RU2818474C2

RU2818474C2 - Гаптоглобин для применения в лечении неблагоприятного вторичного неврологического исхода после геморрагического инсульта

Info

Publication number: RU2818474C2
Application number: RU2021137198A
Authority: RU
Inventors: Михаэль ХУГЕЛЬСХОФЕР; Кристиан ШЕР; Доминик ШЕР
Original assignee: Универзитет Цюрих; Цсл Беринг Аг
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2024-05-02

Abstract

Заявленное изобретение относится к области медицины и раскрывает применение гаптоглобина для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, сопровождающегося внесосудистым эритролизом и высвобождением бесклеточного гемоглобина в спинномозговую жидкость (СМЖ), включающее воздействие на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества гаптоглобина и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить гаптоглобину образовать комплекс с бесклеточным гемоглобином и тем самым нейтрализовать его. Техническим результатом изобретения является лечение или профилактика неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта. 14 з.п. ф-лы, 19 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к способам и композициям для лечения и/или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта в компартменте спинномозговой жидкости (СМЖ), в частности, после субарахноидального кровоизлияния (SAH).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Все ссылки, включая любые патенты или патентные заявки, процитированные в этом описании, включены сюда посредством ссылки, чтобы обеспечить полное понимание изобретения. Тем не менее, такие ссылки не следует рассматривать как признание того, что любой из этих документов является частью общих знаний в данной области техники в Австралии или любой другой стране.

Геморрагический инсульт включает разрыв кровеносного сосуда в головном мозге или на его поверхности с кровоизлиянием в окружающие ткани. Примеры геморрагического инсульта включают: i) внутримозговое кровоизлияние (называемое здесь ICH), которое включает разрыв кровеносного сосуда в мозге; ii) внутрижелудочковое кровоизлияние (именуемое здесь IVH), которое включает кровоизлияние в желудочковую систему головного мозга; и iii) субарахноидальное кровоизлияние (называемое здесь SAH), которое включает кровоизлияние в пространство между мозгом и тканью, покрывающей мозг, известном как субарахноидальное пространство. Чаще всего причиной SAH является разорвавшаяся аневризма (далее aSAH). Другие причины SAH включают травмы головы, нарушения свертываемости крови и прием препаратов, разжижающих кровь.

Приблизительно 30% IVH в основном ограничиваются желудочковой системой субъекта и обычно вызваны внутрижелудочковой травмой, аневризмой, сосудистыми мальформациями или опухолями, особенно сосудистого сплетения. Остальные 70% имеют вторичный характер и являются результатом расширения существующего кровоизлияния, будь то внутрипаренхимальное или SAH. Было обнаружено, что IVH встречается в 35% случаев умеренных и тяжелых черепно-мозговых травм. Таким образом, IVH обычно не возникает без обширных сопутствующих повреждений.

Аневризматическое субарахноидальное кровоизлияние (aSAH) является наиболее частой причиной SAH и связано с самыми высокими показателями смертности и длительными неврологическими нарушениями^{1, 2}. Несмотря на успехи в лечении аневризм и нейроинтенсивной терапии, средний уровень летальности в стационаре в Европе составляет 44,4% и в США оставляет 32,2%³. 35% выживших сообщают о низком общем качестве жизни через 1 год после события кровоизлияния, 83-94% не могут вернуться к работе^4-6. По оценкам, частота aSAH в результате разрыва внутричерепной аневризмы в США составляет 1 случай на 10000 человек, что дает примерно 27000 новых случаев ежегодно. Кроме того, aSAH чаще встречается у женщин, чем у мужчин (2:1); пик заболеваемости приходится на людей в возрасте от 55 до 60 лет.

Несмотря на улучшение лечения пациентов с геморрагическим инсультом и снижение смертности за последние десятилетия, инвалидность и смертность в этой популяции остаются высокими. Повреждение головного мозга может произойти сразу и в первые дни после SAH. Это раннее повреждение головного мозга может быть связано с физическим воздействием на мозг, таким как повышение внутричерепного давления, грыжи, внутримозговое, внутрижелудочковое кровоизлияние и гидроцефалия. Возникают последующие неблагоприятные вторичные неврологические исходы, включая ангиографический церебральный вазоспазм (ACV), который в более тяжелых случаях может привести к отсроченной ишемии головного мозга (DCI) и инфаркту мозга. Неблагоприятные вторичные неврологические исходы с возникновением неврологического дефицита вследствие отсроченной ишемии (DIND) обычно возникают между 4 и 14 днями после начального кровоизлияния или кровотечения и являются основным фактором инвалидности и смертности у этих пациентов. DIND является отличительным синдромом церебральной ишемии. Повышенная головная боль, менингизм и температура тела обычно сопровождаются колеблющимся снижением сознания и появлением очаговых неврологических симптомов. Клинический DIND может быть определен или по замедленному снижению сознания, по меньшей мере, на два уровня по шкале комы Глазго (GCS), и/или по новому очагу неврологического дефицита. Серийное сканирование КТ может быть выполнено после операции, во время клинического ухудшения и после периода мониторинга для выявления отсроченных инфарктов. В отдельных случаях, оно может быть дополнено МРТ. Патогенез DIND остается изученным лишь частично, но повсеместно считается многофакторным⁷. Например, нейровоспаление играет решающую роль в распространении травм и повреждении головного мозга. Продукты распада эритроцитов могут привести к высвобождению воспалительных цитокинов, которые запускают вазоспазм и повреждение тканей⁸. Периферические иммунные клетки рекрутируются и активируются в поврежденной ткани. Эти клетки могут проникать в паренхиму мозга и выделять воспалительные цитокины⁹. Кроме того, внутренние толл-подобные рецепторы активируются после инфаркта, что приводит к широко распространенному нейровоспалению. Нейровоспаление также связано с побочными вторичными исходами, которые возникают после SAH¹⁰. Сосуды, подвергшиеся церебральному вазоспазму (CV), обладают повышенной способностью к адгезии лейкоцитов, что способствует отсроченному неврологическому ухудшению¹⁵.

Также потенциально причиной повреждения головного мозга являются воспаление, церебральный микротромбоз, распространяющаяся корковая ишемия, разрушение гематоэнцефалического барьера и отсроченная церебральная ишемия (DCI).

К сожалению, ни одно фармакологическое лечение, направленное на эти процессы, еще не показало эффективности при геморрагических инсультах. Энтеральное введение нимодипина и эндоваскулярное лечение основной причины аневризмы при aSAH остаются единственными вариантами лечения, подтвержденными данными рандомизированных клинических испытаний для улучшения результатов лечения пациентов. Следовательно, существует острая и неудовлетворенная потребность в специфических способах лечения и/или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у пациентов, перенесших геморрагический инсульт.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящего изобретения представлен способ лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, сопровождающегося внесосудистым эритролизом и высвобождением бесклеточного гемоглобина (Hb) в спинномозговую жидкость (СМЖ), где способ включает воздействие на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективным количеством гаптоглобина (Hp) в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb и, тем самым, нейтрализовать его.

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после внутрижелудочкового кровоизлияния в соответствии с описанным в настоящем документе способом, где композиция содержит терапевтически эффективное количество гаптоглобина (Hp) и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлена фармацевтическая композиция для применения при лечении или профилактике неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после внутрижелудочкового кровоизлияния в соответствии с описанным в настоящем документе способом, где композиция содержит терапевтически эффективное количество гаптоглобина (Hp) и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлено использование терапевтически эффективного количества гаптоглобина (Hp) в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после внутрижелудочкового кровоизлияния в соответствии со способом, описанным в настоящем документе.

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлен набор, включающий искусственную СМЖ, как описано в настоящем документе, или композицию, как описано в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлен иллюстративный пример выделения базилярной артерии свиньи из недавно забитых свиней с помощью транскливального подхода. 5-6 сосудистых колец на животное (длиной 2 мм) готовят под препаровальной лупой, избегая обширных механических манипуляций с сосудами.

На фигуре 2 представлена схема и интраоперационная фотография экспериментальной установки с внешним желудочковым дренажем (EVD), входящим в лобный рог левого бокового желудочка, имплантированным нейромониторинговым зондом в правом лобном белом веществе и подзатылочной спинномозговой иглой.

На фигуре 3 показано полуавтоматическое количественное определение диаметров сосудов по цифровой субтракционной ангиографии (DSA). Левая фигура и вставка в правом верхнем углу показывают типовой выбор линейных исследуемых областей (ROI) в передней мозговой артерии (ACA), средней мозговой артерии (MCA), цистернальной части внутренней сонной артерии (ICA) и базилярной артерии (BA). Они были установлены автоматически в прямом сегменте ACA, cICA и BA с интервалом 0,5 мм (5 по количеству) и вручную в криволинейном сегменте MCA (3 по количеству). Для всех ROI диаметр сосуда был рассчитан из профиля интенсивности поперечного сечения (в центре справа), как описано ранее у Fischer et al. 2010 (справа внизу) и усреднено по всем ROI соответствующего сосуда.

На фигуре 4 показано влияние бесклеточного Hb в экспериментах с функцией сосудов с выделенными базилярными артериями свиньи. A. После добавления MAHMA NONOate (60 нМ) к буферу можно наблюдать NO-опосредованный вазодилататорный ответ сегментов сосудов базилярной артерии свиньи (серая кривая). В буфере, содержащем 10 мкМ oxyHb (черная кривая), мы не наблюдали сосудорасширяющего ответа после добавления MAHMA NONOate. Кривые показывают среднее значение ± СО для 15 и 14 сосудов для буфера и буфера+Hb, соответственно. B. После добавления эквимолярной концентрации Hp к буферу, содержащему 10 мкМ Hb, восстанавливается сосудорасширяющий ответ на MAHMA NONOate. Кривые показывают среднее значение ± СО для 16 сосудов на группу. В этом эксперименте сосудистый ответ был нормализован относительно напряжения после пассивного растяжения до оптимального соотношения IC1/IC100 (= 100%) и уровня тонического сокращения после добавления PF2ɑ (= 0%).

На фигуре 5 показаны изображение и спектры поглощения (центрифугированного) образца СМЖ пациента с эритролизом до (темный) и после селективного удаления Hb (светлый) с помощью Hp-колонки. Удаление Hb восстановило сосудорасширяющий ответ на введение MAHMA NONOate, о чем свидетельствует временное уменьшение записей натяжения сегментов базилярной артерии свиньи, которые были погружены в СМЖ (серый). Расширяющий NO-сигнал остается несвязанным в том же образце СМЖ до истощения Hb (черный).

На фигуре 6 показано соединение расширяющего NO-сигнала в базилярных артериях свиньи, погруженных в СМЖ, от пациентов с aSAH (n=9) после введения MAHMA-NONOate в СМЖ. Артерии последовательно исследовали в прегемолитической СМЖ (левая панель), гемолитической СМЖ (средняя панель) и после добавления Hp к гемолитической СМЖ (правая панель).

На фигуре 7 показан круг Уиллиса на цифровой субтракционной ангиографии, на фотографии анатомического образца и на изогнутой многопланарной реконструкции (изогнутая MPR) T1 взвешенного MR изображения. Яркий (белый) сигнал в изогнутой MPR представляет влитый гемопротеин (комплекс Hb-Hp в этом примере), окружающий заднюю соединительную артерию (PCOM) и базилярную артерию (BA), как показано на изображениях фронтальной проекции. Пунктирные линии (1-3) в кривой MPR указывают расположение коронарных срезов.

На фигуре 8 представлены типовые гистологические изображения срезов мозга овцы через боковые желудочки после инъекции TCO-меченного Hb (A) и TCO-меченного Hb:Hp (B), окрашенных на ядра («Ядра») и меченного соединения («TCO-Hb» или «TCO-HbHp»). A, Hb проникает из желудочковой системы через эпендимальный барьер в интерстициальное пространство головного мозга (светлые области на изображениях «TCO-Hb» в A). В, Проникновение комплексов Hb:Hp через эпендимальный барьер в интерстициальное пространство головного мозга резко снижено по сравнению с одним Hb. Однако, если целостность эпендимального барьера нарушена (например, местное повреждение после имплантации EVD), Hb:Hp локально проникает в ткань мозга (острие стрелки). Сканы целых срезов были получены путем сшивания отдельных изображений, полученных с 10х увеличением. Верхние панели отображают наложение окраски ядер (Hoechst) и TCO-меченного Hb или Hb:Hp, соответственно (Tet-Cy5), тогда как нижняя панель показывает только меченый белок.

На Рисунке 9 представлены типовые гистологические изображения срезов головного мозга овцы через средний мозг после инъекции TCO-меченного Hb (A) и TCO-меченного Hb:Hp (B), окрашенных на ядра («Ядра») и меченое соединение («TCO-Hb» или «TCO-HbHp»). A, Hb проникает из краниального субарахноидального пространства СМЖ через ограничители глии среднего мозга в паренхиму головного мозга (светлые области на изображениях «TCO-Hb» в A). В, Распределение комплексов Hb:Hp ограничено периваскулярными пространствами, заполненными СМЖ (пространства Вирхова-Робина) проникающих кортикальных сосудов. Сканы цельных срезов были получены путем сшивания отдельных изображений, полученных с 10х увеличением. Верхние панели отображают наложение ядерного пятна и меченого соединения, тогда как нижняя панель показывает только меченое соединение.

На фигуре 10 показаны типовые конфокальные изображения мелких артерий в перивентрикулярной области среднего мозга овцы после инфузии TCO-меченных Hb (A-D) или комплексов Hb:Hp (E-H). Срезы вибратома размером 120 мкм окрашивали на клетки гладких мышц сосудов (aSMA), синаптические нервные окончания астроцитов (AQP4) и TCO-меченый Hb (тетразин-Cy5). На изображениях с градиентом от черного к белому (сигнал Hb) отображается только сигнал меченого гемопротеина из соответствующего изображения. Делокализация бесклеточного Hb из СМЖ в сосудистые структуры (слой гладкомышечных клеток) и паренхиму головного мозга (область астроцитов) блокируется Hp. Шкала 20 мкм.

На фигуре 11 показано сравнение иллюстративного DSA в боковой проекции двух овец после инфузии Hb (A) или комплексов Hb:Hp (B). Сегментарный вазоспазм основной артерии (стрелка) был очевиден через 60 минут после инфузии Hb, тогда как сегментарный вазоспазм не мог быть обнаружен у животных, которым вливали комплексы Hb:Hp.

На фигуре 12 показаны иллюстративные исходные данные (A) и через 60 минут после инфузии Hb (B) ангиограммы сегментарных вазоспазмов в средней мозговой артерии в боковой проекции (стрелки, верхняя панель) и передней мозговой артерии (стрелка, нижняя панель), а также средней мозговой артерии (звездочка, нижняя панель) в дорсовентральной проекции. На изображениях показаны сегментарные спазмы сосудов, возникающие во всех основных сосудистых территориях.

Фигура 13. На верхней панели (A) показано относительное изменение диаметра мозговых артерий через 60 минут после инфузии Hb или Hb:Hp (ACA: передняя мозговая артерия, BA: базилярная артерия, ICA: внутренняя сонная артерия, MCA: средняя мозговая артерия). Ромбы представляют среднее значение и 95% доверительный интервал (n=4 овцы на группу). На нижней панели показан кумулятивный анализ относительных изменений диаметра всех проанализированных областей артерий через 60 минут после инфузии иСМЖ (B), Hb или Hb:Hp (C). Ромбы представляют среднее значение и 95% доверительный интервал. (ACA: передняя мозговая артерия, BA: базилярная артерия, ICA: внутренняя сонная артерия, MCA: средняя мозговая артерия).

На Фигуре 14 показаны (A) профили последовательного SEC элюирования образцов СМЖ овцы, собранных из субарахноидального пространства после внутрижелудочковой инфузии Hb и (позже) Hp, как указано. Стандартные профили элюирования Hb и комплексов Hb-Hp показаны вверху; и (B) DSA средней мозговой артерии (MCA) на исходном уровне, через 45 минут после инфузии Hb и через 45 минут после инфузии Hp.

На Фигуре 15 показано сочетание NO-опосредованной релаксации базилярных артерий свиней, которые были погружены в СМЖ овцы, собранные до или после 60 мин ангиограмм после лечения. После инфузии искусственной СМЖ (СМЖ-гем 0 мкМ Hb=контр. СМЖ; левая панель), после инфузии Hb (СМЖ-гем 200-240 мкМ Hb; средняя панель): после инфузии Hb-Hp (СМЖ-гем 200-240 мкМ; правая панель). Пунктирная линия на средней панели показывает восстановление NO-ответа посредством добавления ex vivo эквимолярного Hp. Во всех экспериментах дилатационные ответы вызывались одним болюсом MAHMA-NONOate.

На фигуре 16 показана классификация белков СМЖ в образцах пациентов на 1, 4, 7, 11 и 14 дни после острого кровоизлияния. Белки, идентифицированные с помощью LC-MSMS, анализировали с помощью кластеризации K-средних логарифмически преобразованных нормализованных соотношений интенсивности ионов. На правой панели показан анализ основных компонентов идентифицированных белков. Кластер 1: белки, оставшиеся неизменными (т.е. ALB). Кластер 2: белки, уменьшающиеся с течением времени (например, HP, HPR). Кластер 3: количество белков, увеличивающееся с течением времени (например, HBB, HBA, FTH, HBD, CAT, CA1, FTL). Сокращения: ALB, альбумин; HP, гаптоглобин; HPR, белок, родственный гаптоглобину; HBB, Hb-бета; HBA, Hb-альфа; FTH, тяжелая цепь ферритина; HBD, Hb-дельта; CAT, каталаза; CA1, карбоангидраза; FTL, легкая цепь ферритина.

На Фигуре 17 показан гистоморфометрический анализ артериол в сосудистой выстилке четвертого желудочка. 120 мкм срезы головного мозга овцы окрашивали на альфа-гладкомышечный актин (αSMA). (A) Иллюстрация анатомической ситуации исследуемых срезов головного мозга. Исследователь, заслепленный к лечению, записал конфокальные изображения сосудов в сосудистой выстилке. (B) На основе ручного определения внутренней и внешней окружности положительных структур αSMA с помощью программного обеспечения Image J, площадь просвета (A_{внутренняя}) и общая площадь сечения сосуда (A_{внешняя}) были количественно определены для каждого сосуда, и рассчитана доля площади просвета. Эти измерения были выполнены для всех изображений тремя заслепленными исследователями, и средние значения были дополнительно проанализированы. (C) Типовые изображения артериол в сосудистой выстилке овец, обработанных Hb и Hb-гаптоглобином. (D) Нанесенные на график данные и статистический анализ для всех проанализированных сосудов (n=57). (E) Нанесенные на график данные и статистический анализ средней площади просвета на овцу (n=3). Точки обозначают отдельных животных. Ромбы представляют среднее значение и 95% доверительный интервал. Метки перекрытия (горизонтальные линии выше и ниже средней линии) определяют статистически значимое различие между группами, если оно не перекрывается (p <0,05).

На фигуре 18 показан ответ выделенных сегментов базилярной артерии, погруженных в буфер, содержащий 10 мкМ oxyHb, на MAHMA NONOate (60 нМ) на буфер до (два левых прямоугольных графика) и после добавления либо рекомбинантного Hp 1-1, либо полученного из плазмы Hp 2-2. Никакого существенного различия в восстановлении NO-индуцированного вазодилататорного ответа между Hp 1-1 и Hp 2-2 не наблюдается. N=4 сосудистых сегмента на каждое тестируемое состояние.

В этом эксперименте сосудистый ответ был нормализован относительно напряжения после пассивного растяжения до оптимального соотношения IC1/IC100 (= 100%) и уровня тонического сокращения после добавления PF2ɑ (= 0%).

На Фигуре 19 показан ответ выделенных сегментов базилярной артерии, погруженных в буфер, содержащий 10 мкМ oxyHb, на MAHMA NONOate (60 нМ) на буфер до (верхняя панель «Hb погружения») и после («Hp погружения» нижняя панель) добавления любой эквимолярной концентрации полученного из плазмы Hp 1-1 (кривые из черных точек) или полученного из плазмы Hp 2-2 (серые кривые). Не наблюдается качественной разницы в восстановлении сосудорасширяющего ответа на NO между Hp 1-1 и Hp 2-2, полученным из плазмы. N=6 сосудистых сегментов на каждое тестируемое состояние.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Во всем этом описании, если контекст не требует иного, слово «содержать» или его варианты, такие как «содержит» или «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел.

Ссылка в этом описании на любую предыдущую публикацию (или информацию, полученную из нее) или на любой известный вопрос, не является и не должна восприниматься как подтверждение или признание или любая форма предположения, что предыдущая публикация (или полученная информация из нее) или известный объект составляет часть общих знаний в области, к которой относится данное описание.

Следует отметить, что при использовании в описании формы единственного числа включают аспекты множественного числа, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на «агент» включает один, а также два или несколько агентов; ссылка на «композицию» включает одну композицию, а также две или несколько композиций; и так далее.

В отсутствие каких-либо указаний на обратное, ссылка на «%» содержания в настоящем описании должна приниматься как означающая % масс./масс. (масса/масса). Например, под раствором, содержащим гаптоглобин в количестве, по меньшей мере, 80% от общего белка, понимается композиция, содержащая, по меньшей мере, 80% масс./масс. от общего белка.

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на неожиданном открытии авторов изобретения о том, что Hp может снижать или иным образом предотвращать опосредованные бесклеточным Hb неблагоприятные вторичные неврологические исходы, такие как церебральный вазоспазм, in vivo. Таким образом, в описанном в настоящем документе аспекте представлен способ лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, сопровождаемого внесосудистым эритролизом и высвобождением бесклеточного гемоглобина (Hb) в спинномозговую жидкость (СМЖ), где способ включает воздействие на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества гаптоглобина (Hp) в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp или его функциональному аналогу образовать комплекс с и, тем самым, нейтрализовать, бесклеточный Hb.

Геморрагический инсульт

Геморрагический инсульт, или кровоизлияние, в компартмент СМЖ также взаимозаменяемо называется в настоящем документе кровоизлиянием в мозг, внутримозговым кровоизлиянием или внутричерепным кровоизлиянием. Обычно он характеризуется разрывом кровеносного сосуда в головном мозге, вызывающим локальное кровоизлияние. Локация кровоизлияния может быть разной. Например, кровоизлияние в компартмент СМЖ может быть результатом внутрижелудочкового кровоизлияния, внутрипаренхимального кровоизлияния и/или субарахноидального кровоизлияния.

Геморрагический инсульт состоит из ряда патологий с различным естественным течением, оценкой и управлением, что известно специалистам в данной области техники. Обычно его разделяют на первичный или вторичный, в зависимости от этиологии.

В одном варианте осуществления геморрагическим инсультом является внутрижелудочковое кровоизлияние (IVH) или субарахноидальное кровоизлияние (SAH). В одном варианте осуществления, геморрагическим инсультом является собой аневризматическое субарахноидальное кровоизлияние (aSAH).

Способы диагностики геморрагического инсульта и, в частности, SAH, у субъекта будут знакомы специалистам в данной области техники, иллюстративные примеры включают церебральную ангиографию, компьютерную томографию (КТ) и спектрофотометрический анализ oxyHb и билирубина в СМЖ субъекта (см., например, Cruickshank AM., 2001, ACP Best Practice No 166, J. Clin. Path., 54(11):827-830).

Специалистам в данной области техники будет понятно, что геморрагический инсульт может быть спонтанным кровоизлиянием (например, в результате разрыва аневризмы) или травматическим кровоизлиянием (например, в результате травмы головы). В одном варианте осуществления, геморрагическим инсультом является спонтанное кровоизлияние, также известное как не травматическое кровоизлияние. В одном из вариантов осуществления, геморрагическим инсультом является травматическое кровоизлияние.

Термин «спинномозговая жидкость» или СМЖ означает жидкость в желудочках головного мозга, а также в краниальных и спинномозговых субарахноидальных пространствах. Желудочки головного мозга, краниальные и спинномозговые субарахноидальные пространства в совокупности называются в настоящем документе «компартментом СМЖ». Таким образом, в варианте осуществления, описанном в настоящем документе, способ включает воздействие на компартмент СМЖ пациента, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества Hp.

СМЖ преимущественно, но не исключительно, секретируется сосудистыми сплетениями, которые состоят из гранулярных менингеальных выступов в просвет желудочков, эпителиальная поверхность которых переходит в эпендиму. Исследования также показали, что интерстициальная жидкость мозга, эпендима и капилляры также могут играть роль в секреции СМЖ. Объем СМЖ у взрослых людей оценивается примерно в 150 мл, с типовым распределением от 125 мл в краниальном и спинномозговом субарахноидальном пространстве до 25 мл в желудочках, хотя и с заметными различиями между индивидуумами. Секреция СМЖ у взрослых людей колеблется от 400 до 600 мл в день, причем около 60-75% СМЖ продуцируется сосудистыми сплетениями боковых желудочков и сосудистой выстилкой третьего и четвертого желудочков. Хориоидальная секреция СМЖ обычно включает два этапа: (i) пассивную фильтрация плазмы из хориоидальных капилляров в хориоидальный интерстициальный компартмент в соответствии с градиентом давления и (ii) активный транспорт из интерстициального компартмента в просвет желудочков через хориоидальный эпителий с участием карбоангидразы и белков-переносчиков мембранных ионов. СМЖ играет важную роль в гомеостазе церебральной интерстициальной жидкости и нейрональной среды, регулируя баланс электролитов, циркуляцию активных молекул и устранение катаболитов. СМЖ транспортирует продукты секреции хориоидального сплетения к местам их действия, тем самым модулируя активность определенных областей мозга путем пропитки, в то время как синаптическая передача вызывает более быстрые изменения активности. Отходы метаболизма мозга, продукты перекисного окисления и гликозилированные белки накапливаются с возрастным снижением оборота СМЖ (Sakka et al., 2011, European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases, 128(6):309-316).

Неблагоприятный вторичный неврологический исход

Пациенты, пережившие геморрагический инсульт, например SAH, подвергаются значительному риску развития одного или нескольких неблагоприятных вторичных неврологических исходов или осложнений. Термин «неблагоприятный вторичный неврологический исход» в контексте настоящего описания относится к неблагоприятному неврологическому событию (вторичное повреждение ткани мозга), которое следует за геморрагическим инсультом. Вторичное повреждение после геморрагического инсульта может быть вызвано каскадом событий, инициированных первичным повреждением (например, объемным воздействием и физическим разрушением), физиологической реакцией на гематому (например, воспалением) и/или выделением крови и компонентов крови. Неблагоприятные вторичные неврологические исходы известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают неврологический дефицит вследствие отсроченной ишемии (DIND), отсроченную церебральную ишемию (DCI), нейротоксичность, апоптоз, воспаление, истощение оксида азота, окислительное повреждение ткани, церебральный вазоспазм, церебральную вазореактивность, отек и распространяющуюся деполяризацию (см., например, Al-Tamimi et al., World Neurosurgery, 73(6):654-667 (2010); Macdonald et al., Neurocrit. Care, 13:416-424 (2010); и Macdonald et al., J. Neurosurg. 99:644-652 (2003)).

Термины «лечение», «лечение», «лечить» и подобные используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения облегчения, минимизации, уменьшения, облегчения, ослабления или иного ингибирования неблагоприятного вторичного неврологического исхода, включая один или несколько его симптомов, как описано в настоящем документе. Термины «лечение», «лечение» и подобные также используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения профилактики возникновения неблагоприятного вторичного неврологического исхода или задержки начала или последующего прогрессирования неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта, который может быть предрасположен к или подвержен риску развития неблагоприятного вторичного неврологического исхода, но еще не диагностирован. В этом контексте термины «лечение», «лечение» и подобные используются взаимозаменяемо с такими терминами, как «профилактика», «профилактический» и «превентивный». Однако следует понимать, что описанные в настоящем документе способы не должны полностью предотвращать неблагоприятный вторичный неврологический исход у субъекта, подлежащего лечению. Может быть достаточно, чтобы способы, описанные в настоящем документе, просто облегчили, уменьшили, ослабили, улучшили или иным образом ингибировали неблагоприятный вторичный неврологический исход у субъекта до такой степени, чтобы было меньше неблагоприятных вторичных неврологических исходов и/или меньше тяжелых неблагоприятных вторичных неврологических исходов, чем в противном случае могло бы наблюдаться при отсутствии лечения. Таким образом, описанные в настоящем документе способы могут снизить количество и/или тяжесть неблагоприятных вторичных неврологических исходов у субъекта после геморрагического инсульта.

Следует понимать, что ссылка на субъекта в настоящем документе не подразумевает, что субъект перенес геморрагический инсульт, но также включает в себя субъекта, который находится в группе риска геморрагического инсульта. В одном из вариантов осуществления, субъект имеет (т.е. испытывает) геморрагический инсульт или его симптом. В другом варианте осуществления, у субъекта не было геморрагического инсульта во время лечения, но он находится в группе риска геморрагического инсульта. В качестве наглядного примера, субъект имеет аневризму, которая еще не разорвалась, но есть риск разрыва. В этом случае субъект может подвергнуться хирургическому вмешательству, чтобы минимизировать риск разрыва аневризмы (например, хирургическим клипированием или эндоваскулярной спиралью). Следовательно, способы, описанные в настоящем документе, могут быть соответственно назначены субъекту в качестве профилактической меры для минимизации, уменьшения, отмены или иного ингибирования неблагоприятного вторичного неврологического исхода в случае разрыва аневризмы до, во время или после хирургического вмешательства. В этом контексте описанные в настоящем документе способы могут использоваться в качестве профилактических мер до, во время или после хирургического вмешательства.

Степень, в которой описанные в настоящем документе способы обеспечивают субъективное, качественное и/или количественное снижение количества и/или тяжести неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта, может быть представлена в виде доли уменьшения, например на, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 45% до примерно 55%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60%, предпочтительно, от примерно 55% до примерно 65%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 65% до примерно 75%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 75% до примерно 85%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, предпочтительно, от примерно 85% до примерно 95% или наиболее предпочтительно, от примерно 90% до 100% по сравнению с числом и/или тяжестью неблагоприятных вторичных неврологических исходов до воздействия на СМЖ терапевтически эффективного количества Hp.

Подходящие способы, с помощью которых можно измерить субъективное, качественное и/или количественное снижение количества и/или тяжести неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта, знакомы специалистам в данной области техники и во многом зависят от характера неблагоприятного вторичного неврологического исхода, который необходимо измерить. Иллюстративные примеры описаны в настоящем документе в другом месте.

В одном из вариантов осуществления, неблагоприятный вторичный неврологический исход выбран из группы, состоящей из неврологического дефицита вследствие отсроченной ишемии (DIND), отсроченной церебральной ишемии (DCI), нейротоксичности, воспаления, истощения оксида азота, окислительного повреждения ткани, церебрального вазоспазма, церебральной вазореактивности, отека и распространяющейся деполяризации.

В одном из вариантов осуществления, неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является неврологический дефицит вследствие отсроченной ишемии (DIND). DIND после SAH является серьезным и плохо изученным синдромом церебральной ишемии, характеризующимся усилением головной боли, менингизма и/или температуры тела, обычно сопровождаемый колеблющимся снижением сознания и появлением очаговых неврологических симптомов. DIND обычно определяется как ухудшение неврологической функции, наблюдаемое по меньшей мере, через 3-4 дня после геморрагического приступа. Его также называют клиническим/симптоматическим вазоспазмом или отсроченной церебральной ишемией (DCI). DIND остается важной причиной заболеваемости и смертности у выживших после начального кровоизлияния. Сообщаемая распространенность DIND составляет от 20% до 35%, хотя у пациентов с более высокой нагрузкой крови она может достигать 40%. DIND приписывается церебральным инфарктам примерно у 20% пациентов и примерно в 13% всех случаев смерти и инвалидности после aSAH. Подходящие способы определения DIND известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в Dreier et al., Brain, 2006; 129(12): 3224-3237, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте осуществления, DIND определяется путем распространения деполяризации массы, что подтверждается, например, распространением отрицательных медленных изменений напряжения с помощью электрокортикографии. В одном из вариантов осуществления, DIND ассоциирован с замедленным снижением сознания, по меньшей мере, на два уровня GCS и/или новым очаговым неврологическим дефицитом.

В одном из вариантов осуществления, неблагоприятным вторичным неврологическим результатом является церебральный вазоспазм. Церебральный вазоспазм, или CV (также называемый «ангиографическим церебральным вазоспазмом»), является одной из наиболее частых причин очаговой ишемии после геморрагического инсульта и может составлять вплоть до примерно 23% инвалидности и смерти, связанных с SAH. CV обычно характеризуется сужением кровеносных сосудов, вызванным постоянным сокращением кровеносных сосудов, в частности, артерий большой емкостных у основания головного мозга (т.е. мозговых артерий) после геморрагического инсульта в субарахноидальном пространстве. Поэтому термин «вазоспазм» обычно используется в отношении ангиографически определяемого сужения артерии. Постоянное сокращение кровеносных сосудов снижает перфузию дистальных отделов головного мозга и увеличивает сопротивление сосудов головного мозга. При отсутствии лечения CV может, в конечном итоге, привести к нейротоксичности (повреждению клеток головного мозга) в форме церебральной ишемии и инфаркта, в первую очередь, из-за ограниченного кровоснабжения ткани мозга. CV может быть обнаружен любыми подходящими средствами, известными специалистам в данной области техники, иллюстративные примеры которых включают вычислительную субтракционную ангиографию (DSA), компьютерную томографию (КТ) ангиографию (КТА), магнитно-резонансную (МР) ангиографию (МРА), транскраниальную допплеровскую эхографию и катетерную (церебральную) ангиографию (КА). В одном из вариантов осуществления, CV определяют с помощью вычислительной субтракционной ангиографии (DSA). Не будучи связанными теорией или конкретным способом применения, вазоспазм мозговых артерий обычно начинается примерно через 3 дня после SAH, достигает пика примерно через 7-8 дней и разрешается примерно через 14 дней (см., например, Weir et al., Ω., 48:173-178 (1978)), при этом некоторая степень ангиографического сужения наблюдается, по меньшей мере, у двух третей пациентов, имеющих ангиографию между 4 и 12 днями после SAH.

Частота CV зависит от временного интервала после SAH. Как отмечается в другом месте в настоящем документе, пик заболеваемости обычно наступает примерно через 7-8 дней после SAH (диапазон 3-12 дней). Помимо времени после SAH, другими основными факторами, влияющими на распространенность вазоспазма, являются объем, плотность, временная персистенция и распределение субарахноидальной крови. Прогностические факторы CV могут включать количество субарахноидальной крови на скане КТ, гипертензию, анатомические и системные факторы, клиническую степень и то, получает ли пациент антифибринолитики.

Симптомы CV обычно развиваются подостро и могут колебаться и могут включать чрезмерную сонливость, вялость, ступор, гемипарез или гемиплегию, абулию, языковые нарушения, дефицит полей зрения, нарушение зрения и паралич черепных нервов. Хотя некоторые симптомы локализованы, они, как правило, не указывают на какой-либо конкретный патологический процесс. Церебральная ангиография обычно используется как золотой стандарт для визуализации и изучения мозговых артерий, хотя также можно использовать транскраниальную допплеровскую эхографию.

Как отмечалось в другом месте в настоящем документе, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что Hp может снижать или иным образом предотвращать бесклеточный Hb-опосредованный CV in vivo. Следует понимать, что степень, в которой описанные в настоящем документе способы снижают или иным образом предотвращают Hb-опосредованный CV, может зависеть от нескольких факторов, таких как степень сужения сосудов (сужение сосудов), которое индуцируется бесклеточным Hb после геморрагического инсульта, концентрация бесклеточного Hb в спинномозговой жидкости субъекта после геморрагического инсульта, период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию Hp, и наличие или отсутствие какого-либо постоянного кровотечения. Способы оценки того, уменьшают ли описанные в настоящем документе способы или иным образом предотвращают CV у субъекта, знакомы специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают вычислительную субтракционную ангиографию (DSA), компьютерную томографию (КТ), ангиографию (КТА), магнитно-резонансную (МР) ангиографию (МРА) и катетерную ангиографию (КА).

В одном из вариантов осуществления воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, восстанавливает средний диаметр просвета суженного церебрального кровеносного сосуда, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, или более предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50% после 60-минутного периода воздействия, как определено с помощью DSA.

В одном из вариантов осуществления, воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, восстанавливает средний диаметр просвета суженной передней мозговой артерии, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, или более предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50% после 60-минутного периода воздействия, как определено с помощью DSA.

В одном из вариантов осуществления, воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, восстанавливает средний диаметр просвета суженной внутренней сонной артерии по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, или более предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50% после 60-минутного периода воздействия, как определено с помощью DSA.

В одном из вариантов осуществления, воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, восстанавливает средний диаметр просвета суженной медиальной мозговой артерии по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, или более предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50% после 60-минутного периода воздействия, как определено с помощью DSA.

В одном из вариантов осуществления, воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, восстанавливает средний диаметр просвета суженной базилярной артерии по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, или более предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50% после 60-минутного периода воздействия, как определено с помощью DSA.

В одном варианте осуществления, воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, увеличивает среднюю площадь просвета суженного небольшого паренхиматозного сосуда (например, церебральной артериолы) на, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 30%, предпочтительно, по меньшей мере, 35%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, 45%, предпочтительно, по меньшей мере, 55%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, предпочтительно, по меньшей мере, 65%, предпочтительно, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 75% или более предпочтительно, по меньшей мере, 80% после 60-минутного периода воздействия, как определено визуализацией перфузии in vivo (например, МРТ перфузии, КТ перфузии). В одном варианте осуществления, малым паренхиматозным сосудом является церебральную артериолу. В одном варианте осуществления, воздействие Hp на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, как описано в настоящем документе, восстанавливает церебральную микроперфузию путем профилактики сужения небольших паренхиматозных сосудов по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, на 25%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, предпочтительно, по меньшей мере, на 35%, предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, предпочтительно, по меньшей мере, на 45%, предпочтительно, по меньшей мере, на 55%, предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, предпочтительно, по меньшей мере, на 65% предпочтительно, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 75% или более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% после 60-минутного периода воздействия, как определено визуализацией перфузии in vivo (например, МРТ перфузии, КТ перфузии). В одном варианте осуществления, малым паренхиматозным сосудом является церебральная артериола.

В одном из вариантов осуществления, неблагоприятным вторичным неврологическим результатом является отсроченная церебральная ишемия (DCI). DCI обычно возникает примерно у трети пациентов с aSAH и вызывает смерть или стойкую инвалидность у половины этих пациентов (Dorsch and King, Journal of Clinical Neuroscience, 1:19-26 (1994)). DCI часто характеризуется как замедленное неврологическое ухудшение в результате ишемии тканей и обычно связано с возникновением очаговых неврологических нарушений, таких как гемипарез, афазия, апраксия, гемианопсия или синдром игнорирования, и/или снижение шкалы комы Глазго (либо общей оценки, либо одного из ее отдельных компонентов [глазной, моторный с обеих сторон, вербальный]) (см., например, Frontera et al., Stroke, 40:1963-1968 (2009); Kassell et al., J. Neurosurg., 73:18-36 (1990); и Vergouwen et al., Stroke, 41:e47-e52 (2010)). Это может длиться в течение, по меньшей мере, одного часа, не проявляется сразу после окклюзии аневризмы и не может быть объяснено другими причинами с помощью клинической оценки, КТ или МРТ сканирования головного мозга. DCI и развитие отсроченного инфаркта мозга являются одними из наиболее важных причин неблагоприятного исхода после SAH.

Инфаркт мозга также может быть следствием DCI. Например, инфаркт из-за DCI обычно определяется как наличие области гибели клеток головного мозга в результате недостаточности артериального или венозного кровоснабжения головного мозга. Он может быть обнаружен с помощью КТ или МРТ сканирования головного мозга в течение примерно 6 недель после SAH, или на последнем КТ или МРТ, сделанном перед смертью в течение примерно 6 недель, или подтвержден при вскрытии, отсутствует на КТ или МРТ сканировании между примерно 24 и 48 часами после ранней окклюзии аневризмы, и не связано с другими причинами, такими как хирургическое клипирование или эндоваскулярное лечение. Повышенная плотность на изображениях КТ, возникшая из-за желудочкового катетера или интрапаренхиматозной гематомы, обычно не рассматривается как свидетельство инфаркта мозга, вызванного DCI.

Как сообщает Vergouwen et al. (Stroke. 2010;41:2391-2395), единообразные определения «клинического ухудшения, вызванного отсроченной церебральной ишемией» и «инфаркта мозга» должны охватывать наиболее важные элементы с точки зрения морфологических и клинических характеристик, без предположений о его патогенезе. Поскольку инфаркт мозга на КТ/МРТ сильно коррелирует с функциональным исходом через 3 месяца после SAH, и учитывая его ожидаемую высокую степень согласия между наблюдателями, его способность обнаруживать DCI у седативных и коматозных пациентов, а также его объективную количественную оценку последствий DCI, инфаркт мозга при нейровизуализации может быть лучшим показателем результата, чем клиническое ухудшение, вызванное только DCI. Хотя предыдущие определения DCI часто объединяли клинические признаки DCI либо с результатами ангиографии/транскраниального допплера, либо с инфарктом мозга при нейровизуализации или аутопсии, авторы предполагают, что о них следует сообщать отдельно. Они также предполагают, что клиническое ухудшение, вызванное DCI, должно быть не более чем вторичным показателем результата из-за подозреваемых более низких показателей согласия между наблюдателями. Согласно Vergouwen et al., предлагаемое определение клинического ухудшения, вызванного DCI, выглядит следующим образом: «Возникновение очаговых неврологических ухудшений (таких как гемипарез, афазия, апраксия, гемианопсия или синдром игнорирования) или снижение, по меньшей мере, на 2 балла на шкале комы Глазго (либо по общей сумме баллов, либо по одному из ее отдельных компонентов [глазной, моторный с обеих сторон, вербальный]). Это должно длиться, по меньшей мере, 1 час, не проявляется сразу после окклюзии аневризмы и не может быть объяснено другими причинами посредством клинической оценки, КТ или МРТ головного мозга и соответствующих лабораторных исследований».

Также было показано, что неблагоприятные вторичные неврологические исходы после геморрагического инсульта, включая SAH, ассоциированы с воспалением, включая активацию иммунных клеток и/или инфильтрацию в компартмент СМЖ и высвобождение воспалительных цитокинов. Как обсуждалось в Miller et al. (Biomed Res Int. 2014; 2014: 384342), исследования показали, что воспаление является прямым медиатором неврологического повреждения после SAH, и причинным фактором вазоспазма после SAH. Ключевые воспалительные молекулы, участвующие в патофизиологии SAH, знакомы специалистам в данной области, их иллюстративные примеры включают селектины (L-селектин и P-селектин), интегрины (например, функционально-связанный антиген лимфоцитов 1 (LFA-1) и Mac-1 интегрин (CD11b/CD18)), TNFα, моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 (MCP-1), молекула межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), провоспалительные интерлейкины (например, IL-1, IL-6, IL-1B, IL-8) и эндотелин 1 (ET-1). В варианте осуществления, описанном в настоящем документе, неблагоприятный вторичный неврологический исход связан с дифференциальной экспрессией одного или нескольких воспалительных маркеров, выбранных из группы, состоящей из селектина (например, L-селектина и P-селектина), интегрина (например, функционально-связанного антигена лимфоцитов (LFA-1) и Mac-1 интегрина (CD11b/CD18)), TNFα, моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 (МСР-1), межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), провоспалительного интерлейкина и эндотелина 1 (ЕТ-1). В одном из вариантов осуществления, провоспалительный интерлейкин выбран из группы, состоящей из IL-1, IL-6, IL-1B и IL-8.

Nissen et al. ранее показали, что сывороточная концентрация Р-селектина у пациентов с DIND значительно выше по сравнению с пациентами без DIND (J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001;71:329-333). Авторы также показали, что концентрация L-селектина в сыворотке крови у пациентов с DIND значительно ниже по сравнению с пациентами без DIND. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, степень, в которой описанные в настоящем документе способы снижают количество и/или тяжесть неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта, определяется снижением концентрации Р-селектина в сыворотке или СМЖ субъекта, например, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 45% до примерно 55%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60%, предпочтительно, от примерно 55% до примерно 65%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 65% до примерно 75%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 75% до примерно 85%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, предпочтительно, от примерно 85% до примерно 95%, или наиболее предпочтительно, от примерно 90% до 100% по сравнению с концентрацией Р-селектина у субъекта до лечения. В другом варианте осуществления, степень, в которой описанные в настоящем документе способы снижают количество и/или тяжесть неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта, определяется увеличением концентрации L-селектина в сыворотке или СМЖ субъекта, например по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 45% до примерно 55%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60%, предпочтительно, от примерно 55% до примерно 65%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 65% до примерно 75%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 75% до примерно 85%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, предпочтительно, от примерно 85% до примерно 95%, или наиболее предпочтительно, от примерно 90% до 100% по сравнению с концентрацией L-селектина у субъекта до лечения. Способы измерения концентрации P-селектина и L-селектина известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны у Nissen et al. (J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001;71:329-333), содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Уровень провоспалительных цитокинов IL-1B, IL-6, IL-8, TNFα и MCP-1, а также эндотелина-1, также был повышен у пациентов после SAH (Miller et al. Biomed Res Int. 2014; 2014: 384342). Таким образом, в варианте осуществления, описанном в настоящем документе, степень, в которой описанные в настоящем документе способы снижают количество и/или тяжесть неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта, определяется снижением концентрации провоспалительного цитокина в сыворотке или СМЖ субъекта, например, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35% предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 45% до примерно 55%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60% предпочтительно, от примерно 55% до примерно 65%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 65% до примерно 75%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 75% до примерно 85% предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, предпочтительно, от примерно 85% до примерно 95% или наиболее предпочтительно, от примерно 90% до 100% по сравнению с концентрацией провоспалительного цитокина у субъекта до лечения, где провоспалительная молекула выбрана из группы, состоящей из IL-1B, IL-6, IL-8, TNFα, MCP-1 и эндотелина-1. Способы, с помощью которых можно измерить концентрацию медиаторов воспаления, как описано в настоящем документе, известны специалистам в данной области.

Также было показано, что истощение запасов оксида азота (NO) в СМЖ вносит свой вклад в патогенез неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта (см. Pluta et al. JAMA. 2005;293(12):1477-1484). Уровни NO снижаются в СМЖ после SAH из-за (1) токсичности оксигемоглобина для нейронов, содержащих нейрональную синтазу оксида азота (NOS) в адвентиции артерии; (2) эндогенного ингибирования эндотелиальной NOS; и (3) удаления оксида азота оксигемоглобином, высвобождаемым из субарахноидального сгустка. Таким образом, в варианте осуществления, описанном в настоящем документе, степень, в которой описанные в настоящем документе способы снижают количество и/или тяжесть неблагоприятных вторичных неврологических исходов после геморрагического инсульта, определяется увеличением концентрации NO в СМЖ субъекта, например по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 45% до примерно 55%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60%, предпочтительно, от примерно 55% до примерно 65%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 65% до примерно 75%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 75% до примерно 85%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, предпочтительно, от примерно 85% до примерно 95%, или наиболее предпочтительно, от примерно 90% до 100% по сравнению с концентрацией NO в СМЖ субъекта до лечения. Способы измерения концентрации NO в СМЖ известны специалистам в данной области техники, их иллюстративный пример описан у Pluta et al. (JAMA. 2005;293(12):1477-1484), содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Как отмечалось в другом месте в настоящем документе, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что терапевтический Hp может предотвращать проникновение бесклеточного Hb из компартмента СМЖ в интерстициальное пространство мозга. Эти неожиданные открытия позволяют предположить, что компартментализация бесклеточного Hb в компартментах СМЖ через образование комплекса с Hp может предотвратить токсические эффекты бесклеточного Hb (преимущественно oxyHb) на сосудистую сеть головного мозга и паренхиму головного мозга. Таким образом, в варианте осуществления, неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является неблагоприятный вторичный неврологический исход в паренхиме мозга.

Гаптоглобин

Гаптоглобин (Hp) имеет тетрамерную структуру, содержащую две альфа- и две бета-цепи, связанных дисульфидными связями. Бета-цепь (245 аминокислот) имеет массу примерно 40 кДа (из которых примерно 30% масс./масс. составляют углеводы) и является общей для всех фенотипов. Альфа-цепь существует в, по меньшей мере, двух формах: альфа1 (83 аминокислоты, 9 кДа) и альфа2 (142 аминокислоты, 17,3 кДа). Следовательно, Hp существует в трех фенотипах, называемых Hp1-1, Hp2-1 и Hp2-2. Hp1-1 содержит две цепи альфа1, Hp2-2 содержит две цепи альфа2, и Hp2-1 содержит одну цепь альфа1 и одну цепь альфа2. Hp 1-1 имеет молекулярную массу 100 кДа или 165 кДа в комплексе с Hb. Hp1-1 существует в виде единой изоформы и также называется Hp димером. Hp2-1 имеет среднюю молекулярную массу 220 кДа и образует линейные полимеры. Hp2-2 имеет среднюю молекулярную массу 400 кДа и образует циклические полимеры. Каждая отдельная полимерная форма является отдельной изоформой. Разработана методология ПЦР (Koch et al. 2002, Clin. Chem. 48: 1377-1382) для изучения полиморфизма Hp.

Два основных аллеля, Hp1 и Hp2, существуют для гена Hp, обнаруженного на хромосоме 16. Эти два аллеля отвечают за три различных возможных генотипа со структурным полиморфизмом: гомозиготный (1-1 или 2-2) и гетерозиготный 2-1. В западных популяциях, по оценкам, распределение Hp 1-1 составляет ~16%, Hp 2-1 составляет ~48%, и Hp 2-2 составляет ~36%. Hp расщепляется на две субъединицы α и β цепей, соединенных дисульфидной связью. Оба аллеля имеют одну и ту же β цепь. β-цепь отвечает за связывание Hb, таким образом, оба генотипа имеют аналогичную аффинность связывания Hb.

Следует понимать, что встречающиеся в природе и рекомбинантные формы Hp подходят для способов, описанных в настоящем документе, при условии, что они способны образовывать комплекс с бесклеточным Hb и тем самым нейтрализовать биологическую активность бесклеточного Hb. Подходящие встречающиеся в природе формы Hp известны специалистам в данной области, их иллюстративные примеры описаны у Koch et al. (2002, Clin. Chem. 48: 1377-1382) и Kasvosve et al. (2010, Chapter 2 - Haptoglobin Polymorphism and Infection; Advances in Clinical Chemistry, 50:23-46), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

В одном из вариантов осуществления, Hp включает, состоит из или состоит по существу из Hp, полученного из плазмы. Hp предпочтительно, является Hp человека. Множество протоколов выделения Hp из природного источника Hp- (например, плазмы крови) известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в патентах США №№ 4,061,735 и 4,137,307 (Funakoshi et al.) и патентной публикации США № 20140094411 (Brinkman), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Другие подходящие способы выделения Hp из природного источника Hp описаны в Katnik & Jadach (1993, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warz) 41: 303-308), Tseng et al. (2004, Protein Expr Purif 33: 265-273), Katnik et al. (1995, Eur J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 33:727-732), Yang and Mao (1999, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 731: 395-402) и Basler & Burrel (1983 Inflammation 7(4): 387-400).

Следует понимать, что используемый в настоящем документе термин «гаптоглобин» включает все фенотипы (включая все изоформы) Hp. Hp может быть гомогенным (поскольку он состоит по существу из Hp одной и той же изоформы) или гетерогенным (поскольку он включает комбинацию различных изоформ Hp, включая Hp1-1, Hp1-2 и Hp2-2). Следует понимать, что композиция Hp в конечном итоге будет зависеть от фенотипов источника. Например, если объединенные образцы плазмы используются для извлечения/очистки Hp, вероятно, будет выделено более одной изоформы Hp. Подходящие способы определения изоформ Hp, присутствующих в изоляте, будут известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры обсуждаются в Shih et al. (2014, Hematology, 89(4):443-447), полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Другие подходящие способы определения изоформ Hp, присутствующих в изоляте, включают высокоэффективную эксклюзионную хроматографию (анализ HPLC-SEC), Hp ELISA и турбидиметрические измерения, при этом разные изоформы Hp обычно дают разные сигналы в разных анализах.

В одном варианте осуществления, Hp выбран из группы, состоящей из Hp1-1 гомодимера, Hp1-2 мультимера, Hp2-2 мультимера и комбинации любого из вышеперечисленных. В предпочтительном варианте осуществления, Hp содержит, состоит из или состоит по существу из Hp2-2 мультимера. Hp может быть природным Hp (например, полученным из плазмы) или он может быть продуцирован в виде рекомбинантного белка, иллюстративные примеры которого описаны в другом месте в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления, Hp, полученный из плазмы, включает, состоит из или состоит по существу из Hp2-2. В другом варианте осуществления, Hp, полученный из плазмы, содержит, состоит из или состоит по существу из Hp1-1. В другом варианте осуществления, Hp содержит, состоит из или состоит по существу из рекомбинантного Hp.

Если не указано иное, термин Hp, используемый в настоящем документе, включает функциональные аналоги нативного или встречающегося в природе Hp. Термин «функциональный аналог» следует понимать как означающий агент, который обладает по существу такой же биологической активностью, как и природный (нативный) Hp, в той мере, в которой этой биологической активностью является, по меньшей мере, способность аналога образовывать комплекс с бесклеточным Hb, и тем самым нейтрализует его биологическую активность. Под «по существу такой же биологической активностью» обычно подразумевается, что функциональный аналог имеет аффинность связывания с бесклеточным Hb, которое составляет, по меньшей мере, 40% (например, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165% и так далее) аффинности связывания существующего в природе Hp, включая существующие в природе изоформы Hp (например, Hp1-1, Hp1-2 и Hp2-2). Подходящие способы для определения того, является ли агент функциональным аналогом Hp, знакомы специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают описанные в других местах в настоящем документе (например, способность функционального аналога снижать индуцированные бесклеточным Hb церебральные вазоспазмы).

В варианте осуществления, описанном в настоящем документе, функциональным аналогом Hp является функциональный фрагмент нативного Hp. Функциональный фрагмент нативного Hp может иметь любую подходящую длину при условии, что фрагмент сохраняет способность образовывать комплекс с бесклеточным Hb и тем самым нейтрализовать его биологическую активность.

В другом варианте осуществления, функциональным аналогом является пептид, который имеет аминокислотную последовательность, отличную от существующей в природе (нативной) молекулы Hp (т.е. компаратора). Функциональный аналог может включать молекулу, аминокислотная последовательность которой отличается от аминокислотной последовательности альфа- и/или бета-цепей нативного Hp на один или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более) аминокислотных замен, при этом указанное различие не отменяет или не полностью отменяет способность аналога образовывать комплекс с бесклеточным Hb и тем самым нейтрализовать его биологическую активность. В некоторых вариантах осуществления, функциональный аналог содержит аминокислотные замены, которые повышают способность аналога образовывать комплекс с бесклеточным Hb, по сравнению с нативным Hp. В одном из вариантов осуществления, функциональный аналог имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности альфа- и/или бета-цепи нативного Hp одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами. Используемый в настоящем документе термин «консервативная аминокислотная замена» относится к изменению идентичности аминокислоты в настоящем положении для замены ее аминокислотой приблизительно эквивалентного размера, заряда и/или полярности. Примеры естественных консервативных замен аминокислот включают следующие 8 групп замен (обозначенных обычным однобуквенным кодом): (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) К, R, (4) А, G; (5) S, T; (6) Q, N; (7) E, D; и (8) C, S.

В одном из вариантов осуществления, функциональный аналог имеет, по меньшей мере, 85% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью альфа- и/или бета-цепи нативного Hp. Ссылка на «по меньшей мере, 85%» включает 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности или сходства последовательностей, например, после оптимального выравнивания или анализа наилучшего соответствия. Таким образом, в одном варианте осуществления, последовательность имеет, по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере, 86%, предпочтительно, по меньшей мере, 87%, предпочтительно, по меньшей мере, 88%, предпочтительно, по меньшей мере, 89%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 91%, предпочтительно, по меньшей мере, 92%, предпочтительно, по меньшей мере, 93%, предпочтительно, по меньшей мере, 94%, предпочтительно, по меньшей мере, 95%, предпочтительно, по меньшей мере, 96%, предпочтительно, по меньшей мере, 97%, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% или предпочтительно, 100% идентичность последовательностей или гомологию последовательностей с последовательностями, идентифицированными в настоящем документе, например, после оптимального выравнивания или анализа наилучшего соответствия.

Термины «идентичность», «сходство», «идентичность последовательностей», «сходство последовательностей», «гомология», «гомология последовательностей» и подобные, используемые в настоящем документе, означают, что в любом конкретном положении аминокислотного остатка в выровненной последовательности, аминокислотный остаток идентичен между выровненными последовательностями. Термин «сходство» или «сходство последовательностей», используемые в настоящем документе, указывает на то, что в любом конкретном положении в выровненных последовательностях аминокислотный остаток имеет сходный тип между последовательностями. Например, лейцин может быть заменен изолейциновым или валиновым остатком. Как отмечается в другом месте настоящего документа, это можно назвать консервативной заменой. В одном варианте осуществления, аминокислотная последовательность может быть модифицирована путем консервативной замены любого из аминокислотных остатков, содержащихся в ней, так что модификация не влияет на специфичность связывания или функциональную активность модифицированного полипептида по сравнению с не модифицированным (нативным) Hp полипептидом.

В некоторых вариантах осуществления, идентичность последовательности по отношению к пептидной последовательности относится к доле аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей пептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимальной доли гомологии, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Ни N-, ни C-концевые удлинения, ни вставки не должны толковаться как уменьшающие идентичность или гомологию последовательностей. Способы и компьютерные программы для выполнения выравнивания двух или нескольких аминокислотных последовательностей и определения их идентичности или гомологии последовательностей хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, долю идентичности или сходства двух аминокислотных последовательностей можно легко вычислить с использованием алгоритмов, например BLAST, FASTA или алгоритма Смита-Уотермана.

Способы определения «сходства» аминокислотной последовательности хорошо известны специалистам в данной области техники. В общем, «сходство» означает точное сравнение аминокислот с аминокислотами двух или нескольких пептидных последовательностей или в соответствующем месте, где аминокислоты идентичны или обладают аналогичными химическими и/или физическими свойствами, такими как заряд или гидрофобность. Затем можно определить так называемую «долю сходства» между сравниваемыми пептидными последовательностями. В общем, «идентичность» относится к точному аминокислотному соответствию двух пептидных последовательностей.

Две или несколько пептидных последовательностей также можно сравнивать путем определения их «доли идентичности». Долю идентичности двух последовательностей можно описать как количество точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. Приблизительное выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот обеспечивается алгоритмом локальной гомологии из Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Этот алгоритм может быть расширен для использования с пептидными последовательностями с использованием оценочной матрицы, разработанной Dayhoff (Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA), и нормализованной Gribskov (Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763, 1986). Подходящие программы для расчета доли идентичности или сходства между последовательностями обычно известны в данной области техники.

Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения может быть выполнено с помощью компьютеризированных реализаций алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) или проверки и наилучшего выравнивания (т.е. приводящего к наивысшей доле гомологии в окне сравнения), полученного любым из различных выбранных способов. Можно также сослаться на семейство программ BLAST, такое как, например, описано в Altschul et al., (1997, Nucl. Acids Res.25:3389. Подробное обсуждение анализа последовательностей можно найти в разделе 19.3 Ausubel et al. ("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15).

В одном варианте осуществления, функциональный аналог включает аминокислотные замены и/или другие модификации относительно нативного Hp для увеличения стабильности аналога или для увеличения растворимости аналога.

Функциональный аналог может быть существующим в природе соединением/пептидом или может быть получен синтетически путем химического синтеза с использованием способов, известных специалистам в данной области техники.

Hp может быть подходящим образом продуцирован в виде рекомбинантного белка в микроорганизме, который может быть выделен и, при желании, дополнительно очищен. Подходящие микроорганизмы для продуцирования рекомбинантного Hp известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают бактерии, дрожжи или грибы, эукариотные клетки (например, клетки млекопитающих или насекомых) или в векторе рекомбинантного вируса (например, аденовируса, поксвируса, вируса герпеса, вируса леса Семлики, бакуловируса, бактериофага, вируса Синдбис или вируса Сендай). Подходящие бактерии для продуцирования рекомбинантных пептидов известны специалистам в данной области, их иллюстративные примеры включают E. coli, B.subtilis или любые другие бактерии, способные экспрессировать пептидные последовательности. Иллюстративные примеры подходящих типов дрожжей для продуцирования рекомбинантных пептидов включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris или любые другие дрожжи, способные экспрессировать пептиды. Соответствующие способы хорошо известны в данной области техники. Также способы выделения и очистки рекомбинантно полученных пептидных последовательностей хорошо известны в данной области техники и включают, например, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию и ионообменную хроматографию.

Для облегчения выделения рекомбинантного Hp, как описано в настоящем документе, может быть получен слитый полипептид, в котором пептидная последовательность Hp или его функциональный аналог трансляционно слит (ковалентно связан) с гетерологичным полипептидом, что делает возможным выделение аффинной хроматографией. Иллюстративные примеры подходящих гетерологичных полипептидов включают His-Tag (например, His₆. 6 остатков гистидина), GST-Tag (глутатион-S-трансферазу) и т.д.

Для получения рекомбинантного Hp также подходят фаговые библиотеки и/или пептидные библиотеки, например, полученные с помощью комбинаторной химии или полученные с помощью высокопроизводительных способов скрининга для самых различных структур (см., например, Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; и Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 December; 50(6):837-54).

Иллюстративные примеры рекомбинантного Hp включают пептиды с номером доступа. NP_005134 (как описано у Morishita et al. 2018, Clin. Chim. Acta 487, 84-89) и номером доступа P00738.

Hp может быть слит, связан или иным образом присоединен к одной или нескольким гетерологичным группам как часть слитого белка. Один или несколько гетерологичных фрагментов могут улучшать, усиливать или иным образом увеличивать активность или стабильность Hp. В одном варианте осуществления, Hp, как описано в настоящем документе, подходящим образом присоединен к гетерологичной группе для увеличения периода полужизни Hp in vivo. Подходящие гетерологические фрагменты, увеличивающие период полужизни, известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГилирование), гликозилированный ПЭГ, гидроксилэтилкрахмал (HESилирование), полисиаловые кислоты, эластин-подобные полипептиды, полимеры гепарозана и гиалуроновую кислоту. Таким образом, в варианте осуществления, описанном в настоящем документе, гетерологичная группа выбрана из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГилирование), гликозилированного ПЭГ, гидроксилэтилкрахмала (HESилирование), полисиаловых кислот, эластин-подобных полипептидов, полимеров гепарозана и гиалуроновой кислоты. В других вариантах осуществления, гетерологичной группой может быть гетерологичная аминокислотная последовательность, слитая с Hp.

Альтернативно или дополнительно, гетерологичная группа может быть химически конъюгирована с Hp, например, ковалентной связью. Гетерологичная группа, увеличивающая период полужизни, может быть слита, конъюгирована или иным образом присоединена к Hp любыми подходящими способами, известными специалистам в данной области техники, иллюстративным примером которых является химический линкер. Принцип этой методики конъюгации был описан обычным образом у Conjuchem LLC (см., например, патент США № 7,256,253), полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

В других вариантах осуществления, гетерологичной группой является белок, увеличивающий период полужизни (HLEP). Подходящие белки, увеличивающие период полужизни, известны специалистам в данной области, иллюстративный пример которых включает альбумин или его фрагменты. Таким образом, в одном варианте осуществления HLEP является альбумин или его фрагмент. N-конец альбумина или его фрагмента может быть слит с C-концом альфа- и/или бета-цепей Hp. Альтернативно или дополнительно, C-конец альбумина или его фрагмента может быть слит с N-концом альфа- и/или бета-цепей Hp. Один или несколько HLEP могут быть слиты с N- или C-концевой частью(ями) альфа- и/или бета-цепей Hp при условии, что они не отменяют связывание Hp с бесклеточным Hb. Однако следует понимать, что некоторое снижение связывания Hp с бесклеточным Hb может быть приемлемым, пока компонент Hp слитого белка все еще способен образовывать комплекс с бесклеточным Hb и тем самым нейтрализовать его.

Слитый белок может дополнительно содержать химическую связь или линкерную последовательность, расположенную между Hp и гетерологичной группой. Линкерной последовательностью может быть пептидный линкер, состоящий из одной или нескольких аминокислот, в частности, от 1 до 50, предпочтительно, от 1 до 30, предпочтительно, от 1 до 20, предпочтительно, от 1 до 15, предпочтительно, от 1 до 10, предпочтительно, от 1 до 5 или более предпочтительно, от 1 до 3 (например, 1, 2 или 3) аминокислот, которые могут быть равными или отличаться друг от друга. Предпочтительно, линкерная последовательность не присутствует в соответствующем положении Hp дикого типа. Предпочтительные аминокислоты, присутствующие в указанной линкерной последовательности, включают Gly и Ser. В предпочтительном варианте осуществления, линкерная последовательность является по существу не иммуногенной для субъекта, подлежащего лечению способами, описанными в настоящем документе. Под «по существу не иммуногенным» подразумевается, что линкерная последовательность не вызывает детектируемый ответ антитела на линкерную последовательность у субъекта, которому ее вводят. Предпочтительные линкеры могут состоять из чередующихся остатков глицина и серина. Подходящие линкеры известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры которых в WO2007/090584. В одном варианте осуществления, пептидный линкер между Hp и гетерологичной группой содержит, состоит из или состоит по существу из пептидных последовательностей, которые служат в качестве природных междоменных линкеров в белках человека. Такие пептидные последовательности в их природной среде могут быть расположены близко к поверхности белка и доступны для иммунной системы, так что можно предположить природную толерантность к этой последовательности. Иллюстративные примеры приведены в WO 2007/090584. Подходящие расщепляемые линкерные последовательности описаны, например, в WO 2013/120939 A1.

Иллюстративные примеры подходящих последовательностей HLEP описаны ниже. Подобным образом, в настоящем документе описаны слияния с точной «N-концевой аминокислотой» или с точной «C-концевой аминокислотой» соответствующей HLEP, или слияния с «N-концевой частью» или «C-концевой частью» соответствующий HLEP, которые включает N-концевые делеции одной или нескольких аминокислот HLEP. Слитый белок может содержать более одной последовательности HLEP, например, две или три последовательности HLEP. Эти множественные последовательности HLEP могут быть слиты с С-концевой частью альфа- и/или бета-цепей Hp в тандеме, например, в качестве последовательных повторов.

В одном из вариантов осуществления, гетерологичной группой является полипептид, увеличивающий период полужизни. В одном из вариантов осуществления, полипептид, увеличивающий период полужизни, выбран из группы, состоящей из альбумина, члена семейства альбуминов или его фрагментов, сольватированных случайных цепей с большим гидродинамическим объемом (например, XTEN (см. Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), гомо-аминокислотных повторов (HAP) или пролин-аланин-сериновых повторов (PAS), афамина, альфа-фетопротеина, белка, связывающего витамин D, трансферрина или его вариантов или фрагментов, карбоксил-концевого пептида (CTP) субъединицы хорионического гонадотропина-ß человека, полипептида, способного связываться с неонатальным Fc рецептором (FcRn), в частности, с константной областью иммуноглобулина и ее частями, например, Fc фрагментом, полипептидами или липидами, способными связываться в физиологических условиях с альбумином, с членом семейства альбуминов или с его фрагментами, или с константной областью иммуноглобулина или ее частями. Константная область иммуноглобулина или ее части предпочтительно, являются Fc фрагментом иммуноглобулина G1 (IgG1), Fc фрагментом иммуноглобулина G2 (IgG2) или Fc фрагментом иммуноглобулина A (IgA). Полипептид, увеличивающий период полужизни, как используется в настоящем документе, может быть полноразмерным белком, увеличивающим период полужизни, или одним или несколькими его фрагментами, которые способны стабилизировать или продлевать терапевтическую активность или биологическую активность Hp, в частности, увеличивать период полужизни Hp in vivo. Такие фрагменты могут состоять из 10 или нескольких аминокислот в длину или могут включать, по меньшей мере, примерно 15, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 25, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 30, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 50, или более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100 или более непрерывных аминокислот из последовательности HLEP, или могут включать часть или все специфичные домены соответствующего HLEP, при условии, что фрагмент HLEP обеспечивает функциональное продление периода полужизни на, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 20%, или более предпочтительно, по меньшей мере, 25% по сравнению с соответствующим Hp в отсутствие HLEP. Способы определения того, обеспечивает ли гетерологичный фрагмент функциональное продление периода полужизни Hp (in vivo или in vitro), известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в другом месте в настоящем документе.

Часть HLEP слитого белка, как описано в настоящем документе, может быть вариантом HLEP дикого типа. Термин «вариант» включает в себя вставки, делеции и/или замены, либо консервативные, либо неконсервативные, где такие изменения существенно не изменяют способность Hp образовывать комплекс с, и, тем самым, нейтрализовать бесклеточный Hb. HLEP может быть подходящим образом получен от любого позвоночного животного, особенно от любого млекопитающего, например человека, обезьяны, коровы, овцы или свиньи. HLEP, не относящиеся к млекопитающим, включают, но не ограничиваются ими, курицу и лосось.

Слитые белки, как описано в настоящем документе, могут быть созданы соединением внутри рамки, по меньшей мере, двух последовательностей ДНК, кодирующих Hp, и гетерологичного фрагмента, такого как HLEP. Специалисты в данной области техники поймут, что трансляция последовательности ДНК слитого белка приведет к получению единственной белковой последовательности. В результате вставки внутри рамки последовательности ДНК, кодирующей пептидный линкер, согласно варианту осуществления, описанному в настоящем документе, может быть получен слитый белок, содержащий Hp, подходящий линкер и гетерологичный фрагмент.

В варианте осуществления, описанном в настоящем документе, Hp слит с гетерологичной группой. В одном из вариантов осуществления, гетерологичный фрагмент включает, состоит или по существу состоит из полипептида, выбранного из группы, состоящей из альбумина или его фрагментов, трансферрина или его фрагментов, С-концевого пептида хорионического гонадотропина человека, последовательности XTEN, гомо-аминокислотных повторов (HAP), пролин-аланин-сериновых повторов (PAS), афамина, альфа-фетопротеина, белка, связывающего витамин D, полипептидов, способных связываться в физиологических условиях с альбумином или с константными областями иммуноглобулина, полипептидов, способных связываться с неонатальным Fc рецептором (FcRn), в частности, константными областями иммуноглобулина и их частями, предпочтительно, Fc частью иммуноглобулина, и комбинаций любых из вышеперечисленных. В другом варианте осуществления, гетерологичная группа выбрана из группы, состоящей из гидроксиэтилкрахмала (HES), полиэтиленгликоля (PEG), полисиаловых кислот (PSA), эластин-подобных полипептидов, полимеров гепарозана, гиалуроновой кислоты и альбуминсвязывающих лигандов, например цепей жирных кислот, и комбинаций любых из вышеперечисленных.

Термины «сывороточный альбумин человека» (HSA) и «альбумин человека» (HA) и «альбумин» (ALB) используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Термины «альбумин» и «сывороточный альбумин» являются более широкими и охватывают сывороточный альбумин человека (и его фрагменты и варианты), а также альбумин других видов (и его фрагменты и варианты).

Используемый в настоящем документе термин «альбумин» в совокупности относится к полипептиду или аминокислотной последовательности альбумина, или фрагменту или варианту альбумина, имеющему одну или несколько функциональных активностей (например, биологических активностей) альбумина. В частности, «альбумин» относится к альбумину человека или его фрагментам, включая зрелую форму альбумина человека или альбумина других позвоночных или их фрагментов, или аналогов или вариантов этих молекул или их фрагментов. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, альтернативный термин «FP» используют для идентификации HLEP, в частности, для определения альбумина как HLEP.

Слитые белки, описанные в настоящем документе, могут подходящим образом содержать встречающиеся в природе полиморфные варианты альбумина человека и/или фрагменты альбумина человека. Вообще говоря, фрагмент или вариант альбумина будет иметь длину по меньшей мере, 10, предпочтительно, по меньшей мере, 40 или наиболее предпочтительно, более 70 аминокислот.

В одном из вариантов осуществления, HLEP является вариант альбумина с усиленным связыванием с рецептором FcRn. Такие варианты альбумина могут давать более длительный период полужизни в плазме Hp или его функционального аналога по сравнению с Hp или его функциональным фрагментом, который слит с альбумином дикого типа. Альбуминовая часть слитых белков, описанных в настоящем документе, может подходящим образом включать, по меньшей мере, один субдомен или домен альбумина человека или его консервативные модификации.

В одном из вариантов осуществления, гетерологичной группой является молекула иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент. В данной области техники известно, что константные области (Fc) иммуноглобулина G (IgG) увеличивают период полужизни терапевтических белков (см., например, Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). Константная область тяжелой цепи IgG состоит из 3 доменов (CH1-CH3) и шарнирной области. Последовательность иммуноглобулина может происходить от любого млекопитающего или от подклассов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, соответственно. Фрагменты IgG и IgG без антигенсвязывающего домена также можно использовать в качестве гетерологичной группы, в том числе в качестве HLEP. Hp или его функциональный аналог может быть подходящим образом связан с IgG или фрагментами IgG через шарнирную область антитела или пептидный линкер, который даже может быть расщепляемым. В нескольких патентах и патентных заявках описано слияние терапевтических белков с константными областями иммуноглобулина для увеличения периода полужизни терапевтических белков in vivo. Например, в US 2004/0087778 и WO 2005/001025 описаны слитые белки Fc доменов или, по меньшей мере, частей константных областей иммуноглобулина, с биологически активными пептидами, которые увеличивают период полужизни пептида, который, в противном случае, быстро бы выводился in vivo. Были описаны слитые белки Fc-IFN-β, которые достигают повышенной биологической активности, продленного периода полужизни в кровотоке и большей растворимости (WO 2006/000448 A2). Были описаны белки Fc-EPO с увеличенным периодом полужизни в сыворотке и повышенной активностью in vivo (WO 2005/063808 A1), а также слияния Fc с G-CSF (WO 2003/076567 A2), глюкагон-подобным пептидом-1 (WO 2005/000892 A2), факторами свертывания (WO 2004/101740 A2) и интерлейкином-10 (патент США № 6,403,077), все со свойствами увеличения периода полужизни.

Иллюстративные примеры подходящих HLEP, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, также описаны в WO 2013/120939 A1, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в настоящем документе, означает количество или концентрацию Hp в СМЖ, которая достаточна для того, чтобы позволить Hp связываться и образовывать комплекс с бесклеточным Hb, присутствующим в СМЖ, и тем самым нейтрализовать в противном случае неблагоприятный биологический эффект бесклеточного Hb. Специалистам в данной области техники понятно, что терапевтически эффективное количество пептида может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, иллюстративные примеры которых включают, возможность введения Hp непосредственно субъекту (например, интратекально, интракраниально или интрацеребровентрикулярно), здоровье и физическое состояние субъекта, подлежащего лечению, таксономическую группу субъекта, подлежащего лечению, тяжесть кровоизлияния (например, степень кровотечения), способ введения, концентрацию и/или количество бесклеточного Hb в компартменте СМЖ и комбинации любых из вышеперечисленных.

Терапевтически эффективное количество Hp обычно находится в относительно широком диапазоне, который может быть определен специалистами в данной области техники. Иллюстративные примеры подходящих терапевтически эффективных количеств Hp включают от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ, предпочтительно, от примерно 2 мкМ до примерно 5 мМ, предпочтительно, от примерно 100 мкМ до примерно 5 мМ, предпочтительно, от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ, предпочтительно, от примерно 5 мкМ до примерно 100 мкМ, предпочтительно, от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ, или более предпочтительно, от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ.

В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ. В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 2 мкМ до примерно 5 мМ. В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 100 мкМ до примерно 5 мМ. В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ. В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ. В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ.

В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp составляет, по меньшей мере, эквимолярное количество по отношению к концентрации бесклеточного Hb в СМЖ субъекта после кровоизлияния. В другом варианте осуществления, терапевтически эффективным количеством Hp является количество, достаточное для образования комплекса от примерно 3 мкМ до примерно 300 мкМ бесклеточного Hb в СМЖ. Подходящие способы измерения концентрации бесклеточного Hb в СМЖ известны специалистам в данной области, их иллюстративные примеры описаны в Cruickshank AM., 2001, ACP Best Practice No 166, J. Clin. Path., 54(11):827-830) и Hugelshofer M. et al., 2018. World Neurosurg.;120:e660-e666), содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Следует понимать, что достижение терапевтически эффективного количества Hp, как описано в настоящем документе, может зависеть от конечного объема СМЖ, который воздействует на Hp или его функциональный аналог. Например, если Hp вводят взрослому человеку (например, интратекально), и принимая во внимание, что средний объем СМЖ у взрослого человека составляет примерно 150 мл, терапевтически эффективное количество примерно 10 мкМ Hp может быть достигнуто путем введения субъекту 5 мл раствора примерно 310 мкМ Hp. В другом иллюстративном примере, способы, описанные в настоящем документе, включают удаление 50 мл СМЖ у субъекта и замену его на 50 мл искусственной СМЖ, содержащей примерно 30 мкМ Hp, тем самым достигая терапевтически эффективного количества примерно 10 мкM Hp в компартменте СМЖ субъекта.

Дозы Hp также могут быть скорректированы для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, несколько разделенных доз можно вводить ежедневно, еженедельно или с другими подходящими временными интервалами, или дозировки могут быть пропорционально уменьшены, как показано остротой ситуации.

Термин «воздействие», используемый в настоящем документе, означает контакт СМЖ с Hp, позволяющий Hp связываться и образовывать комплекс с бесклеточным Hb (преобладающей формой которого будет oxyHb). который присутствует в СМЖ, посредством чего образование комплексов Hb:Hp по существу нейтрализует в противном случае неблагоприятное биологическое действие бесклеточного Hb на ткань мозга. Под «в значительной степени нейтрализует» подразумевается снижение неблагоприятного биологического воздействия бесклеточного Hb на ткань мозга, которое субъективно или качественно представлено в виде доли снижения, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 15% до примерно 25%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 25% до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 35% до примерно 45%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 45% до примерно 55%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60%, предпочтительно, от примерно 55% до примерно 65%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 65% до примерно 75%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 75% до примерно 85%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, предпочтительно, от примерно 85% до примерно 95%, или более предпочтительно, от примерно 90% до 100% по сравнению с биологическим действием бесклеточного Hb на ткань мозга в отсутствие терапевтического Hp, в том числе, по меньшей мере, на 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. Способы, с помощью которых можно измерить или определить снижение неблагоприятного биологического эффекта бесклеточного Hb (качественно или количественно), знакомы специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в других разделах настоящего документа.

Как также отмечалось в настоящем документе, авторы настоящего изобретения также впервые показали, что терапевтически эффективное количество Hp может предотвращать вмешательство бесклеточного oxyHb в СМЖ с цереброваскулярной передачей NO-сигналов, чтобы снизить частоту вазоспазмов и DIND. Используя динамическую МРТ, авторы настоящего изобретения подтвердили быструю, макроскопически идентичную дисперсию Hb и Hb:Hp комплексов в субарахноидальном пространстве после инъекции в желудочковую систему. Гистологический анализ также неожиданно показал обширное проникновение Hb из компартмента СМЖ в интерстициальное пространство головного мозга, тогда как комплексы Hb: Hp были в основном ограничены субарахноидальным пространством. Эти неожиданные открытия позволяют предположить, что компартментализация бесклеточного Hb в компартментах СМЖ через образование комплекса с Hp может предотвратить токсические эффекты бесклеточного Hb (преимущественно, oxyHb) на сосудистую сеть головного мозга и паренхиму головного мозга.

Следует понимать, что способ, с помощью которого СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, как описано в настоящем документе, может варьироваться в зависимости, например, от того, должно ли указанное воздействие осуществляться в пределах компартмента СМЖ субъекта, нуждающегося в этом (т.е., in vivo) или экстракорпорально в СМЖ, полученной от субъекта (т.е., ex vivo). Если указанное воздействие должно быть выполнено в компартменте СМЖ субъекта, нуждающегося в этом (т.е., in vivo), путь введения Hp будет выбран так, чтобы позволить Hp контактировать с бесклеточным Hb в компартменте СМЖ. Подходящие пути введения известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают интратекальный, интракраниальный и интрацеребровентрикулярный. В одном из вариантов осуществления, терапевтически эффективное количество Hp вводится через внешний желудочковый дренаж, который вводят, например, субъекту после геморрагического инсульта, чтобы временно дренировать СМЖ и снизить внутричерепное давление.

В одном из вариантов осуществления, способ включает внутричерепное введение субъекту терапевтически эффективного количества Hp.

В одном из вариантов осуществления, способ включает интратекальное введение субъекту терапевтически эффективного количества Hp. В одном из вариантов осуществления, способ включает интратекальное введение субъекту терапевтически эффективного количества Hp в позвоночный канал. В одном варианте осуществления, способ включает интратекальное введение субъекту терапевтически эффективного количества Hp в субарахноидальное пространство.

В одном из вариантов осуществления, способ включает интрацеребровентрикулярное введение субъекту терапевтически эффективного количества Hp.

Альтернативно или дополнительно, способы, описанные в настоящем документе, включают удаление СМЖ у субъекта, нуждающегося в этом, воздействие на СМЖ терапевтически эффективного количества Hp в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с и, тем самым, нейтрализовать, бесклеточный Hb в СМЖ, удаление комплексов Hb:Hp, образованных таким образом в СМЖ, для получения СМЖ с уменьшенным Hb, и введение субъекту СМЖ с уменьшенным Hb (например, интратекально или интрацеребровентрикулярно ). Следует понимать, что удаление СМЖ из компартмента СМЖ обычно не приводит к тому, что компартмент СМЖ полностью свободен от СМЖ, при этом следует отметить, что по меньшей мере, некоторое количество СМЖ останется в компартменте СМЖ. Необязательно, компартмент СМЖ можно промыть фармацевтически приемлемым промывочным раствором после удаления СМЖ, чтобы удалить, по меньшей мере, часть остаточного Hb, который может присутствовать в компартменте СМЖ. Промывочный раствор может необязательно содержать Hp, чтобы дополнительно образовывать комплекс и тем самым нейтрализовать, по меньшей мере, часть остаточного бесклеточного Hb, который может присутствовать в компартменте СМЖ. В одном варианте осуществления, промывочным раствором является искусственная СМЖ, как описано в другом месте в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления, способ, описанный в настоящем документе, включает удаление образца СМЖ из компартмента СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, добавление Hp к образцу СМЖ для получения образца СМЖ, обогащенного Hp, введение образца СМЖ, обогащенного Hp, в компартмент СМЖ субъекта, тем самым подвергая компартмент СМЖ воздействию терапевтически эффективного количества Hp и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с и, таким образом, нейтрализовать бесклеточный Hb в СМЖ субъекта, и, при необходимости, повторение вышеуказанных стадий. Предпочтительно количество Hp, которое добавляется к образцу СМЖ, определяют таким образом, чтобы при введении субъекту обеспечивалось терапевтически эффективное количество Hp в СМЖ субъекта. Следовательно, количество Hp, которое необходимо добавить в образец СМЖ, будет зависеть от объема образца СМЖ, который удаляется и повторно вводится субъекту.

В одном варианте осуществления способ включает:

(i) получение образца СМЖ из компартмента СМЖ субъекта после кровоизлияния;

(ii) добавление к образцу СМЖ со стадии (i) Hp для получения образца СМЖ, обогащенного Hp;

(iii) введение обогащенного Hp образца СМЖ субъекту, тем самым подвергая компартмент СМЖ субъекта воздействию терапевтически эффективного количества Hp в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb в компартменте СМЖ субъекта; и

(iv) необязательно, повторение стадий с (i) по (iii).

Желательно, чтобы объем СМЖ, который должен быть удален и повторно введен субъекту, был по существу одинаковым. Например, если образец СМЖ объемом 50 мл удаляется из компартмента СМЖ субъекта, весь объем 50 мл СМЖ, содержащий Hp, будет повторно введен субъекту. Однако следует понимать, что объемы могут быть разными, если любое различие в объемах не приводит к значительным неблагоприятным клиническим исходам. В некоторых вариантах осуществления, объем СМЖ, который повторно вводят субъекту, будет меньше, чем объем СМЖ, который был удален у субъекта. В других вариантах осуществления объем СМЖ, который повторно вводится субъекту, будет больше, чем объем СМЖ, который был удален у субъекта с добавлением Hp, отдельно или в комбинации с любыми другими терапевтическими агентами, составляющими дополнительный объем.

В другом варианте осуществления, способ, описанный в настоящем документе, включает удаление объема СМЖ из компартмента СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, замену объема СМЖ, удаленного у субъекта, объемом искусственной СМЖ, содержащей Hp, тем самым воздействуя на СМЖ пациента терапевтически эффективным количеством Hp в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb и тем самым нейтрализовать его в СМЖ субъекта. Предпочтительно, количество Hp в искусственной СМЖ будет определяться таким образом, чтобы при введении субъекту обеспечивалось терапевтически эффективное количество Hp в СМЖ субъекта. Следовательно, количество Hp, добавляемое к искусственной СМЖ, будет зависеть от объема искусственной СМЖ, которая будет введена субъекту.

В одном варианте осуществления, способ включает:

(i)удаление объема СМЖ из компартмента СМЖ субъекта после кровоизлияния;

(ii) создание искусственной СМЖ, содержащей Hp;

(iii) введение субъекту искусственной СМЖ по пункту (ii), тем самым подвергая компартмент СМЖ субъекта воздействию терапевтически эффективного количества Hp в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb в компартменте СМЖ субъекта; и

Объем искусственной СМЖ, который вводят субъекту, желательно будет по существу таким же, как объем СМЖ, удаленной из субъекта. Например, если образец СМЖ объемом 50 мл удаляется из компартмента СМЖ субъекта, объем примерно 50 мл искусственной СМЖ, содержащей терапевтически эффективное количество Hp, будет использоваться для замены удаленного объема СМЖ. Однако следует понимать, что объемы могут быть разными, если любое различие в объемах не приводит к значительным неблагоприятным клиническим исходам. В некоторых вариантах осуществления, объем искусственной СМЖ, вводимой субъекту, будет меньше объема СМЖ, который был удален у субъекта. В других вариантах осуществления, объем искусственной СМЖ, который вводят субъекту, будет больше, чем объем СМЖ, который был удален из субъекта.

В одном из вариантов осуществления способ, описанный в настоящем документе, включает воздействие Hp на СМЖ в течение примерно 21 дня после геморрагического инсульта. В другом варианте осуществления, описанном в настоящем документе, способ включает воздействие Hp на СМЖ от примерно 2 дней до примерно 4 дней после геморрагического инсульта. В еще одном варианте осуществления способ включает воздействие Hp на ЦСЖ от примерно 5 дней до примерно 14 дней после геморрагического инсульта.

Авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что воздействие на бесклеточный Hb внутри субарахноидального пространства терапевтически эффективного количества Hp в течение периода времени, по меньшей мере, примерно 2 минут, является достаточным для образования определяемых комплексов Hb:Hp в СМЖ. Таким образом, в одном варианте осуществления, период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет, по меньшей мере, примерно 2 минуты (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 минут и т. д.). В одном варианте осуществления, период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет, по меньшей мере, примерно 4 минуты. В другом варианте осуществления, период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет, по меньшей мере, примерно 5 минут. В еще одном варианте осуществления, период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет, по меньшей мере, примерно 10 минут. В одном варианте осуществления период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет от примерно 2 минут до примерно 45 минут, предпочтительно, от примерно 2 минут до примерно 20 минут, или более предпочтительно, от примерно 4 минут до примерно 10 минут.

Используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к млекопитающему, для которого желательно лечение или профилактика. Иллюстративные примеры подходящих субъектов включают приматов, особенно людей, животных-компаньонов, таких как кошки, собаки и подобные, рабочих животных, таких как лошади, ослы и подобные, домашних животных, таких как овцы, коровы, козы, свиньи и подобные, лабораторных животных, таких как кролики, мыши, крысы, морские свинки, хомяки и подобные, а также содержащихся в неволе диких животных, таких как животные в зоопарках и парках дикой природы, олени, динго и подобные. В одном из вариантов осуществления, субъектом является человек. В дополнительном варианте осуществления, субъектом является педиатрический пациент в возрасте (i) от рождения до примерно 2 лет, (ii) от примерно 2 до примерно 12 лет или (iii) от примерно 12 до примерно 21 года.

В одном варианте осуществления, способы, описанные в настоящем документе, включают экстракорпоральное воздействие на СМЖ терапевтически эффективного количества Hp.

Если СМЖ должна подвергаться воздействию Hp экстракорпорально (ex vivo), терапевтически эффективное количество может зависеть от объема СМЖ, на который будет воздействовать Hp, независимо от того, подвергается ли СМЖ воздействию Hp, который находится в растворе, или иммобилизируется на субстрат (например, для аффинной хроматографии) и комбинации любых из вышеперечисленных. Например, если СМЖ подвергается воздействию Hp для образования комплекса и удаления бесклеточного Hb с помощью аффинной хроматографии, количество Hp, которое иммобилизуется на субстрате, не обязательно должно приводить к полному комплексообразованию бесклеточного Hb во время начального прохода, и может потребоваться несколько проходов над субстратом для комплексообразования и, таким образом, удаления практически всего бесклеточного Hb из СМЖ.

В одном варианте осуществления, способ включает (i) получение образца СМЖ от субъекта после геморрагического инсульта и до воздействия Hp на СМЖ; (ii) измерение количества бесклеточного Hb в образце СМЖ, полученном на стадии (i); и (iii) определение, по меньшей мере, эквимолярного количества Hp на основе концентрации бесклеточного Hb со стадии (ii). Подходящие способы измерения количества бесклеточного Hb в образце СМЖ известны специалистам в данной области техники, их иллюстративный пример описан у Oh et al. (2016, Redox Biology, 9: 167-177), содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Как отмечалось в другом месте в настоящем документе, образование комплекса бесклеточного Hb с Hb в СМЖ нейтрализует в противном случае неблагоприятную биологическую активность бесклеточного Hb на ткани мозга. Хотя обычно нет необходимости извлекать или удалять бесклеточные комплексы Hb:Hp, которые образовались в соответствии с описанными в настоящем документе способами, в некоторых случаях может быть желательно удалить указанные комплексы. Например, если способы, описанные в настоящем документе, включают удаление СМЖ у субъекта и последующее экстракорпоральное воздействие Hp на СМЖ, может быть желательно удалить бесклеточные комплексы Hb:Hp, которые образовались в СМЖ, перед повторным введением СМЖ субъекту. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, способ включает удаление комплексов Hp:бесклеточный Hb, образованных в СМЖ.

(i) получение СМЖ от субъекта после кровоизлияния;

(ii) воздействие Hp на СМЖ со стадии (i) в условиях, позволяющих Hp образовывать комплекс с бесклеточным Hb в СМЖ;

(iii) извлечение комплексов Hp:бесклеточный Hb из СМЖ после стадии (ii) для получения СМЖ с пониженным содержанием Hb, который имеет меньшее количество бесклеточного Hb по сравнению с СМЖ со стадии (i);

(iv) возможно повторение стадий (ii) и (iii) для получения СМЖ с пониженным содержанием Hb, который по существу не содержит бесклеточный Hb; и

(v) введение СМЖ с пониженным содержанием Hb, полученной на стадии (iii) или стадии (iv), в компартмент СМЖ субъекта.

В настоящем контексте «СМЖ с пониженным содержанием Hb» означает СМЖ, из которого было удалено некоторое количество бесклеточного Hb, так что СМЖ имеет меньшее количество бесклеточного Hb по сравнению с количеством бесклеточного HB со стадии (iii). Следует понимать, что термин «СМЖ с пониженным содержанием Hb» не предназначен для обозначения того, что весь бесклеточный Hb удален из СМЖ, и, следовательно, включает варианты осуществления, в которых присутствует, по меньшей мере, некоторое количество бесклеточного Hb. В одном варианте осуществления, СМЖ с пониженным содержанием Hb содержит на, по меньшей мере, примерно 5%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 15%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 25%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 30%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 35%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 40%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 45%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 50%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 55%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 60%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 65%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 70%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 75%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 80%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 85%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% или более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95% меньше бесклеточного гемоглобина по сравнению с количеством бесклеточного Hb в СМЖ, полученной от субъекта. В одном варианте осуществления, СМЖ с пониженным содержанием Hb содержит на от примерно 5% до примерно 10%, предпочтительно, от примерно 10% до примерно 20%, предпочтительно, от примерно 20% до примерно 30%, предпочтительно, от примерно 30% до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 40% до примерно 50%, предпочтительно, от примерно 50% до примерно 60%, предпочтительно, от примерно 60% до примерно 70%, предпочтительно, от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, или более предпочтительно, от примерно 90% до примерно 99% меньше бесклеточного Hb по сравнению с количеством бесклеточного Hb в СМЖ, полученной от субъекта.

Как описано в другом месте в настоящем документе, СМЖ с пониженным содержанием Hb можно дополнительно обрабатывать путем повторения стадий (ii) и (iii) для удаления дополнительного бесклеточного Hb из СМЖ, предпочтительно, для получения СМЖ с пониженным содержанием Hb, которая по существу не содержит бесклеточный Hb. Под «по существу свободной от бесклеточного Hb» подразумевается, что СМЖ с пониженным содержанием Hb имеет на от примерно 70% до примерно 80%, предпочтительно, от примерно 80% до примерно 90%, или более предпочтительно, от примерно 90% до примерно 99% меньше бесклеточного Hb по сравнению с количеством бесклеточного Hb в СМЖ, полученной от субъекта.

В варианте осуществления, способ включает повторение стадий (ii) и (iii), по меньшей мере, один раз (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 раз и так далее). В одном варианте осуществления, способ включает повторение стадий (ii) и (iii), по меньшей мере, 1 раз, предпочтительно, 2 раза, предпочтительно, 3 раза, предпочтительно, 4 раза, предпочтительно, 5 раз, предпочтительно, 6 раз, предпочтительно, 7 раз, предпочтительно, 8 раз, предпочтительно, 9 раз или более предпочтительно, 10 раз, как требуется для получения СМЖ с пониженным содержанием Hb, которая по существу не содержит бесклеточный Hb.

Следует понимать, что количество раз, которое необходимо повторить стадии (ii) и (iii) для получения СМЖ с пониженным содержанием Hb, которая по существу не содержит бесклеточный гемоглобин, может зависеть от нескольких факторов, включая (но не ограничиваясь ими) концентрацию бесклеточного Hb в СМЖ субъекта, используемую концентрацию Hb, способ экстракции и так далее. В некоторых случаях, может быть желательно выполнить стадии (ii) и (iii) только один раз, в частности, когда повторение стадий (ii) и (iii) может подвергнуть СМЖ воздействию загрязнителей, таких как бактерии, дрожжи, грибки и вирусы.

Подходящие способы экстракции комплексов Hp:бесклеточный Hb из СМЖ известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают эксклюзионную хроматографию и/или аффинную хроматографию. Эксклюзионная хроматография позволяет идентифицировать комплексы Hp:бесклеточный Hb и отделять их от других компонентов в СМЖ в силу их большего размера по сравнению со свободным Hb и Hp. Аффинная хроматография позволяет идентифицировать комплексы Hp:бесклеточный Hb и отделять их от других компонентов в СМЖ с помощью связывающего агента, который специфически связывается с комплексом Hb:Hp с незначительным связыванием со свободным Hb. Подходящие связывающие агенты включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как известно специалистам в данной области техники.

В одном варианте осуществления, стадия (ii) включает пропускание СМЖ со стадии (i) через субстрат, на котором иммобилизован Hp. Это преимущественно позволяет бесклеточному Hb в СМЖ связываться с Hp, тем самым мобилизуя бесклеточный Hb на субстрат и позволяя СМЖ с пониженным содержанием Hb легко элюироваться с субстрата. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, Hp на стадии (ii) иммобилизован на субстрате. Подходящие субстраты известны специалистам в данной области, их иллюстративные примеры которых смолу для эксклюзионной хроматографии и смолу для аффинной хроматографии. В одном варианте осуществления, субстратом является смола для аффинной хроматографии.

В одном варианте осуществления, стадия (ii) включает пропускание СМЖ со стадии (i) через смолу для аффинной хроматографии в условиях, которые позволяют бесклеточному Hb в СМЖ связываться со смолой; где стадия (iii) включает элюирование СМЖ из смолы после стадии (ii); и где стадия (iv) включает извлечение элюированного СМЖ.

Перед введением СМЖ с пониженным содержанием Hb, полученной на стадии (iii) или стадии (iv), в компартмент СМЖ субъекта на стадии (vi) может быть желательно добавить к СМЖ с пониженным Hb терапевтически эффективного количества Hp для улавливания остаточного бесклеточного Hb, который может присутствовать в компартменте СМЖ субъекта и может вызвать неблагоприятный вторичный неврологический исход, как описано в другом месте в настоящем документе. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, способ включает добавление к СМЖ с пониженным содержанием Hb перед стадией (v) терапевтически эффективного количества Hp, как описано в другом месте в настоящем документе.

Специалисты в данной области техники поймут, что после удаления СМЖ из компартмента СМЖ субъекта после геморрагического инсульта, в отделении СМЖ может оставаться остаточный бесклеточный Hb. Поэтому может быть желательно промыть компартмент СМЖ (после того, как СМЖ был удален в соответствии с стадией (i) выше), чтобы удалить, по меньшей мере, часть остаточного бесклеточного Hb и тем самым устранить или иным образом уменьшить нежелательные вторичные неврологические исходы, к которым в противном случае может привести такой остаточный бесклеточный Hb. Таким образом, в варианте осуществления, способ дополнительно включает промывание компартмента СМЖ после стадии (i) промывочным раствором.

Подходящие промывочные растворы известны специалистам в данной области техники. В одном варианте осуществления, промывочным раствором является искусственная СМЖ.

Искусственной спинномозговой жидкостью (иСМЖ) обычно является жидкость, имитирующая натуральную СМЖ, в том числе, по содержанию соли. Подходящие композиции иСМЖ известны специалистам в данной области, их иллюстративные примеры описаны в US 2006/0057065 и Matzneller et al. (Pharmacology, 2016; 97(5-6):233-44), содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. иСМЖ может содержать NaCl в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области техники, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации NaCl в природной СМЖ. иСМЖ может содержать NaHCO₃ в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природной СМЖ, как будет известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации NaHCO₃ в природной СМЖ. иСМЖ может содержать KCl в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации KCl в природной СМЖ. иСМЖ может содержать NaH₂PO₄ в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации NaH₂PO₄ в природной СМЖ. иСМЖ может содержать MgCl₂ в концентрации, аналогичной концентрации, содержащейся в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации MgCl₂ в природной СМЖ. иСМЖ может содержать глюкозу в концентрации, аналогичной концентрации, содержащейся в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации глюкозы в природной СМЖ. Альтернативно, искусственная СМЖ может не включать глюкозу, чтобы снизить вероятность роста бактерий в любом катетере, используемом для введения иСМЖ субъекту.

В одном варианте осуществления, искусственная СМЖ/промывочный раствор содержит NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂O, CaCl₂H₂O и глюкозу.

В одном из вариантов осуществления, промывочный раствор содержит Hp.

В одном варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ Hp. В одном варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 2 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 100 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ Hp. В одном варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ Hp. В одном варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ Hp.

В одном из вариантов осуществления, промывочный раствор содержит, по меньшей мере, эквимолярное количество Hp по отношению к концентрации бесклеточного Hb в СМЖ субъекта после кровоизлияния. В другом варианте осуществления, промывочный раствор содержит от примерно 3 мкМ до примерно 300 мкМ Hp.

В некоторых вариантах осуществления, может быть желательно отказаться от стадий экстракорпорального удаления бесклеточного Hb из СМЖ субъекта, как описано в настоящем документе, и вместо этого заменить СМЖ субъекта искусственной СМЖ, как описано в другом месте в настоящем документе. Таким образом, в одном варианте осуществления способ включает:

(i) удаление СМЖ у субъекта после кровоизлияния;

(ii) промывание компартмента СМЖ субъекта после стадии (i) промывочным раствором, содержащим терапевтически эффективное количество Hp;

(iii) необязательно, повторение стадии (ii); и

(iv) введение в компартмент СМЖ субъекта после стадии (ii) или стадии (iii) искусственной СМЖ.

При введении терапевтически эффективного количества Hp в промывочный раствор остаточный бесклеточный Hb в компартменте СМЖ может образовывать комплекс с Hp, тем самым нейтрализуя неблагоприятное биологическое действие бесклеточного Hb на ткань мозга.

В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂O, CaCl₂H₂O и глюкозу. В одном варианте осуществления, искусственная СМЖ содержит Hp.

В одном из вариантов осуществления искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 100 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ Hp.

В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит, по меньшей мере, эквимолярное количество Hp по отношению к концентрации бесклеточного Hb в СМЖ субъекта после кровоизлияния. В другом варианте осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 3 мкМ до примерно 300 мкМ Hp.

Вспомогательная терапия

Способы лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, как описано в настоящем документе, могут подходящим образом выполняться вместе, либо последовательно, либо в комбинации (например, в одно и то же время), с одной или несколькими другими стратегиями лечения, разработанными для уменьшения, ингибирования, профилактики или иного облегчения одного или нескольких неблагоприятных вторичных неврологических исходов у субъекта после геморрагического инсульта. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, способ дополнительно включает введение субъекту второго агента для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода после внутрижелудочкового кровоизлияния. Подходящие другие стратегии лечения или вторые агенты для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода после внутрижелудочкового кровоизлияния известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают:

(i) Коррекцию коагулопатии - например, с помощью антагонистов витамина К (VKA), новых пероральных антикоагулянтов (NOAC, таких как дабигатран, ривароксабан и апиксабан), ингибитора фактора VIII (FEIBA) и активированного рекомбинантного фактора VII (rFVIIa), концентрата протромбинового комплекса, активированного угля, антитромбоцитарной терапии (APT) и монотерапии аспирином;

(ii) Снижение артериального давления - например, антигипертензивные средства, иллюстративные примеры которых включают (i) диуретики, такие как тиазиды, включая хлорталидон, хлортиазид, дихлорфенамид, гидрофлуметиазид, индапамид и гидрохлоротиазид; петлевые диуретики, такие как буметанид, этакриновая кислота, фуросемид и торсемид; калийсберегающие агенты, такие как амилорид и триамтерен; и антагонисты альдостерона, такие как спиронолактон, эпиренон и подобные; (ii) бета-адренергические блокаторы, такие как ацебутолол, атенолол, бетаксолол, бевантолол, бисопролол, бопиндолол, картеолол, карведилол, целипролол, эсмолол, инденолол, метапролол, надолол, небиволол, пенбутолол, пиндолол, пропанолол, соталол, тертатолол, тилисолол и тимолол и подобные; (iii) блокаторы кальциевых каналов, такие как амлодипин, аранидипин, азелнидипин, барнидипин, бенидипин, бепридил, цинальдипин, клевидипин, дилтиазем, эфонидипин, фелодипин, галлопамил, исрадипин, лацидипин, лемилдипин, лерканидипин, никардипин, нифедипин, нилвадипин, нимодепин, нисолдипин, нитрендипин, манидипин, пранидипин и верапамил и подобные; (iv) ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ACE), такие как беназеприл; каптоприл; цилазаприл; делаприл; эналаприл; фозиноприл; имидаприл; лозиноприл; моэксиприл; квинаприл; квинаприлат; рамиприл; периндоприл; периндроприл; кваниприл; спираприл; тенокаприл; трандолаприл и зофеноприл и подобные; (v) ингибиторы нейтральной эндопептидазы, такие как омапатрилат, кадоксатрил и экадотрил, фозидотрил, сампатрилат, AVE7688, ER4030 и подобные; (vi) антагонисты эндотелина, такие как тезозентан, A308165 и YM62899, и подобные; (vii) вазодилататоры, такие как гидралазин, клонидин, миноксидил и никотиниловый спирт и подобные; (viii) антагонисты рецептора ангиотензина II, такие как кандесартан, эпросартан, ирбесартан, лозартан, пратосартан, тасосартан, телмисартан, валсартан и EXP-3137, FI6828K и RNH6270 и подобные; (ix) α/β адреноблокаторы, такие как нипрадилол, аротинолол и амосулалол, и подобные; (x) блокаторы альфа-1, такие как теразозин, урапидил, празозин, буназозин, тримазозин, доксазозин, нафтопидил, индорамин, WHIP 164 и XENOlO и подобные; и (xi) -альфа 2 агонисты, такие как лофексидин, тиаменидин, моксонидин, рилменидин и гуанобенз и подобные.

(ii-b) Вазодилататоры - например, гидралазин (апрезолин), клонидин (катапрес), миноксидил (лонитен), никотиниловый спирт (рониакол), сиднон и нитропруссид натрия.

(iii) Управление судорогами, глюкозой и температурой - например, противоэпилептические лекарственные средства, инфузии инсулина для контроля уровня глюкозы в крови, поддержание нормотермии и терапевтическое охлаждение;

(iv) Хирургическое лечение - например, эвакуация гематомы (хирургическое удаление сгустка), декомпрессивная трепанация черепа (DC), малоинвазивная хирургия (MIS; такая как пункционная аспирация кровоизлияний в базальные ганглии), MIS с рекомбинантным активатором плазминогена тканевого типа (rtPA);

(v) Время операции - например, от 4 до 96 часов после появления симптомов;

(vi) Ингибирование тромбина - например, гирудин, аргатробан, ингибиторы сериновой протеазы (например, мезилат нафамостата);

(vii) Предупреждение токсичности гема и железа - например, неспецифические ингибиторы гемоксигеназы (HO), такие как олово-мезопорфирин, хелаторы железа, такие как дефероксамин;

(viii) Антагонисты и агонисты PPARg - например, розиглитазон, 15d-PGJ2 и пиоглитазон;

(ix) Ингибирование активации микроглии - например, фрагмент 1-3 туфцина (ингибирующий фактор микроглии/макрофагов) или миноциклина (антибиотик тетрациклинового класса);

(x) Активация фактора 2, родственного NF-эритроиду-2 (Nrf2);

(xi) Ингибирование циклооксигеназы (COX) - например, целекоксиб (селективный ингибитор COX-2);

(xii) Матричные металлопротеиназы;

(xiii) Модуляторы TNF-α - например, агонисты аденозиновых рецепторов, такие как CGS 21680, TNF-α-специфические антисмысловые олигодеоксинуклеотиды, такие как ORF4-PE; и

(xiv) Повышение артериального давления - например, катехоламины

(xv) Ингибиторы передачи сигналов TLR4 - например, антитело Mts510 и TAK-242 (производное циклогексена);

В одном из вариантов осуществления, вторым средством является вазодилататор. Подходящие вазодилататоры известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры включают сиднон и нитропруссид натрия. Таким образом, в варианте осуществления, описанном в настоящем документе, второй агент выбран из группы, состоящей из сиднона и нитропруссида натрия.

Искусственная СМЖ

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлена искусственная спинномозговая жидкость (СМЖ), содержащая Hp, как описано в настоящем документе.

Искусственной спинномозговой жидкостью (иСМЖ) обычно является жидкость, имитирующую естественную СМЖ, в том числе по содержанию соли. Подходящие композиции иСМЖ известны специалистам в данной области, их иллюстративные примеры описаны в US 2006/0057065 и Matzneller et al. (Pharmacology, 2016; 97(5-6):233-44, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. иСМЖ может содержать NaCl в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природной СМЖ, как будет известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации NaCl в природной СМЖ. иСМЖ может содержать NaHCO₃ в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природном СМЖ, как будет известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации NaHCO₃ в природной СМЖ. иСМЖ может содержать KCl в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природном СМЖ, как будет известно специалистам в данной области, и обычно будет включать концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации KCl в природной СМЖ. иСМЖ может содержать NaH₂PO₄ в концентрации, аналогичной концентрации, обнаруженной в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области техники, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации NaH₂PO₄ в природной СМЖ. иСМЖ может содержать MgCl₂ в концентрации, аналогичной концентрации, содержащейся в природной СМЖ, как известно специалистам в данной области техники, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации MgCl₂ в природной СМЖ. иСМЖ может содержать глюкозу в концентрации, аналогичной концентрации, содержащейся в природной СМЖ, как будет известно специалистам в данной области, и обычно включает концентрации в пределах примерно 15%, более предпочтительно, в пределах примерно 10% от концентрации глюкозы в природной СМЖ. Альтернативно, искусственная СМЖ может не включать глюкозу, чтобы снизить вероятность роста бактерий в любом катетере, используемом для введения иСМЖ субъекту.

В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 100 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ Hp. В одном из вариантов осуществления, искусственная СМЖ содержит от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ Hp.

В одном варианте осуществления, Hp выбран из группы, состоящей из Hp1-1 гомодимера, Hp1-2 мультимера, Hp2-2 мультимера и комбинации любых из вышеперечисленных. В одном из вариантов осуществления, Hp содержит, состоит из или по существу состоит из Hp2-2 мультимера.

Фармацевтические композиции

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлена фармацевтическая композиция для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после внутрижелудочкового кровоизлияния в соответствии с описанными в настоящем документе способами, где композиция содержит терапевтически эффективное количество Hp, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлена фармацевтическая композиция для применения при лечении или профилактике неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после внутрижелудочкового кровоизлияния в соответствии с описанными в настоящем документе способами, где композиция содержит терапевтически эффективное количество Hp, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления, композиция содержит от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ Hp. В одном из вариантов осуществления, композиция содержит от примерно 2 мкМ до примерно 5 мМ Hp. В одном варианте осуществления, композиция содержит от примерно 100 мкМ до примерно 5 мМ Hp или его функционального аналога. В одном из вариантов осуществления, композиция содержит от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ Hp. В одном из вариантов осуществления, композиция содержит от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ Hp. В одном из вариантов осуществления, композиция содержит от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ Hp.

В одном из вариантов осуществления, композиция содержит, по меньшей мере, эквимолярное количество Hp по отношению к концентрации бесклеточного Hb в СМЖ субъекта после кровоизлияния. В другом варианте осуществления, композиция содержит от примерно 3 мкМ до примерно 300 мкМ Hp.

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлено использование терапевтически эффективного количества Hp, как описано в настоящем документе, при производстве лекарственного средства для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после внутрижелудочкового кровоизлияния в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления, описанные в настоящем документе фармацевтические композиции составлены для интратекального введения. Подходящие системы интратекальной доставки известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в Kilburn et al. (2013, Intrathecal Administration. In: Rudek M., Chau C., Figg W., McLeod H. (eds) Handbook of Anticancer Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Cancer Drug Discovery and Development. Springer, New York, NY), содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, описанные в настоящем документе фармацевтические композиции составлены для внутричерепного введения. Подходящие системы интратекальной доставки известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в Upadhyay et al. (2014, PNAS, 111(45):16071-16076), содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, описанные в настоящем документе фармацевтические композиции составлены для интрацеребровентрикулярного введения. Подходящие системы интратекальной доставки известны специалистам в данной области техники, их иллюстративные примеры описаны в Cook et al. (2009, Pharmacotherapy. 29(7):832-845), содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Подходящие фармацевтические композиции и их стандартные дозированные формы могут включать обычные ингредиенты в обычных пропорциях, с или без дополнительных активных соединений или принципов, и такие стандартные лекарственные формы могут содержать любое подходящее эффективное количество активного ингредиента, соизмеримое с предполагаемым диапазоном суточных доз, которые будут использоваться.

Наборы

В другом аспекте, описанном в настоящем документе, представлен набор, содержащий искусственную СМЖ, как описано в настоящем документе, или фармацевтическую композицию, как описано в настоящем документе. Описанные в настоящем документе активные агенты (включая Hp) могут быть представлены в форме набора компонентов, адаптированного для обеспечения одновременного, раздельного или последовательного введения активных агентов. Каждый носитель, разбавитель, адъювант и/или эксципиент должен быть «фармацевтически приемлемым», в том, чтобы он был совместим с другими ингредиентами композиции и физиологически переносился субъектом. Композиции могут быть удобным образом представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть приготовлены способами, хорошо известными в области фармацевтики. Такие способы включают стадию объединения активного ингредиента с носителем, которым является один или несколько дополнительных ингредиентов. Как правило, композиции готовят равномерным и тщательным объединением активного ингредиента с жидкими носителями, разбавителями, адъювантами и/или эксципиентами, или тонко измельченными твердыми носителями, или с обоими, а затем, если необходимо, приданием продукту формы.

Таким образом, настоящее изобретение, в частности, относится к следующим вариантам осуществления [1] - [74]:

[1.] Способ лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, сопровождающегося внесосудистым эритролизом и высвобождением бесклеточного гемоглобина (Hb) в спинномозговую жидкость (СМЖ), способ включает воздействие на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества гаптоглобина (Hp) и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb и тем самым нейтрализовать его.

[2.] Способ по пункту [1], в котором геморрагическим инсультом является спонтанное кровоизлияние или травматическое кровоизлияние.

[3.] Способ по пункту [1] или пункту [2], где геморрагическим инсультом является внутрижелудочковое кровоизлияние или субарахноидальное кровоизлияние.

[4.] Способ по пункту [3], где субарахноидальным кровоизлиянием является аневризматическое субарахноидальное кровоизлияние.

[5.] Способ по любому из пунктов [1] - [4], в котором неблагоприятный вторичный неврологический исход выбран из группы, состоящей из неврологического дефицита вследствие отсроченной ишемии (DIND), отсроченной ишемии головного мозга (DCI), нейротоксичности, воспаления, истощения оксида азота, окислительного повреждения тканей, церебрального вазоспазма, церебральной вазореактивности и отека.

[6.] Способ по пункту [5], где неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является церебральный вазоспазм.

[7.] Способ по пункту [5], где неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является неврологический дефицит вследствие отсроченной ишемии.

[8.] Способ по пункту [5], где неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является отсроченная церебральная ишемия.

[9.] Способ по любому из пунктов [1] - [8], где неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является неблагоприятный вторичный неврологический исход в паренхиме мозга.

[10.] Способ по любому из пунктов [1] - [9], включающий воздействие Hp или его функционального аналога на СМЖ в течение примерно 21 дня после начала кровоизлияния.

[11.] Способ по пункту [10], включающий воздействие Hp на СМЖ от примерно 2 дней до примерно 4 дней после начала кровоизлияния.

[12.] Способ по пункту [10], включающий воздействие Hp на СМЖ от примерно 5 дней до примерно 14 дней после начала кровоизлияния.

[13.] Способ по любому из пунктов [1] - [12], включающий внутричерепное введение Hp субъекту.

[14.] Способ по любому из пунктов [1] - [12], включающий интратекальное введение Hp субъекту.

[15.] Способ по пункту [14], где Hp вводят интратекально в позвоночный канал.

[16.] Способ по пункту [14], где Hp вводят интратекально в субарахноидальное пространство.

[17.] Способ по любому из пунктов [1] - [12], включающий интрацеребровентрикулярное введение субъекту терапевтически эффективного количества Hp.

[18.] Способ по любому из пунктов [13] - [17], где период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет по меньшей мере, примерно 2 минуты.

[19.] Способ по пункту [18], где период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет от примерно 2 минут до примерно 45 минут.

[20.] Способ по пункту [18], где период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет от примерно 2 минут до примерно 20 минут.

[21.] Способ по пункту [18], где период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества Hp, составляет от примерно 4 минут до примерно 10 минут.

[22.] Способ по любому из пунктов [1] - [21], где терапевтически эффективное количество Hp составляет, по меньшей мере, эквимолярное количество по отношению к концентрации бесклеточного Hb в СМЖ субъекта после кровоизлияния.

[23.] Способ по пункту [22], дополнительно включающий (i) получение образца СМЖ от субъекта после кровоизлияния и до воздействия Hp на СМЖ; (ii) измерение количества бесклеточного Hb в образце СМЖ, полученном на стадии (i); и (iii) определение, по меньшей мере, эквимолярного количества Hp на основе концентрации бесклеточного Hb со стадии (ii).

[24.] Способ по любому из пунктов [1] - [23], где терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ.

[25.] Способ по пункту [24], где терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ.

[26.] Способ по пункту [24], где терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ.

[27.] Способ по пункту [24], где терапевтически эффективное количество Hp составляет от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ.

[28.] Способ по любому из пунктов [1] - [27], дополнительно включающий удаление комплексов Hp:бесклеточный Hb, образованных в СМЖ.

[29.] Способ по любому из пунктов [1] - [28], включающий экстракорпоральное воздействие на СМЖ терапевтически эффективного количества Hp.

[30.] Способ по п. [29], включающий:

(ii) добавление к образцу СМЖ стадии (i) Hp для получения образца СМЖ, обогащенного Hp;

(iii) введение образца СМЖ, обогащенного Hp, субъекту, тем самым подвергая компартмент СМЖ субъекта воздействию терапевтически эффективного количества Hp в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb в компартменте СМЖ субъекта; и

[31.] Способ по п. [29], включающий:

(iii) введение субъекту искусственной СМЖ со стадии (ii), тем самым подвергая компартмент СМЖ субъекта воздействию терапевтически эффективного количества Hp в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить Hp образовать комплекс с бесклеточным Hb в компартменте СМЖ субъекта; и

[32.] Способ по п. [29], включающий:

(ii) воздействие Hp на СМЖ со стадии (i) в условиях, позволяющих Hp или его функциональному аналогу образовывать комплекс с бесклеточным Hb в СМЖ;

(iii) извлечение комплексов Hp:бесклеточный Hb из СМЖ после стадии (ii) для получения СМЖ с пониженным содержанием Hb, которая имеет меньшее количество бесклеточного Hb по сравнению с СМЖ из стадии (i);

(iv) необязательно, повторение стадий (ii) и (iii) с получением СМЖ с пониженным содержанием Hb, которая по существу не содержит бесклеточный Hb; и

[33.] Способ по пункту [32], дополнительно включающий добавление к СМЖ с пониженным содержанием Hb перед стадией (vi) терапевтически эффективного количества Hp.

[34.] Способ по пункту [32] или пункту [33], где Hp иммобилизуют на субстрате.

[35.] Способ по пункту [34], в котором субстратом является смола для аффинной хроматографии.

[36.] Способ по пункту [35], где стадия (ii) включает пропускание СМЖ со стадии (i) через смолу для аффинной хроматографии в условиях, которые позволяют бесклеточному Hb в СМЖ связываться со смолой; где стадия (iii) включает элюирование СМЖ из смолы после стадии (ii); и где стадия (iv) включает извлечение элюированного СМЖ.

[37.] Способ по любому из пунктов [32] - [36], необязательно включающий промывание компартмента СМЖ после стадии (i) промывочным раствором.

[38.] Способ по п. [37], где промывочным раствором является искусственная СМЖ.

[39.] Способ по пункту [31] или пункту [38], где искусственная СМЖ содержит NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂O, CaCl₂H₂O и глюкозу.

[40.] Способ по любому из пунктов [37] - [39], где промывочный раствор содержит Hp.

[41.] Способ по пункту [40], где промывочный раствор содержит от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ Hp.

[42.] Способ по пункту [41], где промывочный раствор содержит от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ Hp.

[43.] Способ по любому из пунктов [1] - [42], включающий:

(iii) необязательно, повторение стадии (ii); и

[44.] Способ по пункту [43], где искусственная СМЖ содержит NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂O, CaCl₂H₂O и глюкозу.

[45.] Способ по пункту [43] или пункту [44], где искусственная СМЖ содержит Hp.

[46.] Способ по пункту [45], где искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ Hp.

[47.] Способ по пункту [46], где искусственная СМЖ содержит от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ Hp.

[48.] Способ по любому из пунктов [1] - [47], где Hp выбран из группы, состоящей из Hp1-1 гомодимера, Hp1-2 мультимера, Hp2-2 мультимера и комбинации любых из вышеперечисленных.

[49.] Способ по пункту [48], где Hp содержит Hp2-2 мультимер.

[50.] Способ по любому из пунктов [1] - [49], где Hp является рекомбинантный белок.

[51.] Способ по любому из пунктов [1] - [49], где Hp получают из плазмы.

[52.] Способ по любому из пунктов [1] - [51], дополнительно включающий введение субъекту второго агента для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода после внутрижелудочкового кровоизлияния.

[53.] Способ по пункту [52], где вторым средством является сосудорасширяющее средство.

[54.] Способ по пункту [52] или пункту [53], где второй агент выбран из группы, состоящей из сиднона и нитропруссида натрия.

[55.] Искусственная спинномозговая жидкость (СМЖ), содержащая Hp.

[56.] Искусственная СМЖ по пункту [55], где Hp присутствует в количестве от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ.

[57.] Искусственная СМЖ по пункту [55], где Hp присутствует в количестве от примерно 5 мкМ до примерно 300 мкМ.

[58.] Искусственная СМЖ по пункту [55], где Hp присутствует в количестве от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ.

[59.] Искусственная СМЖ по пункту [58], где Hp присутствует в количестве от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ.

[60.] Искусственная СМЖ по любому из пунктов [57] - [59], где Hp выбран из группы, состоящей из Hp1-1 гомодимера, Hp1-2 мультимера, Hp2-2 мультимера и комбинации любых из вышеизложенных.

[61.] Искусственная СМЖ по пункту [60], содержащая Hp2-2 мультимер.

[62.] Искусственная СМЖ по пункту [59] или [60], где Hp является рекомбинантный белок.

[63.] Искусственная СМЖ по пункту [57] или [58], где Hp происходит из плазмы.

[64.] Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта в соответствии со способом по любому из пунктов [1] - [54], композиция содержит терапевтически эффективное количество Hp и фармацевтически приемлемый носитель.

[65.] Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта в соответствии со способом по любому из пунктов [1] - [54], композиция содержит терапевтически эффективное количество Hp и фармацевтически приемлемый носитель.

[66.] Композиция по пункту [64] или пункту [65], где Hp присутствует в количестве от примерно 2 мкМ до примерно 20 мМ.

[67.] Композиция по пункту [66], где Hp присутствует в количестве от примерно 2 мкМ до примерно 300 мкМ.

[68.] Композиция по пункту [66], где Hp присутствует в количестве от примерно 5 мкМ до примерно 50 мкМ.

[69.] Композиция по пункту [66], где Hp присутствует в количестве от примерно 10 мкМ до примерно 30 мкМ.

[70.] Композиция по любому из пунктов [64] - [69], где Hp выбран из группы, состоящей из Hp1-1 гомодимера, Hp1-2 мультимера, Hp2-2 мультимера и комбинации любого из вышеперечисленных .

[71.] Композиция по пункту [70], содержащая Hp2-2 мультимер. Согласно дополнительному варианту осуществления, композиция по пункту [70] содержит Hp1-1 гомодимер.

[72.] Использование терапевтически эффективного количества гаптоглобина (Hp) в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта в соответствии со способом по любому из пунктов [1] - [54].

[73.] Терапевтически эффективное количество гаптоглобина (Hp) для использования при лечении или профилактике неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, в соответствии со способом по любому из пунктов [1] - [54].

[74.] Набор, содержащий искусственную СМЖ по любому из пунктов [55] - [63] или композицию по любому из пунктов [64] - [71].

Специалисты в данной области техники поймут, что описанное в настоящем документе изобретение допускает изменения и модификации, отличные от конкретно описанных. Следует понимать, что изобретение включает в себя все такие вариации и модификации, которые находятся в пределах сущности и объема. Изобретение также включает все стадии, признаки, композиции и соединения, упомянутые или указанные в настоящем описании, по отдельности или вместе, и любые и все комбинации любых двух или более из указанных стадий или признаков.

Некоторые варианты осуществления изобретения теперь будут описаны со ссылкой на следующие примеры, которые предназначены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема описанного выше.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

А. Эксперименты с сосудистой функцией ex vivo

Выделение сосудов-мишеней

Базилярные артерии выделяют из свежих голов забитых свиней с местной бойни (SBZ, Zurich, Switzerland). Головы располагают в супинированном положении в пользовательском удерживающем устройстве, и скат обнажают от уровня затылочных мыщелков до заднего носового отверстия путем резекции остаточных мягких тканей. Твердую мозговую оболочку осторожно отделяют от переднего края большого затылочного отверстия и слегка мобилизуют, чтобы создать пространство для трепанации черепа. Двусторонняя парамедианная остеотомия ската и частичная кондилэктомия с использованием долота приводят к обнажению вентральной твердой мозговой оболочки. Твердую мозговую оболочку осторожно удаляют, оставив нетронутыми периваскулярные паутинные цистерны вентрального ствола мозга. Черепные нервы III-XII рассекают для мобилизации ствола мозга. Ствол мозга выделяют резким рассечением на уровне понтомезэнцефалического соединения и ножек мозжечка и переносят в предварительно охлажденный (4°C) буферный раствор. С помощью препаровальной лупы позвоночные артерии идентифицируют как анатомический ориентир и разрезают на 2 мм проксимально к вертебробазилярному переходу. Тщательная арахноидальная подготовка позволяет поэтапно мобилизовать базилярную артерию, избегая чрезмерных механических манипуляций с сосудом. Сегмент базилярной артерии между вертебробазилярным соединением и каудальной церебральной артерией использован для приготовления вплоть до 6 сосудистых колец (длина 2 мм на кольцо) (фигура 1).

Во время всех хирургических приготовлений особое внимание уделяется тому, чтобы избежать какого-либо сдавливания или растяжения артерий. Время между смертью животного и переносом иссеченных сосудов в буфер было меньше 90 минут.

Подготовка буферов и химикатов

Буфер Кребса-Хенселейта (KHB) готовят партиями по пять литров. Готовят исходные растворы 2,27 М NaCl и KCl, а также 1,00 М KH₂PO₄. Соблюдение правильного порядка химикатов и тщательное перемешивание после каждой стадии добавления имеют решающее значение для приготовления этого буфера, поскольку ионный состав нескольких компонентов близок к максимальной растворимости; особенно для гидрокарбоната кальция, который имеет тенденцию осаждаться в виде извести (CaCO₃), а также фосфата кальция и гипса (CaSO₄). В 4 литрах дистиллированной воды при комнатной температуре смешивают 10,35 мл 2,27 М KCl и 138,1 мл 2,27 М NaCl. Добавляют 10,50 г NaHCO₃, и буфер перемешивают до полного растворения всех солей. Добавляют 6,0 мл 1,00 М KH₂PO₄, и раствор снова перемешивают. 1,84 г CaCl₂×2 H₂O, затем 1,48 г MgSO₄×7 H₂O растворяют в буфере. Добавляют 121 мл 2,27 М NaCl. Буфер нагревают точно до 37°C и уравновешивают барботированием 5% CO₂ и 95% O₂ в течение, по меньшей мере, одного часа. pH доводят до 7,40 добавлением по каплям концентрированной ортофосфорной кислоты. Объем доводят дистиллированной водой до 5 литров. Буфер хранят при комнатной температуре (соли выпадают в осадок при 4°C). Глюкозу добавляют только непосредственно перед использованием до концентрации 2 г/л, чтобы предотвратить преждевременное микробиологическое загрязнение буфера. Конечный ионный состав для KHB: 143 мМ Na⁺, 5,90 мМ K⁺, 1,20 мМ Mg₂ ⁺, 2,50 мМ Ca₂ ⁺, 125 мМ Cl^-, 25,0 мМ HCO₃ ^-, 1,20 мМ SO₄ ²⁺, 1,20 мМ PO₄ ^3- и 11,1 мМ глюкозы.

MAHMA-NONOate

MAHMA-NONOate (ENZO Life Sciences, Lausen, Switzerland) растворяют в 20 мМ NaOH до исходной концентрации 10 мМ и хранят небольшими аликвотами при -80°C. Перед использованием, химическое вещество разбавляют до концентрации 25 мкМ в 5 мМ NaOH и хранят на льду. Крайне важно поддерживать MAHMA-NONOate при высоком уровне pH непосредственно до того момента, пока он не будет использован, поскольку при физиологическом pH период полураспада этого химического вещества находится в диапазоне от секунд до минут, в зависимости от температуры.

PGF2α

Простагландин F2ɑ (PGF2α) Sigma, Buchs, Switzerland) растворяют в PBS pH 7,4 до исходной концентрации 10 мМ и хранят при -80°C небольшими аликвотами до использования.

Образцы СМЖ пациентов с aSAH

Последовательных пациентов, поступивших в Neurocritical Care Unit, University Hospital of Zurich (академический центр третичной медицинской помощи) с диагнозом aSAH и вставленным EVD из-за гидроцефалии, обследовали для включения в исследование в период с апреля 2017 года по декабрь 2018 года. Исследование было одобрено местным советом по этике и письменное согласие было получено от всех пациентов или их законных представителей до включения в исследование.

Критерии исключения были следующими: неизвестный источник кровоизлияния в течение 72 часов, неспособность зафиксировать аневризму в течение 72 часов, повторное кровотечение из незащищенных аневризм и возраст <18 и >80 лет.

После восстановления аневризмы, образцы желудочковой СМЖ из катетера EVD берут ежедневно между днем 0 (день кровоизлияния) и днем 14. СМЖ центрифугируют при 1500 G в течение 15 минут (центрифуга Capricorn CEP 2000 Benchtop, Capricorn labs, UK). Супернатант собирают без дальнейшего разведения для спектрофотометрии.

Спектры в видимом диапазоне жидких супернатантов регистрируют в диапазоне от 350 до 650 нм с разрешением 2 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Shimadzu, Japan). Спектры подвергают деконволюции путем подбора эталонных спектров известных концентраций окси-гемоглобина (Fe²⁺), мет-гемоглобина (Fe³⁺) и билирубина с помощью воплощения Лоусона-Хансона неотрицательного алгоритма наименьших квадратов¹¹ с R статистическим программным обеспечением, версия 4.2.3 (www.r-project.org), как описано ранее12. В образцах с экстинкцией более 2,0 для пика Сорэ деконволюцию ограничивают длинами волн более 435 нм, чтобы компенсировать нелинейность спектрофотометра при высоких поглощениях.

Образцы СМЖ для экспериментов с проволочной миографией определяют как пре-гемолитические (дни 1-3) и гемолитические (дни 4-14). Из-за ограниченных доступных объемов СМЖ в отдельные дни, образцы последовательных дней объединяют, при необходимости.

Проволочная миография

Сосудистые кольца устанавливают на два штифта диаметром 0,2 мм системы Multi-Channel Myograph System 620M ((Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark), погруженные в ванны для органов с контролируемой температурой (37°C) и непрерывной аэрацией (газовая смесь 95% O₂ и 5% CO₂), содержащие 5 мл буфера Кребса-Хенселейта (KHB). Для экспериментов с СМЖ, ванны для органов оборудуют пользовательскими индивидуализированными вкладками, напечатанными на 3D-принтере (объем 2,5 мл), и образцы СМЖ, разведенные 1:1 искусственной СМЖ для уменьшения необходимых объемов образцов пациентов для отдельных экспериментов.

Сосуды постепенно растягивают до оптимального соотношения IC1/IC100, определенного в предыдущих экспериментах. В качестве пре-сокращающего агента используют простагландин F2α (PGF2α) в концентрации 10 мкМ. NO-опосредованные сосудорасширяющие ответы вызывают добавлением MAHMA-NONOate к буферу для погружения. Все данные записывают с использованием программного обеспечения Lab Chart версии 7.2.1 (AD Instruments, Hastings, UK). Если не указано иное, зарегистрированные, вызванные гемоглобином ответы сосудистой реакции нормализованы относительно максимальной NO-дилатации без воздействия Hb (=100%) и уровня тонического сокращения перед добавлением MAHMA-NONOate (=0%), соответственно, во время единственного эксперимента. Поэтому ответы на графиках обозначены как относительное сокращение.

В. Модель вазоспазмов, вызванных oxyHb, у овец

Животные, содержание и уход

Исследование проводят в соответствии с требованиями законодательства Швейцарии по защите и благополучию животных (TschG 455) и оно получило этическое одобрение федеральных ветеринарных властей «Kantonale Tierversuchskommission Zürich» (разрешение № ZH234/17).

Самок овец Swiss alpine (Staffelegghof, Küttigen bei Aarau, Switzerland) в возрасте 2-4 лет переводят в экспериментальное отделение Veterinary Hospital of Zurich и позволяют акклиматизироваться в новых условиях, по меньшей мере, 7 дней. Стандартизованный скрининг с физическим осмотром и анализом крови проводится ветеринаром в период акклиматизации. Перед операцией животных не кормят при свободном доступе к воде в течение 18-24 часов.

Анестезия

За 30 минут до введения анестезии физическое состояние животных повторно проверяет наблюдающий ветеринарный анестезиолог. Затем каждое животное предварительно медикаментозно обрабатывают бупренорфином (0,01 мг/кг массы тела внутримышечно) и медетомидином (0,07-0,1 мг/кг массы тела внутримышечно). Через 20 минут животное, находящееся под воздействием седативных средств, переводят в ангиографический кабинет, где снова клинически оценивают степень седативного эффекта и состояние здоровья.

Внутривенный катетер 14 G, 3,5 дюйма вводят при стерильном прекондиционировании в левую яремную вену и хирургическим путем фиксируют на коже. Состояние анестезии вызывают внутривенным введением фиксированной дозы мидазолама (0,1 мг/кг массы тела), кетамина (3 мг/кг массы тела) и инъекции переменной дозы пропофола (0,3-1,5 мг/кг массы тела) для достижения эффекта.

После этого десенсибилизуют гортань каждого животного с использованием 10% лидокаина, распыляемого непосредственно и под визуальным контролем через ларингоскоп. Через 20-30 секунд, трахеи животных интубируют с использованием силиконовых эндотрахеальных трубок с внутренним диаметром 11 или 12 мм подходящей длины. Затем животных помещают в положении лежа на левом боку на гибкий вакуумный матрас на столе для осмотра ангиографического устройства Allura Clarity.

Их немедленно подключают к коаксиальной кольцевой дыхательной системе подходящего размера, и начинают искусственную вентиляцию легких со скоростью 6-8 вдохов в минуту и 10 мл/кг массы тела дыхательного объема. Изофлуран подают в кислороде в количестве 0,8-2% об. на протяжении всей процедуры. Зонд пульсоксиметра подключают к животному для оценки и обеспечения адекватного статуса оксигенации гемоглобина на протяжении всей процедуры. Вентиляцию регулируют для поддержания нормокапнии, что оценивают капнографией (CO₂ в конце спокойного выдоха) и измерением газов артериальной крови, а также путем расчета артериально-альвеолярной разницы и с использованием уравнения альвеолярного газа Бора и, таким образом, оценивая относительное функционирование вентиляционно-перфузионного баланса. Поддержание нормального и постоянного артериального парциального давления CO₂ (2,5-5,5 кПа) имело решающее значение, поскольку известно, что артериальный CO₂ является главным фактором цереброваскулярной реактивности, особенно в диапазоне 4-9 кПа.

Мочевой катетер (Foley, размер 9) вставляют в мочевой пузырь, чтобы моча могла стекать во время процедуры и для мониторинга выработки мочи с течением времени. Под ультразвуковым контролем ставят внутрисосудистую канюлю 8F в правую наружную сонную артерию в качестве порта для последующего введения внутрисосудистых катетеров. После размещения, 100 МЕ/кг/МТ нефракционированного гепарина вводят внутривенно для обеспечения антикоагуляции. Это повторяют каждые 6 часов на протяжении всей процедуры. Затем животных помещают в положение лежа на груди, согнув их передние лапы под шею, и согнув задние лапы вперед в качестве конечного положения тела, которое сохраняют неизменным на протяжении остальной части процедуры.

Обе ушные артерии канюлируют с использованием катетеров 20G Surflo Terumo® для непрерывного прямого мониторинга артериального давления и отбора проб артериальной крови для периодического анализа газов крови.

Животных оснащают инструментами для непрерывного измерения (компактный монитор признаков жизни Datex-Ohmeda S3) и записи (с помощью портативного компьютера) частоты сердечных сокращений, электрокардиограммы, инвазивного прямого артериального давления, сатурации гемоглобина кислородом, а также концентраций кислорода, углекислого газа и изофлурана на вдохе и выдохе. Животным вводят лактированный раствор Рингера внутривенно на протяжении всей процедуры со стандартной скоростью 3 мл/кг МТ/час, корректируемой при необходимости для поддержания нормального давления (среднее артериальное давление 60-100 мм рт.ст.) и нормального продуцирования мочи в размере 2 мл/кг/ч.

Состояние анестезии поддерживают и, при необходимости, глубину анестезии варьируют путем регулирования концентрации вдыхаемого изофлурана и/или инфузии пропофола с переменной скоростью, вводимого внутривенно с помощью шприцевого насоса (Perfusor®, BBraun; скорость 0,5-2 мг/кг/час).

Кроме того, для уменьшения случаев движения и облегчения искусственного дыхания, периодически вводят рокуроний в дозе 0,5 мкг/кг внутривенно каждые 2 часа или когда клиническая оценка степени расслабления мышц показывает, что последнего недостаточно, на протяжении всей процедуры.

По завершении периода исследования, т.е. когда все запланированные сборы данных прекращены, животных умерщвляют под анестезией путем внутривенного введения пентобарбитала в дозе 150 мг/кг. Смерть подтверждают с помощью присоединенных инструментов для мониторинга, а также трансторакальной аускультации.

Хирургическая модель

Овец под наркозом помещают ничком на вакуумный матрас с жесткой фиксацией головы в пользовательском удерживающем устройстве. После стрижки и дезинфекции кожи, вокруг операционного поля кладут стерильную ткань. Зонд для нейромониторинга (Luciole Medicale AG, Zürich, Switzerland) вводят через правое переднее парамедианное трепанационное отверстие с помощью набора нейрохирургических болтов ((Raumedic, Helmbrechts, Germany). Внешний желудочковый дренаж (EVD) (DePuys Synthes, Oberdorf, Switzerland) вводят во фронтальный рог левого бокового желудочка через трепанационное отверстие диаметром 11 мм. Субзатылочную цистернальную пункцию для высвобождения СМЖ и взятия проб с помощью стандартной спинномозговой иглы 20G (Dalhausen, Köln, Germany) выполняют под рентгеноскопическим контролем. Образцы СМЖ немедленно центрифугируют при 1500 G в течение 15 минут. Супернатант собирают для измерения концентраций Hb и экспериментов с сосудистой функцией. Для контролируемых желудочковых инъекций к EVD подключают шприцевой насос PHD Ultra (Harvard Apparatus, Holliston, USA). Желудочковые инъекции выполняют с максимальной скоростью потока 30 мл/ч. Иллюстрация экспериментальной установки (см. фигуру 2).

Отслеживание

Для всех животных проводят непрерывное отслеживание внутричерепного давления (ВЧД), температуры мозга, частоты сердечных сокращений, артериального давления, сатурации кислорода и CO₂ в конце спокойного выдоха. Кроме того, анализы газов артериальной крови анализируют каждые 30 минут в течение всей экспериментальной процедуры и контролируют диурез.

Цифровая субтракционная ангиография (DSA)

Ангиограммы выполняют в ангиографической установке Allura Clarity (Philips, Hamburg, Germany). Самый большой анастомоз между правой верхнечелюстной артерией и экстрадуральным чудесным сплетением выборочно катетеризируют с помощью ангиографического микрокатетера через артериальный порт в правой сонной артерии. Бипланарные косые боковые и дорсовентральные проекции получают одновременно. Контрастный болюс 11 мл иоверсола 300 мг йода/мл (Optiray 300, Guebert AG, Zurich, Switzerland) вводят инъекцией со скоростью 2 мл/с через микрокатетер с помощью инжектора контрастного вещества высокого давления (Accutron MR, Medtron AG, Saarbrücken, Germany).

Количественная оценка диаметров сосудов по DSA

Ангиографические изображения обрабатывают с помощью ImageJ, и диаметры сосудов измеряют с помощью плагина для ImageJ13. Для каждой овцы сравнивают ангиограммы в моменты времени до введения иСМЖ, до лечения и после лечения (60 минут после инфузии Hb или HbHp). В последовательности изображений одной DSA в указанные моменты времени боковые проекции служат для определения начала венозной фазы путем контрастного изображения притока кортикальных вен к верхнему сагиттальному синусу («венозный Т-знак»). Для каждой временной точки усредняют интенсивность ряда последних трех изображений артериальной фазы. Все измерения сосудов выполняют в дорсовентральных проекциях в ряду, объединяющем усредненную по интенсивности артериальную фазу пред-иСМЖ, ангиограммы до и после лечения (фигура 3). Измерения проводят в следующих четырех сосудах виллизиева круга: передняя мозговая артерия (ACA), средняя мозговая артерия (MCA), цистернальная часть внутренней сонной артерии (ICA) и базилярная артерия (BA). Для каждого сосуда на изображениях пред-иСМЖ выбирают наиболее проксимальный непересекающийся сегмент. В сосудах с анатомически прямым курсом (ACA, ICA и BA) автоматически генерируют пять линейных исследуемых областей (ROI) с интервалами 0,5 мм. Поскольку существует риск ошибок измерения с двигательными артефактами при не перпендикулярном расположении исследуемых областей в криволинейном MCA, три ROI определяют вручную. Для каждой линейной ROI диаметр сосуда определяют с помощью плагина ImageJ13. Пять измерений на ROI усредняют и рассчитывают среднее значение изменения диаметра. Изменения сосуд-специфического среднего диаметра сравнивают между ангиографиями пред-иСМЖ, до лечения и после лечения для каждой овцы и устанавливают в зависимости от способа лечения (Hb по сравнению с Hb:Hp) с использованием теста Mann-Whitney-U и Kruskal-Wallis.

Магнитно-резонансная томография (МРТ)

Магнитно-резонансную томографию in vivo выполняют в клиническом аппарате МРТ 3 Tesla (Philips ingenia, Amsterdam, Netherlands). Осевые и сагиттальные Т2-взвешенные изображения получают для анатомической ориентации и послеоперационного контроля размещения катетера. Динамическое трехмерное изображение с T1-взвешиванием выполняют с высоким временным разрешением в течение 10 минут, охватывающих время инфузии MnHb. Получение динамических 3D, T1-взвешенных изображений продолжают в течение следующих 80 минут с 10 минутными интервалами с высоким пространственным разрешением. Данные DICOM обрабатывают с использованием программного обеспечения HOROS (Nimble Co LLC d/b/a Purview, Annapolis, MD USA) для реконструкции и анализа изображений.

Гемоглобин

Очищенный оксигемоглобин (oxyHb, Fe²⁺) получают из устаревшей крови с помощью тангенциальной проточной фильтрации (TFF), как описано ранее14. Концентрации Hb во всех записях всегда выражены в гем-эквивалентах.

Мечение белков для гистологической визуализации

Для гистологического анализа очищенные белковые растворы (Hb, Hp) метят TCO-NHS-эфиром (Jena Bioscience, Jena, Germany). Сложный эфир TCO-NHS по каплям добавляют к раствору очищенного белка (20 мг/мл в 100 мМ буфере NaHCO₃). После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением 10% 1М Tris-HCl буфера (pH 8,0) с последующим центрифугированием в течение 30 минут при 4000 g для удаления денатурированных белков. Затем избыток реагентов удаляют с помощью одноразовых обессоливающих колонок (PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, Chicago, IL). При необходимости, растворы меченых белков концентрируют с помощью устройств для ультрафильтрации (Amicon Ultra 15, 10 кДа NMWL, Merck Millipore, Billerica, MA). После обработки все белковые растворы стерилизуют фильтрацией через полиэфирсульфоновую мембрану с размером пор 0,22 мкм (фильтры Steriflip, Merck Millipore, Burlington, MA) и хранят при -80°C до использования.

Искусственная СМЖ (иСМЖ)

Конечный состав иСМЖ: 127 мМ NaCl, 1,0 мМ KCl, 1,2 мМ KH₂PO₄, 26 мМ NaHCO₃, 1,3 мМ MgCl₂*6H₂O, 2,4 мМ CaCl₂*2H₂O и 6,7 мМ глюкозы.

Гаптоглобин и комплексы гемоглобин-гаптоглобин

Очищенный гаптоглобин из плазмы человека (преобладающий фенотип 2-2) получают от CSL Behring AG (Bern, Switzerland). Гаптоглобин из плазмы человека, имеющий фенотип 1-1, также получают от CSL Behring AG (Bern, Switzerland). Гаптоглобин из плазмы человека с преобладающим фенотипом 2-2 очищают, как описано ранее в WO 2014/055552 A1. Связывающую способность Hb определяют с помощью ВЭЖХ. После образования комплекса чистоту комплекса и отсутствие свободного Hb проверяют с помощью ВЭЖХ.

Культура перфузионных клеток для получения рекомбинантного гаптоглобина 1-1

Процесс культивирования клеток состоит из размораживания флаконов, размножения клеток, инокуляции перфузионного реактора, фазы размножения клеток в реакторе, за которой следует фаза продуцирования.

Супернатант клеточной культуры непрерывно отбирают из реактора во время фазы продуцирования в качестве перфузионного сбора через сепаратор клеток и заменяют свежей средой. Перфузионный сбор проводят во время работы реактора. Каждый из перфузионных сборов подвергают дальнейшей промежуточной обработке.

Клон клетки СНО, экспрессирующий фенотип 1 гаптоглобина человека дикого типа, включающий метку HIS, размораживают и культивируют в системе посевных ферментеров, начиная с колбы Т80 (37°C, 5% CO2) и продлевая культивирование до трех 2-литровых встряхиваемых колб. (Параметры: 37°C, 120 об/мин, 80% влажность, 5% CO2). В 20 л стеклянный сосуд системы Sartorius DCU, оборудованный 50 л устройством BioSep, инокулируют 3 л системы посевных ферментеров. Вплоть до трех суток проводят периодическое культивирование, после чего перфузию начинают с VVD (обмен объема сосудов в день) 1.0. Каждый второй день делают сбор примерно 40 л, и остатки разложения клеток отделяют с помощью Pall® Kleenpak™ Nova NP7 Filter Capsule 0,2 мкм внутри линии сбора. Концентрацию клеток (примерно 40х10⁵ клеток/мл) во время ферментации корректируют так, чтобы поддерживать минимальную концентрацию глутамина 2 мМ. (Параметры ферментации: 37°C, pH 7,0, 30% pO2, 150 об/мин, VVD 1,0). Среду, используемую во время всего процесса, модифицируют ProCHO5 с 8 мМ L-Gln, 0,25% Pluro (Fa. Lonza). Всего получают 22 сбора (примерно 900 л).

Очистка rHaptoglobin1-1-His (rHp1-1)

Бесклеточный сбор концентрируют в 30 раз с использованием TFF системы (Pall Centramate 500 S, Pall Corporation, New York, USA) с отделяющей мембраной 30 кДа. Концентрат рГаптоглобина 1-1-HIS загружают в течение ночи на колонку NiSepharose excel (GE Healthcare 17-3712-02), предварительно уравновешенную 20 мМ фосфатом натрия+500 ммоль/л NaCl, pH 7,4. После промывания колонки уравновешивающим буфером, rHaptoglobin1-1-His элюируют элюирующим буфером (20 мМ фосфат натрия+500 ммоль/л NaCl+150 ммоль/л имидазол, pH 7,4). Элюат концентрируют в 10 раз, используя систему TFF (Pall) с отделяющей мембраной 30 кДа. Для отделения rГаптоглобина1-1-His от нежелательных примесей материал загружают в колонку Superdex 200 pg (GE Healthcare, Munich, Germany), предварительно уравновешенную PBS pH 7,4, и фракции пиков, содержащие rгаптоглобин1-1-His, объединяют и снова концентрируют с использованием перемешиваемой Ultrafiltration Cell (Model 402) с мембраной UF-PES-20 (Fa. Hoechst # FP08085) до конечной концентрации примерно 40 мг/мл rГаптоглобина 1-1-HIS.

Hn-Hb и комплексы Mn-Hb:Hp

Mn (III) Хлорид протопорфирина IX (MnPP) вставляют в пустой «гем-карман» тетрамерного апогемоглобина или комплексов апогемоглобин:гаптоглобин в щелочных условиях (NaOH 100 мМ). Затем буфер заменяют солевым раствором. Соединения сразу же хранят при 4°C или хранят в растворе антифриза (пропиленгликоль, глицерин, PBS 0,1M и ddH₂O в соотношении 1:1:1:1) при -20°C до дальнейшей обработки.

C. Гистологическое окрашивание и визуализация

После эвтаназии овец, перед забором головного мозга пространство СМЖ промывают 10 мл 4% PFA через EVD со скоростью инфузии 30 мл/ч. Весь мозг разрезают на коронарные срезы толщиной 1 см и фиксируют в 4% PFA при 4°C в течение ночи. Затем срезы обрезают до подходящего размера для дальнейшей обработки, заливают 4% агарозой в PBS и разрезают на плавающие срезы размером 120 мкм с использованием вибратома (микротом с вибрирующими лезвиями Leica VT1000 S, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany). Срезы обрабатывают. На первой стадии плавающие срезы предварительно кондиционируют в буфере для пермеабилизации (2% BSA с 0,5% Triton-X-100 в PBS) в течение 4 часов при комнатной температуре с последующей инкубацией в 2 мл блокирующего буфера (2% BSA в PBS), содержащего 40 нМ Tetrazine-Cy5 (Jena Bioscience, Jena, Germany) и FITC-связанное моноклональное антитело против α-актина гладких мышц (1:10'000, клон 1A4, Sigma) при 4°C в течение ночи. Затем ядра окрашивают Hoechst 33342 (разведение 1:2'000, Invitrogen, Carlsbad, CA) в течение 40 минут при комнатной температуре. После трехкратной промывки PBS в течение 15 минут срезы закрепляют с помощью FluoroSafe (Merck Millipore, Burlington, MA).

Сканы целых слайдов гистологических срезов получают путем сшивания отдельных изображений с 10х увеличением, полученных с помощью микроскопа Zeiss Observer.Z1, соединенного с Colibri.2, системой ApoTome.2 и моторизованным столиком (Carl Zeiss AG, Feldbach, Switzerland). Изображения с увеличением 63x получают с использованием конфокального микроскопа Leica SP8 (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland).

D. Измерения ВЭЖХ

Для качественной и количественной эксклюзионной хроматографии (ВЭЖХ) образцы, содержащие Hb и/Hp, разделяют на аналитической колонке для ЖХ BioSep-SEC-s3000 (600х7,8 мм), соединенной с колонкой BioSep-SEC-s3000 (75х7,8 мм) Guard (Phenomenex, Torrance, CA), и прикрепленной к насосу для ВЭЖХ LKB 2150 (LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden) и интеллектуальному детектору УФ/ВИЗ Jasco UV-970 (JASCO International Co., Ltd., Tokyo, Japan). В качестве подвижной фазы используют 20 мМ фосфата калия, pH 6,8. Поглощение измеряют при 414 нм и регистрируют с использованием программного обеспечения Lab Chart версии 7.2.1 (AD Instruments, Hastings, UK). Кривые ВЭЖХ анализируют и визуализируют с помощью R статистического программного обеспечения версии 4.2.3 (www.r-project.org).

Результаты

А. Гаптоглобин восстанавливает NO-опосредованную вазодилатацию в базилярных артериях свиней, подвергшихся воздействию Hb ex vivo

Бесклеточный гемоглобин, добавленный к буферу Кребса-Хенселейта в концентрации 10 мкМ, полностью подавляет индуцированную NO вазодилатацию в экспериментах с проволочной миографией (фигура 4А). Добавление эквимолярного Hp в значительной степени восстанавливает NO-ответ после 20-минутного инкубационного периода (фигура 4B). Hp также восстанавливает сосудорасширяющий ответ на экзогенный NO в той степени, в какой это наблюдается с образцами СМЖ, взятыми у тех же пациентов через 2 дня после кровотечения, до возникновения эритролиза (фигура 6). В экспериментах с сосудистой функцией не наблюдают значительной разницы в восстановлении NO-ответа между Hp 2-2, полученным из плазмы, и рекомбинантным (фигура 18) или полученным из плазмы (фигура 19) Hp 1-1.

B. Бесклеточный Hb является основным нарушителем передачи сигналов артериального оксида азота в спинномозговой жидкости пациентов с aSAH.

Ранним клиническим признаком DIND является возникновение вазоспазмов в артериях головного мозга. Реакции бесклеточного oxyHb(Fe²⁺O₂)/deoxyHb (Fe²⁺) с сосудорасширяющим оксидом азота (NO) может сдвинуть баланс в сторону сосудосуживающих сил. Чтобы исследовать этот механизм дерегуляции, NO-опосредованные вазодилататорные ответы базилярных артерий свиней, которые были погружены в образцы СМЖ человека, количественно оценивают ex vivo. В СМЖ пациента с DIND, содержащей высокий уровень бесклеточного Hb, ожидаемый дилататорный ответ на введение короткоживущего NO-донора (MAHMA-NONOate) подавляется (фигура 5). Однако, когда бесклеточный Hb выборочно удален из СМЖ с помощью Hp-аффинной колонки, физиологический вазодилататорный ответ восстанавливается. Анализ LC-MSMS СМЖ пациента до и после удаления Hb показал, что основная часть белкового состава в эритролитической СМЖ осталась неизменной. Этот эксперимент идентифицирует бесклеточный Hb как основного нарушителя артериальной передачи сигналов NO в спинномозговой жидкости пациентов с aSAH.

C. Hb и Hb:Hp, введенный в боковой желудочек, быстро распределяется в субарахноидальном пространстве in vivo.

В динамической 3D МРТ показано, что комплексы MnHb и MnHb:Hp, введенные в боковой желудочек, быстро распределяются по физиологическим внутренним путям СМЖ через третий желудочек, проток и четвертый желудочек (n=5) (фигура 7). В течение нескольких минут высокий сигнал MnHb может быть обнаружен в базальных цистернах, погружающих большие мозговые артерии задней черепной ямки у всех животных (фигура 8). Дальнейшее распространение на среднюю и переднюю ямки головного мозга по Уиллисову кругу наблюдают в течение 20 минут после инъекции. Как и ожидалось, никакой разницы между распределением Hb и Hb:Hp комплексов в компартменте СМЖ обнаружить не удалось.

D. Гаптоглобин отделяет Hb в компартменте СМЖ и снижает проникновение в стенки сосудов головного мозга и паренхиму головного мозга.

Гистологический анализ показал проникновение TCO-меченного гемоглобина из СМЖ в интерстициальное пространство мозга через эпендимальный барьер желудочковой системы, тогда как совместная инфузия Hp резко уменьшила это распространение (фигура 8). Кроме того, сильное интерстициальное проникновение Hb также наблюдается из субарахноидального пространства через ограничители глии на поверхности мозга (фигура 9А). Напротив, комплексы Hb:Hp в основном ограничены периваскулярными пространствами, заполненными СМЖ (пространства Вирхова-Робина) проникающих кортикальных сосудов (фигура 9В).

В системном кровотоке, ограниченные по размеру барьеры предотвращают делокализацию большого комплекса Hb-Hp в уязвимые ткани, такие как почки, миокард или сосудистая стенка резистентных артерий. Чтобы передать эту общую концепцию защиты Hp в мозг, комплексы TCO-Hb или TCO-Hb-Hp вводят инфузией в СМЖ овец. Гемопротеины, меченные транс-циклооктеном (TCO), визуализируют в фиксированных формалином срезах ткани с помощью флуоресцентной микроскопии при очень высоком отношении сигнал/шум после реакции клик-химии с тетразин-конъюгированным флуорохромом. Флуоресцентные сканы срезов головного мозга овцы в двух разных положениях переднего и среднего мозга демонстрирует, что в течение 2 часов бесклеточный Hb делокализуется из внутреннего и внешнего пространств СМЖ в паренхиму головного мозга, проявляясь как ободок флуоресцентного сигнала вдоль внутренних и внешних поверхностях раздела СМЖ-мозг. Этот шаблон делокализации отсутствует в образцах овец, которым вводили комплексы TCO-Hb-Hp.

Для иллюстрации распределения комплекса Hb-Hp, на фигурах 8 и 9 выбирают участок переднего мозга, в котором кончик катетера EVD слегка входит в паренхиму головного мозга. В этом месте небольшое количество TCO-Hb-Hp вводят непосредственно в ткань мозга, что служит положительным контролем для процедуры окрашивания и визуализации. Помимо этого, единственный отчетливый сигнал Hb-Hp можно распознать рядом с небольшими артериями, проникающими с пиальных поверхностей в мозг. Перед умерщвлением овцы собирают СМЖ из субарахноидального пространства для анализа SEC и SDS-page. Несмотря на отсутствие сигнала Hb-Hp в срезах мозга, большой комплекс Hb-Hp идентифицируют в СМЖ, состоящем из лестницы полимеров Hp типа 2-2, которые интенсивно флуоресцируют после TCO-реакции с Cy5-тетразином. В совокупности эти данные подтверждают, что комплекс Hb-Hp остается отделенным в пространстве СМЖ. Для конфокальной микроскопии сосудистых структур, срезы головного мозга овец от животных, которым вливали TCO-Hb или TCO-Hb-Hp, окрашивают на гладкомышечные клетки сосудов (αSMA) и на синоптические нервные окончания астроцитов, положительных по аквапорину-4 (AQP4).

На фигуре 10 показаны конфокальные изображения нескольких небольших артерий разного калибра в перивентрикулярной области среднего мозга овцы, которым вводили TCO-меченные Hb или Hb-Hp комплексы, соответственно. Изображения подтверждают, что комплекс Hb-Hp остается отделенным при высокой концентрации в периваскулярном пространстве, заполненном СМЖ (пространство Вирхова-Робина) проникающих артерий. Это пространство очерчено внешним слоем артерии (т.е. адвентицией) с одной стороны и синоптическими нервными окончаниями астроцитов с другой стороны (т.е. пограничной глиальной мембраной). В отсутствие Hp, бесклеточный Hb делокализован через барьер астроцитов в ткань мозга и дополнительно в слой гладких мышц сосудов, достигая субэндотелиального пространства. Это наблюдение может объяснить, почему бесклеточный Hb, но не большой комплекс Hb-Hp, прерывает вазодилататорную передачу сигналов NO в церебральных артериях и тем самым вызывает вазоспазм.

E. Бесклеточный гемоглобин в субарахноидальном пространстве вызывает острый вазоспазм in vivo, который можно предотвратить совместной инфузией гаптоглобина.

Бесклеточный Hb в субарахноидальном пространстве вызывает острый ангиографический вазоспазм у 100% животных (4/4). Вазоспазмы воспроизводимо локализуются в артериях задней и передней черепных ямок (базилярной артерии, мозжечковых артериях, передней мозговой артерии) через 60 минут после желудочковой инъекции Hb (фигуры 11A и 12B). Однако спазмы сосудов также могут быть обнаружены в медиальной черепной ямке (медиальной мозговой артерии, внутренней сонной артерии) с более высокими индивидуальными вариациями (фигура 12). Совместная инфузия Hp полностью предотвращает индукцию сегментарных артериальных вазоспазмов (фигура 11В). Одно животное с совместной инфузией Hb:Hp показало меньшие диаметры сосудов на всех проанализированных сосудистых территориях, без сегментарных паттернов вазоспазмов, наблюдаемых у животных, которым вливали Hb (данные не показаны). Полуавтоматическую количественную оценку диаметра сосудов выполняют на DSA изображениях четырех предварительно определенных областей мозговой артерии, чтобы объективировать визуальное впечатление от вазоспазмов. Значительное сужение базилярной артерии (BA) наблюдают в передней (ACA) и средней (MCA) церебральных артериях, а также в цистернальной внутренней сонной артерии (ICA) при инфузии Hb по сравнению с животными, получавшими Hb:Hp (фигура 13А). Сосудистое сокращение, вызванное Hb, стало еще более очевидным при объединенном анализе всех артериальных сегментов (фигура 13B). Значительное изменение диаметра артерий не наблюдается ни после инфузии Hb-Hp, ни после инфузии равного объема искусственной СМЖ, которое проводят в качестве общей контрольной процедуры во время начальной фазы каждого эксперимента (фигура 13C).

F. Последовательное введение Hp после инфузии Hb in vivo приводит к полному комплексообразованию Hb в СМЖ.

Последовательно вводимый Hp быстро и полностью связывает свободный Hb, диспергированный в субарахноидальном пространстве in vivo. Уже через 10 минут после введения Hp в желудочковую систему несвязанный Hb не обнаруживается в образцах СМЖ, собранных под затылком (фигура 14).

Вазоконстрикторный эффект СМЖ овцы, собранной в момент ангиографического вазоспазма in vivo, может быть нейтрализован Hp в экспериментах по сосудистой функции ex vivo.

G. Сосудосуживающий эффект СМЖ овцы, собранной в момент ангиографического вазоспазма in vivo, может быть нейтрализован Hp в экспериментах по сосудистой функции ex vivo.

Выделенные базилярные артерии, подвергнутые воздействию СМЖ овцы, собранной перед инъекцией Hb, показывают аналогичные дилататорные ответы на NO-подобные сосуды в иСМЖ. После воздействия на геморрагическую СМЖ, собранную во время ангиографического вазоспазма, ответ NO был значительно снижен. Обработка ex vivo путем добавления эквимолярного Hp (скорректированного на индивидуальную концентрацию Hb в образцах СМЖ) в значительной степени восстанавливает чувствительность к NO. Воздействие на СМЖ, собранную через 60 минут после инфузии комплексов Hb:Hp, не нарушает NO-индуцированную вазодилатацию (фигура 15).

H. Внеклеточный гемоглобин является основным нарушителем передачи сигналов артериального оксида азота в СМЖ у пациентов с aSAH.

Количественный анализ протеом LC-MSMS выполняют на последовательных образцах СМЖ от пациентов с aSAH, которые собирают из катетера внешнего желудочкового дренажа (EVD) между 2 и 13 днями после кровоизлияния. Классифицируют все белки, которые были идентифицированы по меньшей мере, с двумя уникальными пептидами с помощью кластерного анализа k-средних логарифмически преобразованных нормализованных соотношений интенсивности ионов (день x/день 2) (фигура 16). Категория 3 включает белки, которые остаются неизменными с течением времени. Категория 2 включает белки, количество которых со временем увеличивается. Категория 2 состоит почти исключительно из компонентов эритроцитов (RBC), а именно из ферментов Hb и RBC, что свидетельствует о замедленном эритролитическом процессе, который происходит в субарахноидальном пространстве после aSAH. В категории 2, Hp широко распространен в исходных образцах, но было обнаружено, что со временем он истощается, оставляя подавляющую часть бесклеточного Hb. Категория 1 включает белки, количество которых со временем уменьшается и в основном состоит из белков плазмы.

I. Гистоморфометрический анализ артериол сосудистой выстилки четвертого желудочка.

Чтобы связать наблюдаемое периваскулярное воздействие Hb на небольшие паренхимальные сосуды (диапазон диаметров 50-100 мкм) с функциональными показателями крупных церебральных артерий в наших исследованиях, проведен гистоморфометрический анализ. Для этого окрашивают срезы головного мозга овцы размером 120 мкм через четвертый желудочек на предмет выявления гладкомышечных клеток (фигура 17A). Конфокальные изображения малых сосудов, положительных по альфа-гладкомышечному актину (αSMA) в сосудистой выстилке получены заслепленным исследователем для разных обработок (n=3 овцы на группу, всего 25 изображений обработанных Hb овец, 32 изображения для обработанных Hb-гаптоглобином овец). Для этого анализа выбрана перивентрикулярная область, чтобы гарантировать наилучшую возможную структурную сохранность из-за того, что на нее очень быстро воздействует фиксатор, введенный малыми дозами внутрижелудочково. Для каждого сосуда, просвет и общая площадь поперечного сечения определяют количественно на основе внутренней и внешней окружности αSMA-положительных структур, которые вручную определены тремя заслепленными исследователями (фигура 17В). В то время как сосуды с сокращенным внешним видом были в изобилии у всех животных с влитым Hb, ни одного не было обнаружено у животных с введенным Hb-гаптоглобином (фигура 17C). Фигуры 17D и 17E показывают количественный анализ площадей люминальной фракции всех проанализированных сосудов, а также среднее значение на овцу. В обоих способах анализа различия были статистически значимыми при меньших площадях просвета Hb по сравнению с животными, получавшими Hb-гаптоглобин.

Резюме и заключение

У пациентов с aSAH неврологический дефицит вследствие отсроченной ишемии (DIND) возникает в основном между 4 и 14 днями постгеморрагии. Этот временной профиль коррелирует с высвобождением oxyHb из лизирующих эритроцитов в субарахноидальный компартмент с пиками oxyHb в СМЖ между 4 и 14 днями. В небольшом обзорном клиническом исследовании наблюдается значительная разница между кумулятивными уровнями oxyHb в СМЖ у пациентов с aSAH с и без развития DIND. Вторичное неврологическое ухудшение является основным фактором неблагоприятного исхода, и предотвращение DIND может изменить правила игры в лечении пациентов с aSAH.

В этом исследовании созданы модели ex vivo и in vivo для изучения эффекта поглощения NO через бесклеточный Hb на церебральные артерии и возможности гаптоглобина предотвращать или иным образом снижать эту токсичность. Концепция внутристеночного истощения NO и последовательной вазоконстрикции за счет бесклеточного oxyHb подтверждают ex vivo в выделенных базилярных артериях свиней. Обработка артерий, подвергшихся воздействию Hb, гаптоглобином полностью восстанавливает индуцированную NO вазодилатацию. Кроме того, на той же модели продемонстрирован NO-зависимый вазоактивный эффект геморрагической СМЖ, полученной от пациентов с aSAH. Несмотря на многочисленные известные вазоактивные молекулы в геморрагической СМЖ, удаление oxyHb путем обработки гаптоглобином восстанавливает сосудорасширяющий ответ на NO в выделенных церебральных артериях до физиологического уровня. Не наблюдают разницы в эффективности восстановления сосудорасширяющего NO-ответа между Hp 2-2 и Hp 1-1 (рекомбинантным или полученным из плазмы).

Для подтверждения наблюдаемых эффектов in vivo создана высокотрансляционная модель на крупных животных. Инъекция бесклеточного oxyHb в компартмент СМЖ у овец индуцирует воспроизводимые ангиографические вазоспазмы у всех животных. Что еще более важно с профилактической точки зрения, образование комплекса oxyHb с гаптоглобином устраняет эту вазореактивность in vivo. Кроме того, концепция терапевтического введения гаптоглобина для восстановления NO-индуцированной вазодилатации продемонстрирована ex vivo в артериях, подвергшихся воздействию геморрагической СМЖ, собранной у животных с ангиографическим вазоспазмом. Эти результаты убедительно подтверждают целесообразность терапевтического введения гаптоглобина пациентам с aSAH для профилактики вмешательства бесклеточного oxyHb в СМЖ с цереброваскулярной передачей NO-сигналов, чтобы снизить частоту неблагоприятных вторичных неврологических исходов, включая церебральный вазоспазм и DIND.

Для изучения распределения бесклеточного oxyHb, введенного в компартмент СМЖ, разработано несколько новых способов мечения для визуализации in vivo и ex vivo . С помощью динамической МРТ подтверждают быструю, макроскопически идентичную дисперсию Hb и Hb:Hp комплексов в субарахноидальном пространстве после инъекции в желудочковую систему. Гистологический анализ выявил обширное проникновение Hb из СМЖ в интерстициальное пространство головного мозга, тогда как комплексы Hb:Hp в основном ограничены субарахноидальным пространством. Эти неожиданные результаты убедительно свидетельствуют о том, что компартментализация бесклеточного гемоглобина в пространствах СМЖ посредством образования комплекса с гаптоглобином способствует, по меньшей мере, частично, предотвращению токсических эффектов бесклеточного Hb на сосудистую сеть головного мозга и паренхиму головного мозга, тем самым подчеркивая интратекальный эффект введения гаптоглобина в качестве терапевтического подхода для достижения достаточной способности поглощать гемоглобин в СМЖ пациентов с aSAH.

Терапевтический потенциал лечения гаптоглобином может не ограничиваться пациентами с aSAH, с учетом того, что все типы спонтанных или травматических внутричерепных кровоизлияний сопровождаются внесосудистым эритролизом и высвобождением бесклеточного Hb в СМЖ и/или интерстициальное пространство мозга. Следовательно, успешный терапевтический подход к удалению бесклеточного внутричерепного гемоглобина имеет огромное потенциальное влияние на большую популяцию неврологических пациентов.

Ссылки

1. Rincon F, Rossenwasser RH, Dumont A. The epidemiology of admissions of nontraumatic subarachnoid hemorrhage in the United States. Neurosurgery. 2013;73:217-22; discussion 212-3.

2. Hughes JD, Bond KM, Mekary RA, Dewan MC, Rattani A, Baticulon R, et al. Estimating the Global Incidence of Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage: A Systematic Review for Central Nervous System Vascular Lesions and Meta-Analysis of Ruptured Aneurysms. World Neurosurg. 2018;115:430-447.e7.

3. Nieuwkamp DJ, Setz LE, Algra A, Linn FHH, de Rooij NK, Rinkel GJE. Changes in case fatality of aneurysmal subarachnoid haemorrhage over time, according to age, sex, and region: a meta-analysis. Lancet Neurol. 2009;8:635-642.

4. Taufique Z, May T, Meyers E, Falo C, Mayer SA, Agarwal S, et al. Predictors of Poor Quality of Life 1 Year After Subarachnoid Hemorrhage. Neurosurgery. 2016;78:256-264.

5. Buchanan KM, Elias LJ, Goplen GB. Differing perspectives on outcome after subarachnoid hemorrhage: the patient, the relative, the neurosurgeon. Neurosurgery. 2000;46:831-8; discussion 838-40.

6. Morris PG, Wilson JTL, Dunn L. Anxiety and depression after spontaneous subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 2004;54:47-52; discussion 52-4.

7. Loch Macdonald R. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nat. Rev. Neurol. 2013;10:44-58.

8. Pluta RM, Afshar JK, Boock RJ, Oldfield EH. Temporal changes in perivascular concentrations of oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, and methemoglobin after subarachnoid hemorrhage. J. Neurosurg. 1998;88:557-561.

9. Willenborg DO, Staykova M, Fordham S, O’Brien N, Linares D. The contribution of nitric oxide and interferon gamma to the regulation of the neuro-inflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 2007;191:16-25.

10. Guzik TJ, Korbut R, Adamek-Guzik T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J. Physiol. Pharmacol. 2003;54:469-487.

11. Lawson CL, Hanson RJ. Solving least squares problems. SIAM; 1995.

12. Lipiski M, Deuel JW, Baek JH, Engelsberger WR, Buehler PW, Schaer DJ. Human Hp1-1 and Hp2-2 phenotype-specific haptoglobin therapeutics are both effective in vitro and in guinea pigs to attenuate hemoglobin toxicity. Antioxid. Redox Signal. 2013;19:1619-1633.

13. Fischer MJM, Uchida S, Messlinger K. Measurement of meningeal blood vessel diameter in vivo with a plug-in for ImageJ. Microvasc. Res. 2010;80:258-266.

14. Elmer J, Harris DR, Sun G, Palmer AF. Purification of hemoglobin by tangential flow filtration with diafiltration. Biotechnol. Prog. 2009;25:1402-1410.

15. Dumont AS, Dumont RJ, Chow MM, Lin CL, Calisaneller T, Ley KF, Kassell NF, Lee KS. Chapter Two: Cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage: putative role of inflammation. Neurosurgery 2003.

Claims

1. Применение гаптоглобина для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода у субъекта после геморрагического инсульта, сопровождающегося внесосудистым эритролизом и высвобождением бесклеточного гемоглобина в спинномозговую жидкость (СМЖ), включающее воздействие на СМЖ субъекта, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества гаптоглобина и в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить гаптоглобину образовать комплекс с бесклеточным гемоглобином и тем самым нейтрализовать его.

2. Применение по п. 1, где геморрагическим инсультом является спонтанное кровоизлияние или травматическое кровоизлияние, предпочтительно внутрижелудочковое или субарахноидальное спонтанное или травматическое кровоизлияние, более предпочтительно аневризматическое субарахноидальное кровоизлияние.

3. Применение по п. 1 или 2, где неблагоприятный вторичный неврологический исход выбран из группы, состоящей из неврологического дефицита вследствие отсроченной ишемии (DIND), отсроченной ишемии головного мозга (DCI), нейротоксичности, воспаления, истощения оксида азота, окислительного повреждения тканей, церебрального вазоспазма, церебральной вазореактивности и отека, предпочтительно церебрального вазоспазма, неврологического дефицита вследствие отсроченной ишемии или отсроченной ишемии головного мозга.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где неблагоприятным вторичным неврологическим исходом является неблагоприятный вторичный неврологический исход в паренхиме мозга.

5. Применение по любому из пп. 1-4, включающее воздействие гаптоглобина или его функционального аналога на СМЖ в течение 21 дня после начала кровоизлияния, предпочтительно от 2 дней до 4 дней после начала кровоизлияния, или от 5 дней до 14 дней после начала кровоизлияния.

6. Применение по любому из пп. 1-5, включающее внутричерепное, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение гаптоглобина субъекту, предпочтительно интратекальное введение в позвоночный канал или в субарахноидальное пространство.

7. Применение по любому из пп. 1-6, где период времени, в течение которого СМЖ подвергается воздействию терапевтически эффективного количества гаптоглобина, составляет по меньшей мере, 2 минуты, предпочтительно от 2 минут до 45 минут, от 2 минут до 20 минут или от 4 минут до 10 минут.

8. Применение по любому из пп. 1-7, где терапевтически эффективное количество гаптоглобина составляет, по меньшей мере, эквимолярное количество по отношению к концентрации бесклеточного гемоглобина в СМЖ субъекта после кровоизлияния, необязательно дополнительно включающее (i) получение образца СМЖ от субъекта после кровоизлияния и до воздействия гаптоглобина на СМЖ; (ii) измерение количества бесклеточного гемоглобина в образце СМЖ, полученном на стадии (i); и (iii) определение, по меньшей мере, эквимолярного количества гаптоглобина на основе концентрации бесклеточного гемоглобина со стадии (ii).

9. Применение по любому из пп. 1-8, где терапевтически эффективное количество гаптоглобина составляет от 2 мкМ до 20 мМ, предпочтительно от 2 мкМ до 300 мкМ, от 5 мкМ до 50 мкМ, или от 10 мкМ до 30 мкМ.

10. Применение по любому из пп. 1-9, дополнительно включающее удаление комплексов гаптоглобин:бесклеточный гемоглобин, образованных в СМЖ.

11. Применение по любому из пп. 1-10, включающее экстракорпоральное воздействие на СМЖ терапевтически эффективного количества гаптоглобина.

12. Применение по п. 11, включающее:

(ii) добавление к образцу СМЖ стадии (i) гаптоглобина для получения образца СМЖ, обогащенного гаптоглобином;

(iii) введение образца СМЖ, обогащенного гаптоглобином, субъекту, тем самым подвергая компартмент СМЖ субъекта воздействию терапевтически эффективного количества гаптоглобина в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить гаптоглобину образовать комплекс с бесклеточным гемоглобином в компартменте СМЖ субъекта; и

(iv) необязательно, повторение стадий с (i) по (iii), или

(i) удаление объема СМЖ из компартмента СМЖ субъекта после кровоизлияния;

(ii) создание искусственной СМЖ, содержащей гаптоглобин;

(iii) введение субъекту искусственной СМЖ со стадии (ii), тем самым подвергая компартмент СМЖ субъекта воздействию терапевтически эффективного количества гаптоглобина в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить гаптоглобину образовать комплекс с бесклеточным гемоглобином в компартменте СМЖ субъекта; и

(ii) воздействие гаптоглобина на СМЖ со стадии (i) в условиях, позволяющих гаптоглобину или его функциональному аналогу образовывать комплекс с бесклеточным гемоглобином в СМЖ;

(iii) извлечение комплексов гаптоглобин:бесклеточный гемоглобин из СМЖ после стадии (ii) для получения СМЖ с пониженным содержанием гемоглобина, которая имеет меньшее количество бесклеточного гемоглобина по сравнению с СМЖ из стадии (i);

(iv) необязательно, повторение стадий (ii) и (iii) с получением СМЖ с пониженным содержанием гемоглобина, которая по существу не содержит бесклеточный гемоглобин; и

(v) введение СМЖ с пониженным содержанием гемоглобина, полученной на стадии (iii) или стадии (iv), в компартмент СМЖ субъекта.

13. Применение по любому из пп. 1-12, включающее:

(ii) промывание компартмента СМЖ субъекта после стадии

(i) промывочным раствором, содержащим терапевтически эффективное количество гаптоглобина;

(iii) необязательно, повторение стадии (ii); и

14. Применение по любому из пп. 1-13, где гаптоглобин выбран из группы, состоящей из гаптоглобин1-1 гомодимера, гаптоглобин1-2 мультимера, гаптоглобин2-2 мультимера и комбинации любых из вышеперечисленных, предпочтительно гаптоглобин2-2 мультимера.

15. Применение по любому из пп. 1-14, дополнительно включающее введение субъекту второго агента для лечения или профилактики неблагоприятного вторичного неврологического исхода после внутрижелудочкового кровоизлияния, предпочтительно сосудорасширяющего средства, более предпочтительно выбранного из группы, состоящей из сиднона и нитропруссида натрия.