RU2466141C2 - МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ - Google Patents
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2466141C2 RU2466141C2 RU2008132760/10A RU2008132760A RU2466141C2 RU 2466141 C2 RU2466141 C2 RU 2466141C2 RU 2008132760/10 A RU2008132760/10 A RU 2008132760/10A RU 2008132760 A RU2008132760 A RU 2008132760A RU 2466141 C2 RU2466141 C2 RU 2466141C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- albumin
- factor
- viia
- polypeptide
- factor vii
- Prior art date
Links
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 title claims description 180
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims abstract description 215
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims abstract description 214
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims abstract description 214
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 181
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 152
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 152
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 136
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 135
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims description 178
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 53
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 30
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 26
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 19
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 claims description 15
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 14
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims description 14
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 14
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 11
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 9
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 claims description 4
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 208000031879 Chédiak-Higashi syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010067787 Coagulation factor deficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013607 Glanzmann thrombasthenia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000005624 HELLP Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010062506 Heparin-induced thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 3
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 3
- 208000028622 Immune thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004078 Snake Bites Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000392 Thrombasthenia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007023 Thrombotic Thrombocytopenic Purpura Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000839 Vitamin K Deficiency Bleeding Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047634 Vitamin K deficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013633 acquired hemophilia Diseases 0.000 claims description 3
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 3
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 claims description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 3
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 3
- 208000016794 vitamin K deficiency hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims description 3
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 241001672981 Purpura Species 0.000 claims description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 claims description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 2
- 206010060906 Dilutional coagulopathy Diseases 0.000 claims 1
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 claims 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- IFIBPUCZKDHEQL-DKWTVANSSA-N (2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound OCC(O)CO.OC[C@H](N)C(O)=O IFIBPUCZKDHEQL-DKWTVANSSA-N 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 16
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 10
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 10
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 10
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 10
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 10
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 10
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 7
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 7
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 6
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 6
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 6
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 6
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 5
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 4
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 4
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 4
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 4
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 3
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- -1 factor 1Xa Proteins 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001593 Bernard-Soulier syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 208000028702 Congenital thrombocyte disease Diseases 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 2
- 102100028466 Frizzled-8 Human genes 0.000 description 2
- 101710140933 Frizzled-8 Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 2
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 2
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- YUXKOWPNKJSTPQ-AXWWPMSFSA-N (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O.C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O YUXKOWPNKJSTPQ-AXWWPMSFSA-N 0.000 description 1
- BMGWZHWESYHXHC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methylpentanoic acid;2-amino-4-methylpentanoic acid Chemical compound CCC(C)C(N)C(O)=O.CC(C)CC(N)C(O)=O BMGWZHWESYHXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010006835 Atrial Natriuretic Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108700041152 Endoplasmic Reticulum Chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- 102100021451 Endoplasmic reticulum chaperone BiP Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150112743 HSPA5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 201000004331 Henoch-Schoenlein purpura Diseases 0.000 description 1
- 206010019617 Henoch-Schonlein purpura Diseases 0.000 description 1
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101001035951 Homo sapiens Hyaluronan-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102100039238 Hyaluronan-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031814 IgA Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100111629 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) KAR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028578 grp78 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000027700 hepatic dysfunction Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 208000015446 immunoglobulin a vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
- A61K38/385—Serum albumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa), и может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают полипептид, представляющий собой полипептид FVII или FVIIa, слитый с альбумином через глицин-сериновый пептидный линкер особой конструкции, отделяющий часть, относящуюся к FVII или FVIIa, от альбуминовой части, при этом полипептид FVII или FVIIa расположен на N-конце слитого белка. Слитый полипептид или векторную конструкцию, содержащую кодирующую его нуклеиновую кислоту, используют в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения нарушений свертываемости крови. Изобретение позволяет получить белок с биологической активностью FVII или FVIIa и увеличенным функциональным временем полужизни в плазме in vivo по сравнению с неслитыми FVII или FVIIa. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 6 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa). Более конкретно, изобретение относится к последовательностям кДНК, кодирующим человеческие фактор VII, фактор VIIa и производные, генетически слитые с кДНК, кодирующими человеческий сывороточный альбумин, который может быть связан через олигонуклеотиды, которые кодируют промежуточные пептидные линкеры, где подобные кодированные производные демонстрируют улучшенную стабильность и удлиненное функциональное время полужизни в плазме, к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим такие последовательности кДНК, клеткам-хозяевам, трансформированным такими рекомбинантными векторами экспрессии, рекомбинантным полипептидам и производным, которые имеют биологическую активность немодифицированного белка дикого типа, но обладают повышенной стабильностью и удлиненным сроком годности, и к способам получения таких рекомбинантных белков и их производных. Изобретение также охватывает вектор переноса для применения в генной терапии человека, который содержит такие модифицированные последовательности ДНК.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фактор VII и фактор VIIa
Гемофилия А представляет собой врожденное нарушение свертываемости крови. Она представляет собой следствие дефицита фактора коагуляции крови VIII, связанного с Х-хромосомой, и поражает почти исключительно мужчин, число случаев заболевания составляет между одним и двумя людьми на 10000 человек. Дефект Х-хромосомы передается носителями женского пола, которые сами гемофилией не страдают. Клиническое проявление гемофилии А состоит в повышенной тенденции к кровотечению. До введения в обиход лечения концентратами фактора VIII продолжительность жизни человека с тяжелой формой гемофилии составляла менее 20 лет. Использование концентратов фактора VIII из плазмы и позже рекомбинантных форм фактора VIII значительно улучшило ситуацию для пациентов, страдающих гемофилией, существенно увеличив среднюю продолжительность их жизни, давая большинству из них возможность жить более или менее нормальной жизнью. Гемофилия В, которая в 5 раз меньше распространена, чем гемофилия А, вызвана нефункциональным или недостающим фактором IX и лечится концентратами фактора IX из плазмы или рекомбинантной формой фактора IX. Как при гемофилии А, так и при гемофилии В самой серьезной медицинской проблемой при лечении болезни является образование алло-антител к заменяющим факторам. До 30% всех пациентов, страдающих гемофилией А, вырабатывает антитела к фактору VIII. Антитела к фактору IX встречаются реже, но с более тяжелыми последствиями, поскольку они менее восприимчивы к терапии путем индукции иммунной толерантности.
Принятая в настоящее время модель коагуляции констатирует, что физиологическим триггером коагуляции является образование комплекса между тканевым фактором (TF) и фактором VIIa (FVIIa) на поверхности клеток, экспрессирующих TF, которые обычно расположены вне сети сосудов. Это приводит к активации фактора IX и фактора X, что, в конечном счете, приводит к получению некоторого количества тромбина. В петле положительной обратной связи тромбин активирует фактор VIII и фактор IX, так называемый "врожденный" рычаг каскада коагуляции крови, усиливая, таким образом, образование фактора Ха, который необходим для формирования полного вброса тромбина, чтобы получить полный гемостаз. Было показано, что при введении сверхфизиологических концентраций фактора VIIa гемостаз достигается без необходимости в факторе VIIIa и факторе IXa. Клонирование кДНК для фактора VII (US 4784950) позволило разработать активированный фактор VII в качестве фармацевтического продукта. Фактор VIIa впервые был успешно применен в 1988 году. С тех пор количество показаний для применения фактора VIIa устойчиво растет, выявляя его потенциал для того, чтобы стать универсальным гемостатическим средством для остановки кровотечения (Erhardtsen, Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 2002, Vol.23, Supplement 1, стр.47-52). Однако короткое время полужизни фактора VIIa, составляющее около 2 часов, ограничивает возможности его применения.
FVII представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, который секретируется клетками печени в кровоток как неактивный профермент в 406 аминокислот. Он содержит 10 γ-карбокси-остатки глютаминовой кислоты (положения 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 и 35), расположенные в N-концевом Gla-домене белка. Для биосинтеза остатков Gla требуется витамин K. С C-концевой стороны Gla-домена расположены два домена эпидермального фактора роста, за которыми идет сопровождаемый домен сериновой протеазы трипсинового типа. Дополнительные посттрансляционые модификации FVII включают гидроксилирование (Asp 63) и гликозилирование N-(Asn145 и Asn322), а также O-типа (Ser52 и Ser60).
FVII преобразуется в свою активную форму, фактор VIIa, протеолизом одной пептидной связи Arg152-Ile153, что приводит к образованию двух полипептидных цепей - N-концевой легкой цепи (24 кДа) и C-концевой тяжелой цепи (28 кДа), которые удерживаются вместе одним дисульфидным мостиком. В противоположность другим зависимым от витамина К факторам коагуляции, для случая FVII не был описан никакой активационный пептид, который бы отщеплялся во время активации этих других факторов коагуляции, зависимых от витамина К. Сайт расщепления Arg152-Ile153 и некоторые аминокислоты ниже демонстрируют гомологию активационному сайту расщепления других зависимых от витамина К полипептидов.
Существенным для достижения активной конформации фактора VIIa является образование солевого мостика после активационного расщепления между Ile153 и Asp343. Активационное расщепление фактора VII может быть достигнуто in vitro с помощью фактора Ха, фактора XIIa, фактора 1Ха, фактора VIIa, фактора 7 активации протеазы (FSAP) и тромбина. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505), сообщили, что некоторое расщепление также имеет место в тяжелой цепи в Arg290 и/или Arg315.
Фактор VII присутствует в плазме в концентрации 500 нг/мл. 1%, например, 5 нг/мл фактора VII присутствует как фактор VIIa. Было найдено, что время полужизни в плазме фактора VII равно приблизительно 4 часам, а фактора VIIa - приблизительно 2 часам. Хотя время полужизни фактора VIIa, равное 2 часам, сравнительно велико для активированного фактора коагуляции (для других активированных факторов коагуляции оно куда более порядка минут из-за необратимого ингибирования серпинами типа антитромбина III), это, тем не менее, представляет собой серьезный недостаток для терапевтического применения фактора VIIa, поскольку приводит к необходимости многократных внутривенных инъекций или непрерывного вливания, чтобы достичь гемостаза. Это сильно увеличивает стоимость лечения и создает неудобства для пациента. До нынешнего момента коммерчески не доступен никакой фармацевтический препарат фактора VIIa с улучшенным временем полужизни в плазме; также не опубликовано никаких данных, показывающих варианты FVII/FVIIa с удлиненным временем полужизни in vivo. Поскольку фактор VII/VIIa имеет потенциал для того, чтобы использоваться как универсальное гемостатическое средство, все еще существует большая медицинская потребность в разработке форм фактора VIIa, который имеет более длительное функциональное время полужизни in vivo.
Ballance et al. (WO 01/79271) описывает слитые полипептиды множества различных терапевтических белков или вариантов и/или фрагментов указанных терапевтических белков, которые, когда они слиты с человеческим сывороточным альбумином или вариантами и/или фрагментами указанного альбумина, как предсказывается, имеют увеличенное функциональное время полужизни in vivo и удлиненный срок хранения. Описаны длинные перечни потенциальных партнеров по слитию клеток без показа посредством экспериментальных данных, почти для всех этих белков, что соответствующие слитые с альбумином полипептиды на деле сохраняют биологическую активность партнера по слитию терапевтического белка и имеют улучшенные свойства. Также согласно WO 01/79271 каждый член из перечня терапевтических белков может быть слит во многих различных ориентациях с альбумином, например, две молекулы терапевтического белка могут быть слиты одна с N-концом, а другая - с С-концом альбумина, или одна молекула терапевтического белка может быть слита или с N-концом, или С-концом альбумина, или множественные области каждого белка могут быть слиты с множественными областями другого белка. Среди множества терапевтических белков, перечисленных в WO 01/79271, как потенциальные партнеры альбумина по слитию упомянуты факторы IX и FVII/FVIIa, но ни для одного из этих белков не представлены никакие экспериментальные доказательства принципа действия.
Шеффилд экспрессировал полипептид фактора IX (фактора протромбина, состоящего из 415 аминокислот), слитого с альбумином, и показал в фармакокинетических экспериментах, что поведение полипептида фактора IX, слитого с альбумином, в плане клиренса у кроликов более точно напоминало поведение фактора IX, нежели альбумина, с демонстрацией только умеренного увеличения окончательного времени полужизни (менее чем двукратного) (Sheffield W.P. et al. (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573).
Исходя из результатов Шеффилда и из-за высокой гомологии между факторами IX и VII (оба являются факторами протромбина, зависимыми от витамина K) и их сопоставимого размера, специалист в данной области предположил бы, что фактор VII также не выиграет от слияния с альбумином в отношении функционального времени полужизни in vivo.
Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, таким образом, состояла в том, чтобы разработать функциональные слитые белки FVIIa-альбумин, которые сохраняют биологическую активность и демонстрируют увеличенное функциональное время полужизни in vivo.
В этом отношении биологическая активность полипептида фактора VII/VIIa относится к его способности активировать факторы коагуляции IX и Х в присутствии тканевого фактора, после того как он сам активирован.
Функциональное время полужизни в плазме in vivo относится к времени полужизни биологической активности слитого полипептида фактора VII/VIIa, когда он введен в плазму. Предпочтительно, плазма представляет собой человеческую плазму.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что слитые с альбумином полипептиды, содержащие, по меньшей мере, один полипептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, слитые с альбумином, или его фрагмент, или вариант, в котором, по меньшей мере, одна молекула фактора VII или фактора VIIa расположена на N-конце слитого белка, дают слитые полипептиды с биологически активной частью фактора VII/фактора FVIIa.
Одним аспектом изобретения являются, таким образом, биологически активные слитые белки, в которых полипептиды фактора VII/VIIa слиты с N-концом человеческого сывороточного альбумина. Слитые белки демонстрируют, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, более 40%, даже более предпочтительно, более 70% и, наиболее предпочтительно, более 90% молярной специфической активности фактора VII/VIIa дикого типа.
Дополнительно, к удивлению, было найдено, что в отличие от слитий фактора IX с N-концом человеческого сывороточного альбумина, как опубликовано Шеффилдом, альбуминовые слития фактора VII/VIIa с N-концом человеческого сывороточного альбумина давали слитые белки фактора VII/FVIIa, которые не только сохраняли биологическую активность фактора VII/FVIIa, но также показывали значительное увеличение функционального времени полужизни в плазме фактора VII/VIIa in vivo.
Экспрессия конструкций слитого альбумина с желаемой частью FVII/FVIIa на С-конце альбумина не была успешной, потому что экспрессированные слитые с альбумином белки не секретировались как интактные молекулы. После перехода через клеточную мембрану наблюдалась расщепление с получением зрелой молекулы FVII/FVIIa, у которой, из-за нарушенного гамма-карбоксилирования, была пониженная молярная специфическая активность, и альбуминовой части с пропептидом FVII, присоединным к ее С-концу. Таким образом, в противоположность раскрытию Ballance et al., было найдено, что только слияние части FVII/FVIIa с N-концом человеческого сывороточного альбумина дает слитый белок с желаемыми биологическими свойствами, соответственно, сохранение биологической активности FVII/FVIIa и увеличенное время полужизни в плазме.
Следующим аспектом изобретения являются, таким образом, биологически активные слитые белки, в которых полипептиды фактора VII/VIIa слиты с N-концом альбумина, которые демонстрируют значительное увеличение функционального времени полужизни в плазме по сравнению с неслитым фактором VII/VIIa. В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды FVII/FVIIa, слитого с альбумином, по настоящему изобретению, содержащие полипептид FVII/FVIIa, имеют удлиненное функциональное время полужизни in vivo или более долго длящуюся или повышенную терапевтическую активность по сравнению со временем полужизни in vivo или терапевтической активностью неслитого FVII/FVIIa.
Одним аспектом настоящего изобретения является, таким образом, FVII/FVIIa, слитый с N-концом альбумина, что приводит к удлинению времени полужизни в плазме по сравнению со временем полужизни неслитого FVII/FVIIa, по меньшей мере, на 100%, предпочтительно, более чем на 200%, даже более предпочтительно, более чем на 500% и, наиболее предпочтительно, более чем на 1000%.
В дальнейшем удивительном аспекте настоящего изобретения авторы обнаружили, что полипептиды слитого с альбумином FVII/FVIIa без линкера показывают значительно пониженную биологическую активность, тогда как полипептиды слитого с альбумином FVII/FVIIa, в которых части FVII/FVIIa отделены от альбумина линкером, демонстрируют зависящее от длины линкера повышение биологической активности фактора VII/VIIa. Часть, соответствующая пептиду фактора VII или фактора VIIa, связана с частью, соответствующей альбумину, пептидным линкером, что позволяет, таким образом, слитой молекуле принять конформацию, которая позволяет достичь более высокой молярной специфической активности по сравнению со слитой молекулой без такой линкерной последовательности.
Следовательно, дальнейшим аспектом настоящего изобретения являются полипептиды связанного с альбумином фактора VII/VIIa содержащие линкерный пептид между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и N-концом альбумина, которые имеют повышенную активность биологического фактора VII/VIIa, например, измеренную как молярную специфическую активность, по сравнению со слитыми белками фактора VII/VIIa без таких линкеров. Увеличение молярной специфической активности слитых белков, в которых часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, слита с N-концом альбумина через пептидный линкер, по сравнению с соответствующими слитыми белками без такого линкера, составляет, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 50% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100%. Эти несущие линкер полипептиды слитого с альбумином фактора VII/VIIa также демонстрируют увеличенное функциональное время полужизни in vivo по сравнению с фактором FVIIa дикого типа. Однако химические линкеры или линкерные системы, такие как, без ограничения, авидин-биотин, будут функционировать аналогично, коль скоро имеются сопоставимые интервалы между частью фактора VII/FVIIa и альбуминовой частью. Ниже термин "пептидный линкер" или ему подобные включают такие другие функциональные линкерные средства, когда они пригодны.
Изобретение охватывает терапевтические полипептиды фактора VII/VIIa, связанного с N-концом альбумина, композиции, фармацевтические композиции, составы и наборы. Изобретение также охватывает применение указанных терапевтических слитых с альбумином полипептидов при определенных медицинских показаниях. Изобретение также охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые с альбумином полипептиды по настоящему изобретению, а также векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, трансформированные этими нуклеиновыми кислотами и векторами, и способы получения слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению путем использования этих нуклеиновых кислот, векторов и/или клеток-хозяев.
Изобретение также обеспечивает композицию, содержащую полипептид слитого с альбумином фактора VII/FVIIa, содержащий пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, необязательно, пептидный линкер, и альбумин, или его фрагмент, или вариант и фармацевтически приемлемый носитель. Еще одной целью изобретения является обеспечение способа лечения пациентов, страдающих нарушениями свертываемости крови. Способ включает стадию введения эффективного количества полипептида, связанного с альбумином FVII/FVIIa.
Еще одной целью изобретения является обеспечение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность полинуклеотида, кодирующую полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa, содержащий пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, необязательно, пептидный линкер, и альбумин, или его фрагмент, или вариант, а также вектора, который содержит такую молекулу нуклеиновой кислоты. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, расположена на 3'-конце последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пропептид, опосредующий гамма-карбоксилирование слитой части, относящейся к фактору VII/VIIa.
Изобретение также обеспечивает способ получения полипептида слитого с альбумином фактора VII/FVIIa, содержащего пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, пептидный линкер и альбумин, или его фрагмент, или вариант, где способ включает:
(а) обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa, которую можно экспрессировать в клетке млекопитающего;
(b) экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в организме с образованием полипептида связанного с альбумином фактора VII/VIIa; и
(c) очистку полипептида связанного с альбумином фактора VII/VIIa.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептидам слияния с альбумином и способам лечения, предотвращения или смягчения симптомов заболеваний или нарушений. Используемый здесь термин "полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa" относится к полипептиду, который образован путем слияния, по меньшей мере, одной молекулы фактора VII/VIIa (или ее фрагмента, или варианта) с N-концом, по меньшей мере, одной молекулы альбумина (или ее фрагмента, или варианта), причем обе части необязательно разделены пептидным линкером.
Полипептид слитого с альбумином фактора VII/FVIIa по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, фрагмент или вариант фактора VII/FVIIa и, по меньшей мере, фрагмент или вариант человеческого сывороточного альбумина, которые связаны друг с другом, например, генетическим слиянием (т.е. слитый с альбумином полипептид генерирован трансляцией нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий весь фактор VII/FVIIa или его часть, присоединен «в рамке» к 5'-концу полинуклеотида, кодирующего весь альбумин или его часть, и они необязательно связаны полинуклеотидом, который кодирует линкерную последовательность, вводя линкерный пептид между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью).
В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, включающий биологически активный и/или терапевтически активный фактор VII/VIIa, слитый с N-концом полипептида сывороточного альбумина, или, альтернативно, состоящий из него.
В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает слитый полипептид с альбумином, включающий биологически активный и/или терапевтически активный фрагмент фактора VII/VIIa и пептидный линкер, слитый с N-концом сывороточного альбумина, или, альтернативно, состоящий из этого.
В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает слитый с альбумином полипептид, включающий биологически активный и/или терапевтически активный вариант фактора VII/VIIa, слитый с N-концом полипептида сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.
В дальнейших вариантах осуществления изобретение обеспечивает полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, включающий биологически активные и/или терапевтически активные фрагмент или вариант FVII/FVIIa, слитые с N-концом фрагмента или варианта сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.
В некоторых вариантах осуществлениях изобретение обеспечивает слитый с альбумином полипептид, включающий зрелую часть FVII/FVIIa, слитую с N-концом зрелой части сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.
В соответствии с WO 01/79271 полипептид слития с альбумином, содержащий FVII/FVIIa, может использоваться как терапевтическое средство при показаниях "нарушения свертываемости крови", "гемофилия A и B", "нарушение функции печени" и "геморрагические случаи, связанные с хирургическим вмешательством".
Другим аспектом изобретения является то, что слитый с альбумином полипептид, содержащий FVII/FVIIa, может также использоваться терапевтически при других показаниях. Наиболее предпочтительными показаниями являются "случаи кровотечения и хирургическое вмешательство у пациентов с врожденной или приобретенной гемофилией с ингибиторами к факторам коагуляции (FVIII или FIX)", "обращение дефицитов гемостаза, развившихся как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или лекарственные средства против коагуляции", "улучшение вторичного гемостаза", "дефициты гемостаза, развившиеся во время инфекций или во время болезней, такие как дефицит витамина К или тяжелое заболевание печени", "резекция печени", "дефициты гемостаза, развившиеся в результате укусов змеи", "гастроинтестинальные кровотечения", "травма", "последствия массивного переливания (дилюционная коагулопатия)", "дефициты фактора коагуляции отличных от FVIII и FIX", "VWD", "дефицит FI", "дефицит FV", "дефицит FVII", "дефицит FX", "дефицит FXIII", "HUS", "врожденные или приобретенные тромбоцитарные болезни и нарушения, подобные тромбоцитопении, ITP, ТТР, синдром HELLP, синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, HIT", "синдром Чедиака-Хигаси", "синдром Германски-Пудлака", "синдром Ренду-Ослера", "пурпура Геноха-Шенлейна" и "заживление ран".
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является обеспечение человеческого фактора VII и человеческого фактора VIIa или их фрагментов или вариантов, слитых с N-концом человеческого альбумина или их фрагментов и вариантов с более продолжительным функциональным временем полужизни in vivo по сравнению с человеческим фактором VII и человеческим фактором VIIa, или их фрагментами, или вариантами. Другая цель изобретения состоит в том, чтобы обеспечить человеческий фактор VII и человеческий фактор VIIa, или их фрагменты, или варианты, слитые с N-концом человеческого альбумина, или фрагменты, или варианты с увеличенной молярной специфической активностью. Чтобы достичь этой цели, слития фактора VII или фактора VIIa с N-концом сывороточного альбумина обеспечиваются необязательно с промежуточным пептидным линкером между FVII/FVIIa и альбумином.
В настоящем описании термины "человеческий сывороточный альбумин (HSA)" и "человеческий альбумин (НА)" взаимозаменяемы. Термины "альбумин" и "сывороточный альбумин" являются более широкими и охватывают человеческий сывороточный альбумин (и его фрагменты и варианты), так же как альбумин других разновидностей (и их фрагменты и варианты). Вместо альбумина также могут использоваться другие подобные альбумину белки, например, без ограничения, человеческий альфа-фетопротеин (как он описан в WO 2005/024044), так же как их функциональные фрагменты или варианты.
Термин "альбумин", как он используется здесь, совокупно относится к полипептиду альбумина или к аминокислотной последовательности, или к фрагменту, или варианту альбумина, имеющим одну или более функциональных активностей (например, биологических активностей) альбумина. В частности "альбумин" относится к человеческому альбумину или его фрагментам, особенно к зрелой форме человеческого альбумина, как показано здесь в SEQ ID No:22 или к альбумину других позвоночных или его фрагментам, или аналогам, или вариантам этих молекул или их фрагментам.
Альбуминовая часть слитых с альбумином полипептидов может содержать полноразмерную последовательность НА, как описано выше, или может включать один или более ее фрагментов, которые способны к стабилизации или продлению терапевтической активности. Такие фрагменты могут иметь 10 и более аминокислот в длину, или могут включать приблизительно 15, 20, 25, 30, 50 или более смежных аминокислот из последовательности НА, или могут включать часть или все домены НА.
Альбуминовая часть слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению может представлять собой вариант нормального НА. Часть, относящаяся к фактору VII слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению, может также быть вариантами полипептидов фактора VII, как описано здесь. Термин "варианты" включает вставки, удаления и замены, консервативные или неконсервативные, где такие изменения, в основном, не изменяют существенным образом активный центр или активный домен, которые сообщают терапевтическую активность полипептидам фактора VII.
В частности, слитые с альбумином полипептиды по настоящему изобретению могут включать встречающиеся в природе полиморфные варианты человеческого альбумина и фрагменты человеческого альбумина. Альбумин может быть получен из любого позвоночного, особенно любого млекопитающего, например человека, коровы, овцы или свиньи. Альбумины не-млекопитающих включают, без ограничения, альбумины курицы и лосося. Альбуминовая часть слитого с альбумином полипептида может быть получена от иного животного, нежели часть, соответствующая FVII/FVIIa.
Вообще говоря, фрагмент или вариант альбумина будет длиной, по меньшей мере, 20, предпочтительно, по меньшей мере, 40, наиболее предпочтительно, более чем 70 аминокислот. Вариант альбумина может предпочтительно состоять из, по меньшей мере, одного целого домена альбумина или фрагментов указанных доменов, например доменов 1 (аминокислоты 1-194 SEQ ID NO:22), 2 (аминокислоты 195-387 SEQ ID NO:22), 3 (аминокислоты 388-585 SEQ ID NO:22), 1+2 (1-387 SEQ ID NO:22), 2+3 (195-585 SEQ ID. NO:22) или 1+3 (аминокислоты 1-194 SEQ ID NO:22+аминокислоты 388-585 SEQ ID NO:22), или, альтернативно, содержать их. Каждый домен сам по себе образован двумя гомологичными субдоменами, а именно 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 и 512-585 с гибкими межсубдоменными линкерными областями, содержащими остатки от Lys106 до Glu119, от Glu292 до Val315 и от Glu492 до Ala511.
Альбуминовая часть слитого с альбумином полипептида по изобретению может содержать, по меньшей мере, один субдомен, или домен НА, или его консервативные модификации.
Изобретение относится к модифицированному полипептиду фактора VII или фактора VIIa, содержащему соединение полипептида фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмента, или варианта с N-концом, полипептида альбумина, или его фрагмента, или варианта, необязательно таким образом, что промежуточный пептидный линкер вводится между модифицированным фактором VII или фактором VIIa и альбумином так, что полипептид модифицированного фактора VII или фактора VIIa имеет увеличенное функциональное время полужизни in vivo по сравнению с полипептидом фактора VII или фактора VIIa, который не был связан с альбумином, или так, что молярная специфическая активность FVII/FVIIa, слитого с альбумином, с промежуточным пептидным линкером превышает молярную специфическую активность FVII/FVIIa, слитого с альбумином, без промежуточного пептидного линкера.
"Фактор VII/VIIa", как этот термин используется в настоящей заявке, означает терапевтический полипептид, состоящий или из неактивированной формы (фактор VII), или из активированной формы (фактор VIIa), или их смесей. "Фактор VII/VIIa" в рамках вышеупомянутого определения включает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность нативного человеческого фактора VII/VIIa. Он также включает полипептиды с немного модифицированной аминокислотной последовательностью, например с модифицированным N-концом или С-концом, что включает концевые аминокислотные удаления или добавления, коль скоро эти полипептиды по существу сохраняют биологическую активность фактора VIIa. "Фактор VII" в рамках вышеупомянутого определения также включает природные аллельные вариации, которые могут существовать и происходить от человека к человеку. "Фактор VII" в рамках вышеупомянутого определения дополнительно включает варианты FVII/FVIIa. Такие варианты отличаются одним или более аминокислотными остатками от последовательности дикого типа. Примеры таких различий могут включать усечение N- и/или С-конца на один или более аминокислотных остатков (например, от 1 до 10 аминокислотных остатков) или добавление одного или более дополнительных остатков на N-и/или С-конце, так же как и консервативные аминокислотные замены, т.е. замены, выполняемые в рамках групп аминокислот с похожими характеристиками, например (1) малых аминокислот, (2) кислых аминокислот, (3) полярных аминокислот, (4) основных аминокислот, (5) гидрофобных аминокислот и (6) ароматических аминокислот. Примеры таких консервативных замен представлены в следующей таблице.
Таблица 1 | |||
(1) | Аланин | Глицин | |
(2) | Аспарагиновая кислота | Глютаминовая кислота | |
(3а) | Аспарагин | Глютамин | |
(3b) | Серин | Треонин | |
(4) | Аргинин | Гистидин | Лизин |
(5) | Изолейцин | Лейцин | Метионин Валин |
(6) | Фенилаланин | Тирозин | Триптофан |
Слитые белки демонстрируют, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, более 40%, даже более предпочтительно, более 70% и, наиболее предпочтительно, более 90% молярной специфической активности неслитого фактора VII/VIIa дикого типа, или соответствующего фрагмента FVII/FVIIa, или их варианта.
Полипептид FVII/VIIa по настоящему изобретению, связанный через промежуточный пептидный линкер с N-концом альбумина, имеет повышенную молярную специфическую активность по сравнению с молярной специфической активностью гомологичного фактора VII/VIIa, слитого с альбумином, без промежуточного пептидного линкера. Увеличение молярной специфической активности полипептида, связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению, по сравнению с молярной специфической активностью полипептида, слитого с альбумином фактора VII/VIIa, без промежуточного пептидного линкера, составляет, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 100% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 200%. Активность фактора VII/VIIa состоит в способности преобразовывать субстратный фактор Х в активный фактор Ха. Активность FVIIa фактора полипептида VII/VIIa, слитого с альбумином, может быть предпочтительно измерена с использованием STACLOT®. Молярная специфическая активность, как она используется в настоящем изобретении, означает: активность, измеренная в анализе STACLOT® после активации слитого белка, связанного с альбумином FVII, в Международных единицах (IU) на 100 IU антигена фактора VII/VIIa, как измерено ELISA.
Полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, на 25% более высокую молярную специфическую активность по сравнению со слитым с альбумином фактором VII/FVIIa без промежуточного пептидного линкера и демонстрируют увеличение функционального времени полужизни in vivo по сравнению с несвязанной формой полипептида фактора VII или фактора VIIa. Функциональное время полужизни in vivo может быть определено, как описано у Lindley et al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa, Clin. Pharmacol Ther. (1994) 55: 638-648).
Полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, на 25% более высокую молярную специфическую активность по сравнению со слитым с альбумином фактором VII/FVIIa без промежуточного пептидного линкера, и их функциональное время полужизни in vivo обычно увеличено, по меньшей мере, на 100%, предпочтительно, по меньшей мере, на 200%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 500% по сравнению с несвязанной формой полипептида фактора VII или фактора VIIa.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой, таким образом, полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, с пептидным линкером, состоящим, по меньшей мере, из одной аминокислоты, предпочтительно, по меньшей мере, из 3 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, из 7 аминокислот и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, из 25 аминокислот.
Функциональное время полужизни in vivo формы дикого типа человеческого фактора VII составляет приблизительно 4 часа в человеческом организме. Функциональное время полужизни полипептидов фактора VII, связанного с альбумином, по настоящему изобретению, составляет обычно, по меньшей мере, приблизительно 8 часов, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12 часов, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 24 часа.
Функциональное время полужизни in vivo формы дикого типа человеческого фактора VIIa дикого типа составляет приблизительно 2 часа в человеческом организме. Функциональное время полужизни полипептидов фактора VIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению составляет обычно, по меньшей мере, приблизительно 4 часа, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 6 часов, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12 часов.
Согласно изобретению часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, соединена с альбуминовой частью пептидным линкером. Линкер является предпочтительно гибким и неиммуногенным и создает интервал между человеческим альбумином и FVII/FVIIa, который минимизирует потенциальную интерференцию этих двух партнеров по слитию, что приводит к повышенной активности FVII/FVIIa слитого белка. Примеры линкеров включают (GGGGS)N, или (GGGS)N, или (GGS)N, где N представляет собой целое число, большее или равное 1, и где G представляет собой глицин, a S представляет собой серин. Эти аминокислоты принадлежат к группе природных аминокислот и были выбраны как примеры для всех возможных природных аминокислот.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью содержит консенсусные сайты для посттрансляционых модификаций. Предпочтительно, такие модификации состоят из сайтов гликозилирования. Более предпочтительно, такие модификации состоят, по меньшей мере, из одного сайта N-гликозилирования структуры Asn-X-Ser/Thr, где Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина. Даже более предпочтительно, такие сайты N-гликозилирования вставлены около амино- и/или карбокси-конца пептиднного линкера так, что они способны экранировать потенциальные неоэпитопы, которые могут образоваться в последовательностях, где часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, переходит в пептидный линкер, и где пептидный линкер переходит в последовательность альбуминовой части соответственно.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью состоит из последовательностей пептида, которые служат как естественные междоменные линкеры в человеческих белках. Предпочтительно, такие последовательности пептида в их естественном окружении расположены рядом с белковой поверхностью и доступны для иммунной системы, так что можно предположить существование естественной толерантности в отношении этой последовательности. Примеры приведены в таблице 2.
Таблица 2 | |||
Последовательность | Белок | Номер доступа | Положение линкера |
EPQ GGGGSGGGGSG Е | Фотокадгерин-10 | Q9P2E7 | Около мембраны, внеклеточный |
GGVGGGGGGAGI | Рецептор ANP | Р17342 | Крайний N-конец, внеклеточный |
PAR GGGGGG KAR | Frizzled-8 | Q9H461 | Междоменный, секретируется |
GGPGGGGGGGPGG | Frizzled-8 | Q9H461 | С-конец, секретируется |
TSR GGGGSGGG ЕРР | LRRFN2 | Q9ULH4 | Междоменный, внеклеточный |
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью состоит из пептидных последовательностей, которые являются междоменными линкерами известных плазменных белков. Примеры приведены в таблице 3.
Таблица 3 | |||
Последовательность | Белок | Номер доступа | Положение линкера |
MYGAKKPLNTEGVMKSRS | FXIIIa | P00488 | Между каталитическим и Ig-подобным доменами |
RGEVKYPLCTRKESK | FXIIIb | P05160 | Между двумя доменами Sushi |
ESGGPLSLS | FVIII | P00451 | Внутри домена В |
APEAPPPTLPP | vWF | P04275 | Между двумя vWA |
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, связана с альбуминовой частью пептидным линкером, освобождающим полипептид фактора VII/VIIa в месте коагуляции, где линкер содержит сайт расщепления протеазой плазмы. Предпочтительно, такие сайты расщепления протеазой плазмы представляют собой сайты сериновых протеаз. Более предпочтительно, сайт расщепления предоставляется сайтом расщепления коагуляционной протеазы. Наиболее предпочтительно, коагуляционная протеаза выбрана из группы, состоящей из фактора IIа, фактора IXa, фактора Xa, фактора XIa, фактора XIIa, активированного белка С, эластазы или калликреина. Аминокислотные последовательности, которые распознаются и расщепляются этими сериновыми протеазами, известны среднему специалисту; например, они описаны в "Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice", Fourth Edition, Colman et al. 2001. Фактор IIа: р34-35, р176, фактор IXa: p40-41, фактор Ха: р34-35, фактор ХIа p128-129, фактор XIIa: pl94, aPC: р34-35, p159, калликреин: p103-104 или эластаза (O'Reilly et al., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science 285: 1926-1928).
Изобретение далее относится к модифицированным полипептидам слитого с альбумином фактора VII/VIIa согласно изобретению, содержащим дополнительные модификации в части, относящейся к фактору VII/VIIa.
В частности, модификации фактора VII/FVIIa охвачены изобретением, в котором фактор VII/VIIa был изменен между Arg144 и Аrg152, добавлением, по меньшей мере, части активационного пептида, отличного зависимого от витамина К полипептида, или заменой, по меньшей мере, части предполагаемого активационного пептида полипептида фактора VII/FVIIa, по меньшей мере, частью активационного пептида, отличного зависимого от витамина К полипептида, как описано в европейской патентной заявке 04019485.4 (которая включена в настоящую заявку в качестве ссылки) и которая описана в следующем абзаце.
FVII особенно близко связан с другими белками с доменом Gla, такими как FIX, FX и белок С, в которых за N-концевым доменом Gla следуют два домена эпидермального фактора роста (EGF), за которыми следует домен сериновой протеазы трипсинового типа.
Удивляет большая разница во времени полужизни в плазме этих близко связанных плазматических белков:
FVII: | 2-4 часа |
Белок С: | 6-8 часов |
FIX: | 18-30 часов |
FX: | 20-42 часа |
Эти молекулы высоко консервированы, и наибольшее различие проявляется в домене активации. Для FVII не описано никакого активационного пептида. Однако, во время активации, в дополнение к расщеплению в Arg152, FVII также может быть расщеплен в Аrg144, что далее приводит к высвобождению предполагаемого активационного пептида из 8 аминокислот, содержащего консервированный сайт N-гликозилирования.
Последовательность между Arg144 и Arg152 в европейской патентной заявке 04019485.4 называется «предполагаемым активационным пептидом».
Удивительно, что длина активационных пептидов и посттрансляционных модификаций активационных пептидов коррелирует с увеличенным временем полужизни:
Таблица 4 | |||
Время полужизни в плазме | Длина активационного пептида в соответствующих человеческих белках | Сайты N-гликозилирования внутри соответствующего активационного пептида | |
FVII | 2-4 часа | Активационного пептида нет (или предполагаемый активационный пептид из 8 аминокислот | 1 в предполагаемом активационном пептиде из 8 аминокислот |
Белок С | 6-8 часов | 16 аминокислот | 0 |
FIX | 18-30 часов | 34 аминокислоты | 2 |
FX | 20-42 часа | 51 аминокислота | 2 |
Изобретение, таким образом, относится к способу получения модифицированного полипептида фактора VII/VIIa, связанного с альбумином, включающему модификацию полипептида фактора VII/VIIa в области между Arg144 и Arg152, так что модифицированный полипептид фактора VII/VIIa имеет увеличенное время полужизни по сравнению с полипептидом фактора VII/VIIa, в котором эта область не была модифицирована.
Изобретение далее относится к способу получения такого модифицированного полипептида фактора VII/VIIa, связанного с альбумином, включающему стадию модификации полипептида фактора VII/VIIa в области между Arg144 и Arg152 указанного полипептида слитого с альбумином фактора VII/VIIa путем добавления, по меньшей мере, части активационного пептида второго зависимого от витамина К полипептида или замены, по меньшей мере, части предполагаемого активационного пептида полипептида фактора VII/VIIa, по меньшей мере, частью активационного пептида другого зависимого от витамина К полипептида.
Изобретение дополнительно охватывает дополнительные мутации последовательности полипептида фактора VII/VIIa, которые усиливают каталитическую активность, удлиняют время полужизни в плазме или модифицируют взаимодействие с тканевым фактором. Особенно полезные мутации фактора VII описаны у Shah efc al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4229-4234, где сообщается об усилениях белковой функции. Другие полезные мутации фактора VII/VIIa приведены в описании уровня техники в европейской патентной заявке 04019485.4.
Изобретение далее относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, как описано в настоящей заявке. Термин "полинуклеотид(ы)" в общем относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. Полинуклеотид может быть одно- или двухцепочечной ДНК, одно- или двухцепочечной РНК. Термин "полинуклеотид(ы)", как он используется здесь, также включает ДНК или РНК, которые содержат одно или более модифицированных оснований и/или необычных оснований, таких как инозин. Следует отметить, что в ДНК и РНК может быть сделано множество модификаций, которые служат многим полезным целям, известным специалистам в данной области. Термин "полинуклеотид(ы)", как он используется здесь, охватывает такие химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, так же как химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток, включая, например, простые и сложные клетки.
Специалист в данной области поймет, что, из-за вырожденности генетического кода, каждый конкретный полипептид может кодироваться различными полинуклеотидами. Эти "варианты" охвачены настоящим изобретением.
Предпочтительно, полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой выделенный полинуклеотид. Термин "выделенный" полинуклеотид относится к полинуклеотиду, который по существу свободен от других последовательностей нуклеиновой кислоты, таких как, без ограничения, другие хромосомные и нехромосомные ДНК и РНК. Выделенные полинуклеотиды могут быть очищены из клетки-хозяина. Могут использоваться известные специалистам в данной области общепринятые способы очистки нуклеиновых кислот, чтобы получить выделенные полинуклеотиды. Этот термин также включает рекомбинантные полинуклеотиды и химически синтезируемые полинуклеотиды.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является плазмида или вектор, содержащие полинуклеотид согласно изобретению. Предпочтительно, плазмида или вектор представляют собой вектор экспрессии. В частном варианте осуществления, вектор представляет собой вектор переноса для применения в генной терапии человека.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по настоящему изобретению или плазмиду или вектор по настоящему изобретению.
Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут использоваться в способе получения слитого с альбумином полипептида FVII/VIIa, который является частью настоящего изобретения. Способ включает:
- культивирование клеток-хозяев по настоящему изобретению при таких условиях, что экспрессируется полипептид слитого с альбумином FVII/VIIa; и
- необязательно, извлечение полипептида слитого с альбумином FVII/VIIa из культуральной среды.
Экспрессия предложенных вариантов
Получение рекомбинантных белков в больших количествах в подходящих клетках-хозяевах требует сборки вышеупомянутых мофицированных кДНК в эффективные единицы транскрипции вместе с подходящими регуляторными элементами в рекомбинантном векторе экспрессии, который может быть размножен в различных системах экспрессии согласно способам, известным специалистам в данной области. Эффективные регуляторные элементы транскрипции могут быть получены из вирусов, имеющих животные клетки в качестве своих природных хозяев, или из хромосомной ДНК клеток животных. Предпочтительно, могут использоваться комбинации промотор-энхансер, полученные из обезьяньего вируса 40, аденовируса, вируса полиомы ВК, человеческого цитомегаловируса или длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, или комбинаций промотор-энхансер, включающих крайне конститутивно транскрибированные гены в клетках животных, типа бета-актин или GRP78. Чтобы достичь устойчивых высоких уровней мРНК, транскрибированной с кДНК, единица транскрипции должна содержать в своей 3'-проксимальной части область ДНК, кодирующую последовательность полиаденилирования завершения транскрипции. Предпочтительно, эта последовательность получена из ранней области транскрипции обезьяньего вируса 40, гена бета-глобина кролика или человеческого гена активатора плазминогена ткани.
Затем кДНК интегрируются в геном подходящей линии клетки-хозяина для экспрессии полипептидов связанного с альбумином фактора VII/VIIa. Предпочтительно, эта линия клетки должна быть линией клетки животного позвоночного происхождения, чтобы гарантировать правильное сворачивание, γ-карбоксилирование остатков глютаминовой кислоты в Gla-домен, образование дисульфидных связей, связанное с аспарагином гликозилирование, O-связанное гликозилирование и другие посттрансляционные модификации, так же как секрецию в среду культивирования. Примерами других посттрансляционных модификаций являются O-сульфатирование тирозина, гидроксилирование, протеолитическая обработка образующейся цепи полипептида и отщепление пропептидной области. Примерами клеточных линий, которые могут использоваться, являются COS-клетки обезьяны, L-клетки мыши, С127-клетки мыши, клетки хомяка ВНК-21, человеческие клетки эмбриональной почки 293 и, предпочтительно, СНО-клетки хомяка.
Рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий соответствующие кДНК, может быть введен в линию животной клетки несколькими различными способами. Например, могут быть созданы рекомбинантные векторы экспрессии из векторов, основанных на различных вирусах животных. Примерами этих векторов являются векторы, основанные на бакуловирусе, вирусе вакцинии, аденовирусе и, предпочтительно, бычьем вирусе папилломы.
Единицы транскрипции, кодирующие соответствующие ДНК, могут быть также введены в клетки животного вместе с другим рекомбинантным геном, который может функционировать как доминирующий селектируемый маркер в этих клетках, чтобы облегчить выделение определенных клеточных клонов, которые интегрировали рекомбинантную ДНК в свой геном. Примерами этого типа доминирующих селектируемых маркерных генов являются амино-гликозид-фосфотрансфераза Tn5, придающая устойчивость к генетицину (G418), гигромицин-фосфотрансфераза, придающая устойчивость к гигромицину, и пуромицин-ацетил-трансфераза, придающая устойчивость к пуромицину. Рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий такой селектируемый маркер, может либо находиться на том же самом векторе, что и вектор, кодирующий кДНК желаемого белка, либо он может быть кодирован на отдельном векторе, который одновременно введен и интегрирован в геном клетки-хозяина, что часто приводит к прочной физической связи между различными единицами транскрипции.
Другие типы селектируемых маркерных генов, которые могут использоваться вместе с кДНК желаемого белка, основаны на различных единицах транскрипции, кодирующих дигидрофолатредуктазу (dhfr). После ввода этого типа гена в клетки, испытывающие недостаток эндогенной dhfr-активности, предпочтительно, в СНО-клетки (DUKX-В11, DG-44), это позволит им расти в средах, в которых отсутствуют нуклеозиды. Примером такой среды является среда Ham's F12 без гипоксантина, тимидина и глицина. Эти dhfr-гены могут быть введены вместе с единицами транскрипции кДНК фактора коагуляции в CHO-клетки вышеупомянутого типа, или связанными на одном векторе, или на различных векторах, в силу чего возникают dhfr-положительные клеточные линии, производящие рекомбинантный белок.
Если вышеупомянутые клеточные линии клетки будут выращены в присутствии цитотоксического dhfr-ингибитора метотрексата, то появятся новые клеточные линии, устойчивые к метотрексату. Эти клеточные линии могут производить рекомбинантный белок с повышенной скоростью из-за повышенного числа связанных dhfr и единиц транскрипции желаемого белка. При размножении этих клеточных линий в повышающихся концентрациях метотрексата (1-10000 нм) могут быть получены новые клеточные линии, которые производят желаемый белок с очень высокой скоростью.
Вышеуказанные клеточные линии, производящие желаемый белок, могут быть выращены в большом масштабе либо в суспензионной культуре, либо на различных твердых подложках. Примерами таких подложек являются микроносители, основанные на декстрановых или коллагеновых матрицах, или твердые подложки в виде полых волокон, или различные керамические материалы. При выращивании в суспензионной клеточной культуре или на микроносителях культура вышеупомянутых клеточных линий может быть выполнена либо как периодическая культура, либо как перфузионная культура с непрерывным производством кондиционированной среды в течение длительных периодов времени. Таким образом, согласно настоящему изобретению, вышеупомянутые клеточные линии хорошо подходят для разработки производственного процесса получения желаемых рекомбинантных белков.
Рекомбинантный белок, который накапливается в питательной среде секретирующих клеток вышеупомянутых типов, может быть сконцентрирован и очищен различными биохимическими и хроматографическими методами, включая методы, использующие различия в размере, заряде, гидрофобности, растворимости, специфическом сродстве и т.д. между желаемым белком и другими веществами в среде для культивирования клеток.
Примером такой очистки является адсорбция рекомбинантного белка моноклональным антителом, которое иммобилизовано на твердой подложке. После десорбции белок может быть дополнительно очищен с помощью различных хроматографических методик, основанных на вышеупомянутых свойствах.
Предпочтительным является чистить полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению до ≥80% чистоты, более предпочтительно, до ≥95% чистоты, и наиболее предпочтительным является фармацевтически чистое состояние, которое выше 99,9% чистоты по отношению к загрязняющим макромолекулам, в частности другим белкам и нуклеиновым кислотам, и свободно от инфекционных и пирогенных средств. Предпочтительно, выделенный или очищенный полипептид связанного с альбумином FVII/VIIa по настоящему изобретению по существу не содержит других полипептидов.
Описанные в данном изобретении полипептиды связанного с альбумином фактора VII/VIIa могут быть приготовлены в виде фармацевтических препаратов для терапевтического применения. Очищенные белки могут быть растворены в общепринятых физиологически совместимых водных буферных растворах, в которые могут быть необязательно добавлены фармацевтические эксципиенты, с получением фармацевтических препаратов.
Такие фармацевтические носители и эксципиенты, также как подходящие фармацевтические составы, хорошо известны в уровне техники (см., например, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al. Pharmaceutical Press (2000)). В частности, фармацевтическая композиция, содержащая вариант полипептида по настоящему изобретению, может быть приготовлена в лиофилизированном или стабильном растворимом виде. Вариант полипептида может быть лиофилизирован с помощью различных процедур, известных в уровне техники. Лиофилизированные составы ресуспендируются перед применением путем добавления одного или более фармацевтически приемлемых разбавителей, таких как стерилизованная вода для инъекцией или стерильный физиологический солевой раствор.
Составы композиции доставляют человеку любыми фармацевтически подходящими средствами введения. Различные системы доставки известны и могут использоваться для введения композиции любым общепринятым путем. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению вводятся системно. Для системного применения варианты связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению составлены для парентеральной (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной, внутрицеребральной, внутрилегочной, внутриносовый или трансдермальной) или для энтеральной (например, оральной, вагинальной или ректальной) доставки в соответствии с общепринятыми методами. Наиболее предпочтительным путем является внутривенное введение. Составы могут вводиться непрерывно путем вливания или путем болюсной инъекции. Некоторые составы охватывают системы медленного высвобождения.
Модифицированные биологически активные полипептиды слитого с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению вводятся пациентам в терапевтически эффективной дозе, что означает дозу, которая достаточна, чтобы оказать желаемые эффекты, что приводит к предотвращению или ослаблению тяжести или распространения состояния или показания, в отношении которых осуществляется лечение, без достижения дозы, которая вызывает невыносимые неблагоприятные побочные эффекты. Точная доза зависит от многих факторов, таких как, например, показание, состав и способ введения, и она должна определяться в преклинических и клинических испытаниях для каждого соответствующего показания.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться сама по себе или совместно с другими терапевтическими средствами. Эти средства могут быть включены как часть того же самого фармацевтического продукта.
Различные продукты по настоящему изобретению являются полезными в качестве лекарственных средств. Соответственно, настоящее изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид слитого с альбумином фактора FVIIA/IIa, как описано здесь, полинуклеотид по настоящему изобретению или плазмиду или вектор по настоящему изобретению.
Модифицированные ДНК по настоящему изобретению могут также быть интегрированы в вектор переноса для применения в генной терапии человека.
Другим аспектом настоящего изобретения является применение полипептида связанного с альбумином фактора FVII/VIIa, полинуклеотида по настоящему изобретению, плазмиды или вектора по настоящему изобретению, или клетки-хозяина по настоящему изобретению для производства лекарственного средства для лечения или предотвращения нарушений свертываемости крови. Нарушения свертываемости крови включают, без ограничения, гемофилию A. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лечение включает генную терапию человека.
Изобретение также касается способа лечения индивидуума с одним или более следующих показаний: "случаи кровотечения и хирургическое вмешательство у пациентов с врожденной или приобретенной гемофилией с ингибиторами к факторам коагуляции (FVIII или FIX)", "обращение дефицитов гемостаза, развившихся как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или лекарственные средства против коагуляции", "улучшение вторичного гемостаза", "дефициты гемостаза, развившиеся во время инфекций или во время болезней, такие как дефицит витамина К или тяжелое заболевание печени", "резекция печени", "дефициты гемостаза, развившиеся в результате укусов змеи" "гастроинтестинальные кровотечения". Также предпочтительными показаниями являются "травма", "последствия массивного переливания (дилюционная коагулопатия)", "дефициты фактора коагуляции, отличные от FVIII и FIX", "VWD", "дефицит FI", "дефицит FV", "дефицит FVII", "дефицит FX", "дефицит FXIII", "HUS", "врожденные или приобретенные тромбоцитарные болезни и нарушения, подобные тромбоцитопении, ITP, ТТР, синдром HELLP, синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, HIT", "синдром Чедиака-Хигаси", "синдром Германски-Пудлака", "синдром Ренду-Ослера", "пурпура Геноха-Шенлейна" и "заживление ран". Способ также включает введение указанному индивидууму эффективного количества полипептида FVII/VIIa, связанного с альбумином, как описано здесь. В другом варианте осуществления, способ включает введение индивидууму эффективного количества полинуклеотида по настоящему изобретению или плазмиды или вектора по настоящему изобретению. Как альтернатива, способ может включать введение индивидууму эффективного количества клеток-хозяев по настоящему изобретению, описанному здесь.
Описание таблиц и рисунков
Фигура 1.
Сайт рестрикции XhoI, введенный в сайт природного стоп-кодона FVII заменой TAG на TCG, подчеркнут. Сайт NotI, используемый для дальнейшего конструирования, подчеркнут двойной чертой. Аминокислотная последовательность С-конца фактора VII дана в трехбуквенном коде (заключены в рамку).
Фигура 2.
Схема линкерных последовательностей, вставленных между С-концом фактора VII и N-концом альбумина в различных конструкциях pFVII. Сайт расщепления тромбина в pFVII-834 подчеркнут. Аспарагины сайтов N-гликозилирования подчеркнуты двойной чертой.
Фигура 3. Слитые белки альбумина и FVII были активированы FXa, и активность FVIIa была измерена в анализе STACLOT®. На графике показана активность белков с увеличением длины линкера по сравнению с белком без линкера (полученного из плазмиды pFVII-974).
Фигура 4.
Результаты экспериментов РК с фактором VII дикого типа (pFVII-659), слитых белков альбумина и FVII, полученного из плазмы FVII (pdFVII) и rFVIIa (NovoSeven®), как измерено ELISA.
Примеры
Пример 1. Создание кДНК, кодирующих полипептиды FVII, слитого с альбумином
Кодирующая последовательность фактора FVII была амплифицирована ПЦР из библиотеки кДНК печени человека (ProQuest, Invitrogen) с использованием праймеров Wel303 и Wel304 (SEQ ID NO 1 и 2). После второго цикла ПЦР с использованием праймеров Wel286 и We 128 7 (SEQ ID NO 3 и 4) полученный фрагмент был клонирован в pCR4TOPO (Invitrogen). Оттуда кДНК FVII была перенесена в виде фрагмента EcoRI в сайт EcoRI в pIRESpuroS (BD Biosciences), где внутренний сайт XhoI был ранее удален. Полученная плазмида была обозначена как pFVII-659.
Затем сайт рестрикции XhoI был введен в pFVII-659 в сайте природного стоп-кодона FVII (фигура 1), путем сайт-направленного мутагенеза в соответствии со стандартными протоколами (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) с использованием олигонуклеотидов We1643 и We1644 (SEQ ID NO 5 и 6). Полученная плазмида была обозначена как pFVII-700.
Олигонуклеотиды We1731 и We1732 (SEQ ID NO 7 и 8) отжигали в эквимолярных концентрациях (10 пмоль) в стандартных условиях ПЦР, заполняли и амплифицировали с использованием протокола ПЦР: начальная денатурация в течение 2 минут при 94°C, далее 7 циклов по 15 секунд денатурации при 94°C, 15 секунд отжига при 55°C и 15 секунд элонгации при 72°C, что оканчивается стадией удлинения в течение 5 минут при 72°C. Полученный фрагмент расщепляли рестрикционными эндонуклеазами XhoI и NotI и лигировали в pFVII-700, расщепленную теми же самыми ферментами. Полученная плазмида была обозначена как pFVII-733 и содержала кодирующую последовательность для FVII и C-концевое удлинение отщепляемого глицин-серинового линкера тромбина.
Были вставлены другие линкеры, основанные на pFVII-733, без сайта расщепления тромбина и дополнительных сайтов N-гликозилирования. Для этого пары праймеров We2148 и We2149 (SEQ ID NO 9 и 10), We2148 и We2150 (SEQ ID NO 9 и 11), We2148 и We2151 (SEQ ID NO 9 и 12), We2152 и We2153 (SEQ ID NO 13 и 14), We2152 и We2154 (SEQ ID NO 13 и 15), We2152 и 2155 (SEQ ID NO 13 и 16) и We2156 и We2157 (SEQ ID NO 17 и 18) соответственно отжигали и амплифицировали, как описано выше. Соответствующие фрагменты ПЦР расщепляли рестрикционными эндонуклеазами XhoI и BamHI и вставляли в pFVII-733, расщепленную теми же ферментами. В сайт BamHI полученных плазмид, а также в сайт BamHI pFVII-733 вводили BamHI-фрагмент, содержащий кДНК зрелого человеческого альбумина. Этот фрагмент генерировали ПЦР на последовательности кДНК альбумина, используя праймеры We1862 и We1902 (SEQ ID NO 19 и 20) при стандартных условиях. Полученные плазмиды были обозначены как pFVII-935, pFVII-936, pFVII-937, pFVII-938, pFVII-939, pFVII-940, pFVII-941 и pFVII-834 соответственно. Их линкерные последовательности и С-концевая последовательность FVII и N-концевая последовательность альбумина схематически показаны на фигуре 2.
Более короткие линкерные последовательности, основанные на pFVII-938, генерировали делеционным мутагенезом. Для этого праймеры мутагенеза We2247 и We2248 (SEQ ID NO 23 и 24), We 2249 и We2250 (SEQ ID NO 25 и 26), We2251 и We2252 (SEQ ID NO 27 и 28) и We2253 и We2254 (SEQ ID NO 29 и 30) использовали в стандартных протоколах мутагенеза (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) с получением плазмид pFVII-1014, pFVII-1015, pFVII-1016 и pFVII-1370 соответственно.
Чтобы генерировать слитый белок альбумина и FVII без линкера, делеционный мутагенез, как описано выше, применяли в отношении плазмиды pFVII-935, используя праймеры We2181 и We2182 (SEQ ID NO 31 и 32). Полученная плазмида была обозначена как pFVII-974.
Основанный на плазмиде pFVII-974 инсерционный мутагенез применяли для генерирования линкеров из 1-3 аминокислот. Для этого праймеры мутагенеза We2432 и We2433 (SEQ ID NO 33 и 34), We2434 и We2435 (SEQ ID NO 35 и 36) и We2436 и We2437 (SEQ ID NO 37 и 38) использовали в стандартных протоколах мутагенеза (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) с получением плазмид pFVII-1158, pFVII-1159 и pFVII-1160 соответственно.
Дальнейшие конструкции генерировали в аналогичных процедурах, применяя в стандартных протоколах мутагенеза праймеры мутагенеза We2713 и We2714 (SEQ ID No 39 и 40) на плазмиде pFVII-1370, We2715 и We2716 (SEQ ID No 41 и 42) на плазмиде pFVII-1370, We2717 и We2718 (SEQ ID No 43 и 44) на плазмиде pFVII-1016 и We2756 и We2757 (SEQ ID No 45 и 46) на плазмиде pFVII-935 с получением плазмид pFVII-1361, pFVII-1362, pFVII-1363 и pFVII-1382 соответственно.
Линкерные последовательности и C-концевая последовательность FVII и N-концевая последовательность альбумина вышеописанных плазмид схематически показаны на фигуре 2.
Пример 2. Трансфекция и экспрессия слитых полипептидов фактора VII-альбумин
Плазмиды выращивали в E.coli TOP10 (Invitrogen) и очищали с использованием стандартных протоколов (Qiagen). Клетки НЕК-293 были трансфицированы, используя реактив Lipofectamine 2000 (Invitrogen), и их выращивали в бессывороточной среде (Invitrogen 293 Express) в присутствии 50 нг/мл витамина К и 4 мкг/мл пуромицина. Трансфицированные популяции клеток расширяли с помощью Т-колбы во вращающиеся бутыли, из которых супернатант собирался для очистки.
Пример 3. Очистка полипептидов FVII и слитого с альбумином FVII.
Собранную клеточную культуру, содержащую FVII или слитый белок FVII-альбумин, наносили на 2,06 мл-колонку с Q-sepharose FF, ранее уравновешенную 20-мМ буфером HEPES, pH 7,4. Затем колонку промывали 10 объемами указанного буфера HEPES. Элюцию связанных молекул FVII достигали путем прогона линейного градиента от 0 до 1,0 М NaCl в 20 мМ-буфере HEPES на объеме в 20 колонок. Элюат содержал приблизительно 85-90% нанесенного антигена FVII при концентрациях белка от 0,5 до 1 г/л.
Альтернативно, FVII очищали хроматографией, используя иммобилизованный тканевой фактор, как описано в ЕР 0770625 В1.
Антиген FVII и активность определяли, как описано в примере 4.
Пример 4. Определение активности FVII и антигена.
Активность FVII определяли с использованием коммерчески доступного хромогенного испытательного набора (Chromogenix Coaset FVII с использованием обычной человеческой плазмы [Dade Behring] в качестве стандарта) на основе метода, описанного Seligsohn et al. Blood (1978) 52:978-988.
Активность FVIIa определяли с использованием коммерчески доступного испытательного набора (STACLOT®) VIIa-rTF, Diagnostica Stago на основе метода, описанного Morissey et al. (1993) Blood 81:734-744.
Антиген FVII определяли ELISA, принцип которого известен специалистам в данной области. Вкратце, микропластины инкубировали с 120 мкл захватывающего антитела на лунку (IgG овцы против FVII человека, Cedarlane CL20030AP, разбавленные 1:1000 в буфере А [Sigma C3041]) на ночь при температуре окружающей среды. После промывки пластин три раза буферным раствором В (Sigma P3563), каждую лунку инкубировали с 200 мкл буфера С (Sigma P3688) в течение одного часа при температуре окружающей среды. После еще трех стадий промывки буфером В, серийные разбавления исследуемого образца в буфере В, а также серийные разбавления стандартной человеческой плазмы (Dade Behring; 50-0,5 mU/мл [1 mU равна 0,5 нг]) в буфере В (объемы на клетку: 100 мкл), инкубировали в течение двух часов при температуре окружающей среды. После трех стадий промывки буфером В, 100 мкл антитела-определителя с разбавлением 1:5000 в буфере В (IgG овцы против FVII человека, Cedarlane CL20030K, пероксидазы) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение еще двух часов при температуре окружающей среды. После трех стадий промывки буфером В, 100 мкл раствора субстрата (ТМВ, Dade Behring, OUVF) добавляли в лунку и инкубировали в течение 30 минут при температуре окружающей среды в темноте. Добавлением 100 мкл неразбавленного стоп-раствора (Dade Behring, OSFA) приготовляли образцы к считыванию в подходящем планшет-ридере при длине волны 450 нм. Концентрации тестируемых образцов затем рассчитывали, используя стандартную кривую со стандартной человеческой плазмой в качестве эталона.
Пример 5. Активация фактором Ха слитых полипептидов FVII и FVIIa с альбумином
Полипептиды FVII, очищенные, как описано в примере 3, диализировали против буфера, состоящего из 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1 мМ цитрата натрия, 1 г/л каприлата натрия, рН8.5. В этом буферном окружении FVII активировали в FVIIa инкубацией с FXa (коммерчески доступный препарат, 100 IU/мл, ERL), фосфолипидами (Phospholipon 25P, 1 г/л, Rhone Poulenc-Nattermann, Köln) и Ca++ (раствор CaCl2 в Aqua dest, 1M) в течение различных временных интервалов при 37°C. Конечные концентрации были от приблизительно 30 до 65 IU/мл FVII, по измерениям хромогенного анализа; 0,5% FXa, отнесенный к FVII, т.е. 1 IU FXa и 200 IU FVII, 0,02 г/л фосфолипидов и 5 мл CaCl2.
Активацию оканчивали добавлением 10% (v/v) буфера, состоящего из 20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 200 мм цитрата натрия, 1 г/л каприлата натрия, pH 5,0.
Для параллельного мониторинга расщепления молекул, образец активированной смеси и соответствующий неактивированный образец наносили на SDS-PAGE с окраской Кумасси синим и сканировали полосы на плотность.
Вкратце, образцы восстанавливали, наносили на SDS-PAGE (градиент 8-16% полиакриламид, гели Novex® Tris-Glycin, Invitrogen; согласно инструкциям производителя) и окрашивали Кумасси синим G-250. Полученные полосы сканировали (Versa DOC®, Bio-Rad), и относительные концентрации белка вычисляли, используя программное обеспечение Image Quant (V 4.20, Amersham).
Пример 6. Активность слитых белков FVII-альбумин зависит от длины линкера.
Слитые белки FVII-альбумин с длиной линкера от 0 до 31 аминокислот активировали как описано выше и активность FVIIa определяли анализом STACLOT®. Хотя слитые полипептиды, независимо от длины линкера, показывали сопоставимую степень расщепления FXa, активности FVIIa слитых белков с альбумином, измеренные анализом активности, показали удивительный результат: чем длиннее линкер между FVII и альбуминовой частью, тем выше была измеренная молярная специфическая активность FVIIa (фигура 3 и таблица 5), а конструкция без линкера (974) показала менее половины активности FVIIa по сравнению с конструкциями с пептидными линкерами длиной 19 или более аминокислот. Даже одна аминокислота в качестве линкера (pFVII-1158) увеличивала молярную специфическую активность слитого белка на 31% по сравнению со слитым белком без линкера (pFVII-974). Это заставляет предположить, что прямое слияние FVII и альбуминных последовательностей могло бы привести к конформационной ситуации, где альбуминовая часть мешает либо принятию нужной конформации части, соответствующей FVIIa, либо взаимодействию с ее субстратом. По-видимому, эта помеха значительно уменьшена в конструкциях, имеющих промежуточный пептидный линкер между фактором VII/VIIa и альбумином.
Слитый с альбумином белок без линкера (974) показал приблизительно 25% молярной специфической активности по сравнению с NovoSeven® (таблица 6).
Таблица 5 | |||
Слитый с альбумином белок, полученный из pFVII- | Длина линкера [аминокислоты] | Количество сайтов N-гликозилирования внутри линкера | % повышения активности Staclot по сравнению со слитым белком без линкера |
974 | 0 | 0 | 0 |
1158 | 1 | 0 | 31,3 |
1159 | 2 | 0 | 75,6 |
1160 | 3 | 0 | 104,0 |
1370 | 4 | 0 | 81,6 |
1361 | 5 | 0 | 107,0 |
1362 | 6 | 0 | 98,5 |
1363 | 7 | 0 | 178,1 |
1015 | 10 | 1 | 155,7 |
1014 | 13 | 2 | 201,5 |
1382 | 16 | 0 | 149,8 |
935 | 19 | 0 | 194,5 |
936 | 25 | 0 | 255,7 |
937 | 31 | 0 | 249,8 |
Таблица 6. | ||
Сравнение молярной специфической активности (выраженной в единицах FVIIa, измеренной анализом Staclot, на 100 единиц антигена FVII, как измерено ELISA) между слитым белком FVII-альбумин без линкера (974) и NovoSeven® | ||
Белок | Специфичная активность Staclot [IU/100 IU антиген FVII] | % специфичной активности |
974 | 489 | 27.8 |
NovoSeven® | 1759 | 100.0 |
Claims (12)
1. Слитый полипептид, представляющий собой полипептид фактора VII или фактора VIIa, слитый с альбумином через пептидный линкер, отделяющий часть, относящуюся к фактору VII или фактору VIIa, от альбуминовой части, при этом полипептид фактора VII или фактора VIIa расположен на N-конце слитого белка, где слитый полипептид характеризуется следующей структурой, выбранной из аминокислотных последовательностей:
…LRAPFPGGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSDAHKSE…
…LRAPFPSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSNGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSVPRAVGGSGGSGGSGSGSDAHKSE…
где «…LRAPFP» - обозначает полипептид фактора VII или фактора VIIa человека, a «DAHKSE…» - обозначает полипептид сывороточного альбумина человека,
причем слитый белок имеет биологическую активность фактора VII/VIIa и обладает увеличенным функциональным временем полужизни в плазме in vivo по сравнению с неслитыми фактором VII или фактором VIIa.
…LRAPFPGGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSDAHKSE…
…LRAPFPSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSNGSGGSGGSGGSNGSGGSGGSGGSGGNGSDAHKSE…
…LRAPFPSSVPRAVGGSGGSGGSGSGSDAHKSE…
где «…LRAPFP» - обозначает полипептид фактора VII или фактора VIIa человека, a «DAHKSE…» - обозначает полипептид сывороточного альбумина человека,
причем слитый белок имеет биологическую активность фактора VII/VIIa и обладает увеличенным функциональным временем полужизни в плазме in vivo по сравнению с неслитыми фактором VII или фактором VIIa.
2. Полипептид по п.1, где слитый белок имеет, по меньшей мере, 25% молярной специфической биологической активности фактора VII/VIIa по сравнению с соответствующими неслитыми фактором VII или фактором VIIa дикого типа.
3. Полипептид по п.1, где слитый белок имеет функциональное время полужизни в in vivo, которое увеличено, по меньшей мере, на 100% по сравнению с неслитыми фактором VII или фактором VIIa.
4. Полипептид п.1, где слитый полипептид имеет молярную специфическую активность по сравнению со слитыми белками фактора VII или фактора VIIa без линкера, увеличенную, по меньшей мере, на 25%.
5. Применение слитого с альбумином полипептида по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения нарушений свертываемости крови.
6. Применение по п.5, где нарушения свертываемости крови включают одно или более из следующих: гемофилия А, гемофилия В, геморрагические случаи, связанные с хирургическим вмешательством, нарушения функции печени, приводящие к нарушениям свертываемости крови, "случаи кровотечения и хирургическое вмешательство у пациентов с врожденной или приобретенной гемофилией с ингибиторами к факторам коагуляции (FVIII или FIX)", "обращение дефицитов гемостаза, развившихся как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или лекарственные средства против коагуляции", "улучшение вторичного гемостаза", "дефициты гемостаза, развившиеся во время инфекций или во время болезней, такие как дефицит витамина K или тяжелое заболевание печени", "резекция печени", "дефициты гемостаза, развившиеся в результате укусов змеи", "гастроинтестинальные кровотечения", "травма", "последствия массивного переливания (дилюционная коагулопатия)", "дефициты фактора коагуляции, отличные от FVIII и FIX", "VWD", "дефицит FI", "дефицит FV", "дефицит FVII", "дефицит FX", "дефицит FXIII", "HUS", "врожденные или приобретенные тромбоцитарные болезни и нарушения, подобные тромбоцитопении, ITP, ТТР, синдром HELLP, синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, HIT", "синдром Чедиака-Хигаси", "синдром Германски-Пудлака", "синдром Ренду-Ослера", "пурпура Геноха-Шенлейна" и "заживление ран".
7. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения нарушений свертываемости крови, которая содержит эффективное количество слитого с альбумином полипептида по любому из пп.1-4 вместе с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид по п.1, где последовательность указанной молекулы нуклеиновой кислоты, по существу, соответствует полинуклеотидной последовательности, кодирующей слитый с альбумином полипептид по любому из пп.1-4, где указанная полинуклеотидная последовательность расположена на 3'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей пропептид, который опосредует гамма-карбоксилирование слитой части, относящейся к фактору VII/VIIa.
9. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.8.
10. Клетка-хозяин, способная экспрессировать экзогенный генетический материал, где указанная клетка-хозяин содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.8 или вектор по п.9.
11. Способ получения слитого с альбумином полипептида по любому из пп.1-4, который включает:
(a) обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый с альбумином полипептид по любому из пп.1-4, которую можно экспрессировать в клетке-хозяине;
(b) экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в организме с образованием слитого с альбумином полипептида; и
(c) очистку слитого с альбумином полипептида.
(a) обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый с альбумином полипептид по любому из пп.1-4, которую можно экспрессировать в клетке-хозяине;
(b) экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в организме с образованием слитого с альбумином полипептида; и
(c) очистку слитого с альбумином полипептида.
12. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения нарушений свертываемости крови, где указанная фармацевтическая композиция содержит вектор по п.9.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06002359.5 | 2006-02-06 | ||
EP06002359A EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2006-02-06 | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008132760A RU2008132760A (ru) | 2010-02-20 |
RU2466141C2 true RU2466141C2 (ru) | 2012-11-10 |
Family
ID=36762937
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008132760/10A RU2466141C2 (ru) | 2006-02-06 | 2007-02-03 | МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8765915B2 (ru) |
EP (3) | EP1816201A1 (ru) |
JP (2) | JP5726404B2 (ru) |
KR (2) | KR101439817B1 (ru) |
CN (1) | CN101379189B (ru) |
AU (1) | AU2007214011B9 (ru) |
BR (1) | BRPI0707513A2 (ru) |
CA (1) | CA2636671C (ru) |
DK (1) | DK1984503T4 (ru) |
ES (2) | ES2793325T3 (ru) |
HK (1) | HK1129421A1 (ru) |
MX (1) | MX2008009893A (ru) |
PL (1) | PL1984503T5 (ru) |
RU (1) | RU2466141C2 (ru) |
WO (1) | WO2007090584A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2585231C2 (ru) * | 2010-06-04 | 2016-05-27 | Ск Кемикалз Ко., Лтд. | Слитый белок, обладающий активностью фактора vii |
RU2758160C2 (ru) * | 2016-09-20 | 2021-10-26 | Байер Фарма Акциенгезельшафт | Новые антитела против фактора xi и их применения |
Families Citing this family (79)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2405709A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
KR101492422B1 (ko) * | 2006-04-11 | 2015-02-12 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법 |
US7939632B2 (en) * | 2006-06-14 | 2011-05-10 | Csl Behring Gmbh | Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity |
JP5800458B2 (ja) * | 2006-06-14 | 2015-10-28 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 血液凝固因子を有するタンパク質分解によって切断可能な融合タンパク質 |
EP1867660A1 (en) * | 2006-06-14 | 2007-12-19 | CSL Behring GmbH | Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor |
KR101542752B1 (ko) * | 2006-12-22 | 2015-08-10 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 연장된 생체내 반감기를 갖는 변형된 응고 인자 |
JP5613876B2 (ja) * | 2007-10-15 | 2014-10-29 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル | 延長された半減期を備えるヒト第ix因子変異体 |
US20110137011A1 (en) | 2008-04-21 | 2011-06-09 | Novo Nordisk A/S | Hyperglycosylated human coagulation factor ix |
CN103739712B (zh) | 2008-06-24 | 2016-10-05 | 德国杰特贝林生物制品有限公司 | 具有延长的体内半衰期的因子viii、冯·维勒布兰德因子或它们的复合物 |
CA2748662A1 (en) * | 2009-01-19 | 2010-07-22 | Bayer Healthcare Llc | Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety |
US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
US8680050B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
WO2010091122A1 (en) | 2009-02-03 | 2010-08-12 | Amunix, Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
CN102317315A (zh) | 2009-02-11 | 2012-01-11 | 诺维信生物制药丹麦公司 | 白蛋白变体和缀合物 |
US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
ES2705249T3 (es) | 2009-06-08 | 2019-03-22 | Amunix Operating Inc | Polipéptidos reguladores de glucosa y métodos para su producción y uso |
WO2011020866A2 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Csl Behring Gmbh | Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders |
US20120263701A1 (en) * | 2009-08-24 | 2012-10-18 | Volker Schellenberger | Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same |
WO2011028344A2 (en) * | 2009-08-25 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same |
JP2013509170A (ja) | 2009-10-30 | 2013-03-14 | ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ | アルブミン変異体 |
JP5876416B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-03-02 | グリフオルス・セラピユーテイクス・インコーポレーテツドGrifols Therapeutics,Inc. | フォンウィルブランド因子(vWF)含有調製品並びにこれに関連する方法、キット及び使用 |
CN102753575A (zh) * | 2010-01-28 | 2012-10-24 | 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 | 因子vii融合多肽 |
PL2591006T3 (pl) | 2010-07-09 | 2019-10-31 | Bioverativ Therapeutics Inc | Przetwarzalne cząsteczki jednołańcuchowe i polipeptydy wytworzone przy ich zastosowaniu |
EP2590668A4 (en) * | 2010-07-09 | 2014-04-02 | Biogen Idec Hemophilia Inc | FACTOR IX POLYPEPTIDES AND METHOD OF USE THEREOF |
TWI557135B (zh) | 2010-11-03 | 2016-11-11 | 介控生化科技公司 | 經修飾之第九因子多胜肽及其用途 |
JP2012125190A (ja) * | 2010-12-15 | 2012-07-05 | Kakei Gakuen | 会合ユニット作製用リンカーペプチド |
ES2675353T3 (es) * | 2011-02-04 | 2018-07-10 | Octapharma Ag | Procedimiento para inactivación/eliminación de factores de coagulación por precipitación |
TWI565715B (zh) * | 2011-10-06 | 2017-01-11 | 韓美科學股份有限公司 | 凝血因子VII及VIIa之衍生物、接合物及含該接合物之複合物與其用途 |
EP2780364A2 (en) | 2011-11-18 | 2014-09-24 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
EP2814502B1 (en) | 2012-02-15 | 2017-09-13 | CSL Behring GmbH | Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity |
PL3564260T3 (pl) | 2012-02-15 | 2023-03-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Kompozycje czynnika viii oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania |
AU2013204636B2 (en) | 2012-02-15 | 2016-04-14 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant Factor VIII proteins |
KR20140136934A (ko) | 2012-03-16 | 2014-12-01 | 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 | 알부민 변이체 |
JP2015525222A (ja) * | 2012-06-08 | 2015-09-03 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドBiogen MA Inc. | キメラ性凝固因子 |
US20150252345A1 (en) | 2012-09-25 | 2015-09-10 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of Using FIX Polypeptides |
BR112015010318A2 (pt) | 2012-11-08 | 2017-08-22 | Albumedix As | Variantes de albumina |
TWI641382B (zh) * | 2013-01-31 | 2018-11-21 | 韓美藥品股份有限公司 | 於包含因子vii之組成物中使病毒失活之方法 |
EP2956002B1 (en) | 2013-02-16 | 2017-09-06 | Albumedix A/S | Pharmacokinetic animal model |
US9175279B1 (en) | 2013-03-15 | 2015-11-03 | Csl Limited | Method of purifying factor VII and/or factor VIIa |
TWI828269B (zh) | 2013-03-15 | 2024-01-01 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ix多肽調配物 |
EP2796145B1 (en) | 2013-04-22 | 2017-11-01 | CSL Ltd. | A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge |
TW202003554A (zh) | 2013-08-14 | 2020-01-16 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子viii-xten融合物及其用途 |
IL282168B2 (en) | 2014-01-10 | 2023-03-01 | Bioverativ Therapeutics Inc | Factor viii chimeric proteins and their uses |
KR20160143820A (ko) * | 2014-04-11 | 2016-12-14 | 시에스엘 리미티드 | 출혈의 예방 및 치료를 위한 반감기 연장 인자 fviia 단백질 및 이의 투약 용법 |
CA2953593C (en) | 2014-07-02 | 2023-09-26 | Csl Limited | Modified von willebrand factor |
DE102014112212A1 (de) * | 2014-08-26 | 2016-03-03 | Akesion Gmbh | Rekombinante Fusionsproteine zur Vorbeugung oder Behandlung von Adhäsionen bei Geweben oder Organen |
AU2016266627A1 (en) | 2015-05-22 | 2018-01-18 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia |
AU2016267539B2 (en) | 2015-05-22 | 2019-12-05 | CSL Behring Lengnau AG | Methods for preparing modified von willebrand factor |
CN104926946B (zh) * | 2015-07-13 | 2021-09-17 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用 |
CN106397571A (zh) * | 2015-07-31 | 2017-02-15 | 李金松 | 一种新型羧基末端肽及长效白介素7 |
CN106397570B (zh) * | 2015-07-31 | 2019-11-15 | 袁武梅 | 一种羧基末端肽及长效干扰素 |
CN108472337B (zh) | 2015-08-03 | 2022-11-25 | 比奥贝拉蒂治疗公司 | 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法 |
CA2989966C (en) | 2015-08-20 | 2024-04-30 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
GB201520021D0 (en) | 2015-11-13 | 2015-12-30 | Asterion Ltd | Fusion polypeptide |
ES2803773T3 (es) * | 2015-12-02 | 2021-01-29 | CSL Behring Lengnau AG | Medios mejorados para la expresión de proteínas recombinantes dependientes de vitamina k |
EP3184149A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases |
WO2017117630A1 (en) | 2016-01-07 | 2017-07-13 | Csl Limited | Mutated von willebrand factor |
JP6851381B6 (ja) | 2016-01-07 | 2021-04-21 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト | 変異切断型フォンウィルブランド因子 |
US11123438B2 (en) | 2016-08-19 | 2021-09-21 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Linker peptide for constructing fusion protein |
CN106279436B (zh) * | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 活化的人凝血因子vii融合蛋白及其制备方法与用途 |
CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
CN106317226B (zh) | 2016-08-19 | 2017-09-05 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 用于构建融合蛋白的连接肽 |
MX2019002734A (es) * | 2016-09-13 | 2019-05-27 | Bayer Healthcare Llc | Glicoformas del factor viia. |
SG10201912768YA (en) | 2016-11-11 | 2020-02-27 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder |
ES2869339T3 (es) | 2016-11-11 | 2021-10-25 | CSL Behring Lengnau AG | Polipéptidos del factor von Willebrand truncados para el tratamiento de la hemofilia |
CN108727486A (zh) * | 2017-04-24 | 2018-11-02 | 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 | 长效神经生长因子、制备方法及其组合物 |
KR20200018690A (ko) | 2017-06-22 | 2020-02-19 | 체에스엘 베링 렝나우 아게 | 절단된 vwf에 의한 fviii 면역원성의 조절 |
KR20190086269A (ko) * | 2018-01-12 | 2019-07-22 | 재단법인 목암생명과학연구소 | 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법 |
KR102134571B1 (ko) * | 2018-06-15 | 2020-07-16 | 주식회사 알테오젠 | 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질의 제조 방법 |
MX2021011824A (es) * | 2019-03-27 | 2021-12-10 | Sigilon Therapeutics Inc | Composiciones, dispositivos y metodos para la terapia del factor vii. |
BR112021022940A2 (pt) | 2019-05-17 | 2022-01-18 | Csl Behring Ag | Haptoglobina para uso no tratamento de um resultado neurológico secundário após um acidente vascular cerebral hemorrágico |
KR20220029733A (ko) | 2019-07-04 | 2022-03-08 | 체에스엘 베링 렝나우 아게 | 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) |
JP2023500953A (ja) | 2019-11-11 | 2023-01-11 | ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト | 第viii因子に対する寛容を誘導するためのポリペプチド |
US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
AU2022214388A1 (en) | 2021-02-01 | 2023-07-27 | Csl Behring Ag | Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke |
JP2024517857A (ja) | 2021-05-07 | 2024-04-23 | ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト | 組換えハプトグロビン(Hp)ベータ鎖を作製するための発現系 |
WO2024047219A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Csl Behring Ag | Haptoglobin for use in treating or preventing exaggerated erectile response or erectile dysfunction |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001079271A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Principia Pharmaceutical Corporation | Albumin fusion proteins |
Family Cites Families (111)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5019A (en) * | 1847-03-13 | Shirt-bosom | ||
US5625041A (en) * | 1990-09-12 | 1997-04-29 | Delta Biotechnology Limited | Purification of proteins |
US4970300A (en) * | 1985-02-01 | 1990-11-13 | New York University | Modified factor VIII |
GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
US5641663A (en) * | 1985-11-06 | 1997-06-24 | Cangene Corporation | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces |
AU628018B2 (en) | 1987-07-28 | 1992-09-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Kluyveromyces as a host strain |
JP2791418B2 (ja) * | 1987-12-02 | 1998-08-27 | 株式会社ミドリ十字 | 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体 |
HU213571B (en) | 1988-07-23 | 1997-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Process for producing peptides and dna sequences |
US5705363A (en) * | 1989-03-02 | 1998-01-06 | The Women's Research Institute | Recombinant production of human interferon τ polypeptides and nucleic acids |
ATE92107T1 (de) | 1989-04-29 | 1993-08-15 | Delta Biotechnology Ltd | N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen. |
US5766883A (en) * | 1989-04-29 | 1998-06-16 | Delta Biotechnology Limited | Polypeptides |
GB8909916D0 (en) | 1989-04-29 | 1989-06-14 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
US5667986A (en) * | 1989-10-18 | 1997-09-16 | Delta Biotechnology Limited | Yeast promoter for expressing heterologous polypeptides |
US5580560A (en) * | 1989-11-13 | 1996-12-03 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII/VIIa |
US5766897A (en) * | 1990-06-21 | 1998-06-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cysteine-pegylated proteins |
US5646012A (en) * | 1991-04-30 | 1997-07-08 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Yeast promoter and use thereof |
FR2676070B1 (fr) | 1991-04-30 | 1994-09-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Promoteur de levure et son utilisation. |
US5223408A (en) * | 1991-07-11 | 1993-06-29 | Genentech, Inc. | Method for making variant secreted proteins with altered properties |
US6348327B1 (en) * | 1991-12-06 | 2002-02-19 | Genentech, Inc. | Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells |
FR2686901A1 (fr) | 1992-01-31 | 1993-08-06 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
FR2686900B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-07-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
US5364771A (en) * | 1992-04-07 | 1994-11-15 | Emory University | Hybrid human/porcine factor VIII |
FR2694294B1 (fr) * | 1992-07-30 | 1994-09-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Promoteur de levure et son utilisateur. |
DE4244915C2 (de) * | 1992-08-14 | 1998-12-03 | Widmar Prof Dr Tanner | DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind |
WO1994015625A1 (en) | 1993-01-15 | 1994-07-21 | Enzon, Inc. | Factor viii - polymeric conjugates |
EP0699075B1 (en) | 1993-05-21 | 2001-12-12 | Zymogenetics, Inc. | MODIFIED FACTOR VII for inhibiting vascular restenosis and platelet deposition |
US5621039A (en) * | 1993-06-08 | 1997-04-15 | Hallahan; Terrence W. | Factor IX- polymeric conjugates |
DK144093D0 (ru) | 1993-12-23 | 1993-12-23 | Novo Nordisk As | |
FR2719593B1 (fr) | 1994-05-06 | 1996-05-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur préparation et composition pharmaceutique les contenant. |
AT403167B (de) * | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Immuno Ag | Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems |
EP0793504B1 (en) * | 1994-12-12 | 2005-06-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Chimeric cytokines and uses thereof |
AU6455896A (en) | 1995-07-11 | 1997-02-10 | Chiron Corporation | Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered metal-binding properties |
SE9503380D0 (sv) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
DE19538715A1 (de) | 1995-10-18 | 1997-04-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Reinigung von Faktor VII und aktiviertem Faktor VII |
GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
US6087129A (en) * | 1996-01-19 | 2000-07-11 | Betagene, Inc. | Recombinant expression of proteins from secretory cell lines |
US6110707A (en) * | 1996-01-19 | 2000-08-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant expression of proteins from secretory cell lines |
CA2246431A1 (en) | 1996-01-19 | 1997-07-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant expression of proteins from secretory cell lines |
JP3735921B2 (ja) * | 1996-02-07 | 2006-01-18 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | GPIb・脂質複合体およびその用途 |
US20040092442A1 (en) | 1996-04-24 | 2004-05-13 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
DE69740154D1 (de) | 1996-04-24 | 2011-05-05 | Univ Michigan | Gegen Inaktivierung resistenter Faktor VIII |
US6300065B1 (en) * | 1996-05-31 | 2001-10-09 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Yeast cell surface display of proteins and uses thereof |
US6458563B1 (en) * | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
JP2000503860A (ja) * | 1996-08-02 | 2000-04-04 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 精巣―特異的インシュリン同族体ポリペプチド |
US7026447B2 (en) * | 1997-10-09 | 2006-04-11 | Human Genome Sciences, Inc. | 53 human secreted proteins |
CA2305690A1 (en) | 1997-10-09 | 1999-04-22 | Human Genome Sciences, Inc. | 53 human secreted proteins |
WO1999055306A1 (en) | 1998-04-27 | 1999-11-04 | Opperbas Holding B.V. | Pharmaceutical composition comprising factor viii and neutral liposomes |
AU3998799A (en) | 1998-05-20 | 1999-12-06 | Genentech Inc. | Treatment for hemophilia |
EP1088084B1 (en) | 1998-06-15 | 2006-09-13 | GTC Biotherapeutics, Inc. | Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein |
AU761027B2 (en) | 1998-08-25 | 2003-05-29 | Merck Patent Gmbh | Expression and export of angiostatin and endostatin as immunofusis |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
DK1180121T3 (da) | 1999-05-17 | 2004-03-01 | Conjuchem Inc | Langtidsvirkende insulinotrope peptider |
AU5282200A (en) | 1999-05-24 | 2000-12-12 | American National Red Cross, The | Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor |
JP2003503426A (ja) | 1999-07-02 | 2003-01-28 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | FVIIaアンタゴニスト |
WO2001029242A2 (en) | 1999-10-21 | 2001-04-26 | Monsanto Company | Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants |
ATE336514T1 (de) | 2000-02-11 | 2006-09-15 | Merck Patent Gmbh | Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen |
ATE428445T1 (de) | 2000-02-11 | 2009-05-15 | Bayer Healthcare Llc | Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate |
US6946134B1 (en) * | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050100991A1 (en) | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU2001275897A1 (en) | 2000-07-12 | 2002-01-21 | Immunex Corporation | Improvement of cell culture performance |
WO2002029045A2 (en) | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of vitamin k-dependent proteins |
EP1328622A2 (en) | 2000-10-18 | 2003-07-23 | Maxygen Aps | Protein c or activated protein c-like molecules |
SI1355942T1 (sl) | 2000-12-07 | 2009-02-28 | Lilly Co Eli | Glp-1 fuzijski proteini |
CA2434097A1 (en) | 2001-01-12 | 2002-08-08 | The American National Red Cross | Methods and compositions for reducing heparan sulfate proteoglycan-mediated clearance of factor viii |
MXPA03008209A (es) | 2001-03-12 | 2004-11-12 | Progenetics Llc | Produccion de altos niveles del factor viii transgenico con estabilidad disenada, y sus usos terapeuticos. |
US20050244931A1 (en) | 2001-04-12 | 2005-11-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20050054051A1 (en) | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20060084794A1 (en) | 2001-04-12 | 2006-04-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US20030143191A1 (en) | 2001-05-25 | 2003-07-31 | Adam Bell | Chemokine beta-1 fusion proteins |
DE60234193D1 (de) | 2001-06-14 | 2009-12-10 | Scripps Research Inst | Stabilisierte faktor viii mit gentechnisch konstruierten disulfidbindungen |
EP1423136A4 (en) | 2001-08-10 | 2007-07-25 | Epix Pharm Inc | POLYPEPTIDE CONJUGATES HAVING INCREASED CIRCULATION HALF-VIES |
AU2002332041A1 (en) | 2001-10-05 | 2003-04-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
EP2292271A3 (en) * | 2001-10-10 | 2011-09-14 | BioGeneriX AG | Remodelling and glycoconjugation of an antibody |
EP1463752A4 (en) * | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
US20080167238A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-07-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
US7122641B2 (en) | 2001-12-21 | 2006-10-17 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
CA2471363C (en) | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
WO2003066085A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-08-14 | Delta Biotechnology Limited | Albumin-fused anti-angiogenesis peptides |
AU2003217415B2 (en) | 2002-02-14 | 2009-01-08 | William J Rutter | Chimeric molecules for cleavage in a treated host |
US20080108560A1 (en) | 2002-03-05 | 2008-05-08 | Eli Lilly And Company | Heterologous G-Csf Fusion Proteins |
CA2484155C (en) | 2002-04-29 | 2015-10-13 | Baxter International Inc. | Antagonists of factor viii interaction with low-density lipoprotein receptor-related protein |
MXPA04012496A (es) | 2002-06-21 | 2005-09-12 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Glicoformos del factor vii pegilados. |
CN1241946C (zh) | 2002-07-01 | 2006-02-15 | 美国福源集团 | 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白 |
FR2841904B1 (fr) | 2002-07-03 | 2004-08-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Analogues de facteurs x clivables par la thrombine |
AU2003265866A1 (en) | 2002-09-03 | 2004-03-29 | Vit Lauermann | Targeted release |
CN1480466A (zh) * | 2002-09-03 | 2004-03-10 | �й������ž�����ҽѧ��ѧԺ����ҽ | 一类溶栓抗凝双功能融合蛋白及应用 |
CA2513213C (en) * | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
EP1444986A1 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-11 | Aventis Behring GmbH | Pharmaceutical preparation for the improved treatment of blood-clotting disorders |
US20050176108A1 (en) | 2003-03-13 | 2005-08-11 | Young-Min Kim | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
US20070041987A1 (en) | 2003-03-19 | 2007-02-22 | Daniel Carter | Fragments or polymers of albumin with tunable vascular residence time for use in therapeutic delivery and vaccine development |
SI1624891T2 (sl) * | 2003-05-06 | 2013-09-30 | Biogen Idec Hemophilia Inc. | Strjevalni faktor-FC himerni proteini za zdravljenje hemofilije |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
MXPA05013565A (es) | 2003-06-12 | 2006-03-09 | Lilly Co Eli | Proteinas de fusion analogas al glp-1. |
US7550263B2 (en) | 2003-09-05 | 2009-06-23 | Gtc Biotherapeutics, Inc. | Method for the production of fusion proteins in transgenic mammal milk |
CA2551916C (en) | 2003-12-31 | 2014-04-29 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics |
PL1729795T3 (pl) | 2004-02-09 | 2016-08-31 | Human Genome Sciences Inc | Białka fuzyjne albuminy |
AU2005243427B2 (en) | 2004-05-04 | 2010-07-22 | Novo Nordisk Health Care Ag | O-linked glycoforms of polypeptides and method to manufacture them |
EP1598367A1 (en) | 2004-05-18 | 2005-11-23 | ZLB Behring GmbH | Modified coagulation factors with enhanced stability and their derivatives |
US7670595B2 (en) | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
KR20070043051A (ko) | 2004-08-17 | 2007-04-24 | 쳇엘베 베링 게엠베하 | 변형된 비타민 k 의존적 폴리펩타이드 |
WO2006027111A1 (en) | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Zlb Behring Gmbh | Modified coagulation factor viii with enhanced stability |
AU2006233638A1 (en) | 2005-04-14 | 2006-10-19 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation Factor VIII with enhanced stability and its derivates |
BRPI0614761A2 (pt) | 2005-08-12 | 2009-05-19 | Human Genome Sciences Inc | proteìnas de fusão de albumina |
EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
KR101492422B1 (ko) | 2006-04-11 | 2015-02-12 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법 |
AU2007258609B2 (en) | 2006-06-07 | 2013-01-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
EP1867660A1 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-19 | CSL Behring GmbH | Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor |
US7939632B2 (en) | 2006-06-14 | 2011-05-10 | Csl Behring Gmbh | Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity |
KR101542752B1 (ko) | 2006-12-22 | 2015-08-10 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 연장된 생체내 반감기를 갖는 변형된 응고 인자 |
DK2109457T3 (en) | 2007-02-12 | 2016-04-11 | Csl Behring Gmbh | THERAPEUTIC USE OF KAZAL TYPE SERINE PROTEASE INHIBITORS |
-
2006
- 2006-02-06 EP EP06002359A patent/EP1816201A1/en not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-02-03 CA CA2636671A patent/CA2636671C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-03 PL PL07703248T patent/PL1984503T5/pl unknown
- 2007-02-03 ES ES10164043T patent/ES2793325T3/es active Active
- 2007-02-03 EP EP07703248.0A patent/EP1984503B2/en not_active Not-in-force
- 2007-02-03 AU AU2007214011A patent/AU2007214011B9/en not_active Ceased
- 2007-02-03 ES ES07703248T patent/ES2504517T5/es active Active
- 2007-02-03 BR BRPI0707513-8A patent/BRPI0707513A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-02-03 MX MX2008009893A patent/MX2008009893A/es active IP Right Grant
- 2007-02-03 EP EP10164043.1A patent/EP2233576B1/en active Active
- 2007-02-03 CN CN200780004623.4A patent/CN101379189B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-03 RU RU2008132760/10A patent/RU2466141C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-02-03 DK DK07703248.0T patent/DK1984503T4/en active
- 2007-02-03 KR KR1020087021858A patent/KR101439817B1/ko active IP Right Grant
- 2007-02-03 JP JP2008552755A patent/JP5726404B2/ja active Active
- 2007-02-03 WO PCT/EP2007/000937 patent/WO2007090584A1/en active Application Filing
- 2007-02-03 US US12/223,616 patent/US8765915B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-03 KR KR1020147012098A patent/KR101579083B1/ko active IP Right Grant
-
2009
- 2009-09-23 HK HK09108088.7A patent/HK1129421A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-06-26 JP JP2013133394A patent/JP2013188230A/ja active Pending
-
2014
- 2014-05-15 US US14/279,143 patent/US20140356346A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-06-28 US US15/195,467 patent/US20170080061A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001079271A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Principia Pharmaceutical Corporation | Albumin fusion proteins |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SYED S. et al. Potent antithrombin activity and delayed clearance from the circulation characterize recombinant hirudin genetically fused to albumin, Blood, 1997, v.89, №9, p.3243-3252. PRESCOTT M. et al. The length of polypeptide linker affects the stability of green fluorescent protein fusion proteins, Anal. Biochem., 1999, v.273, №2, p.305-307. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2585231C2 (ru) * | 2010-06-04 | 2016-05-27 | Ск Кемикалз Ко., Лтд. | Слитый белок, обладающий активностью фактора vii |
RU2758160C2 (ru) * | 2016-09-20 | 2021-10-26 | Байер Фарма Акциенгезельшафт | Новые антитела против фактора xi и их применения |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2466141C2 (ru) | МОДИФИЦИРОВАННЫЙ КОАГУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР VIIa С ПРОДЛЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ | |
US8828939B2 (en) | Modified vitamin K dependent polypeptides | |
EP2007885B1 (en) | Method of increasing the in vivo recovery of therapeutic polypeptides | |
EP1867660A1 (en) | Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor | |
AU2012258466A1 (en) | Modified coagulation Factor VIIa with extended half-life | |
AU2013202563A1 (en) | Method of increasing the in vivo recovery of therapeutic polypeptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200204 |