００μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約５μＭ～約２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１０μＭ～約１２０μＭのＨｘを含む。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、出血後の対象のＣＦＳ内の無細胞ヘムの濃度に対して、少なくとも等モル量のＨｘを含む。別の実施形態では、人工ＣＳＦは、約３μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、Ｈｐをさらに含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。
一実施形態では、人工ＣＳＦは、出血後の対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｐの濃度に対して、少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、人工ＣＳＦは、約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。
一実施形態では、人工的ＣＳＦは、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘ、および約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工的ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｘ、および約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工的ＣＳＦは、約１００μＭ～約２０ｍＭのＨｘ、および約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工的ＣＳＦは、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘ、および約２μＭ～約３００ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工的ＣＳＦは、約５μＭ～約２００μＭのＨｘ、および約２μＭ～約５０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工的ＣＳＦは、約１０μＭ～約１２０μＭのＨｘ、および約２μＭ～約３０ｍＭのＨｐを含む。
医薬組成物
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬組成物であって、本明細書に記載されるような治療有効量のＨｘおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用される医薬組成物であって、本明細書に記載されるような治療有効量のＨｘおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｘを含む。一実施形態では、組成物は、約１００μＭ～約２０ｍＭのＨｘ、またはその機能的類似体を含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、組成物は、約５μＭ～約２００μＭのＨｘを含む。一実施形態では、組成物は、約１０μＭ～約１２０μＭのＨｘを含む。
一実施形態では、組成物は、出血後の対象のＣＳＦ内の無細胞ヘムの濃度に対して、少なくとも等モル量のＨｘを含む。別の実施形態では、組成物は、約３μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む。
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、治療有効量のＨｐをさらに含む。
一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。
一実施形態では、組成物は、出血後の対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの濃度に対して少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、組成物は、約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。
一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘ、および約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｘ、および約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約１００μＭ～約２０ｍＭのＨｘ、および約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘ、および約２μＭ～約３００ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約５μＭ～約２００μＭのＨｘ、および約２μＭ～約５０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約１０μＭ～約１２０μＭのＨｘ、および約２μＭ～約３０ｍＭのＨｐを含む。
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬の製造における、本明細書に記載されるような治療有効量のＨｘの使用が提供される。
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、髄腔内投与用として製剤化される。好適な髄腔内送達システムは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｋｉｌｂｕｒｎら（２０１３，Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｒｕｄｅｋ Ｍ．，Ｃｈａｕ Ｃ．，Ｆｉｇｇ Ｗ．，ＭｃＬｅｏｄ Ｈ．（ｅｄｓ）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、頭蓋内投与用として製剤化される。好適な髄腔内送達システムは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｕｐａｄｈｙａｙら（２０１４，ＰＮＡＳ，１１１（４５）：１６０７１－１６０７６）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脳室内投与用として製剤化される。好適な髄腔内送達システムは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｃｏｏｋら（２００９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．２９（７）：８３２－８４５）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。
好適な医薬組成物およびその単位投与剤形は、追加の活性化合物もしくは原理を伴い、または伴わずに従来の成分を従来の割合で含み得るが、またそのような単位投与剤形は、意図される１日の投薬量について、その採用された範囲と釣り合った任意の好適な有効量の有効成分を含有し得る。
キット
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載されるような人工ＣＳＦ、または本明細書に記載されるような医薬組成物を含むキットが提供される。本明細書に記載されるような活性な薬剤（Ｈｘおよび場合によりＨｐを含む）は、活性な薬剤の同時、個別、または連続投与を可能にするために考案された、いくつかのコンポーネントからなるキットの形態で存在し得る。各担体、希釈剤、アジュバント、および／または賦形剤は、組成物のその他成分と適合性を有し、そして対象により生理学的に忍容されるように、「薬学的に許容され」なければならない。組成物は、単位投与剤形で好都合に提供され、そして薬学の分野において周知の方法により製造することができる。そのような方法は、有効成分を担体（１つまたはそれ以上のアクセサリー成分を構成する）と関連付ける工程を含む。一般的に、組成物は、有効成分を、液体の担体、希釈剤、アジュバント、および／もしくは賦形剤、または細かく分割された固体担体、またはその両方と均一かつ緊密に関連付け、次に必要な場合には生成物を成形することにより製造される。
診断方法
本明細書に別途記載されるように、本発明者らは、脳室ＣＳＦ－Ｈｂの濃度は、対象が出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するかどうか判定するのに使用可能であることを驚くべきことに見出した。
したがって、本明細書で開示される別の態様では、対象が、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するかどうか判定する方法であって、
（ｉ）出血性脳卒中後の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程
を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクが、工程（ｉｉｉ）における比較に基づき決定される、方法が提供される。
ＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例は本明細書に別途記載されている。
一実施形態では、「参照値」は、健康な対象または健康な対象の集団のＣＳＦ内無細胞Ｈｂの量を表す値である。この文脈において、試験対象由来のＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が参照値を上回れば、対象は出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有することが示唆される。反対に、試験対象由来のＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が参照値に等しいかそれよりも低ければ、対象は出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有さないことが示唆される。
一実施形態では、「参照値」は、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を有した対象または対象の集団のＣＳＦ内無細胞Ｈｂの量を表す値である。この文脈において、試験対象由来のＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が参照値と同等かまたはそれを上回れば、対象は出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有することが示唆される。反対に、試験対象由来のＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が参照値よりも低ければ、対象は出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有さないことが示唆される。
一実施形態では、参照値は実質的にゼロであり、ＣＳＦ内に検出可能な生理学的無細胞Ｈｂが存在しないことを意味する。別の実施形態では、参照値は、出血性脳卒中を有するが、しかし有害な神経学的転帰を有さない１人またはそれ以上の患者のＣＳＦ内無細胞Ｈｂのレベルを表す。この文脈において、いくつかの事例では、有害な神経学的転帰をもたらすことのない、許容し得るＣＳＦ内無細胞Ｈｂの閾値レベルが存在し得るものと理解される。
一実施形態では、対象は、工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判断される。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、そして対象は、工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が少なくとも約３μＭである場合、血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は遅発性脳虚血であり、そして対象は、工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が少なくとも約５μＭである場合、遅発性脳虚血を発症するリスクを有するものと判定される。
一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は遅発性虚血性神経障害であり、そして工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は遅発性虚血性神経障害を発症するリスクを有するものと判定される。
「少なくとも約７μＭ」とは、少なくとも約７μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約９μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３５μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約４５μＭ、少なくとも約５０μＭ等を含む。一実施形態では、工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が、少なくとも約７μＭ、好ましくは少なくとも約８μＭ、好ましくは少なくとも約９μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、好ましくは少なくとも約１５μＭ、好ましくは少なくとも約２０μＭ、好ましくは少なくとも約２５μＭ、好ましくは少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約３５μＭ、好ましくは少なくとも約４０μＭ、好ましくは少なくとも約４５μＭ、またはより好ましくは少なくとも約５０μＭである場合、対象は出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される。
同様に、「少なくとも約３μＭ」とは、少なくとも約３μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約６μＭ、少なくとも約７μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約９μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約３５μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約４５μＭ、少なくとも約５０μＭなどを含む。一実施形態では、工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル内無細胞Ｈｂの量が、少なくとも約３μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約６μＭ、少なくとも約７μＭ、好ましくは少なくとも約８μＭ、好ましくは少なくとも約９μＭ、好ましくは少なくとも約１０μＭ、好ましくは少なくとも約１５μＭ、好ましくは少なくとも約２０μＭ、好ましくは少なくとも約２５μＭ、好ましくは少なくとも約３０μＭ、好ましくは少なくとも約３５μＭ、好ましくは少なくとも約４０μＭ、好ましくは少なくとも約４５μＭ、またはより好ましくは少なくとも約５０μＭである場合、対象は出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される。
本明細書に記載されるような出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを決定する方法は、有利には、対象が、その決定されたリスクを考慮しながら、該当する処置レジメンに対して階層化されるのを可能にする。例えば、対象が出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される場合には、対象は本明細書に記載される処置方法に対して階層化される。反対に、対象は、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有さないものと判定される場合には、対象は、無処置、または代替的かつそれほど侵襲的でない処置レジメンに対して階層化される可能性がある。
リスクを決定する方法は、好適には、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（例えば、ＲＯＣＲパッケージ（ｖ１．０－１１）（Ｓｉｎｇら、２００５年）、ｐｌｏｔＲＯＣパッケージ（ｖ２．２．１）（Ｓａｃｈｓ、２０１７年））、対応するブートストラップ曲線下面積（ＡＵＣ）（ｐＲＯＣパッケージ（ｖ１．１６．２）（Ｒｏｂｉｎら、２０１１年））、および／または最適なＹｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ（ＲＯＣｉｔパッケージ（ｖ１．１．１）（Ｍｄ Ｒｉａｚ Ａｈｍｅｄ、２０１９年））を使用する工程を含み得る。出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを決定する方法の例証的事例についても、本明細書に別途記載される。
一実施形態では、方法は、有害な二次神経学的転帰のリスクを有するものと判定された対象を処置する工程をさらに含み、前記処置は、対象のＣＳＦを、（ｉ）本明細書に記載されるように、Ｈｘが無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）に；および／または（ｉｉ）本明細書に記載されるように、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む。
本明細書で開示される別の態様では、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰に対応する処置に対して対象を階層化する方法であって、（ａ）本明細書に記載されるように、対象が有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するかどうか判定する工程、および（ｂ）本明細書に記載される方法に基づき、有害な二次神経学的転帰のリスクを有するものと判定された対象を処置する工程を含む方法が提供される。
当業者は、本明細書に記載される本発明は、特に記載されている形態以外の変形形態および改変形態を採りやすい傾向にあることを認識する。本発明は、精神および範囲に収まるすべてのそのような変形形態および改変形態を含むものと理解される。本発明には、本明細書において参照または表示される工程、特性、組成物、および化合物のすべても個別にまたは全体として含まれ、ならびに前記工程または特性の任意の２つまたはそれより多くのあらゆるすべての組合せもやはり含まれる。
例証目的に限定されるように意図されており、そして本明細書にこれまでに記載された一般性を制限するように意図するものではない下記の実施例を参照しながら、本発明の特定の実施形態をここで記載する。
ＳＡＨ－ＳＢＩのバイオマーカーとしての脳室ＣＳＦ Ｈｂ
この試験は開始前に倫理上の承認を受けた。インフォームドコンセントをすべての患者またはその法定代理人から得た。すべての実験を、生物安全性規則を順守しつつ、適する作業条件において実施した。結果はＳＴＲＯＢＥ宣言（ｖｏｎ Ｅｌｍら、２００７年）に基づき報告される。
治験集団
臨床データおよびＣＳＦサンプルを、３年間にわたり（２０１７年４月～２０２０年３月）、学術的三次医療センターの神経集中医療ユニットに入院した、ａＳＡＨを有するプロスペクティブな連続する患者コホートから取得した。適格性基準には：（ｉ）年齢＞１８歳；（ｉｉ）クモ膜下出血の放射線学的診断；（ｉｉｉ）非動脈瘤性クモ膜下出血（例えば、外傷、中脳周囲クモ膜下出血）の除外；（ｉｖ）標準的な医療の一環としての外部脳室ドレイン（ＥＶＤ）の挿入が含まれた。
臨床データの取得
患者データ収集を、ＣＳＦサンプリングとは独立に、またそれに対して盲検化して実施した。人口統計学の特徴（年齢、性別）、臨床スコアおよび指標（ＷＦＮＳグレード、Ｈｕｎｔ ＆ Ｈｅｓｓグレード、初期グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ））、および放射線学的アセスメント（動脈瘤の場所、最大動脈瘤直径、血腫容積（下記参照）、脳室内出血（ＩＶＨ）の存在、Ｆｉｓｈｅｒグレーディング、ＢＮＩグレーディング）を含むベースライン構成を診断時に評価した（図７Ａ）。臨床データを、神経集中医療ユニットにおいて行われた標準化マルチモーダルモニタリングに基づき、ＳＡＨ－ＳＢＩについて、１４日間ハイリスク期において、および３ヶ月フォローアップの一環としてプロスペクティブに収集した（図７Ａ）。一般的な患者管理は現行の国際ガイドラインに適合した（Ｄｉｒｉｎｇｅｒら、２０１１年；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、２０１２年）。ＤＩＮＤ、ＤＣＩ、またはａＶＳＰの存在を毎日評価した。ＤＩＮＤは、新規限局性神経学的障害、または任意のその他の特定可能な原因、例えば水頭症、てんかん発作、または全身的要因等に起因しない、少なくとも２時間、少なくとも２ポイントにおけるＧＣＳの減少として定義した。患者を臨床的に評価できなかった場合（例えば、鎮静状態）には、臨床データを入手不可（ｎｏｎ－ａｖａｉｌａｂｌｅ；ＮＡ）として分類した。ＤＣＩは、外科的介入に帰属できない、ＣＴ／ＣＴＰまたはＭＲＩにおける新規虚血または新規梗塞として定義した。ａＶＳＰの定義には、デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）、磁気共鳴血管造影法（ＭＲＡ）のコンピューター６断層撮影血管造影（ＣＴＡ）に基づく大脳動脈の新規狭小化が含まれた。各日において適する画像化手順が存在しなかった場合、これをＮＡとして付記した。ＳＡＨ－ＳＢＩは、ＤＩＮＤ、ＤＣＩ、およびａＶＳＰの複合転帰として定義した。それに加えて、中大脳動脈、前および後大脳動脈の両方の流速を、ＴＣＤを使用して毎日評価した。
合併症（髄膜脳炎、中枢性塩類喪失、尿崩症、肺炎、たこつぼ型心筋症、非痙攣性てんかん重積状態、慢性水頭症、死亡）、および機能状態（拡張グラスゴー転帰尺度（ＧＯＳＥ）および修正ランキンスケール（ｍＲＳ））を、３ヶ月フォローアップまで評価した。
クモ膜下血腫セグメンテーションおよび容量分析
初回ＣＴスキャンに基づき、クモ膜下血腫の容積を、３ＤＳｌｉｃｅｒを使用しながら手作業により輪郭描写した（Ｋｉｋｉｎｉｓら、２０１４年）。これを対象４７例のうち４６例（１例は初回ＭＲＩしか受けず、したがってこの分析から除外された）において実施した。輪郭描写前の前処理は脳抽出から構成された。２００ＨＵの閾値が設定されたスカルマスクから得られた最大キャビティーを抽出した（Ｗｅｉｄｅｒｔら、２０２０年）。したがって、ブレーンマスクに、オリジナルのＣＴスキャンを掛け算し、５×５×３カーネルを用いてメディアンフィルター処理した（図７Ｂ）。出血の容積を、ボクセルサイズにセグメント化されたボクセルの数を掛け算することにより決定した（図２Ｃ）。
ＣＳＦサンプリング
ＣＳＦサンプルを、動脈瘤修復後から開始してＥＶＤから毎日収集した。第１日目（出血後の当日）と第１４日目との間にサンプリング期間を設けるようにした。ＣＳＦ収集を、臨床データに対して盲検化して実施した。サンプル収集直後に、ＣＳＦを１５００Ｇで１５分間遠心分離し（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ ＣＥＰ ２０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ ｌａｂｓ社、英国）、そして上清をさらなる分析用として－８０℃で保管した。
ＣＳＦ Ｈｂおよびヘム代謝物の分光光度測定
全ＣＳＦサンプルの３５０～６５０ｎｍ間の視覚範囲内の吸収スペクトルを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本）上で測定した。異なるＨｂ種およびその代謝物（ｏｘｙＨｂ、ｍｅｔＨｂ、ビリルビン、ビリベルジン）の定量を、スペクトラルデコンボリューションを使用して実施した。したがって、これまでの記載に従い、非負の最小二乗アルゴリズムを使用して、濃度既知の個々の物質の減滅曲線をＣＳＦの減滅曲線に当て嵌めた（Ｄｅｕｅｌら、２０１５年）。
ＬＣ－ＭＳＭＳ ＣＳＦプロテオーム分析
ラベルフリープロテオミクス定量アプローチ（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用して、患者１８例のＣＳＦプロテオームの特徴づけを、観察期間（ａＳＡＨ後の０、０．５、１、１．５、および２週目）に沿って５つの連続した時点において行った（図７Ｃ）。一般化可能性を改善するために、サンプルを２バッチにおいて処理したが、標準化後に分析する場合、それらを統合した（全８５サンプル－バッチ１において４８、バッチ２において３７）。Ｈｂは赤血球溶解後のＣＳＦ中に豊富に存在するが、イオン抑制を回避し、そして感度を増加させるために、分析前にハプトグロビンアフィニティーカラムを使用してそれを選択除去した（Ｈｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒら、２０１９年）。
トリプシンを用いたＨｂ枯渇ＣＳＦサンプルの消化後に、マススペクトロメトリー分析を、Ｄｉｇｉｔａｌ ＰｉｃｏＶｉｅｗソース（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社）を備え、およびＭ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）に接続したＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上で実施した。
Ａ．サンプル調製
Ｑｕｂｉｔ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）を使用して総タンパク質濃度を推定した。サンプルを、次にプロトコールのバージョンが最新の市販ｉＳＴ Ｋｉｔ（ＰｒｅＯｍｉｃｓ Ｐｈｏｅｎｉｘ社、ドイツ）を使用して調製した。要するに、タンパク質、２０μｇを「溶解」バッファー中で可溶化し、９５℃で１０分間沸騰させ、そして超音波強度を８５％に設定しながらＨＩＦＵを用いて３０秒間処理した。その後、サンプルをカートリッジに移し、そして「消化」溶液、５０μｌを添加することにより消化した。３７℃でインキュベートしてから６０分後に、停止溶液、１００μｌを用いて消化を停止した。カートリッジ内の溶液を３８００ｇでの遠心分離により除去した一方、ｉＳＴ－フィルターによりペプチドを保持した。最後に、ペプチドを洗浄、溶出、乾燥し、そしてＬＣ－ＭＳ分析用としてバッファー（３％アセトニトリル、０．１％ギ酸）、２０μＬ中で再可溶化した。
Ｂ．液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー分析
マススペクトロメトリー分析を、Ｄｉｇｉｔａｌ ＰｉｃｏＶｉｅｗソース（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社）を備え、およびＭ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）に接続したＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上で実施した。２つのチャンネルにおける溶媒組成物は、チャンネルＡについて０．１％ギ酸、およびチャンネルＢについて０．１％ギ酸、９９．９％アセトニトリルであった。サンプル毎に、希釈済みのペプチド、１μＬを、市販のＭＺ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ Ｔｒａｐ Ｃｏｌｕｍｎ（１００Å、５μｍ、１８０μｍ×２０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）、それに後続してｎａｎｏＥａｓｅ ＭＺ Ｃ１８ ＨＳＳ Ｔ３ Ｃｏｌｕｍｎ（１００Å、１．８μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）にロードした。７７分内で～２２％Ｂ、１０分内で３２％Ｂ、そして１０分かけて９５％Ｂとするグラジエントにより、３００ｎＬ／分の流速でペプチドを溶出させた。ランダムな順番でサンプルを取得した。マススペクトロメーターを、５００’０００の目標値まで蓄積した後に、２００ｍ／ｚにおいて１２０’０００の分解能でフルスキャンＭＳスペクトル（３００～１’５００ｍ／ｚ）を取得するデータ依存モード（ＤＤＡ）で稼働させた。データ依存ＭＳ／ＭＳを、０．８Ｄａのウィンドウによる四重極単離および３５％断片化エネルギーを用いたＨＣＤの断片化を使用しながら、線形イオントラップ内で記録した。イオントラップを、目標値１０’０００および最大インジェクションタイム５０ｍｓによる高速スキャンモードで稼働させた。５’０００を上回る強度を有する前駆体のみをＭＳ／ＭＳ用として選択し、また最大サイクルタイムを３秒に設定した。荷電状態スクリーニングを可能にした。一重で、アサイメントされず、かつ７価よりも高い荷電状態を棄却した。ＭＳ／ＭＳ測定用としてこれまでに選択された前駆体質量を２０秒間のさらなる選択から除外し、そして除外ウィンドウを１０ｐｐｍに設定した。内部ロック質量較正を使用して、ｍ／ｚ３７１．１０１２および４４５．１２００においてサンプルを取得した。ローカルラボラトリー情報マネジメントシステム（ＬＩＭＳ）を使用して、マススペクトロメトリープロテオミクスデータを取り扱った（Ｔｕｒｋｅｒら、２０１０年）。
Ｃ．タンパク質の同定およびラベルフリータンパク質の定量
取得された生のＭＳデータをＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．６．２．３）により処理し、一体型Ａｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを使用するタンパク質の同定がそれに後続した（ＣｏｘおよびＭａｎｎ、２００８年）。スペクトルを、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）参照プロテオーム（ｔａｘｏｎｍｙ ９６０６、２０１９年７月９日以降のバージョン）に対して検索し、その反転デコイ化ｆａｓｔａデータベース（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｄｅｃｏｙｅｄ ｆａｓｔａ ｄａｔａｂａｓｅ）および一般的なタンパク質汚染物質に連結した。システインのカルバミドメチル化を固定された修飾として設定した一方、メチオニン酸化およびＮ末端タンパク質アセチル化を変数として設定した。酵素特異性をトリプシン／Ｐに設定し、アミノ酸７個の最短ペプチド長および最大２個の切断失敗を許容した。ＭａｘＱｕａｎｔ Ｏｒｂｉｔｒａｐのデフォルト検索設定を使用した。最大の偽陽性率（ＦＤＲ）を、ペプチドについて０．０１、およびタンパク質について０．０５に設定した。ラベルフリー定量を可能にし、そして実行間の一致（ｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｕｎｓ）について２分ウィンドウを適用した。ＭａｘＱｕａｎｔ実験デザインテンプレートでは、個々の定量的値を取得するために、各ファイルは実験デザイン内で個別に保持される。ＭａｘＱｕａｎｔ結果をＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．社）にロードし、ペプチドおよびタンパク質の同定について妥当性確認した。少なくとも２つのペプチドを用いて同定されたタンパク質のみを、フォローアップ分析用として検討した。
タンパク質の個々のタンパク質強度を、ベースライン時（週０）における各タンパク質の平均強度に対して標準化し、そしてｌｏｇ２変換した。全体的な倍率変化を、全タイムコースにわたりタンパク質毎に対数比の合計として計算した。さらに、時点毎に、標準化後のタンパク質強度を、ウィルコクソン順位和検定を使用してベースライン（週０）と比較し、そしてｐ値は、ｍｅｔａｐパッケージを使用して、すべての時点にわたり統合した（Ｄｅｗｅｙ、２０２０年）。ｋ平均分析を使用して、ＣＳＦプロテオームの時間的変化をクラスター化し、それによって最適なクラスターの数を、Ｆａｃｔｏｅｘｔｒａパッケージ（ｖ１．０．７）を使用しながらエルボー図（図７Ｄ）を用いて視覚的に決定した（ＫａｓｓａｍｂａｒａおよびＭｕｎｄｔ、２０２０年）。
ヘモグロビン、ハプトグロビン、ヘモペキシン、およびｒＬＰ
これまでに記載されたように、ｅｘ ｖｉｖｏ実験で使用したＨｂは、期限切れのヒト血液濃縮物から精製した（Ｅｌｍｅｒら、２００９年）。上記したように、スペクトラルデコンボリューションによりＨｂ濃度を決定し、そして全ヘムのモル濃度として表す（１ＭのＨｂ四量体は４Ｍのヘムと同等である）。Ｈｘを、テストサンプルにおいて測定されたヘムの濃度に対して等モル濃度で使用した。これらの試験で使用したすべてのＨｂについて、第一鉄ｏｘｙＨｂ（ＨｂＦｅ２＋Ｏ２）の割合は、分光光度法により決定した場合、常に９８％を上回った。ヒト血漿由来の精製済みハプトグロビン（表現型１－１）およびヘモペキシンを、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社から取得した。
神経血管機能
血管機能アッセイ（図７Ｅ）を、現地屠殺場から得た新鮮なブタ脳底動脈を使用して実施した（ｎ＝１２）。これまでに公表されたように、最適な受動的プレ張力（ｐａｓｓｉｖｅ ｐｒｅｔｅｎｓｉｏｎ）である８に達するまで血管を事前に引き伸ばした（Ｈｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒら、２０２０年）。次に、１０μＭのプロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α；Ｓｉｇｍａ社、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を、プレ収縮剤として使用した。内因性ＮＯ非存在下で最大可能張力を決定するために、１０μＭの濃度のＬ－Ｎ５－（１－イミノエチル）オルニチンヒドロクロリド（Ｌ－ＮＩＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＵＳ－ＭＯ）を、実験終了時に添加した。記録した張力を各血管の個々のＮＯ予備容量、すなわちＰＧＦ２α添加後のベースライン（０％）および実験終了時にＬ－ＮＩＯを添加した後の張力（１００％）に対して標準化した（図７Ｆ）。実験期間において張力が連続的に失われ、その結果ＰＧＦ２α最大値／Ｌ－ＮＩＯ最大値の比が０．７未満の損傷血管を分析から除外した（図７Ｆ）。第１シリーズの実験を、ａＳＡＨ後のＳＡＨ－ＳＢＩに関して高リスク期にある患者ＣＳＦの血管収縮能を評価し、およびこのプロセスにおけるｏｘｙＨｂの特別な役割を評価するために実施した。この目的のために、高リスク期（４～１４日目の間）由来の患者ＣＳＦを、ハプトグロビンアフィニティーカラムを使用して、Ｈｂについて選択的に枯渇させた。実験の初期段階において、血管をＨｂ枯渇ＣＳＦ内中に浸漬した。その後、Ｈｂについて、血管張力に対するその特異的効果を明確にするために予め枯渇させた量だけ正確にＣＳＦに添加した。第２シリーズの実験においては、Ｈｂへの曝露を増加させたときの血管張力に対する影響を評価した。クレブス－ヘンゼライトバッファー内での半ｌｏｇ１０ Ｈｂ希釈系列（１０－４Ｍ～１０－８Ｍ）を作製し、そしてＨｂ濃度を漸増させながら血管を浸漬した。ハプトグロビン効果の評価では、第３シリーズの実験を、同一のＨｂ用量漸増（ただし、ハプトグロビンの等モル添加を除く）を用いて実施した。
ＴＢＡＲＳ
ＣＳＦサンプルの酸化能力を、十分定義された再構成リポタンパク質と共にインキュベートした後に、最終的な脂質過酸化産物として生ずるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の形成を測定することにより定量した（ｒＬＰ、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ社から取得、Ｂｅｒｎ、スイス）（図７Ｇ）。９６ウェルプレートを使用して、ＣＳＦ、２５μＬを、ｒＬＰ、５μＬ（３ｍｇ／ｍＬ）と混合し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。その後、チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）アッセイ法を使用して、ＭＤＡの濃度を測定した。要するに、７５０ｍＭのトリクロル酢酸、１２５μＬを含む１ＭのＨＣｌをサンプルに添加し、短時間ボルテックス処理した後、後続する２５ｍＭの２－チオバルビツール酸を含む１ＭのＮａＯＨ、１００μＬの添加がそれに後続した。
８０℃、６０分のインキュベーション期間の後、上清中のＴＢＡＲＳを定量した。ＭＤＡの絶対的定量では、５３２ｎｍにおける吸収から６００ｎｍにおける吸収を差し引き、そしてモル吸光係数０．１５６ｍＭ－１・ｃｍ－１を用いて濃度を計算した。より高感度であるが、相対的定量を実現するために、励起波長として５１０ｎｍを使用しながら、５５０ｎｍにおける蛍光発光を測定した。
統計分析
統計分析を、Ｒ３．６．３（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ、２０２０年）を使用して実施した。カテゴリーデータは絶対数（ｎ）および割合（％）として、連続データは平均値と標準偏差（ＳＤ）として提供される。因子実験については、ｅｚパッケージ（ｖ４．４－０）を使用して反復測定ＡＮＯＶＡを実施した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ、２０１６年）。混合線形モデル分析を、ｌｍｅ４パッケージ（ｖ１．１－２３）を用いて実施した（Ｂａｔｅｓら、２０１５年）。遺伝子セット富化分析では、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した遺伝子セット富化分析ＧＳＥＡソフトウェア（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、２００５年）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）のホールマーク遺伝子セット（Ｌｉｂｅｒｚｏｎら、２０１５年）を使用した。インプットとして、同定されたタンパク質のランク化されたリストを使用し、ランクスコアはタンパク質の－ｌｏｇ１０（ｐ値）および合計（対数比）の積として計算した。ベースライン測定（動脈瘤の場所、動脈瘤サイズ、血腫容積、ＩＶＨの存在）とＣＳＦ－Ｈｂとの間、ならびにＣＳＦ－ＨｂとＳＡＨ－ＳＢＩとの間の関連性を、ｍｇｃｖパッケージ（ｖ１．８－３１）を使用して、ａＳＡＨ後の日数と患者ＩＤに対するランダム効果についてスプライン近似しながら、一般加法モデル（ＧＡＭ）を使用して分析した（Ｗｏｏｄ、２０１７年）。ＳＡＨ－ＳＢＩに対するＣＳＦ ｏｘｙＨｂの感度および特異性を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＲＯＣＲパッケージ（ｖ１．０－１１）（Ｓｉｎｇら、２００５年）、ｐｌｏｔＲＯＣパッケージ（ｖ２．２．１）（Ｓａｃｈｓ、２０１７年）、対応するブートストラップ曲線下面積（ＡＵＣ）（ｐＲＯＣパッケージ（ｖ１．１６．２）（Ｒｏｂｉｎら、２０１１年）、および最適なＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ（ＲＯＣｉｔパッケージ（ｖ１．１．１）（Ｍｄ Ｒｉａｚ Ａｈｍｅｄ、２０１９年）を使用して分析した。ＴＣＤ流速を、その臨床的アセスメント（病理学的または非病理学的）（感度および特異性を決定する役目を果たす）に従い最初にカテゴリー的に使用した。第２に、ＴＣＤのスケール化では、測定されたＣＳＦ Ｈｂと病態生理学的に関連付けるために、ＴＣＤ流速を連続的に使用し、各値をコホートの対応する血管（前、中、または後大脳動脈）上を流れる平均流量に対してスケール化した。最大スケール化ＴＣＤは、毎日測定された値をスケール化した後の最大値を表した。試験の探索的特徴に起因して、統計的有意性のレベルは定義せず、その代わりに結果をエビデンスのレベルに基づき解釈した：ｐ＜０．００１：非常に強いエビデンス；ｐ＜０．０１：強いエビデンス；ｐ＜０．０５：エビデンス；ｐ＜０．１：弱いエビデンス；ｐ＞０．１：エビデンス無し（Ｂｌａｎｄ、２０１５年）。
結果
Ａ．治験集団
適格性基準を満たす連続的にスクリーニングされた患者５２例のうち、４７例が含まれた。
患者５例、またはその法定代理人がインフォームドコンセントを拒絶した。表１は患者コホートのベースライン構成を要約する。
Figure 2024504822000001
Ｂ．ＣＳＦ－Ｈｂおよびヘム代謝物の分光光度測定
スペクトラルデコンボリューションを用いた分光光度測定を、無細胞ｏｘｙＨｂ（第一鉄型ＨｂＦｅ２＋）、およびその下流代謝物であるビリベルジンおよびビリルビン、ならびに主要なＨｂ酸化生成物であるｍｅｔＨｂ（第二鉄型ＨｂＦｅ３＋）を定量化するのに使用した。ｏｘｙＨｂの個々の時間的プロファイルおよびピーク濃度（０．６μＭ～２４２．２μＭ）は、きわめて変動的であった（図８）。ほとんどの患者において、ａＳＡＨ後の最初の２～３日間、ｏｘｙＨｂは非常に低いままであったが、その後有意に増加し、９～１２日の間でプラトーとなり、そしてその後減少した（図１Ａ）。ビリルビンは１日目にすでに上昇し、最初の３～５日間において最も有意な増加を示した後、プラトーに達した（図１Ａ）。このタイムコースは、クモ膜下腔内でのマクロファージによるファゴサイトーシスおよびヘム代謝を反映する。中間代謝物であるビリベルジンは、４日目以降顕著に上昇を開始し、そして１２日目にそのピークに達する（図１Ａ）。やはり、ｍｅｔＨｂも遅延性の増加に従い、ａＳＡＨから１１日後にピークを有し、ＣＳＦ内での無細胞ｏｘｙＨｂのゆっくりとした自動酸化と整合する（図１Ａ）。
Ｃ．ＬＣ－ＭＳＭＳ ＣＳＦプロテオーム分析
定量的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を、出血後の５時点において収集された、患者１８例に由来するＣＳＦサンプル８５件において実施した。図１Ｂは、ｋ平均クラスタリングにより４群に割り振られたＣＳＦタンパク質、７５７個の時間的経過について例証する。図１Ｃは、患者毎に全サンプルにわたり合計した、標準化後シグナル強度のＶｏｌｃａｎｏプロットを示し、出血後２週間以内のタンパク質の蓄積または枯渇に関する全体像を提供する。クラスター１（緑色）は、経時的に不変のままであったタンパク質が含まれた。クラスター４（黄色）は、経時的に強度が減少したタンパク質を表す。これらは、主に、初回出血によりクモ膜下腔に進入し、そしてその後ＣＳＦから排出された血漿タンパク質であった。分子シグネチャーデータベース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ；ＭＳｉｇＤＢ）のホールマーク遺伝子セットを使用して、ランク化されたタンパク質を遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）し（Ｌｉｂｅｒｚｏｎら、２０１５年）、トップネガティブ富化を凝固に割り振った（ＥＳ＝－０．６６、ＦＤＲ＝０．００７、図１Ｄ）。図１Ｅは、４つの選択された血漿タンパク質（ＨＰ、ＨＰＲ、ＨＰＸ、およびＡＬＢ）の時間的経過を示す。クラスター２（紫色）には、経時的に顕著に蓄積した１２例を含むタンパク質、そしてクラスター３（青色）には中程度に増加したタンパク質が含まれた。
ＧＳＥＡにより、解糖（ＥＳ＝０．７８、ＦＤＲ＝０．０１６、図１Ｆ）およびヘム代謝（ＥＳ＝０．７４、ＦＤＲ＝０．０９６、図１Ｈ）が、細胞質タンパク質の放出を伴う赤血球（ＲＢＣ）の溶解およびマクロファージによるＨｂの分解をそれぞれ表すトップ富化ホールマークとして特定された。図１Ｇは、ＲＢＣタンパク質であるカルボアンヒドラーゼ１（ＣＡ１）および２（ＣＡ２）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ならびにアルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）のタイムコースを示す。図１Ｉは、マクロファージタンパク質ＣＤ１６３、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＤ１４、およびＴＩＭＰ－１を示す。これらのタンパク質の蓄積は、出血後の最初の数日内にクモ膜下腔内にマクロファージが顕著に流入したことを指し示す。全体として、ａＳＡＨ後の患者ＣＳＦ内のプロテオーム動力学により、溶血ならびに適応性マクロファージ応答は、ａＳＡＨ後にＣＳＦ腔内で生ずる２つの支配的プロセスであるということが裏付けられた。
Ｄ．ＣＳＦ－Ｈｂレベルの決定因子
ＣＳＦ－Ｈｂ濃度の決定因子を推定するために、ａＳＡＨ後の日数および患者ＩＤに対するランダム効果についてスプライン近似を用いながら、一般加法モデル（ＧＡＭ）を適用した。部分的依存性プロットを図２Ｂに示す。動脈瘤のサイズは、ＣＳＦ－Ｈｂの経過と関連するようには見えなかった。異なるいくつかの動脈瘤の場所のなかでも、中大脳動脈動脈瘤のみがＨｂレベルと負の関連性を有した（ｐ＝０．００１８）。血腫の容積がＣＳＦ－Ｈｂレベルとの強い関連性を示した。ａＳＡＨ後の日数は、最初の３～５日間において負の関連性を有するが、その後弱い正の関連性が後続する日に認められた。この関連性は、クモ膜下腔内での溶血およびＣＳＦ－Ｈｂ生成の遅発的発現を反映する可能性がきわめて高い。ＩＶＨの存在はより高いレベルのＣＳＦ－Ｈｂと関連した（ｐ＜０．０００１）。ＩＶＨが存在する場合、ＣＳＦ－Ｈｂは初期の増加からプラトーを示した一方、ＩＶＨの非存在下では、増加はより遅発的かつ漸増的であるが、しかしおよそ第１２日目には匹敵するピーク濃度で平準化する（図２Ｃ）。これは、ＣＳＦコンパートメント効果の可能性がきわめて高い（図２Ｄ）。
Ｅ．ＣＳＦ－Ｈｂの増加は二次脳損傷と関連する
３ヶ月フォローアップ時のＳＡＨ－ＳＢＩ、レスキュー療法、合併症、死亡率、および機能的状態を代表するコホート転帰パラメーター（患者毎および日毎）を表３にまとめる。ＳＡＨ－ＳＢＩにより階層化されたＣＳＦ－Ｈｂレベルを、図３Ａおよび図９に示す。ａＳＡＨ後の日数および患者ＩＤに対するランダム効果についてスプライン近似を用いたＧＡＭに基づき、ＳＡＨ－ＳＢＩの発生とＣＳＦ－Ｈｂ濃度との間の関連性について非常に強いエビデンス（ｐ＝０．０００４５）が見出された。図３Ｂは、ＣＳＦ－ＨｂおよびＳＡＨ後の日数に対するＳＡＨ－ＳＢＩの部分的依存性を示す。ＳＡＨ－ＳＢＩに対するモニタリングマーカーとしての毎日測定ＣＳＦ－Ｈｂの検出力を推定するために、各受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線および対応するＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を、ＤＩＮＤ、ＤＣＩ、ａＶＳＰ（図９Ａ～図９Ｃ、表２）および複合転帰ＳＡＨ－ＳＢＩ（図３Ｃ、表２）について計算した。データを高リスク期間（４～１４日目）に限定し、出血後の最初の数日においてＨｂレベルが一般的に低いことにより導入される潜在的バイアスを回避することで、再計算したモデルにおいて高い診断正確性が不変のままに保たれた（図９Ｄ）。ビリルビン、ビリベルジン、およびメトヘモグロビンは、ｏｘｙＨｂよりも低い診断正確性を有した（図９Ｅ～図９Ｇ）。最適なＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘを演算することにより、ＳＡＨ－ＳＢＩに対してＣＳＦ－Ｈｂ、７．１μＭの値が得られた（図３Ｃ）。ａＶＳＰ、ＤＣＩ、およびＤＩＮＤの個々の転帰について、最適なＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘは、それぞれ３．４、５．５、および７．１μＭであった（図９Ａ～図９Ｃ）。
Figure 2024504822000002
Figure 2024504822000003
臨床診療におけるその高頻度の使用を前提とすれば（Ｄｉｒｉｎｇｅｒら、２０１１年；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、２０１２年）、患者コホートにおける臨床および放射線学スコアならびに毎日のＴＣＤ測定の診断正確性を評価した。臨床および放射線学スコアは予測品質不良を示した（表２、図９Ｈ～図９Ｋ）。ＴＣＤ測定は、ＳＡＨ－ＳＢＩ、ａＶＳＰ、ＤＣＩ、およびＤＩＮＤに対して高い特異性を示した。しかしながら、ＴＣＤの感度は最低限度であった（表２）。
高ＣＳＦ－Ｈｂレベルも、３ヶ月フォローアップにおけるＧＯＳＥスコア（ｐ＝０．００５６、図３Ｄ）およびｍＲＳスコア（ｐ＝０．００１６、図９Ｌ）により表現される臨床転帰の不良に関連した。
Ｆ．脳底動脈血管収縮および脂質過酸化は患者ＣＳＦ－Ｈｂの濃度範囲内で生ずる
データは、無細胞ＨｂはＳＡＨ－ＳＢＩの上流メディエーターであることを示唆する。この関連性の妥当性を裏付けるために、患者コホート内のＣＳＦ－Ｈｂ濃度範囲に一致するＨｂへの曝露を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏ血管収縮および脂質過酸化を調べた。ＰＧＦ２αにより事前収縮させたブタ脳底動脈を用いた新規血管機能モデルを確立し、そして実験終了時に内在する内皮ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）応答により拡張させた。この構成は、内因性ＮＯ予備容量に対するＨｂの効果について調査を可能にした。補充的ＮＯドナーは使用しなかった。
図４Ａは、１０－６．５～１０－６ＭのｏｘｙＨｂにおいて血管張力の急激な増加を伴い、そして１０－５ＭのｏｘｙＨｂにおいて最大収縮に到達するシグモイド用量応答曲線を示す。ＣＳＦ－Ｈｂのカテゴリー対して最大スケール化患者ＴＣＤ値をプロットしたとき、ほぼ同一の曲線が取得された（図４Ｂ）。Ｅｘ ｖｉｖｏ血管収縮アッセイで使用された濃度ステップに一致するようにＣＳＦ－Ｈｂカテゴリーを選択した。ａＶＳＰを有する患者（赤色のドット）は、概ね１０－５Ｍ以上のＣＳＦ－Ｈｂを有した。ｏｘｙＨｂと、不飽和ホスファチジルコリン（ｉｎ ｖｉｖｏでのＨｂ過酸化反応に対する主要な生理学的脂質基質と考えられる）を含有する再構成されたリポタンパク質とからなる混合物内でのＴＢＡＲＳの生成についても測定した（Ｄｅｕｅｌら、２０１５年）。図４Ｃに示す用量反応性実験は、ＭＤＡ形成における最も急激な増加が、一連の異なる反応インキュベーション時間にわたり、１０－５．５～１０－５ＭのｏｘｙＨｂにおいてやはり生じたことを実証する。図４Ｄは、本発明者らの患者のＣＳＦ－Ｈｂ濃度を、上記パラメーターの値をプロットしたｘ軸と同一のｘ軸にプロットする。図４Ｄは、ＳＡＨ－ＳＢＩを有する患者とＳＡＨ－ＳＢＩを有さない患者とを区別する、ＣＳＦ－Ｈｂに対する計算後のカットオフ濃度（最適なＹｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ）は、ほぼ最大の脳底動脈血管収縮、ＴＣＤ値、およびＴＢＡＲＳの生成と一致することを示す。
全体として、血管機能および脂質過酸化試験は、ＳＡＨ－ＳＢＩを有する患者における関連するＣＳＦ－Ｈｂ濃度と重複する臨界変曲点を示唆する。
Ｇ．ＣＳＦ－Ｈｂの枯渇および中和は病理学的血管収縮および脂質過酸化を緩和する。
患者内のＣＳＦ－ＨｂをＳＡＨ－ＳＢＩ関連の病態生理学と機構的にリンクさせるために、一連のＨｂ枯渇および中和実験を実施した。ハプトグロビンカラムによりＣＳＦ－Ｈｂが枯渇したＣＳＦに浸漬されたブタ脳底動脈セグメント（図５Ａ）は、高度に精製されたＨｂがオリジナルのＣＳＦ－Ｈｂ濃度まで補充された同一ＣＳＦサンプルに浸漬されたセグメントよりも有意に低い収縮力を有した（図５Ｂ）。この実験構成は、ハプトグロビンカラムにより血管作用物質の潜在的非特異的除去についてコントロールする。可溶性ハプトグロビン１－１（Ｈｐ１－１）の抗血管攣縮効果を確認するためにＨｂ用量応答実験も反復した。Ｈｂ濃度範囲全般において、Ｈｐ１－１は脳底動脈の収縮力を有意に減弱させた（反復測定分散分析、ｐ＜０．００１）（図５Ｃ）。
ａＳＡＨ後の患者から得たＣＳＦサンプルの酸化能力についても定量した。ベースラインＣＳＦ（０日目）と比較して、リポタンパク質を高リスク期に収集されたＣＳＦサンプルに曝露した後、ＭＤＡ生成物の可変性の増加が判明した（０．５～２週；図５Ｄ）。Ｈｐ１－１をＣＳＦ－Ｈｂに対して等モル濃度で添加すると、ＭＤＡ形成を効果的に減弱した。特に、ヘモペキシンを等モル濃度で添加すると、ＭＤＡ形成のなおもより強い減弱を示した。
患者ＣＳＦサンプルにおけるヘモグロビンおよびヘムスカベンジャータンパク質の定量的評価
Ａ．ＣＳＦサンプルにおけるヒトＨｐ、Ｈｐｘ、およびアルブミンの定量
ＣＳＦサンプル、１０マイクロリッターを清浄なエッペンドルフチューブ内に配置し、その後、タンパク質を沈殿させるためにＭｅＯＨ、８０μＬを添加した。メタノールを遠心分離後に除去し、そしてペレットを風乾し、その後、重同位元素標識ペプチド（ヒトハプトグロビン、ヘモペキシン、およびアルブミンに対して特異的であり、また内部標準として使用される）を含有する５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３／０．１６％のｐｒｏｔｅａｓｅＭＡＸ中に再懸濁した。５６℃／５５０ｒｐｍで４５分間インキュベートした後、０．５ＭのＤＴＴを添加することによりサンプルを還元した（５６℃／５５０ｒｐｍ、２０分間）。次に、０．５ＭのＩＡＡを添加し、そして遮光、ＲＴで２０分間インキュベートすることによりサンプルをアルキル化した。トリプシン消化を３７℃／５５０ｒｐｍで実施し、そしてギ酸添加により３時間後に停止した。遠心分離後、サンプルをＣ１８カラム上で速やかに分離した（ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ、２．１×１５０ｍＭ）。Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ－６５５０ ｉＦｕｎｎｅｌ ＱＴＯＦ ＬＣ－ＭＳシステムを使用して測定を実施した。
データを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔソフトウェアを使用しながら、アナライトおよび内部標準のピーク面積を計算することにより分析した。各標準サンプルについて、内部標準に対するアナライトの平均応答比を濃度に対してプロットすることにより、標準曲線をＡｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔにおいてタンパク質毎に作成した。ＣＳＦサンプル中のアナライト濃度を、標準曲線式を使用して逆算した。
Ｂ．ＣＳＦにおける遊離ヘモグロビンおよびハプトグロビン結合ヘモグロビンの決定
Ｈｂ（無細胞Ｈｂ）のＨｐ結合および未結合分画を、ＬＰＧ－３４００ＳＤクォータナリーポンプおよびフォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）に連結したＵｌｔｉｍａｔｅ３０００ＳＤ ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用しながら、ＳＥＣ－高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により決定した。ＣＳＦサンプルおよびＨｂ標準を、Ｄｉｏｌ－１２０（３μｍ、３００×８．０ｍｍ）カラム（ＹＭＣ ＣＯ Ｌｔｄ．社）上、移動相としてＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｂｉｃｈｓｅｌ社）を用いながら、１ｍＬ／分の流速で分離した。すべてのサンプルについて、２つの波長を記録した（λ＝２８０ｎｍおよびλ＝４１４ｎｍ）。ＣＳＦ内の結合および未結合Ｈｂを、両ピークのピーク面積を計算することにより決定した（Ｈｂ：Ｈｐの場合、Ｈｐ表現型に応じてリテンションタイム７～８分；無細胞Ｈｂの場合、リテンションタイム１０分）。ＣＳＦサンプルから得られた値を、濃度に対してプロットしたピーク面積に基づく標準曲線を生成することにより内挿した。
Ｃ．ＣＳＦ内ヘム結合型ヘムタンパク質の決定
ヘム結合型ヘムタンパク質を、ＬＰＧ－３４００ＳＤクォータナリーポンプおよびフォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）に連結したＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＳＤ ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用しながら、ＳＥＣ－高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により決定した。ＣＳＦサンプルおよびヘム標準を、Ｄｉｏｌ－１２０（３μｍ、３００×８．０ｍｍ）カラム（ＹＭＣ ＣＯ Ｌｔｄ．社）上、移動相としてＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｂｉｃｈｓｅｌ社）を用いながら、１ｍＬ／分の流速で分離した。すべてのサンプルについて、２つの波長を記録した（λ＝２８０ｎｍおよびλ＝４１４ｎｍ）。ＣＳＦ内のヘムタンパク質を、両ピークのピーク面積を計算することにより決定した（ヘム結合型ヘムタンパク質の場合、リテンションタイム９分；無細胞Ｈｂの場合リテンションタイム１０分）。ＣＳＦサンプルから得られた値を、濃度に対してプロットしたピーク面積に基づく標準曲線を生成することにより内挿した。
Ｄ．ヒトＣＳＦサンプル内ヘモペキシン：ヘム複合体の検出
ＣＳＦサンプル、５０マイクロリッターを、清浄なエッペンドルフチューブ内に配置し、その後、バッファーＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）、１５０μＬを添加した。第１のクロマトグラフィー工程では、存在量が非常に大きいヒトタンパク質を枯渇させたが、それを２つのＬＰＧ－３４００ＳＤクォータナリーポンプおよびフォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）に連結したＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＳＤ ＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）上、製造業者のプロトコールに従い実施した。要するに、希釈した血漿サンプルを、ヒトアルブミンおよびＩｇＧを枯渇させる多重親和性除去カラムに注入し（ヒトＩｇＧ／ＨＳＡ、４．６×５０ｍＭ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）、そしてバッファーＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を移動相として用いながら、０．２５ｍＬ／分の流速で分離した。枯渇したＣＳＦを新鮮なＨＰＬＣバイアル内に収集し、再注入し、そしてＤｉｏｌ－３００（３μｍ、３００×８．０ｍｍ）カラム（ＹＭＣ ＣＯ Ｌｔｄ．社）上、移動相としてＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｂｉｃｈｓｅｌ社）を用いながら、１ｍＬ／分の流速で分離した。すべてのサンプルについて、２つの波長を記録した（λ＝２８０ｎｍおよびλ＝４１４ｎｍ）。ヘモペキシン：ヘム複合体の量を、複合体のピーク面積を計算することにより決定した（リテンションタイム９分）。枯渇したＣＳＦサンプルから得られた値を、濃度に対してプロットしたピーク面積に基づく標準曲線を生成することにより内挿した。
結果
１４日間にわたり収集されたａＳＡＨ患者２８例から得られたＣＳＦサンプルにおいて、無細胞ヘモグロビンを評価した（図１１）。ＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂを定量する方法論は、上記実施例１に記載されるコホートに適用された方法とは異なる（コホートは同一）ものの、結果は完全に一致する（相関係数（ｒ）＝０．９６）。再度、データは、無細胞Ｈｂレベルは経時的に増加し、そしておよそ１０日目（１．５週目）にピークに達することを実証した。対照的に、血液がＣＳＦ中に浸入することに起因して、ハプトグロビンおよびヘモペキシン濃度は、健常対照者と比較して非常に早い時点において増加した。両スカベンジャータンパク質は、ヘモグロビンレベルに対して逆動力学を示し、溶血の遷延に起因する枯渇が示唆される。アルブミン濃度はタイムコース全体を通じて同程度にとどまったが、しかし健常対照者ＣＳＦサンプルと比較した場合、有意に増加した。
次のステップでは、スカベンジャータンパク質であるハプトグロビンおよびヘモペキシンを、ヘモグロビンまたはヘムとの複合体としてのその存在に関して調査した。全体的に、両タンパク質の動力学に基づき予測されるように、値は非常に低く、また大部分のデータポイントは標準曲線外に内挿された。無細胞Ｈｂデータと総合すれば、患者ＣＳＦ内で両タンパク質が明確に検出される早期の時点においては、標的はまだ存在せず、またＨｂレベルが増加している後期の時点においては、両スカベンジャーはすでに枯渇しており、ＣＳＦから排出されていることが示唆される。したがって、これらのデータは、天然Ｈｂ解毒経路は完全に飽和しており、スカベンジャータンパク質は枯渇していることを示唆する。中間ヘム保管タンパク質であるアルブミンが、試験全体を通じて上昇することが判明したが、また無細胞ＨｂまたはＨｐ結合型Ｈｂ以外のヘム結合タンパク質であるヘムタンパク質の追加調査から、ＣＳＦ内の総アルブミンと類似したパターンが明らかとなった。ヘモペキシンに結合したヘムは非常に低いか、または存在さえしないものと同定されたので、これらのデータは、検出されたヘムタンパク質の大部分は実際にはアルブミンに結合したヘムであることを示唆する。ヘモペキシンとは対照的に、アルブミンに結合したヘムは、鉄媒介式の毒性になおも関与することができ、したがってａＳＡＨ患者における二次脳損傷の主要な寄与因子の１つと考えられる。これらのデータより、ａＳＡＨ患者におけるヘム媒介式の酸化的障害をさらに低下させるためにヘモペキシンを使用することが支持される。
ヘム毒性／ヘモペキシン保護
Ａ．線条体内注射モデル
野生型オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０～１２週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、ドイツ）から入手し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ（ＬＡＳＣ）の動物施設において維持し、そしてスイス連邦家畜局（Ｓｗｉｓｓ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ）のガイドラインに基づき処置した。
マウスを、１００％の酸素中で気化されたイソフルラン（誘発の場合４～５％、維持の場合１～２％；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏ．社、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、米国）で麻酔した。外科手技全体を通じて、体温を直腸プローブを用いてモニタリングし、そして電子サーモスタットコントロール式の加温ブランケットを使用しながら一定に維持した。麻酔したマウスをモーター付き定位固定フレーム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）内に配置し、そして長さ１ｃｍの正中線皮膚切開を行った。頭蓋骨を覆う軟組織を除去した後、ブレグマにフレームを合わせ、そして小さな頭蓋穿孔を標的に対する進入ポイント上部にドリル穿孔した。次に３３Ｇ針を、線条体（ブレグマ座標：２ｍｍ ＭＬ、０．５ｍｍ ＡＰ、３．５ｍｍ ＤＶ）内にゆっくりと前進させ（０．１ｍｍ／秒）、それに後続して、ヘム－アルブミン（１ｍＭ）、ハプトグロビン（５ｍＭ）（タンパク質コントロール群）、またはヘム－ヘモペキシン（１ｍＭ）、１０μＬを、輸液速度１００ｎｌ／秒で注射した。針をその場に５分間留置し、次にゆっくりと取り出し、そして皮膚切開部を、縫合糸を用いて閉鎖した。外科手技の後、動物を加温した覚醒ボックス内に配置し、そして動物が完全に回復し、そしてそのホームケージ（ｈｏｍｅｃａｇｅ）に戻すことが可能になるまでモニタリングした。
Ｂ．行動試験
オープンフィールド探索試験を、拡散照明（アリーナの中央部において測定した場合、およそ３５ｌｘ）の下、試験室内に位置する不透明アクリルガラスからなる４つの等しい四角形アリーナ（４０×４０×３５ｃｍ（高さ））内で実施した。デジタルカメラを、４つのアリーナの上部に直接取り付けた。画像を５Ｈｚの速度で捕捉し、そしてＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎ（Ｎｏｌｄｕｓ社、オランダ）トラッキングシステムが稼働するＰＣに伝送した。基礎的な歩行活動を測定する場合、動物をアリーナ中央部に静かに配置し、そして１５分間探索できるようにした。５分間の環境順化期後に開始して、１０分間に移動した総距離（ｃｍ表示）を測定した。
ロータロッド行動試験では、マウスを回転シリンダー上に配置し、したがって強制的に歩行させる。これは、強制的歩行活動の評価を可能にする。シリンダーの回転を、３００秒の期間おいて、１分間当たり５回転（開始時）から最大４０回転（終了時）まで加速させる。マウスがシリンダーから落下するまでの時間を測定する。
個々の神経学的障害に関して、マウスにビーム歩行試験を施した。その場合、マウスは挙上させたビームを横断して安全な場所（小型シェルター）に到達しなければならない。ビームは、長さ１００ｃｍおよび幅１３ｍｍを有する。アセスメント期間中、運動機能を、処置に対して盲検化された治験責任医師２名によりスコア化した。
Ｃ．ＭＲＩプロトコール
マウスを、１００％の酸素中で気化されたイソフルラン（誘発の場合４～５％、維持の場合１～２％；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏ．社、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、米国）で麻酔した。画像化手順全体を通じて、体温を直腸プローブを用いてモニタリングし、そして加温ブランケットを使用しながら一定に維持し、そして呼吸数をプレチスモグラフィーにより記録した。マウスを、７Ｔ小型動物用ＭＲＩスキャナー（Ｂｒｕｃｋｅｒ社、ドイツ）内に配置した。Ｔ２、ＡＳＬ、およびＤＷＩ画像を、標準化されたプロトコールに従い記録した。
結果
図１２に示すように、オープンフィールド試験（図１２Ａ）、ロータロッド試験（図１２Ｂ）、およびビーム歩行試験（図１２Ｃ）の低下により証明されるように、ヘムは、線条体内注射から２４時間後のマウスにおける神経学的機能に障害を及ぼした。対照的に、ヘム：Ｈｘ複合体を線条体内注射されたマウスは、同一時点（２４時間）における神経行動学的活動において障害を示さなかった。神経学的機能の障害は、ヘムを線条体内注射されたマウスの放射線学的変化と関連し、病変周囲の浮腫、ＡＤＣマップにおける拡散制限、および動脈スピンラベル標識（ＡＳＬ）画像上の限局性潅流障害（図１３）が含まれた。ヘム：Ｈｐｘを線条体内注射されたマウスでは、軽微な放射線学的変化のみが認められた。図１４に示すように、放射線学的変化を定量化することにより、ヘムの線条体内注射は、大脳浮腫の形成および潅流の局部的低下（ヘム：Ｈｐｘを注射されたマウス内には存在しない）と関連することが確認された。
考察
本発明者らはＳＡＨ－ＳＢＩに対するバイオマーカーとして脳室ＣＳＦ－Ｈｂを同定したが、それは他の確立された方法の診断正確性を驚異的に凌駕する。臨床的に重要な濃度範囲内において、ＣＳＦ－Ｈｂは血管収縮を誘発し、そして不飽和脂質をｅｘ ｖｉｖｏで酸化することから、ＣＳＦ－Ｈｂは、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）内への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の上流メディエーターとしての役割を演ずることが示唆される。高ＣＳＦ－Ｈｂと有害な臨床転帰との強い関連性、基本的な病態生理学的根拠、ならびにヘモペキシンおよびハプトグロビンの好ましい効果より、ＣＳＦ－Ｈｂは、適するバイオマーカーとして、およびＳＡＨ－ＳＢＩ対するリスクに晒されている患者における標的として位置付けられる。
出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰、例えばＤＩＮＤ、ＤＣＩ、およびａＶＳＰ等に対するその高い診断正確性に加えて、ＣＳＦ－Ｈｂの追加の長所は、その単純かつ信頼性のある分析論にある。精密なＣＳＦ－Ｈｂ値は、単純な２工程手順（ＣＳＦから細胞およびデブリを取り除くための遠心分離工程、ならびに後続する自動化されたスペクトラルデコンボリューションを用いた分光光度測定から構成される）で、ＩＣＵにおいて決定可能である。さらに、分光光度測定の基礎となる物理法則は、標準曲線または較正サンプルのパラレル測定を行わずしてＣＳＦ－Ｈｂの絶対的な定量を可能にする。全体として、この手順は、分析コストおよび稼働時間を有意に低下させ、そして広範囲に及ぶ適用可能性および受け入れ可能性を増強し得る。
本発明者らは、ＣＳＦ－Ｈｂは患者ＣＳＦにおける主要な血管収縮物質であることも明らかにした。さらに、ｅｘ ｖｉｖｏでの血管攣縮モデルにおけるＨｂ濃度のアクティブダイナミックレンジは、大脳動脈内のＴＣＤ流動速度および本発明者らの患者コホートにおけるＳＡＨ－ＳＢＤの有無を判定する臨界変曲点とオーバーラップする。同一の臨床的に重要な濃度範囲内において、ＣＳＦ－Ｈｂは脂質酸化剤としてきわめて活性であることが判明し、酸化性のＨｂ毒性は、非虚血性神経傷害に寄与することが示唆される。患者ＣＳＦにおける脂質酸化活性は、下流Ｈｂ代謝物であるヘムに少なくとも一部起因した。ヘモペキシンによるその選択的中和は、ＭＤＡの形成を実質的にブロックした一方、ハプトグロビンは部分的な阻害をもたらした。
本明細書で開示されるデータは、ＣＳＦ－Ｈｂは、ＳＡＨ－ＳＢＩを予防および処置するための好適な薬物標的であることを実証する。これは、ＣＳＦ－Ｈｂと有害な臨床転帰との強い関連性、合理的病態生理学、ならびに臨床的に重要な毒性範囲においてヘモペキシンおよびハプトグロビンを用いたＣＳＦ－Ｈｂ中和の好ましい機能的効果により支持される。今日まで、ａＳＡＨ後のＳＡＨ－ＳＢＩの発生を低下させる唯一の薬物は、カルシウムチャネル遮断薬ニモジピン（クラスＩ、レベルＡ）である。ニモジピンは臨床転帰に対してプラスの効果を有するものの、ａＶＳＰの発生を防止しない。様々な薬物、ＣＳＦドレナージ、クモ膜下ラバージュ、終板開窓術、または頭部振盪の予防効果に関するこれまでの試験は、ＳＡＨ－ＳＢＩのリスクに対する有意な効果をいまだ示していない。すでに症候性の患者では、治療オプションは、局所的脳血流を改善するための非因果的レスキュー療法に限定される。
本明細書に記載されるＣＳＦ分析において、内因性ハプトグロビンは、ａＳＡＨ後の最初の数日以内に、無細胞Ｈｂが関連して生成する前にＣＳＦから排出されることが明らかとなった。したがって、内因性ハプトグロビンの保護機能は無視し得ると思われる一方、外因性ハプトグロビンは、臨床的に重要なＣＳＦ－Ｈｂ濃度範囲内において抗血管攣縮的および抗酸化的効果を提供する。思いがけず、ヘムスカベンジャータンパク質であるヘモペキシンはハプトグロビンの酸化防止機能を凌駕したが、そうしたことは、酸化または分解されたＣＳＦ－Ｈｂからヘムの一部がすでに放出され、低親和性ヘム結合タンパク質と会合したまま存続する酸化性遊離ヘムのプールを形成している可能性があることを示唆する。これらのデータは、ａＳＡＨの文脈においてハプトグロビンおよびヘモペキシンを治療的に併用すれば、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰に対する相乗的保護を提供するものと期待されることを示唆する。
本発明者らは、ヘモペキシンは、線条体内注射後に生ずる、神経学的機能のヘム媒介式の障害を無害化することも明らかにした。この効果は放射線学的変化と相関関係を有し、ヘムを線条体内注射されたマウスは、病変周囲の浮腫、ＡＤＣマップにおける拡散制限、および動脈スピンラベル標識（ＡＳＬ）画像上の限局性潅流障害を示した一方、ヘム：Ｈｐｘ複合体を線条体内注射されたマウスでは、これらの有害な放射線学的変化は概ね存在しなかったことに留意されたい。
参考文献
1. Bates D, Machler M, Bolker B, Walker S. Fitting Linear Mixed-Effects Models Usinglme4 [Internet]. Journal of Statistical Software 2015; Available from: http://dx.doi.org/10.18637/jss.v067.i01
2. Behrouz R. The Rise and Fall of Transcranial Doppler Ultrasonography for the Diagnosis of Vasospasm in Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage. J Neurosurg Anesthesiol 2019; 31: 79-80.
3. Bland M. An Introduction to Medical Statistics. Oxford University Press; 2015
4. Connolly ES Jr, Rabinstein AA, Carhuapoma JR, Derdeyn CP, Dion J, Higashida RT, et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/american Stroke Association. Stroke 2012; 43: 1711-37.
5. Deuel JW, Vallelian F, Schaer CA, Puglia M, Buehler PW, Schaer DJ. Different target specificities of haptoglobin and hemopexin define a sequential protection system against vascular haemoglobin toxicity. Free Radic Biol Med 2015; 89: 931-43.
6. Dewey M. metap: meta-analysis of significance values. 2020
7. Diringer MN, Bleck TP, Claude Hemphill J 3rd, Menon D, Shutter L, Vespa P, et al. Critical care management of patients following aneurysmal subarachnoid hemorrhage: recommendations from the Neurocritical Care Society’s Multidisciplinary Consensus Conference. Neurocrit Care 2011; 15: 211-40.
8. Elmer J, Harris DR, Sun G, Palmer AF. Purification of hemoglobin by tangential flow filtration with diafiltration. Biotechnol Prog 2009; 25: 1402-10.
9. Hugelshofer M, Buzzi RM, Schaer CA, Richter H, Akeret K, Anagnostakou V, et al. Haptoglobin administration into the subarachnoid space prevents hemoglobin-induced cerebral vasospasm. J Clin Invest 2019; 129: 5219-35.
10. Kassambara A, Mundt F. factoextra: Extract and Visualize the Results of Multivariate Data Analyses [Internet]. 2020; Available from: https://CRAN.R-project.org/package=factoextra
11. Kikinis R, Pieper SD, Vosburgh KG. 3D Slicer: A Platform for Subject-Specific Image Analysis, Visualization, and Clinical Support. Intraoperative Imaging and Image-Guided Therapy 2014: 277-89.
12. Lawrence MA. ez: Easy Analysis and Visualization of Factorial Experiments [Internet]. 2016; Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ez
13. Liberzon A, Birger C, Thorvaldsdottir H, Ghandi M, Mesirov JP, Tamayo P. The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst 2015; 1: 417-25.
14. Md Riaz Ahmed. ROCit- An R Package for Performance Assessment of Binary Classifier with Visualization [Internet]. 2019 [cited 2020 Sep 17] Available from: https://openprairie.sdstate.edu/datascience_symposium/2019/posters/6/
15. Robin X, Turck N, Hainard A, Tiberti N, Lisacek F, Sanchez J-C, et al. pROC: an open-source package for R and S to analyze and compare ROC curves [Internet]. BMC Bioinformatics 2011; Available from: http://dx.doi.org/10.1186/1471-2105-12-77
16. Sachs MC. plotROC: A Tool for Plotting ROC Curves [Internet]. J Stat Softw 2017; Available from: http://dx.doi.org/10.18637/jss.v079.c02
17. Sing T, Sander O, Beerenwinkel N, Lengauer T. ROCR: visualizing classifier performance in R.Bioinformatics 2005; 21: 3940-1.
18. Sloan MA, Haley EC Jr, Kassell NF, Henry ML, Stewart SR, Beskin RR, et al. Sensitivity and specificity of transcranial Doppler ultrasonography in the diagnosis of vasospasm following subarachnoid hemorrhage. Neurology 1989; 39: 1514-8.
19. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 15545-50.
20. Weidert S, Andress S, Linhart C, Suero EM, Greiner A, Bocker W, et al. 3D printing method for next-day acetabular fracture surgery using a surface filtering pipeline: feasibility and 1-year clinical results. International Journal of Computer Assisted Radiology and Surgery 2020; 15: 565-75.
21. Wood SN. Generalized Additive Models: An Introduction with R, Second Edition. CRC Press; 2017

Claims (138)

  1. 血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、ヘモペキシン（Ｈｘ）が無細胞ヘムと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｘに曝露する工程を含む方法。
  2. 出血性脳卒中は、天然に生じる出血または外傷性出血である、請求項１に記載の方法。
  3. 出血性脳卒中は、脳室内出血またはクモ膜下出血である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. クモ膜下出血は、動脈瘤性クモ膜下出血である、請求項３に記載の方法。
  5. 有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性、および浮腫からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 有害な二次神経学的転帰は、脳血管攣縮である、請求項５に記載の方法。
  7. 有害な二次神経学的転帰は、酸化性組織傷害である、請求項５に記載の方法。
  8. 有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害である、請求項５に記載の方法。
  9. 有害な二次神経学的転帰は、遅発性脳虚血である、請求項５に記載の方法。
  10. 有害な二次神経学的転帰は、脳実質内の有害な二次神経学的転帰である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 出血の発現後約２１日以内に、ＣＳＦをＨｘに曝露する工程を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 出血の発現後約２日間～約１４日間、ＣＳＦをＨｘに曝露する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. Ｈｘは、対象に対して頭蓋内投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. Ｈｘは、対象に対して髄腔内投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. Ｈｘは、脊椎管中に髄腔内投与される、請求項１４に記載の方法。
  16. Ｈｘは、クモ膜下腔中に髄腔内投与される、請求項１４に記載の方法。
  17. Ｈｘは、対象に対して脳室内投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  18. Ｈｘは、対象に対して外部脳室ドレイン経由で脳室内投与される、請求項１７に記載の方法。
  19. ＣＳＦが治療有効量のＨｘに曝露される期間は、少なくとも約２分である、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 治療有効量のＨｘは、出血後の対象のＣＳＦにおいて測定される場合、無細胞ヘム、またはヘム当量として表される無細胞Ｈｂの濃度に対して、少なくとも等モル量である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. （ｉ）出血後およびＣＳＦをＨｘに曝露する前の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂまたは無細胞ヘムの量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた、ヘム当量として表される無細胞Ｈｂ、または無細胞ヘムの濃度に基づき、Ｈｘの少なくとも等モル量を決定する工程
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. Ｈｘの治療有効量は、約２μＭ～約１ｍＭである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. Ｈｘの治療有効量は、約２μＭ～約４００μＭである、請求項２２に記載の方法。
  24. Ｈｘの治療有効量は、約５μＭ～約２００μＭである、請求項２２に記載の方法。
  25. Ｈｘの治療有効量は、約１０μＭ～約２００μＭである、請求項２２に記載の方法。
  26. ＣＳＦ内で形成されたＨｘ：無細胞ヘム複合体を除去する工程をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ＣＳＦを、治療有効量のＨｘに体外的に曝露する工程を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  28. （ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｘを添加して、Ｈｘ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉｉ）Ｈｘ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これによりＨｘが対象のＣＳＦコンパートメントにおいて無細胞ヘムと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｘに曝露する工程；および
    （ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
    を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. （ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
    （ｉｉ）Ｈｘを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これにより、対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、Ｈｘが無細胞ヘムと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｘに曝露する工程；および
    （ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
    を含む、請求項２７に記載の方法。
  30. （ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
    （ｉｉ）ＣＳＦにおいて、Ｈｘまたはその機能的類似体が無細胞ヘムと複合体を形成するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｘに曝露する工程；
    （ｉｉｉ）Ｈｘ：無細胞ヘム複合体を、工程（ｉｉ）の後のＣＳＦから抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより少ない量の無細胞ヘムを有するヘム減少ＣＳＦを取得する工程；
    （ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞ヘムを実質的に含まないヘム減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
    （ｖ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたヘム減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
    を含む、請求項２７に記載の方法。
  31. 工程（ｖｉ）の前に、ヘム減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｘを添加する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. Ｈｘは、基材上に固定されている、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  33. Ｈｘが固定化された基材は、粒径排除クロマトグラフィー樹脂、アフィニティークロマトグラフィー樹脂、フィルター、およびメンブレンからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 工程（ｉｉ）は、ＣＳＦ中の無細胞ヘムが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをアフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含み、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）後に樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含み、および工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 場合により、工程（ｉ）後のＣＳＦコンパートメントを、洗浄溶液を用いて洗浄する工程を含む、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 洗浄溶液は、人工ＣＳＦである、請求項３５に記載の方法。
  37. 人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ６・Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、およびグルコースを含む、請求項２９または請求項３６に記載の方法。
  38. 洗浄溶液は、Ｈｘを含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 洗浄溶液は、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 洗浄溶液は、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. （ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｘを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
    （ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）を反復する工程；および
    （ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントに人工ＣＳＦを投与する工程
    を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ６・Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、およびグルコースを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 人工ＣＳＦは、Ｈｘを含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
  44. 人工ＣＳＦは、約２μＭ～約８０ｍＭのＨｘを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 人工ＣＳＦは、約２μＭ～約１，２００μＭのＨｘを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. Ｈｘは、組換えタンパク質である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. Ｈｘは、血漿由来である、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  48. ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程をさらに含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 出血の発現後約２１日以内に、ＣＳＦをＨｐに曝露する工程を含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 出血の発現後約２日間～約１４日間、ＣＳＦをＨｐに曝露する工程を含む、請求項４８に記載の方法。
  51. Ｈｐは、対象に対して頭蓋内投与される、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. Ｈｐは、対象に対して髄腔内投与される、請求項の４８～５０いずれか１項に記載の方法。
  53. Ｈｐは、脊椎管中に髄腔内投与される、請求項５２に記載の方法。
  54. Ｈｐは、クモ膜下腔中に髄腔内投与される、請求項５２に記載の方法。
  55. Ｈｐは、対象に対して脳室内投与される、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  56. ＣＳＦがＨｐに曝露される期間は、少なくとも約２分である、請求項４８～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 治療有効量のＨｐは、出血後の対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの濃度に対して少なくとも等モル量である、請求項４８～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. （ｉ）出血後およびＣＳＦをＨｐに曝露する前の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた無細胞Ｈｂの濃度に基づき、Ｈｐの少なくとも等モル量を決定する工程
    をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 治療有効量のＨｐは、約２μＭ～約２０ｍＭである、請求項４８～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 治療有効量のＨｐは、約２μＭ～約３００μＭである、請求項５９に記載の方法。
  61. 治療有効量のＨｐは、約５μＭ～約５０μＭである、請求項５９に記載の方法。
  62. 治療有効量のＨｐは、約１０μＭ～約３０μＭである、請求項５９に記載の方法。
  63. ＣＳＦ内で形成されたＨｐ：無細胞Ｈｂ複合体を除去する工程をさらに含む、請求項４８～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. ＣＳＦを、治療有効量のＨｐに体外的に曝露する工程を含む、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  65. （ｊ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｐを添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉｉ）Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これによりＨｐが対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
    （ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
    を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. （ｊ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
    （ｉｉ）Ｈｐを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これによりＨｐが対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
    （ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
    を含む、請求項６４に記載の方法。
  67. （ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
    （ｉｉ）ＣＳＦにおいて、Ｈｐまたはその機能的類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐに曝露する工程；
    （ｉｉｉ）Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体を、工程（ｉｉ）の後のＣＳＦから抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより少ない量の無細胞Ｈｂを有するＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；
    （ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
    （ｖｉ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
    を含む、請求項６４に記載の方法。
  68. 工程（ｖｉ）の前に、Ｈｂ減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｐを添加する工程をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
  69. Ｈｐは、基材上に固定化されている、請求項６７または請求項６８に記載の方法。
  70. 基材は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂である、請求項６９に記載の方法。
  71. 工程（ｉｉ）は、ＣＳＦ中の無細胞Ｈｂが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをアフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含み；工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）の後の樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含み；および工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 場合により、工程（ｉ）後のＣＳＦコンパートメントを、洗浄溶液を用いて洗浄する工程を含む、請求項６５～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 洗浄溶液は、人工ＣＳＦである、請求項７２に記載の方法。
  74. 人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ６・Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、およびグルコースを含む、請求項６６または請求項７３に記載の方法。
  75. 洗浄溶液は、Ｈｐを含む、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 洗浄溶液は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 洗浄溶液は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む、請求項７６に記載の方法。
  78. （ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｐを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
    （ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）を反復する工程；および
    （ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）の後の対象のＣＳＦコンパートメントに、人工ＣＳＦを投与する工程
    を含む、請求項４８～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＣｌ６・Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、およびグルコース含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 人工ＣＳＦは、Ｈｐを含む、請求項７８または請求項７９に記載の方法。
  81. 人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 人工ＣＳＦは、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む、請求項８１に記載の方法。
  83. Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項４８～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体を含む、請求項８３に記載の方法。
  85. Ｈｘは、組換えタンパク質である、請求項４８～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. Ｈｐは、血漿由来である、請求項４８～８４のいずれか１項に記載の方法。
  87. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約８μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項４８～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約７μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項８７に記載の方法。
  89. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約６μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項８７に記載の方法。
  90. 対象に、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１～８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 第２の薬剤は、血管拡張薬である、請求項９０に記載の方法。
  92. 第２の薬剤は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムからなる群から選択される、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
  93. 請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のＨｘおよび薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物。
  94. 請求項４８～８９のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のＨｐおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  95. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約８μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項９４に記載の使用のための組成物。
  96. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約７μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項９５に記載の使用のための組成物。
  97. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約６μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項９５に記載の使用のための組成物。
  98. 請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬の製造における、治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）の使用。
  99. 請求項４８～８８のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬の製造における、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）の使用。
  100. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約８μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項９９に記載の使用。
  101. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約７μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項１００に記載の使用。
  102. 治療有効量のＨｐは、処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約６μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項１００に記載の使用。
  103. 請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための治療有効量のヘモペキシン（Ｈｘ）。
  104. 請求項４８～８９のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰の処置または予防で使用するための治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）。
  105. 処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約８μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項１０４に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  106. 処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約７μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項１０５に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  107. 処置期間中に、対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂの量を、約６μＭ以下のレベルまで低下させるのに十分である、請求項１０５に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  108. 対象は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するかどうか判定する方法であって、
    （ｉ）出血性脳卒中後の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程
    を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクは、工程（ｉｉｉ）における比較に基づき決定される、方法。
  109. 工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１０８に記載の方法。
  111. 有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１０８に記載の方法。
  112. 有害な二次神経学的転帰は遅発性脳虚血であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約３μＭである場合、対象は遅発性脳虚血を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１０８に記載の方法。
  113. 有害な二次神経学的転帰は遅発性虚血性神経障害であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は遅発性虚血性神経障害を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１０８に記載の方法。
  114. 請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定された対象を処置する工程をさらに含む、請求項１０８～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  115. （ｉ）出血性脳卒中後の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程
    を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクは工程（ｉｉｉ）における比較に基づき判定される方法により、対象は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法。
  116. 工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１１５に記載の方法。
  117. 有害な二次神経学的転帰は、血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１１５に記載の方法。
  118. 有害な二次神経学的転帰は、血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１１５に記載の方法。
  119. 有害な二次神経学的転帰は、遅発性脳虚血であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約３μＭである場合、対象は遅発性脳虚血を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１１５に記載の方法。
  120. 有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は遅発性虚血性神経障害を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１１５に記載の方法。
  121. （ｉ）出血性脳卒中後の対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程
    を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクは工程（ｉｉｉ）における比較に基づき判定される方法により、対象は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項９３～９７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
  122. 工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２１に記載の使用のための組成物。
  123. 有害な二次神経学的転帰は、血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２１に記載の使用のための組成物。
  124. 有害な二次神経学的転帰は、血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２１に記載の使用のための組成物。
  125. 有害な二次神経学的転帰は遅発性脳虚血であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約３μＭである場合、対象は遅発性脳虚血を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２１に記載の使用のための組成物。
  126. 有害な二次神経学的転帰は遅発性虚血性神経障害であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は遅発性虚血性神経障害を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２１に記載の使用のための組成物。
  127. （ｉ）出血性脳卒中後の対象に由来する脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程
    を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクは工程（ｉｉｉ）における比較に基づき判定される方法により、対象は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／またはＨｂのＣＳＦ中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項９８～１０２のいずれか１項に記載の使用。
  128. 工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２７に記載の使用。
  129. 有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２７に記載の使用。
  130. 有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２７に記載の使用。
  131. 有害な二次神経学的転帰は遅発性脳虚血であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約３μＭである場合、対象は遅発性脳虚血を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２７に記載の使用。
  132. 有害な二次神経学的転帰は遅発性虚血性神経障害であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は遅発性虚血性神経障害を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１２７に記載の使用。
  133. （ｉ）出血性脳卒中後の対象に由来する脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを取得する工程；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の量を測定する工程；および
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を参照値と比較する工程
    を含み、対象の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクは工程（ｉｉｉ）における比較に基づき判定される方法により、対象は、血管外溶血、ならびに無細胞ヘムおよび／または無細胞ＨｂのＣＳＦ中への放出を伴う出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１０４～１０７のいずれか１項に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  134. 工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は有害な二次神経学的転帰を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１３３に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  135. 有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１３３に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  136. 有害な二次神経学的転帰は血管造影血管攣縮であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は血管造影血管攣縮を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１３３に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  137. 有害な二次神経学的転帰は遅発性脳虚血であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約３μＭである場合、対象は遅発性脳虚血を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１３３に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
  138. 有害な二次神経学的転帰は遅発性虚血性神経障害であり、および工程（ｉｉ）において決定されたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量が少なくとも約７μＭである場合、対象は遅発性虚血性神経障害を発症するリスクを有するものと判定される、請求項１３３に記載の使用のための治療有効量のＨｐ。
JP2023546211A 2021-02-01 2022-01-31 出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法 Pending JP2024504822A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163144043P 2021-02-01 2021-02-01
US63/144,043 2021-02-01
PCT/EP2022/052203 WO2022162218A1 (en) 2021-02-01 2022-01-31 Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024504822A true JP2024504822A (ja) 2024-02-01

Family

ID=80739092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023546211A Pending JP2024504822A (ja) 2021-02-01 2022-01-31 出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4284407A1 (ja)
JP (1) JP2024504822A (ja)
KR (1) KR20230142569A (ja)
CN (1) CN117136068A (ja)
AU (1) AU2022214388A1 (ja)
CA (1) CA3206884A1 (ja)
IL (1) IL304515A (ja)
WO (1) WO2022162218A1 (ja)

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4137307A (en) 1973-11-15 1979-01-30 The Green Cross Corporation Process for preparing haptoglobin aqueous solution using strong anion exchanger
US4061735A (en) 1973-11-15 1977-12-06 The Green Cross Corporation Haptoglobin in aqueous solution and process for preparing the same
EP0793504B1 (en) 1994-12-12 2005-06-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric cytokines and uses thereof
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6887470B1 (en) 1999-09-10 2005-05-03 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
US20080108560A1 (en) 2002-03-05 2008-05-08 Eli Lilly And Company Heterologous G-Csf Fusion Proteins
SI1624891T2 (sl) 2003-05-06 2013-09-30 Biogen Idec Hemophilia Inc. Strjevalni faktor-FC himerni proteini za zdravljenje hemofilije
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
MXPA05013565A (es) 2003-06-12 2006-03-09 Lilly Co Eli Proteinas de fusion analogas al glp-1.
CA2551916C (en) 2003-12-31 2014-04-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US20060057065A1 (en) 2004-09-11 2006-03-16 Yanming Wang Composition and method to prevent and treat brain and spinal cord injuries
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
KR102231613B1 (ko) 2012-10-03 2021-03-25 체에스엘 베링 아게 단백질 정제 방법
US9534029B2 (en) 2012-10-03 2017-01-03 Csl Behring Ag Method of purifying proteins
AU2018314767B2 (en) 2017-08-08 2024-03-21 Csl Behring Ag Hemopexin formulations
BR112021022940A2 (pt) * 2019-05-17 2022-01-18 Csl Behring Ag Haptoglobina para uso no tratamento de um resultado neurológico secundário após um acidente vascular cerebral hemorrágico

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022214388A1 (en) 2023-07-27
KR20230142569A (ko) 2023-10-11
CN117136068A (zh) 2023-11-28
CA3206884A1 (en) 2022-08-04
IL304515A (en) 2023-09-01
WO2022162218A1 (en) 2022-08-04
EP4284407A1 (en) 2023-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11141469B2 (en) Methods and compositions for treating aging-associated conditions
EP2941440B1 (en) Polymeric forms of h-nox proteins
EP2707055B1 (en) Reducing soluble urokinase receptor in the circulation
JP7204030B2 (ja) 鎌状赤血球症における血管閉塞性クリーゼ、急性肺障害、および／または急性呼吸窮迫症候群を治療、改善および／または予防するためのａｄａｍｔｓ１３の使用
US20130123185A1 (en) Methods of treating and diagnosing acute chest syndrome
Ohtsuki et al. Is P‐glycoprotein Involved in Amyloid‐β Elimination Across the Blood–Brain Barrier in Alzheimer's Disease?
JP2011516419A (ja) 鉄欠乏性障害を治療するためのフェリチンの使用
US20130012443A1 (en) Methods of treatment of central nervous system hemorrhage using protoporphyrin ix-fe compounds
US20060216294A1 (en) Method of modulation
JP2024504822A (ja) 出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法
US20220211808A1 (en) Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
US20190231856A1 (en) Compositions and methods for treating intracerebral hemorrhage
RU2818474C2 (ru) Гаптоглобин для применения в лечении неблагоприятного вторичного неврологического исхода после геморрагического инсульта
CN114206377A (zh) 重组adamts13治疗镰状细胞病的应用
US10947311B2 (en) VCAM-1 mediated methods and compositions for treating aging-associated impairments
Walters Hematopoietic cell transplantation for sickle cell disease
JP7237085B2 (ja) 凝固異常を伴う敗血症の治療及び／又は改善のための医薬
KR20240005075A (ko) 재조합 합토글로빈 (hp) 베타 쇄를 생산하기 위한 발현 시스템
WO2018088464A1 (ja) 脳梗塞の治療薬
WO2022155499A1 (en) Active delivery of radiotracers across the blood brain barrier
CA3128503A1 (en) Targeting cd24-siglec interactions for treating subjects with prediabetes or diabetes
EA045409B1 (ru) Рекомбинантная человеческая кислая альфа-глюкозидаза
JP2014132029A (ja) 鉄欠乏性障害を治療するためのフェリチンの使用